RU2680268C1

RU2680268C1 - Detection system of most significant prokaryotic representatives of human intestinal microbiota based on pcr panel

Info

Publication number: RU2680268C1
Application number: RU2017129843A
Authority: RU
Inventors: Анна Сергеевна Попенко; Александр Викторович Тяхт; Дмитрий Глебович Алексеев; Наталья Сергеевна Клименко; Максим Леонидович Филипенко; Александра Сергеевна Шадрина
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Кномикс"
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2019-02-19
Also published as: WO2019078765A3; WO2019078765A2

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and is a set of synthetic oligonucleotides for identifying marker regions of bacteria genes and archaea from the human intestinal microbiota. New method of profiling the individual's intestinal microbiota is developed and experimentally tested. Method is based on a semi-quantitative and qualitative determination of the representatives of prokaryotic taxa, which have the described association with various human pathologies and are most represented in the human intestinal microbiota. Set includes oligonucleotides specific to and capable of hybridizing with fragments of the 16S rRNA genes indicated in the description of bacterial and archaea taxa.EFFECT: set allows to increase the accuracy and speed of detection of microorganisms potentially responsible for human diseases.8 cl, 48 dwg, 2 ex, 6 tbl

Description

Область техникиTechnical field

Данное изобретение относится к биотехнологии, медицине и диетологии. Изобретение описывает способ характеризации микробиоты кишечника человека на основе набора синтетических олигонуклеотидов и может применяться для прогностических и диагностических целей.This invention relates to biotechnology, medicine and nutrition. The invention describes a method for characterizing the human intestinal microbiota based on a set of synthetic oligonucleotides and can be used for prognostic and diagnostic purposes.

Уровень техникиState of the art

Микробиота (а также микробном или микрофлора) кишечника человека - это совокупность всех микроорганизмов, обитающих в толстом и тонком отделах кишечника. Совокупный качественный или количественный состав микробиоты называется ее профилем, а процесс его определения - профилированием микробиоты. Существуют разные подходы к изучению микробиоты, у каждого из них есть свои ограничения. Бактериальный посев позволяет выявить только культивируемые микроорганизмы, и по нему невозможно определить относительную представленность микроорганизмов. Метагеномное секвенирование - один из самых точных методов для определения качественного и полуколичественного состава микробиоты, но требует значительной технологической базы и достаточно дорог, поэтому используется не очень широко. Альтернативой секвенированию является анализ микробиоты при помощи методов полимеразной цепной реакции (далее ПЦР) с использованием олигонуклеотидных последовательностей, гибридизующихся с участками генома определенных микроорганизмов и их групп (для этой цели обычно используется последовательность гена 16S рРНК).The microbiota (as well as the microbial or microflora) of the human intestine is the totality of all microorganisms that live in the large and thin sections of the intestine. The total qualitative or quantitative composition of the microbiota is called its profile, and the process of its determination is called the profiling of the microbiota. There are different approaches to the study of microbiota, each of them has its own limitations. Bacterial culture allows only cultivated microorganisms to be detected, and it is impossible to determine the relative representation of microorganisms from it. Metagenomic sequencing is one of the most accurate methods for determining the qualitative and semi-quantitative composition of microbiota, but it requires a significant technological base and is quite expensive, therefore it is not used very widely. An alternative to sequencing is the analysis of microbiota using the methods of polymerase chain reaction (hereinafter PCR) using oligonucleotide sequences that hybridize with the genome regions of certain microorganisms and their groups (for this purpose, the 16S rRNA gene sequence is usually used).

В норме в микробиоте кишечника человека преобладают бактерии из отделов Bacteroidetes и Firmicutes, среди прочих встречаются представители Actinobacteria и Proteobacteria. Бактерии взаимодействуют с организмом хозяина, влияя на его метаболизм и иммунитет. В частности, бактерии из клостридиальных кластеров XIVa и IV, относящиеся к отделу Firmicutes, являются эффективными производителями короткоцепочечной жирной кислоты бутирата, также известной как масляная кислота. Это вещество является активным противовоспалительным агентом, положительно влияя на состояние кишечного эпителия. Превалирование в микробиоте бактерий, способных синтезировать бутират, ассоциировано со здоровьем кишечника и организма в целом.Normally, bacteria from the departments of Bacteroidetes and Firmicutes predominate in the microbiota of the human intestine, among others there are representatives of Actinobacteria and Proteobacteria. Bacteria interact with the host organism, affecting its metabolism and immunity. In particular, bacteria from the clostridial clusters XIVa and IV, belonging to the Firmicutes department, are effective producers of short-chain fatty acid butyrate, also known as butyric acid. This substance is an active anti-inflammatory agent, positively affecting the condition of the intestinal epithelium. The prevalence in microbiota of bacteria capable of synthesizing butyrate is associated with the health of the intestine and the body as a whole.

Из ряда работ (Forslund, K., et al., Nature, 2015, 528.7581:262-266; Le Chatelier Е, et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers. Nature. 2013 Aug 29; 500(7464):541-6; Karlsson FH, et al. Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nature Communications. 2012;3:1245-50) известно, что микробиота претерпевает изменения при определенных патологических состояниях организма. В частности, ряд исследований показали, что при метаболических расстройствах, таких как ожирение или диабет второго типа, понижена представленность бутират-производящих бактерий из клостридиальных кластеров XIVa и IV, лактобактерий Lactobacillus, Bifidobacterium, археи Methanobrevibacter smithii, членов бактериального семейства Christensenellaceae, и в то же время повышена представленность представителей семейства Enterobacteriaceae, Peptostreptococcaceae, куда входят патогенные и оппортунистически патогенные клостридии, бактерии Ruminococcus из семейства Lachnospiraceae. Бактериальный род Akkermansia, основным представителем которого в кишечнике является вид Akkermansia muciniphila, ассоциирован с нормальным обменом веществ и может способствовать защите от избыточного веса.From a series of works (Forslund, K., et al., Nature, 2015, 528.7581: 262-266; Le Chatelier E, et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers. Nature. 2013 Aug 29; 500 (7464) : 541-6; Karlsson FH, et al. Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nature Communications. 2012; 3: 1245-50) it is known that the microbiota undergoes changes under certain pathological conditions of the body. In particular, a number of studies have shown that in metabolic disorders, such as obesity or type 2 diabetes, the presence of butyrate-producing bacteria from clostridial clusters XIVa and IV, lactobacilli Lactobacillus, Bifidobacterium, Archaea Methanobrevibacter smithii, members of the bacterial family Christensenellaceae, and at the same time, the representation of the Enterobacteriaceae family, Peptostreptococcaceae, which includes pathogenic and opportunistically pathogenic clostridia, Ruminococcus bacteria from the Lachnospiraceae family, is increased. The bacterial genus Akkermansia, whose main representative in the intestine is the species Akkermansia muciniphila, is associated with normal metabolism and can help protect against overweight.

