RU2684639C1 - Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда - Google Patents
Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда Download PDFInfo
- Publication number
- RU2684639C1 RU2684639C1 RU2018121114A RU2018121114A RU2684639C1 RU 2684639 C1 RU2684639 C1 RU 2684639C1 RU 2018121114 A RU2018121114 A RU 2018121114A RU 2018121114 A RU2018121114 A RU 2018121114A RU 2684639 C1 RU2684639 C1 RU 2684639C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysozyme
- sorbent
- immobilized
- matrix
- ligand
- Prior art date
Links
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 58
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims description 6
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 abstract 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 5
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000002113 nanodiamond Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- 241001248479 Pseudomonadales Species 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005474 detonation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 241000947836 Pseudomonadaceae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- -1 bromoacetyl Chemical class 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к технологиям использования сорбентов, применяемых в том числе для медицинских целей, а именно для экстракорпоральной терапии больных с сепсисом с использованием сорбции биологических жидкостей. Задача изобретения: практическая реализация идеи применения иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда в матрице гемосовместимого сорбента для удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с отсутствием риска утечки лизоцима в сорбируемую биологическую жидкость (водный раствор, в том числе физраствор, плазму крови и цельную кровь (с учетом гемосовместимости сорбента)). Задача решается предлагаемым способом удаления (сорбции) эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью химически (ковалентно) иммобилизованного в аминированной агарозной матрице лизоцима в качестве лиганда. Иммобилизацию лизоцима на агарозной аминированной матрице проводят с получением молекулярного спейсера -NH-CH-NH-CH-NH-, присоединяющего молекулу лизоцима. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл.
Description
Область техники
Изобретение относится к технологиям использования сорбентов, применяемых в том числе для медицинских целей, а именно для экстракорпоральной терапии больных с сепсисом с использованием сорбции биологических жидкостей.
Уровень техники
Использование препаратов иммобилизованного лизоцима является важной задачей, расширяющей спектр медицинского и биотехнологического применения данного фермента.
Бактериальный эндотоксин (БЭ) - это поверхностный липополисахарид бактерий, который накапливается в крови при сепсисе, на который сильно реагирует иммунная система человека. С медицинской точки зрения иногда важнее быстро убрать находящиеся в биожидкости БЭ, чем добиваться полного обезвреживания бактерий, продуцирующих эти БЭ. Проблема удаления БЭ в современной практике частично решается рядом сорбентов с синтетическими лигандами. Есть патенты на эту тему. Выборочно это:
В международной заявке на изобретение WO 2010083545 SORBENT FOR ENDOTOXINS (Опубликовано: 2010-07-29) описывается сорбент для удаления БЭ из биологической жидкости, который содержит нерастворимый в воде пористый носитель и полимиксин (polymixin), который иммобилизуется на носителе, причем упомянутый носитель имеет нейтральную, гидрофобную поверхность и иммобилизированный полимиксин удерживается на поверхности сорбента путем гидрофобного взаимодействия. Сорбент разработан для экстракорпоральной очистки крови, прежде всего, для лечения сепсиса. Данная заявка фактически покрывает все варианты сорбентов с полимиксином, иммобилизированным посредством гидрофобного взаимодействия.
Однако, такой способ иммобилизации не исключает утечку лиганда.
В патенте на изобретение DE 4209988 ENDOTOXIN ADSORBER HAVING HIGH BINDING CAPACITY - COMPRISES POLYETHYLENEIMINE BONDED TO POROUS CARRIER, ESP. POLYSACCHARIDE (Опубликовано: 1993-03-04) заявляются адсорбенты эндотоксинов, содержащие полиэтиленимин, нековалентно или ковалентно связанные с внутренней и/или наружной поверхностью пористого материала носителя. Материал-носитель представляет собой мембрану или гранулу, например, полисахарид, целлюлозу, полисульфон, полиакрилонитрил или полиамид. Такие адсорбенты используются для удаления БЭ из биологических жидкостей.
Однако, в изобретении не показана гемосовместимость сорбента и сам лиганд иной, чем в предлагаемом изобретении.
В патенте RU 2641924 СОРБЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (Опубликовано: 23.01.2018 Бюл. №3) описан сорбционный материал, содержащий пористый носитель, функциональные группы на поверхности которого ковалентно связаны с лигандом, способным к образованию прочных комплексов с бактериальными эндотоксинами. Пористый носитель представляет собой гранулы размером от 50 до 900 микрон, выполненные из полимера или сополимера. Изобретение обеспечивает получение новых селективных сорбентов для очистки жидких сред от БЭ.
Однако, отличается материал носителя (матрицы), способ иммобилизации и сам лиганд. Кроме того, не показана гемосовместимость сорбента.
Найдена только лишь одна статья Capture of bacterial endotoxins using a supermacroporous monolithic matrix with immobilized polyethyleneimine, lysozyme or polymyxin В. Авторы: Amro Наnоrа, Fatima M. Plieva, Martin 
, Igor Yu. Galaev, Bo Mattiasson Publication: Journal of Biotechnology 118 (2005) 421-433 Publisher: Elsevier Date: 10 September 2005. В статье представлены результаты обстоятельного научного исследования удаления (захвата) БЭ (липополисахаридов) с помощью супермакропористых монолитных колонн с непрерывным слоем, так называемых криогелевых колонн, с ковалентно иммобилизованными полиэтиленимином (PEI), полимиксином В (РМВ) и лизоцимом (в том числе с иммобилизацией лизоцима в отдельности). БЭ были количественно сорбированы из смесей с модельным белком, бычьим сывороточным альбумином (БСА) при рН 7,2 практически без потерь белка. При рН 3,6 БЭ были сорбированы непосредственно из неочищенного клеточного лизата Escherichia coli (E.coli).
Однако, здесь испытания по удалению БЭ проводилась только на модельных растворах с БЭ и нет исследований гемосовместимости сорбента. Также использована другая схема иммобилизации в отличие от схемы в предлагаемом изобретении.
Еще имеется работа, посвященная криогелю поливинилового спирта, в который был нековалентно включен лизоцим на стадии изготовления самого криогеля в процессе циклического многократного замораживания-оттаивания (ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛИЗОЦИМА В КРИОГЕЛЬ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА. Декина С.С., Романовская И.И., Овсепян А.М., Молодая А.Л., Пашкин И.И. // Biotechnol. Acta. 2014. V.7. No 3. Р. 69). Иммобилизованный таким образом лизоцим характеризуется расширенным рН-профилем активности, существенно отличным от такового для растворимого фермента. Расширение рН-профиля активности является положительным моментом в плане дополнительного расширения спектра условий применимости лизоцима.
Однако, у лизоцима, нековалентно иммобилизованного в криогеле поливинилового спирта, есть ограничения по сферам применения, особенно в медицине, так как в этом варианте иммобилизации присутствует фактор утечки фермента из геля, и не была показана возможность удаления БЭ из биожидкости.
Еще один вариант иммобилизации лизоцима - это включение белка в нанопоры наночастиц силикагеля (Као K.-Ch., Lin T.-S., Мои Ch.-Y. // J. Phys. Chem. C. 2014. V. 118. P. 6734). Было показано, что при такой иммобилизации несколько возрастала активность и заметно улучшалась стабильность активности лизоцима.
Однако следует отметить, что данный вариант иммобилизации также является нековалентным присоединением и соответственно предполагает утечку белка с частиц, и также не была показана возможность удаления БЭ из биологической жидкости.
Существует способ приготовления лизоцима, ковалентно иммобилизованного на полистироле (Wu Y., Daeschel М.А. // J. Food Sci. 2007. V. 72. Nr.9 P.M369). В этом методе применяются подходы из твердофазного синтеза пептидов. Используют хлорметил-полистирол, на который прививают s-аминокапроновую кислоту с третбутилоксикарбонильной защитой, затем переводят аминогруппу в бромацетил производное с последующим присоединением единственного гистидина лизоцима (His-15). Полученный иммобилизованный лизоцим обладает хорошей стабильностью. Из плюсов способа следует отметить точную направленную иммобилизацию и отсутствие побочных продуктов с неустановленной структурой.
Из минусов способа можно отметить высокую стоимость исходных материалов и сложность схемы синтеза, что однозначно станет препятствием для широкого практического применения. Также не показана возможность удаления БЭ из биологической жидкости.