Также выявлена связь между развитием других заболеваний человека и составом микробиоты. Профиль микробиоты при воспалительных заболеваниях кишечника человека, в том числе болезни Крона и неспецифическом язвенном колите, в первую очередь характеризуется сниженной относительной представленностью бутират-производящих бактерий и аномально высокой долей представителей семейства Enterobacteriaceae, в частности, Escherichia coli (Imhann F, et al, Gut, 2016, doi: 10.1136/gutjnl-2016-312135). У пациентов с атеросклерозом в кишечной микробиоте обнаружено снижение уровня Akkermansia muciniphila, а также бактерий родов Roseburia, Eubacterium и Dorea, входящих в клостридиальный кластер XIVa. Ряд бактерий, в том числе члены родов Proteus, Lachnoclostridium и другие, трансформируют фосфатидилхолин, содержащийся в красном мясе, яйцах и субпродуктах, в триметиламин (ТМА). Полученное соединение легко усваивается в клетках печени и окисляется в триметиламин-N-оксид (ТМАО), который обладает атерогенной активностью. Также бактерии способны производить ТМА из L-карнитина, содержащегося в диетической рыбе и красном мясе (Gregory JC, Buffa JA, Org E, et al. Transmission of Atherosclerosis Susceptibility with Gut Microbial Transplantation. The Journal of Biological Chemistry. 2015; 290(9):5647-5660).The relationship between the development of other human diseases and the composition of the microbiota was also revealed. The profile of microbiota in inflammatory bowel diseases, including Crohn's disease and ulcerative colitis, is primarily characterized by a reduced relative representation of butyrate-producing bacteria and an abnormally high proportion of representatives of the Enterobacteriaceae family, in particular Escherichia coli (Imhann F, et al, Gut , 2016, doi: 10.1136 / gutjnl-2016-312135). In patients with atherosclerosis in the intestinal microbiota, a decrease in the level of Akkermansia muciniphila, as well as bacteria of the genera Roseburia, Eubacterium and Dorea, included in the clostridial cluster XIVa, was found. A number of bacteria, including members of the genera Proteus, Lachnoclostridium and others, transform the phosphatidylcholine found in red meat, eggs and offal into trimethylamine (TMA). The resulting compound is easily absorbed in the liver cells and is oxidized to trimethylamine-N-oxide (TMAO), which has atherogenic activity. Bacteria are also able to produce TMA from L-carnitine found in diet fish and red meat (Gregory JC, Buffa JA, Org E, et al. Transmission of Atherosclerosis Susceptibility with Gut Microbial Transplantation. The Journal of Biological Chemistry. 2015; 290 (9 ): 5647-5660).

Посредством анализа профиля микробиоты кишечника человека по образцам кала можно получать информацию, которая позволит оценить уровень разнообразия микробиоты, предсказывать предрасположенность к определенным заболеваниям, разрабатывать диетологические рекомендации. Поскольку в кишечнике человека может быть обнаружено порядка 1000 видов бактерий (

М, de Vos WM. FEMS Microbiol Rev, 2014, Sep; 38(5):996-1047), определить количество каждого из этих видов по отдельности в исследуемом образце достаточно сложно и дорого. В литературе описаны методы предсказания некоторых заболеваний на основе детекции присутствия определенных бактерий в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) человека (например, US 20170159108 А1 (опубликовано 6 апреля 2017), US 20170096709 А1 (опубликовано 7 июня 2017), WO 2012080753 (опубликовано 21 июня 2012), РФ 2601132 (опубликовано 27 октября 2016), РФ 2362808 (опубликовано 27 июля 2009)), однако они опираются на ограниченный, искусственно выбранный набор микроорганизмов, и не учитывают состояние микробиоты в целом. Для оптимизации методики профилирования микробиоты кишечника необходимо создание набора для теста на наличие и представленность определенных прокариотических таксонов (таксономических единиц, которые могут включать в себя виды, рода, семейства и тд, а также их группы), который бы наиболее полно характеризовал состояние всей микробиоты человека, при этом позволяя определять степень сходства с микробиотой пациентов с различными заболеваниями (нарушения метаболизма, воспалительные заболевания кишечника и другие), а также оценивать динамику кишечного сообщества под воздействием внешних факторов, таких, как диетическое вмешательство или прием лекарственных препаратов. Одновременно с этим набор должен быть прост в использовании, доступен большинству медицинских лабораторий, при этом позволяя производить большое количество анализов за короткий промежуток времени на стандартном оборудовании. Данное изобретение решает задачу создания подобного набора и применимо для создания недорогого и информативного экспресс-теста для профилирования микробиоты человека, в том числе с целью оценки вероятности развития заболеваний на основании ассоциативных связей между патологиями и микробными маркерами, выработки персонализированных рекомендаций по употреблению определенных продуктов питания, в том числе, а также оценке влияния лекарственных препаратов (а также пребиотиков и пробиотиков) на организм человека.By analyzing the profile of the microbiota of the human intestine from stool samples, information can be obtained that will assess the level of diversity of the microbiota, predict a predisposition to certain diseases, and develop nutritional recommendations. Since about 1000 species of bacteria can be detected in the human intestine (