Также в ходе патентного поиска были проанализированы несколько патентов про способы иммобилизации лизоцима в матрицах сорбентов.
Патент RU 2569510 СОРБЕНТ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЙ СОБОЙ НАНОАЛМАЗНЫЙ МАТЕРИАЛ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ (Опубликовано: 27.11.2015 Бюл. №33). Сорбенты из наноалмазсодержащих материалов получают в результате детонационного синтеза и модификации. Поверхность детонационных наноалмазов подвергают целенаправленному изменению путем модифицирования химически активными жидкими и газообразными веществами при повышенных температурах. В результате модифицирования состав поверхностных радикалов, содержащих атомы неуглеродной природы (О, Н, N, S), пополняется дополнительными атомами, что приводит к появлению дополнительных аналогичных или новых функциональных групп, способных образовывать связи с функциональными группами биологических объектов. Изобретение обеспечивает возможность удаления широкого спектра белковых материалов с помощью полученных сорбентов из различных биологических жидкостей.
Однако, наноалмазы в медицинских экстракорпоральных процедурах не используются, лизоцим привязан нековалентно и поэтому не исключена утечка в биожидкость.
Патент Китая CN 106589202 (A) LYSOZYME IMMOBILIZED CARRIER AND PREPARATION METHOD THEREOF (Опубликовано: 2017-04-26). Изобретение относится к матрице (носителю) иммобилизованного лизоцима и способу получения, относящемуся к области иммобилизации фермента. В изобретении применяется экологически безопасный технологический процесс суспензионной полимеризации с использованием метилакрилата в качестве основного сырья, дивинилбензола в качестве сшивающего агента, регулирующего структуру смолы путем добавления третьего мономерного стирола для увеличения механической прочности носителя, макропористый носитель лизоцима был приготовлен в присутствии реагента, а гидролиз слабокислой макропористой катионообменной смолы был получен с получением ферментного носителя. В конце отвержденный лизоцим получали взаимодействием смолы, глутаральдегида и лизоцима.
Однако, для данного материала не была показана гемосовместимость и не была показана возможность удаления БЭ из биологической жидкости.
Таким образом в ходе тщательных патентно-информационных поисков не удалось найти ни одной публикации про удаление эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью гемосовместимого сорбента с иммобилизованным лизоцимом, что позволяет сделать предварительный вывод, что, вероятно, этого никто еще не делал практически до сих пор.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения явилась практическая реализация идеи применения иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда в матрице гемосовместимого сорбента для удаления БЭ из биологических жидкостей с практическим отсутствием риска утечки лизоцима (невнесение никаких дополнительных веществ) в сорбируемую биологическую жидкость (водный раствор, в том числе физраствор, плазму крови и цельную кровь (с учетом гемосовместимости сорбента)). Возможна адаптация и к другим биожидкостям.
Задача решается предлагаемым способом удаления БЭ из биологических жидкостей с помощью химически (ковалентно) иммобилизованного в аминированной агарозной матрице лизоцима в качестве лиганда. Способ проверен на удалении энтеробактериальных эндотоксинов (кишечной палочки Escherichia coli, сорбция 65±17 нг на мл сорбента) и псевдомонадных эндотоксинов (синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, сорбция 190±25 нг на мл сорбента). Кишечная палочка и синегнойная палочка относятся к тем бактериям, эндотоксины которых очень серьезно ухудшают прогноз у больных с сепсисом.
Иммобилизацию лизоцима на агарозной аминированной матрице проводят с получением молекулярного спейсера -NH-C6H12-NH-C5H10-NH-, присоединяющего молекулу лизоцима.
Перечень рисунков
Рис. 1 - Схема приготовления аминированной матрицы и затем ковалентная иммобилизация (присоединение к матрице) лизоцима через молекулярный спейсер.
Осуществление изобретения
На рис. 1 представлена схема приготовления аминированной матрицы и затем ковалентная иммобилизация (присоединение к матрице) лизоцима через молекулярный спейсер. Большую роль в повышении эффективности действия иммобилизованного лизоцима играет применение спейсера (для устранения стерических препятствий присоединению макромолекулярных лигандов (лизоцима) между ними и матрицей бывает необходимо ввести молекулу спейсера). Наиболее перспективный вариант иммобилизованного лизоцима получен ковалентным присоединением фермента к матрице через спейсер -NH-C6H12-NH-C5H10-NH-.