M, de Vos WM. FEMS Microbiol Rev, 2014, Sep; 38 (5): 996-1047), it is rather difficult and expensive to determine the amount of each of these species separately in the studied sample. The literature describes methods for predicting certain diseases based on the detection of the presence of certain bacteria in the human gastrointestinal tract (GIT) (for example, US 20170159108 A1 (published April 6, 2017), US 20170096709 A1 (published June 7, 2017), WO 2012080753 (published 21 June 2012), RF 2601132 (published October 27, 2016), RF 2362808 (published July 27, 2009)), but they rely on a limited, artificially selected set of microorganisms and do not take into account the state of the microbiota as a whole. To optimize the profiling technique of intestinal microbiota, it is necessary to create a kit for testing for the presence and presentation of certain prokaryotic taxa (taxonomic units, which may include species, genera, families, etc., as well as their groups), which would most fully characterize the state of the entire human microbiota while allowing to determine the degree of similarity with the microbiota of patients with various diseases (metabolic disorders, inflammatory bowel diseases and others), as well as to assess the dyne iku intestinal community under the influence of external factors, such as dietary intervention or medication. At the same time, the kit should be easy to use, accessible to most medical laboratories, while allowing a large number of tests to be performed in a short period of time on standard equipment. This invention solves the problem of creating such a kit and is applicable for creating an inexpensive and informative rapid test for profiling human microbiota, including with the aim of assessing the likelihood of developing diseases based on the associative relationships between pathologies and microbial markers, developing personalized recommendations for the use of certain foods, including assessment of the effect of drugs (as well as prebiotics and probiotics) on the human body.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Задачей настоящего изобретения является создание набора или комплекта олигонуклеотидных зондов и праймеров для качественной и полуколичественной оценки представленности определенного набора бактериальных и архейных таксонов при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, который бы позволял эффективно и полно охарактеризовать изменения состава микробиоты человека при возникновении определенных заболеваний, приеме лекарственных препаратов или изменении диеты.The objective of the present invention is to provide a set or set of oligonucleotide probes and primers for the qualitative and semi-quantitative assessment of the representativeness of a specific set of bacterial and archaeal taxa using the real-time polymerase chain reaction (PCR) method, which would allow to effectively and fully characterize changes in the composition of a person’s microbiota when certain diseases, medications, or diet changes.

Указанная задача решается путем создания нового набора биомаркеров, где в качестве биомаркера выступают прокариотические (бактериальные или архейные) таксоны. Принципы отбора биомаркеров по настоящему изобретению заключались в том, что представители этих таксонов должны: (а) быть наиболее представленными в микробиоте кишечника человека, (б) иметь описанное положительное или отрицательное влияние на здоровье человека и/или (в) быть прямо или обратно ассоциированными с теми или иными патологиями.This problem is solved by creating a new set of biomarkers, where prokaryotic (bacterial or archaeal) taxa act as a biomarker. The principles for the selection of biomarkers of the present invention were that the representatives of these taxa should: (a) be most represented in the microbiota of the human intestine, (b) have the described positive or negative effect on human health and / or (c) be directly or inversely associated with one or another pathology.

На основании этих принципов, а также исходя из данных, полученных путем метагеномного анализа 655 образцов микробиоты кишечника человека от населения Российской Федерации, при помощи рационального дизайна были разработаны и экспериментально протестированы 14 прокариотических таксонов, удовлетворяющих вышеперечисленным условиям. В совокупности, указанные таксоны составляют 56±11% (среднее значение ± стандартное отклонение) от общей микробной представленности в микробиоте кишечника в проанализированных образцах. Особенностью данного изобретения является то, что разработанный набор таксонов-биомаркеров способен указать на предрасположенность или наличие определенных заболеваний у человека и при этом охватить большую часть фактического состава микробиоты кишечника человека.Based on these principles, as well as on the basis of data obtained by metagenomic analysis of 655 samples of the human intestinal microbiota from the population of the Russian Federation, 14 prokaryotic taxa satisfying the above conditions were developed and experimentally tested using a rational design. In aggregate, these taxa account for 56 ± 11% (mean ± standard deviation) of the total microbial representation in the intestinal microbiota in the analyzed samples. A feature of this invention is that the developed set of biomarker taxa is able to indicate a predisposition or the presence of certain diseases in humans and at the same time cover most of the actual composition of the human intestinal microbiota.

Некоторые варианты изобретения включают набор для определения уровня представленности микроорганизмов в образце, взятом из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) субъекта, путем амплификации определенных участков генома этих микроорганизмов в условиях количественного ПЦР и нормирования на общее количество прокариотической ДНК в указанном образце, включающий комплект олигонуклеотидных зондов, имеющих олигонуклеотидные последовательности, каждая из которых способна специфически гибридизоваться с участком генома микроорганизмов, имеющим последовательность, уникальную для только одного таксона, а микроорганизмы выбраны из следующей группы из 14 бактериальных и архейных таксонов: Lactobacillus spp.; Bifidobacterium spp.; Bacteroides spp.; Prevotella spp.; Enterobacteriaceae; Akkermansia spp.; Clostridium cluster XIVa, состоящий из родов Roseburia spp., Dorea spp., Eubacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Anaerostipes spp., Butyrivibrio spp., Coprococcus spp., Lachnospira spp., Ruminococcus spp., Collinsella; Clostridium cluster IV, состоящий из родов Subdoligranulum spp., Faecalibacterium spp., Anaerotruncus spp.; Christensenellaceae; Enterococcus spp.; Streptococcus spp.; Methanobrevibacter spp.; Ruminococcus spp., относящиеся к семейству Lachnospiraceae; Blautia spp., и комплект олигонуклеотидных зондов, имеющих олигонуклеотидные последовательности, каждая из которых способна специфически гибридизоваться с участком генома, имеющим последовательность, общую для всех прокариотических микроорганизмов, присутствующих в ЖКТ субъекта.Some variants of the invention include a kit for determining the level of representation of microorganisms in a sample taken from the gastrointestinal tract (GIT) of a subject by amplifying certain parts of the genome of these microorganisms under conditions of quantitative PCR and normalization to the total amount of prokaryotic DNA in the specified sample, including a set of oligonucleotide probes having oligonucleotide sequences, each of which is capable of specifically hybridizing to a portion of the genome of microorganisms having sequence unique to only one taxon, and microorganisms selected from the group consisting of 14 bacterial and archaeal taxa: Lactobacillus spp .; Bifidobacterium spp .; Bacteroides spp .; Prevotella spp .; Enterobacteriaceae; Akkermansia spp .; Clostridium cluster XIVa, consisting of the genera Roseburia spp., Dorea spp., Eubacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Anaerostipes spp., Butyrivibrio spp., Coprococcus spp., Lachnospira spp., Rococins. Clostridium cluster IV, consisting of the genera Subdoligranulum spp., Faecalibacterium spp., Anaerotruncus spp .; Christensenellaceae; Enterococcus spp .; Streptococcus spp .; Methanobrevibacter spp .; Ruminococcus spp., Belonging to the family Lachnospiraceae; Blautia spp., And a set of oligonucleotide probes having oligonucleotide sequences, each of which is capable of specifically hybridizing to a portion of the genome having a sequence common to all prokaryotic microorganisms present in the gastrointestinal tract of the subject.