Для аминирования агарозной матрицы ее промывали 10-тью объемами дистиллированной воды на стеклянном фильтре, присоединенном к водоструйному насосу с помощью колбы Бунзена. К навеске геля добавляли двукратное количество 2% водного раствора периодата натрия и инкубировали 2 часа на качалке при 20°С. После инкубации матрицу промывали 20-кратным объемом дистиллированной воды. К матрице, активированной периодатом натрия, добавляли однократный объем 2М раствора 1,6-диаминогексана и инкубировали 2 часа на качалке при 25°С. Затем добавляли 2-кратный объем свежеприготовленного 0,5% (по весу) раствора натрия боргидрида натрия и инкубировали 30 минут при перемешивании. Обработку боргидридом повторяли дважды. Далее промывали гель 5-кратным объемом 1 М раствора NaCl и 20-кратным объемом дистиллированной воды. Затем к 10 мл 50% суспензии аминированной матрицы в буферной смеси 30 мМ NaHCO3-NaOH, рН=10,0 добавляли 0,56 мл 25% раствора глутарового альдегида и перемешивали в течение 30 мин на качалке при 25°С. Далее гель промывали 50 мл буферного раствора 30 мМ NaHCO3-NaOH, рН=10,0 и смешивали с 10 мл раствора лизоцима в том же буферном растворе (концентрация лизоцима 7,5 мг/мл). Смесь инкубировали 1 час на качалке при 25°С. Полученный сорбент обрабатывали 10 мл 0,5% (по весу) водного раствора боргидрида натрия дважды. Время каждой инкубации с раствором боргидрида натрия составляло 20 мин. После блокировки сорбент промывали 200 мл дистиллированной воды. Выход на стадии иммобилизации лизоцима для всех образцов составил не менее 98%. В качестве матрицы сорбента использовали промышленно выпускаемые макропористые агарозные матрицы марок Sepharose (Сефароза) (производитель GE Healthcare, США) и WorkBeads (WB) 200 Sec (производитель Bio-Works, Швеция) (прим.: в настоящий момент максимальный опыт использования в клинической медицинской практике накоплен для сорбентов на основе агарозных матриц).
Для доказательства, что лиганд иммобилизованного лизоцима не отваливается от матрицы (и потом не утекает из сорбента) получали смывы с гелей препаратов иммобилизованного лизоцима. В колонку высотой 5 см и сечением 1 см2 помещали 2 мл 50% суспензии сорбента. Далее исследовали связывание иммобилизованным лизоцимом бактериальных эндотоксинов (липополисахаридов) при добавлении полученного на выходе из колонки смыва. Затем собирали вытекший из колонки раствор и дополнительно промывали колонку буферной смесью. Собирали смыв с колонку до достижения суммарного объема жидкости 3 мл. В случае наличия утечки лиганда, смывы будут обладать бактериолитической активностью. Бактериолитическая активность регистрируется уже при концентрации лизоцима 0,05 мкг в мл и более. Так как в смывах активности нами не обнаружено, то мы можем гарантировать, что концентрация лизоцима в смывах менее 0,05 мкг в мл. Весь смыв может содержать не более 3×0,05 мкг = 0,15 мкг. Объем сорбента в этом испытании был 1 мл, иммобилизованного лизоцима было 15 мг (15000 мкг) на мл сорбента. Таким образом в смыве не может быть лизоцима в количестве более 0,15/15000=0,00001 (одной стотысячной части) от иммобилизованного количества (или 0,001%).
Также были получены экспериментальные результаты проверки гемосовместимости (с кровью человека) синтезированного сорбента с иммобилизованным лизоцимом. По методике проверки кровь доноров брали в пробирки 50 мл с предварительно добавленным до конечной концентрации 2,5 Ед/мл гепарином. Колонку делали из носика 10 мл и фильтра 90 (133) мкм. Вносили 200 мкл сорбента, промывали 2 мл физиологического раствора, снизу надевали силиконовый шланг. Предобработку сорбента гепарином проводили после промывки физиологическим раствором из расчета 100 Ед гепарина на 1 мл сорбента, инкубация сорбента с 2-кратным объемом физ. раствора с гепарином, RT, перемешивание, 10 мин. Хроматографию сорбента с 4 мл крови проводили при комнатной температуре, самотеком, время контакта от 20 до 30 минут. Кровь после хроматографии собирали в пробирку 15 мл. В качестве отрицательного контроля использовалась колонка без сорбента. В кровь после колонки добавляли ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ, аликвотили по 1 мл и измеряли клетки в геманализаторе Elite3 Erba Mannheim (2-3 параллели). Сравнительные результаты представлены в таблицах 1-8 по эритроцитам, тромбоцитам, лимфоцитам, гемоглобину и гематокриту.