Предпочтительные варианты изобретения включают вышеупомянутый набор для определения уровня микроорганизмов, в котором участки генома, которые участвуют в гибридизации с указанными зондами, кодируют ген 16S рРНК. Другие предпочтительные варианты изобретения отличаются тем, что указанный комплект олигонуклеотидных зондов содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-30 или SEQ ID NO: 91-96, или из группы идентичных одной из этих последовательностей по меньшей мере на 95%. Зонды из этого комплекта могут содержать флуорофор, выбранный из списка FAM, R6G и ROX, прикрепленный на 5'-конце или 3'-конце последовательности зонда при помощи ковалентной связи, и содержат нефлуоресцентный тушитель, выбранный из списка DABCYL, BHQ и Eclipse, прикрепленный на противоположном от указанного флуорофора конце последовательности указанного зонда при помощи ковалентной связи. При этом, олигонуклеотидные зонды в комплекте могут содержать как одинаковые, так и разные пары флуорофор-тушитель, а для одного и того же флуорофора возможно использование различных тушителей.Preferred embodiments of the invention include the aforementioned kit for determining the level of microorganisms, in which parts of the genome that are involved in hybridization with these probes encode the 16S rRNA gene. Other preferred embodiments of the invention are characterized in that said set of oligonucleotide probes contains at least one sequence selected from SEQ ID NO: 1-30 or SEQ ID NO: 91-96, or from at least 95 identical groups of one of these sequences % The probes in this kit may contain a fluorophore selected from the FAM, R6G, and ROX list attached to the 5'-end or 3'-end of the probe sequence via covalent bonding, and contain a non-fluorescence quencher selected from the DABCYL, BHQ and Eclipse list, attached at the opposite end of the indicated fluorophore sequence of the specified probe using a covalent bond. Moreover, the oligonucleotide probes in the kit can contain both the same and different pairs of the fluorophore quencher, and different quenchers can be used for the same fluorophore.

Предпочтительные варианты изобретения также включают вышеупомянутый набор, дополнительно содержащий комплект праймеров, пригодных для использования при амплификации участков генома этих микроорганизмов в условиях количественного ПЦР, при этом для каждого используемого зонда в комплект праймеров включается специфичная пара праймеров, способная гибридизоваться с той же последовательностью ДНК микроорганизмов, что и указанный зонд, или последовательностью, комплементарной указанной последовательности ДНК, при этом указанные праймеры содержат по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31-90 или SEQ ID NO: 97-108, или из группы идентичных одной из этих последовательностей по меньшей мере на 95%.Preferred embodiments of the invention also include the aforementioned kit, additionally containing a set of primers suitable for use in amplification of the genome regions of these microorganisms under conditions of quantitative PCR, while for each probe used a specific pair of primers capable of hybridizing with the same DNA sequence of microorganisms is included in the set of primers, as the specified probe, or a sequence complementary to the specified DNA sequence, while these primes The rods contain at least one sequence selected from SEQ ID NO: 31-90 or SEQ ID NO: 97-108, or from the group identical to at least 95% of one of these sequences.

Вышеупомянутый набор может также дополнительно содержать, по меньшей мере, одно из следующего: (а) средства для проведения амплификации и/или реакции удлинения праимера для одного или нескольких олигонуклеотидов из комплекта зондов; (б) средства для получения и/или хранения образца кала; (в) средства для выделения нуклеиновой кислоты из образца кала.The aforementioned kit may further comprise at least one of the following: (a) means for amplifying and / or extending the primer for one or more oligonucleotides from the probe set; (b) means for obtaining and / or storing a stool sample; (c) means for isolating a nucleic acid from a stool sample.

Другие варианты изобретения включают способ определения уровня представленности микроорганизмов в образце, взятом из ЖКТ субъекта, включающий следующие стадии: (i) выделение геномной ДНК микроорганизмов из указанного образца; (ii) проведение амплификации определенных участков генома микроорганизмов в условиях количественной ПЦР с применением выделенной геномной ДНК из (i) иOther embodiments of the invention include a method for determining the level of representation of microorganisms in a sample taken from the gastrointestinal tract of a subject, the method comprising the following steps: (i) isolating the genomic DNA of the microorganisms from the specified sample; (ii) amplification of certain parts of the genome of microorganisms in terms of quantitative PCR using isolated genomic DNA from (i) and

олигонуклеотидных зондов, имеющих олигонуклеотидные последовательности, каждая из которых способна специфически гибридизоваться с участком генома микроорганизмов, имеющим последовательность, уникальную для только одного таксона, а микроорганизмы выбраны из следующей группы из 14 бактериальных и архейных таксонов: Lactobacillus spp.; Bifidobacterium spp.; Bacteroides spp.; Prevotella spp.; Enterobacteriaceae; Akkermansia spp.; Clostridium cluster XIVa, состоящий из родов Roseburia spp., Dorea spp., Eubacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Anaerostipes spp., Butyrivibrio spp., Coprococcus spp., Lachnospira spp., Ruminococcus spp., Collinsella; Clostridium cluster IV, состоящий из родов Subdoligranulum spp., Faecalibacterium spp., Anaerotruncus spp.; Christensenellaceae; Enterococcus spp.; Streptococcus spp.; Methanobrevibacter spp.; Ruminococcus spp., относящиеся к семейству Lachnospiraceae; Blautia spp., и олигонуклеотидных зондов, имеющих олигонуклеотидные последовательности, каждая из которых способна специфически гибридизоваться с участком генома, имеющим последовательность, общую для всех прокариотических микроорганизмов, присутствующих в ЖКТ субъекта; (iii) определение уровня представленности микроорганизмов из указанных таксонов при помощи нормирования на общее количество прокариотической ДНК в указанном образце.oligonucleotide probes having oligonucleotide sequences, each of which is capable of specifically hybridizing to a portion of the genome of microorganisms having a sequence unique to only one taxon, and the microorganisms are selected from the following group of 14 bacterial and archaeal taxa: Lactobacillus spp .; Bifidobacterium spp .; Bacteroides spp .; Prevotella spp .; Enterobacteriaceae; Akkermansia spp .; Clostridium cluster XIVa, consisting of the genera Roseburia spp., Dorea spp., Eubacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Anaerostipes spp., Butyrivibrio spp., Coprococcus spp., Lachnospira spp., Rococins. Clostridium cluster IV, consisting of the genera Subdoligranulum spp., Faecalibacterium spp., Anaerotruncus spp .; Christensenellaceae; Enterococcus spp .; Streptococcus spp .; Methanobrevibacter spp .; Ruminococcus spp., Belonging to the family Lachnospiraceae; Blautia spp., And oligonucleotide probes having oligonucleotide sequences, each of which is capable of specifically hybridizing to a portion of the genome having a sequence common to all prokaryotic microorganisms present in the gastrointestinal tract of a subject; (iii) determining the level of representation of microorganisms from these taxa by normalizing the total amount of prokaryotic DNA in the specified sample.