Общим выводом анализа результатов в таблицах является то, что синтезированный по предлагаемому способу сорбент с иммобилизованным лизоцимом совместим с цельной кровью человека (гемосовместим).
Результаты проверки гемосовместимости полученного сорбента с ковалентно иммобилизованным лизоцимом
1. Эритроциты
2. Тромбоциты.
3. Лимфоциты
4. Гемоглобин, гематокрит.
Примеры проверки осуществления способа - с энтеробактериальными эндотоксинами и псевдомонадными эндотоксинами.
В таблице 9 представлены данные по связыванию иммобилизованным лизоцимом бактериальных токсинов (липополисахаридов) микроорганизма Escherichia coli (кишечная палочка) семейства Enterobacteriaceae и микроорганизма Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) семейства Pseudomonadaceae. Концентрацию эндотоксина определяли по его активности при помощи набора для определения активности эндотоксина "Hycult". В качестве стандарта энтеробактериального эндотоксина использовали препарат Escherichia coli 055-В5 ("Endosafe", США), и стандарт псевдомонадного эндотоксина Pseudomonas_aeruginosa «Пирогенал» 100 мкг/мл ("Медгамал", Россия).
Прим.: 1 нанограмм (нг) на мл геля = 5 ЕЭ (единиц эндотоксина)
Из данных таблицы 9 видно, что вышеописанный иммобилизованный лизоцим способен достаточно эффективно связывать (удалять) эндотоксины кишечной и синегнойной палочек. Например, при тяжелом сепсисе у пациента может быть порядка 100 или более ЕЭ на мл плазмы крови. Соответственно, например, колонка с сорбентом объемом 250 мл может удалять до 81250 ЕЭ энтеробактериального эндотоксина или 237500 ЕЭ псевдомонадного эндотоксина, что соответствует содержанию эндотоксинов: в 0,812 литра (для энтеробактериального эндотоксина) или 2,375 литра (для псевдомонадного эндотоксина) такого пациента, у которого исходно 100 ЕЭ на мл плазмы его крови. При 2-3 литрах плазмы объем крови пациента составляет до 4-6 литров.
Таким образом, иммобилизованный лизоцим в сорбенте способен существенно снижать уровень эндотоксинов при его применении в сорбционных колонках.
Представленные экспериментальные данные подтверждают практическое решение задач изобретения. Результаты экспериментов показали достаточно высокую эффективность и доказали возможность применения вышеописанного иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда в матрице сорбента для удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с отсутствием риска утечки лизоцима в обрабатываемую (фильтруемую) биологическую жидкость и при этом подтверждена гемосовместимость сорбента.
Предлагаемый способ разработан в рамках выполнения работы по Соглашению №14.574.21.0181 между Министерством образования и науки Российской Федерации (Госзаказчик) и МГТУ им. Н.Э. Баумана.
Claims (2)
1. Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда гемосовместимого сорбента, характеризующийся связыванием эндотоксинов кишечной и синегнойной палочек лизоцимом, иммобилизованным на агарозной аминированной матрице с молекулярным спейсером -NH-C6H12-NH-C5H10-NH-, присоединяющим молекулу лизоцима; в качестве матрицы гемосовместимого сорбента с отсутствием риска утечки иммобилизованного лизоцима используют промышленно выпускаемые крупнопористые агарозные матрицы.
2. Способ по п. 1, характеризующийся сорбцией энтеробактериальных эндотоксинов кишечной палочки Escherichia coli 65±17 нг на мл сорбента и сорбцией псевдомонадных эндотоксинов синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa 190±25 нг на мл сорбента.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121114A RU2684639C1 (ru) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121114A RU2684639C1 (ru) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2684639C1 true RU2684639C1 (ru) | 2019-04-11 |
Family
ID=66168146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018121114A RU2684639C1 (ru) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2684639C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1622398A1 (ru) * | 1988-07-21 | 1991-01-23 | Институт Органического Синтеза Ан Латвсср | Способ выделени рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток |
| CN106589202A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-04-26 | 黄晖 | 一种溶菌酶固定化载体及其制备方法 |
-
2018
- 2018-06-07 RU RU2018121114A patent/RU2684639C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1622398A1 (ru) * | 1988-07-21 | 1991-01-23 | Институт Органического Синтеза Ан Латвсср | Способ выделени рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток |
| CN106589202A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-04-26 | 黄晖 | 一种溶菌酶固定化载体及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Dekina S.S et al."MUCOADHESIVE GEL WITH IMMOBILIZED LYSOZYME: PREPARATION AND PROPERTIES", Biotechnologia Acta, 2015, Vol.8, No. 3, p.104-109. * |
| Левашов П.А. и др. "СИНТЕЗ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ СИНТЕТИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ ДЛЯ ПРОЦЕДУР ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО АФЕРЕЗА", Биомедицинская химия, т.56(6), 2010, 739-746. * |
| Левашов П.А. и др. "СИНТЕЗ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ СИНТЕТИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ ДЛЯ ПРОЦЕДУР ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО АФЕРЕЗА", Биомедицинская химия, т.56(6), 2010, 739-746. Dekina S.S et al."MUCOADHESIVE GEL WITH IMMOBILIZED LYSOZYME: PREPARATION AND PROPERTIES", Biotechnologia Acta, 2015, Vol.8, No. 3, p.104-109. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0110409B1 (en) | Adsorbent and process for preparing the same | |
| JP5656871B2 (ja) | エンドトキシン用着収剤 | |
| JP5858299B2 (ja) | エンドトキシン用の新しい吸着剤 | |
| CA2481711C (en) | Method and device for selective separation of a compound from a body fluid | |
| US20050249724A1 (en) | Extracorporeal stablised expanded bed adsorption method for the treatment of sepsis | |
| JP2004516896A (ja) | 細胞外体液からの特異的生体高分子物質の体外捕獲 | |
| CN101279242A (zh) | 用于抗体清除的血液净化吸附剂 | |
| JPH0434451B2 (ru) | ||
| JPH03238004A (ja) | 分離方法および分離剤 | |
| US6090292A (en) | Device for purifying solutions containing proteins and use of the device | |
| CN100493695C (zh) | 用于治疗内毒素血症的内毒素吸附材料 | |
| JPH01171638A (ja) | 血清アミロイドａ蛋白用吸着体 | |
| JPH0667472B2 (ja) | 血清アミロイドｐ蛋白用吸着体 | |
| RU2684639C1 (ru) | Способ удаления эндотоксинов из биологических жидкостей с помощью ковалентно иммобилизованного лизоцима в качестве лиганда | |
| JPH0622633B2 (ja) | 吸着体およびそれを用いた除去装置 | |
| RU2694883C1 (ru) | Способ ковалентной иммобилизации лизоцима для последующего применения иммобилизованного лизоцима для снижения бактериальной обсемененности биологических жидкостей | |
| JPS59169532A (ja) | Ｃ反応性蛋白の吸着材 | |
| JPH0611333B2 (ja) | 免疫複合体の吸着体およびそれを用いた免疫複合体の除去装置 | |
| JP2013010701A (ja) | エンドトキシン吸着体、それを用いた全血灌流型体外循環用カラム及び医薬品精製用クロマトグラフィー充填剤 | |
| US6803183B2 (en) | Method for removing pyrogens from plasma and blood for treatment of septic shock | |
| AU2008201015B2 (en) | Improved separation | |
| JP5250288B2 (ja) | 体液浄化システムの作動方法 | |
| RU2700605C1 (ru) | Сорбент для сочетанного удаления из плазмы человека атерогенных липопротеидов и С-реактивного белка | |
| Beena et al. | Chitosan: A novel matrix for hemoperfusion | |
| JPH01158970A (ja) | 直接血液潅流用免疫グロブリン吸着材および吸着装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20200907 |