Предпочтительные варианты изобретения также включают вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что участки генома, которые участвуют в гибридизации с указанными зондами, кодируют ген 16S рРНК. Другие предпочтительные варианты изобретения также включают вышеупомянутый способ, в котором для амплификации участков генома указанных микроорганизмов используются следующие олигонуклеотидные зонды: (a) SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 для детекции Bacteroides spp.; (6) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 для детекции Prevotella spp.; (в) SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 для детекции Bifidobacterium spp.; (г) SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 для детекции Enterobacteriaceae; (д) SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 для детекции Akkermansia spp.; (e) SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 для детекции Methanobrevibacter spp.; (ж) SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для детекции Streptococcus spp.; (з) SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 для детекции Enterococcus spp.; (и) SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 для детекции Christensenellaceae; (к) SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20 для детекции Lactobacillus spp.; (л) SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22 для детекции Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (м) SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24 для детекции Blautia spp; (н) SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 для детекции Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 для детекции Clostridium cluster XIVa; (n) SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 для детекции общей прокариотической ДНК.Preferred embodiments of the invention also include the aforementioned method, characterized in that regions of the genome that are involved in hybridization with said probes encode the 16S rRNA gene. Other preferred embodiments of the invention also include the aforementioned method, in which the following oligonucleotide probes are used to amplify genome regions of these microorganisms: (a) SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the detection of Bacteroides spp .; (6) SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for the detection of Prevotella spp .; (c) SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the detection of Bifidobacterium spp .; (d) SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for the detection of Enterobacteriaceae; (e) SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for the detection of Akkermansia spp .; (e) SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for the detection of Methanobrevibacter spp .; (g) SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for the detection of Streptococcus spp .; (h) SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for the detection of Enterococcus spp .; (i) SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for the detection of Christensenellaceae; (k) SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for the detection of Lactobacillus spp .; (k) SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for the detection of Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (m) SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for detection of Blautia spp; (n) SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for the detection of Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the detection of Clostridium cluster XIVa; (n) SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 for detecting total prokaryotic DNA.

Другие предпочтительные варианты изобретения также включают вышеупомянутый способ, в котором для амплификации участков генома указанных микроорганизмов используются следующие пары праймеров, специфичные для каждого используемого зонда: (a) SEQ ID NO: 31-32 вместе с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 33-34 вместе с SEQ ID NO: 2 для детекции Bacteroides spp.; (б) SEQ ID NO: 35-36 вместе с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 37-38 вместе с SEQ ID NO: 4 для детекции Prevotella spp.; (в) SEQ ID NO: 39-40 вместе с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 41-42 вместе с SEQ ID NO: 6 для детекции Bifidobacterium spp.; (r) SEQ ID NO: 43-44 вместе с SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 45-46 вместе с SEQ ID NO: 8 для детекции Enterobacteriaceae; (д) SEQ ID NO: 47-48 вместе с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 49-50 вместе с SEQ ID NO: 10 для детекции Akkermansia spp.; (e) SEQ ID NO: 51-52 вместе с SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 53-54 вместе с SEQ ID NO: 12 для детекции Methanobrevibacter spp.; (ж) SEQ ID NO: 55-56 вместе с SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 57-58 вместе с SEQ ID NO: 14 для детекции Streptococcus spp.; (з) SEQ ID NO: 59-60 вместе с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 61-62 вместе с SEQ ID NO: 16 для детекции Enterococcus spp.; (и) SEQ ID NO: 63-64 вместе с SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 65-66 вместе с SEQ ID NO: 18 для детекции Christensenellaceae; (к) SEQ ID NO: 67-68 вместе с SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 69-70 вместе с SEQ ID NO: 20 для детекции Lactobacillus spp.; (л) SEQ ID NO:71-72 вместе с SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO:73-74 вместе с SEQ ID NO: 22 для детекции Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (м) SEQ ID NO:75-76 вместе с SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 77-78 вместе с SEQ ID NO: 24 для детекции Blautia spp; (н) SEQ ID NO: 79-80 вместе с SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 81-82 вместе с SEQ ID NO: 26 для детекции Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 83-84 вместе с SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 85-86 вместе с SEQ ID NO: 28 для детекции Clostridium cluster XIVa; (п) SEQ ID NO: 87-88 вместе с SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 89-90 вместе с SEQ ID NO: 30 для детекции общей прокариотической ДНК. В предпочтительных вариантах изобретения указанный образец является образцом кала человека.Other preferred embodiments of the invention also include the aforementioned method, which uses the following primer pairs specific to each probe used to amplify the genome regions of these microorganisms: (a) SEQ ID NO: 31-32 together with SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 33-34 together with SEQ ID NO: 2 for the detection of Bacteroides spp .; (b) SEQ ID NO: 35-36 together with SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 37-38 together with SEQ ID NO: 4 for the detection of Prevotella spp .; (c) SEQ ID NO: 39-40 together with SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 41-42 together with SEQ ID NO: 6 for the detection of Bifidobacterium spp .; (r) SEQ ID NO: 43-44 together with SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 45-46 together with SEQ ID NO: 8 for the detection of Enterobacteriaceae; (e) SEQ ID NO: 47-48 together with SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 49-50 together with SEQ ID NO: 10 for the detection of Akkermansia spp .; (e) SEQ ID NO: 51-52 together with SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 53-54 together with SEQ ID NO: 12 for the detection of Methanobrevibacter spp .; (g) SEQ ID NO: 55-56 together with SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 57-58 together with SEQ ID NO: 14 for the detection of Streptococcus spp .; (h) SEQ ID NO: 59-60 together with SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 61-62 together with SEQ ID NO: 16 for the detection of Enterococcus spp .; (i) SEQ ID NO: 63-64 together with SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 65-66 together with SEQ ID NO: 18 for the detection of Christensenellaceae; (k) SEQ ID NO: 67-68 together with SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 69-70 together with SEQ ID NO: 20 for the detection of Lactobacillus spp .; (k) SEQ ID NO: 71-72 together with SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 73-74 together with SEQ ID NO: 22 for the detection of Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (m) SEQ ID NO: 75-76 together with SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 77-78 together with SEQ ID NO: 24 for the detection of Blautia spp; (n) SEQ ID NO: 79-80 together with SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 81-82 together with SEQ ID NO: 26 for the detection of Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 83-84 together with SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 85-86 together with SEQ ID NO: 28 for the detection of Clostridium cluster XIVa; (o) SEQ ID NO: 87-88 together with SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 89-90 together with SEQ ID NO: 30 to detect total prokaryotic DNA. In preferred embodiments of the invention, said sample is a human stool sample.

При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: разработан новый способ профилирования микробиоты кишечника индивида, который основан на полуколичественном и качественном определении представителей прокариотических таксонов, которые имеют описанную ассоциацию с теми или иными патологиями человека и наиболее представлены в микробиоте кишечника человека;When implementing the invention, the following technical results are achieved: a new method has been developed for profiling an individual’s intestinal microbiota, which is based on a semi-quantitative and qualitative determination of representatives of prokaryotic taxa that have the described association with various human pathologies and are most represented in the human intestinal microbiota;

- путем рационального дизайна разработан ограниченный комплект олигонуклеотидных зондов и праймеров, позволяющий определять представителей прокариотических таксонов, которые имеют описанную ассоциацию с теми или иными патологиями человека и наиболее представлены в микробиоте кишечника человека; такой комплект позволяет повысить точность и скорость определения микроорганизмов, потенциально ответственных за заболевания человека. Краткое описание рисунков- through a rational design, a limited set of oligonucleotide probes and primers has been developed, which allows one to identify representatives of prokaryotic taxa that have the described association with various human pathologies and are most represented in the human intestinal microbiota; this kit allows you to increase the accuracy and speed of determination of microorganisms that are potentially responsible for human diseases. Brief Description of Drawings

Фиг. 1. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 1. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 2. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 2. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different numbers of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 3. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 3. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 4. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 4. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 5. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 5. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 6. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 6. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 7. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 7. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг.8. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.Fig. 8. - A graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 9. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 9. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 10. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 10. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 11. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 11. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 12. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 12. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 13. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 13. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 14. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 14. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 15. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 15. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 16. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 16. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 17. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 17. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 18. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 18. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 19. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 19. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 20. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 20. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 21. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 21. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 22. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 22. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 23. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 23. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 24. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 24. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 25. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 25. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг.26. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.Fig.26. - A graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 27. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 27. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 28. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 28. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 29. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 29. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 30. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 30. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 31. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 31. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 32. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 32. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 33. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 33. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 34. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 34. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг.35. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.Fig. 35. - A graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 36. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 36. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 37. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 37. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 38. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 38. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 39. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 39. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 40. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 40. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences according to Table 6.

Фиг. 41. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 41. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 42. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 42. - Graph of the threshold cycle (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 43. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 43. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 44. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 44. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 45. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 45. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 46. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 46. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 47. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 47. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (the value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Фиг. 48. - График величины порогового цикла (Cq) и результатов амплификации при проведении ПЦР (значение относительных флуоресцентных единиц (RFU) при различном числе циклов амплификации) с олигонуклеотидными последовательностями, согласно Таблице 6.FIG. 48. - Graph of the threshold cycle value (Cq) and amplification results during PCR (value of relative fluorescence units (RFU) for different number of amplification cycles) with oligonucleotide sequences, according to Table 6.

Определения и терминыDefinitions and Terms

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of the present invention, the terms “includes” and “including” are interpreted as meaning “includes, inter alia,”. These terms are not intended to be construed as “consists of only”.

Под «субъектом» и «индивидом» следует понимать млекопитающее, преимущественно человека.Under the "subject" and "individual" should be understood as a mammal, mainly humans.

Под «таксоном» следует понимать группу организмов, связанных той или иной степенью родства и достаточно обособленную, чтобы ей можно было присвоить определенную таксономическую категорию того или иного ранга - вид, род, семейство и т.д. Таксоны по настоящему изобретению включают могут включать в себя рода, семейства, или их группы.A “taxon" should be understood as a group of organisms connected by one degree or another of kinship and sufficiently separate so that it can be assigned a specific taxonomic category of one rank or another - species, genus, family, etc. The taxa of the present invention may include genera, families, or groups thereof.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на многократном избирательном копировании (амплификации) определенного участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи фермента ДНК полимеразы в определенных условиях с использованием двух праймеров, комплементарных противоположным концам разных цепей требуемого участка ДНК. Метод ПЦР включает в себя три этапа: выделение ДНК из образца; амплификацию последовательности ДНК; анализ полученных результатов. Эффективность ПЦР определяется количеством амплифицированного продукта после определенного количества проведенных циклов амплификации.The polymerase chain reaction (PCR) method is based on multiple selective copying (amplification) of a specific DNA nucleic acid section using the DNA polymerase enzyme under certain conditions using two primers complementary to the opposite ends of different chains of the desired DNA region. The PCR method includes three stages: DNA extraction from the sample; amplification of the DNA sequence; analysis of the results. The effectiveness of PCR is determined by the amount of amplified product after a certain number of cycles of amplification.

Количественная ПЦР (qPCR), или ПЦР в реальном времени, используется для одновременной амплификации и измерения количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления, или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I.Quantitative PCR (qPCR), or real-time PCR, is used to simultaneously amplify and measure the amount of a specific PCR product in each reaction cycle. This method uses DNA probes to accurately measure the amount of reaction product as it accumulates, or use the fluorescent intercalating dye Sybr Green I.

Под зондом, или олигонуклеотидным зондом, понимается олигонуклеотидная последовательность, способная гибридизоваться с последовательностью участка гена 16S рРНК в промежутке между теми участками, что гибиридизуются с праймерами.By probe, or oligonucleotide probe, is meant an oligonucleotide sequence capable of hybridizing with the sequence of a portion of the 16S rRNA gene in the gap between those regions that hybridize with primers.

Под "гибридизацией" понимается соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот, которое приводит к образованию двухцепочечной последовательности.By "hybridization" is meant an in vitro compound of complementary single-stranded nucleic acids, which leads to the formation of a double-stranded sequence.

Под уровнем, или уровнем представленности, определенного микроорганизма в образце следует понимать долю генетического материала этого микроорганизма от общего количества бактериального генетического материала (общей прокариотической ДНК), определенного в этом образце.The level, or level of representation, of a particular microorganism in a sample should be understood as the fraction of the genetic material of this microorganism from the total amount of bacterial genetic material (total prokaryotic DNA) defined in this sample.

Используемый здесь термин «процент идентичности двух последовательностей» определяется числом положений идентичных нуклеотидов в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных нуклеотидов в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей может быть определен с помощью бесплатной программы NCBI Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).As used herein, the term “percent identity of two sequences” is defined by the number of positions of identical nucleotides in these two sequences, taking into account the number of spaces and the length of each space that must be entered to optimally match the two sequences by alignment. The percentage of identity is equal to the number of identical nucleotides in these positions, taking into account sequence alignment divided by the total number of positions and multiplied by 100. The percentage of identity of two nucleotide sequences can be determined using the NCBI Nucleotide BLAST freeware program (https: //blast.ncbi.nlm. nih.gov/).

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.Unless defined separately, technical and scientific terms in this application have standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature.

Подробное раскрытие изобретенияDetailed Disclosure of Invention

Настоящее изобретение относится к комплекту олигонуклеотидных зондов и праймеров и их применению для профилирования микробиоты кишечника субъекта. В состав микробиоты кишечника входят микробные таксоны, представляющие собой потенциальные биомаркеры ряда заболеваний. Путем соотнесения показателей относительной представленности таксонов в микробиоте индивида с таковой у здоровых индивидов, а также у пациентов с различными заболеваниями, возможно на основе ассоциативных связей оценить сбалансированность состава кишечного сообщества этого индивида. Предложенный набор позволяет определить эти показатели.The present invention relates to a set of oligonucleotide probes and primers and their use for profiling the intestinal microbiota of a subject. The intestinal microbiota includes microbial taxa, which are potential biomarkers of a number of diseases. By correlating the indicators of the relative representation of taxa in the microbiota of an individual with that in healthy individuals, as well as in patients with various diseases, it is possible to evaluate the balance of the composition of the intestinal community of this individual on the basis of associative relationships. The proposed set allows you to determine these indicators.

Наиболее практичным и в то же время достаточно информативным способом определения состава микробиоты кишечника человека является анализ образца кала. В кале содержится слепок всей микробиоты кишечника, но большую часть ее составляют бактерии толстого кишечника, как наиболее близкого к анальному отверстию отдела и наиболее заселенного бактериями. Возможно также использовать образцы биопсии, а также содержимого различных отделов кишечника - в таких случаях результат анализа будет более прицельно характеризовать микробное сообщество в соответствующем отделе. Предлагаемый набор предназначен для использования на образцах кала, а также может быть использован для профилирования образцов микробиоты кишечника, полученных другими методами.The most practical and at the same time quite informative way of determining the composition of the microbiota of the human intestine is the analysis of a stool sample. The feces contains a cast of the entire intestinal microbiota, but most of it is composed of bacteria of the large intestine, which is the closest to the anus of the department and the most populated by bacteria. It is also possible to use biopsy samples, as well as the contents of various sections of the intestine - in such cases, the result of the analysis will more accurately characterize the microbial community in the corresponding section. The proposed kit is intended for use on stool samples, and can also be used for profiling intestinal microbiota samples obtained by other methods.

Методами секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing) авторами были проанализированы 655 образцов микробиоты кишечника человека, полученных в результате проведенного краудфандингового проекта "OhMyGut", а также собранных от пользователей продукта "Генетика микробиоты" компании "Атлас". При помощи проведенного анализа, а также на основании опубликованных литературных данных, устанавливающих ассоциацию определенных прокариотических таксонов с заболеваниями человека, авторами были отобраны 14 прокариотических таксонов, составляющих 56±11% (среднее значение ± стандартное отклонение) от общей микробной представленности в микробиоте кишечника в проанализированных образцах, и при этом имеющих опубликованную ассоциацию с заболеванием человека (см. Таблица 1). Указанное количество детектируемых таксонов позволяет сбалансировать полноту характеристики состава микробиоты по экономическим и техническим соображениям.Using the methods of next-generation sequencing, the authors analyzed 655 samples of the human intestinal microbiota obtained as a result of the OhMyGut crowdfunding project, as well as those collected from Atlas Microbiota Genetics product users. Using the analysis performed, as well as on the basis of published literature establishing the association of certain prokaryotic taxa with human diseases, the authors selected 14 prokaryotic taxa, representing 56 ± 11% (mean ± standard deviation) from the total microbial representation in the intestinal microbiota in the analyzed samples, and while having a published association with human disease (see Table 1). The specified number of detected taxa allows you to balance the completeness of the characteristics of the composition of the microbiota for economic and technical reasons.

При осуществлении изобретения определение уровня представленности микроорганизмов в образце, взятом из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) субъекта, происходит путем амплификации определенных участков генома этих микроорганизмов в условиях количественного ПЦР и нормирования на общее количество прокариотической ДНК в указанном образце. В предпочтительных вариантах изобретения эти участки генома кодируют ген 16S рРНК. Ген 16S рРНК присутствует у всех прокариот и содержит как консервативные участки, одинаковые для всех прокариотических организмов, так и вариабельные участки, отличающиеся между разными прокариотическими таксонами, но при этом имеющие одинаковую последовательность внутри одного таксона. Поэтому последовательность гена 16S рРНК удобно использовать для идентификации специфических прокариотических таксонов. Тем не менее, использование этого изобретения не ограничивается исключительно последовательностью гена 16S рРНК, и другие последовательности, позволяющие идентифицировать специфические прокариотические таксоны, также могут быть использованы.In the implementation of the invention, the determination of the level of representation of microorganisms in a sample taken from the gastrointestinal tract (GIT) of the subject occurs by amplification of certain parts of the genome of these microorganisms under conditions of quantitative PCR and normalization to the total amount of prokaryotic DNA in the specified sample. In preferred embodiments of the invention, these regions of the genome encode the 16S rRNA gene. The 16S rRNA gene is present in all prokaryotes and contains both conserved regions that are the same for all prokaryotic organisms and variable regions that differ between different prokaryotic taxa, but which have the same sequence within the same taxon. Therefore, the 16S rRNA gene sequence is conveniently used to identify specific prokaryotic taxa. However, the use of this invention is not limited solely to the sequence of the 16S rRNA gene, and other sequences allowing identification of specific prokaryotic taxa can also be used.

Проведенный метагеномный анализ последовательностей 16s рРНК микроорганизмов позволил разработать и экспериментально протестировать специфические олигонуклеотидные зонды, которые могут быть использованы для специфической детекции и определения относительной представленности вышеуказанных микроорганизмов (см. Таблица 2). Данный комплект зондов может служить основой для создания экспресс-теста для диагностики состояния микробиоты человека путем анализа наиболее информативных прокариотических таксонов, имеющих ассоциацию с заболеваниями человека. Путем анализа данных о профиле микробиоты можно делать выводы о текущем состоянии микробиоты и возможных рисках перехода состава микроорганизмов в конфигурации, ассоциированные с заболеваниями. Набор для профилирования микробиоты может также включать, но необязательно, дополнительный комплект зондов из таблицы 4, а также праймеры, пригодные для проведения реакции количественного ПЦР, указанные в таблицах 3 и 5.The metagenomic analysis of 16s rRNA sequences of microorganisms allowed us to develop and experimentally test specific oligonucleotide probes that can be used for specific detection and determination of the relative representation of the above microorganisms (see Table 2). This set of probes can serve as the basis for the creation of an express test for the diagnosis of human microbiota by analyzing the most informative prokaryotic taxa associated with human diseases. By analyzing the data on the microbiota profile, conclusions can be drawn about the current state of the microbiota and the possible risks of the composition of microorganisms in the configuration associated with diseases. The microbiota profiling kit may also include, but not necessarily, an additional set of probes from table 4, as well as primers suitable for carrying out the quantitative PCR reaction shown in tables 3 and 5.

Предлагаемая экспресс-тест система в оптимальном варианте будет содержать по 2 различных комплекта "пара праймеров + олигонуклеотидный зонд" на каждый таксон, а также дополнительную пару праймеров с олигонуклеотидным зондом для оценки общей прокариотической ДНК. Также, предлагаемая экспресс-тест система может дополнительно содержать пару праймеров для оценки представленности ДНК человека. В качестве праймеров для оценки представленности ДНК человека могут быть использованы любые существующие праймеры на ДНК человека, например, описанные в коммерческом наборе Quantifiler^™ Human DNA Quantification Kit). Также в оптимальном варианте экспресс-тест система будет включать буфер для полимеразной цепной реакции, ДНК полимеразу (Taq), положительный и отрицательный контроли, и внешний контрольный образец.The proposed rapid test system in the best case scenario will contain 2 different sets of “pair of primers + oligonucleotide probe” for each taxon, as well as an additional pair of primers with an oligonucleotide probe to evaluate total prokaryotic DNA. Also, the proposed rapid test system may further comprise a pair of primers for assessing the presence of human DNA. As primers for assessing the representativeness of human DNA, any existing human DNA primers can be used, for example, those described in the commercial Quantifiler ^™ Human DNA Quantification Kit). Also optimally, the rapid test system will include a polymerase chain reaction buffer, DNA polymerase (Taq), positive and negative controls, and an external control sample.

Суммарно, тест-система для одного образца микробиоты кишечника человека в оптимальном варианте будет занимать 16 лунок из 96 на стандартном 96-луночном планшете для проведения ПЦР в режиме реального времени, таким образом, позволяя единовременно проанализировать 6 образцов микробиоты. Альтернативно, можно использовать планшеты на 384 лунки, и тогда единовременно указанным способом можно анализировать до 24 образцов.In total, the test system for one sample of the human intestinal microbiota will optimally occupy 16 out of 96 wells on a standard 96-well real-time PCR plate, thus allowing the analysis of 6 microbiota samples at a time. Alternatively, 384 well plates can be used, and then up to 24 samples can be analyzed at once in this manner.

Олигонуклеотидные зонды из комплекта зондов по изобретению способны к гибридизации с последовательностями в ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК и которые специфичны для определенных бактерий или групп бактерий. SEQ ID NO: 1-2 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Bacteroides spp; SEQ ID NO: 3-4 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Prevotella spp.; SEQ ID NO: 5-6 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Bifidobacterium spp.; SEQ ID NO: 7-8 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Enterobacteriaceae; SEQ ID NO: 9-10 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Akkermansia spp.; SEQ ID NO: 11-12 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Methanobrevibacter spp.; SEQ ID NO: 13-14 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Streptococcus spp.; SEQ ID NO: 15-16 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Enterococcus spp.; SEQ ID NO: 17-18 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Christensenellaceae; SEQ ID NO: 19-20 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Lactobacillus spp.; SEQ ID NO: 21-22 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Ruminococcus spp., относящиеся к семейству Lachnospiraceae (Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]); SEQ ID NO: 23-24 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Blautia spp; SEQ ID NO: 25-26 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Clostridial Cluster IV; SEQ ID NO: 27-28 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими бактериальную 16S рРНК Clostridial Cluster XIVa; SEQ ID NO: 29-30 предназначены для взаимодействия с последовательностями ДНК, кодирующими общую бактериальную 16S рРНК (используется для нормирования на общую прокариотическую ДНК). Если не указано иначе, все нуклеотидные последовательности приведены в настоящем документе от 5'-конца к 3'-концу в соответствии с традиционными обозначениями в данной области техники.Oligonucleotide probes from the probe kit of the invention are capable of hybridization with sequences in DNA encoding bacterial 16S rRNA and which are specific for certain bacteria or groups of bacteria. SEQ ID NO: 1-2 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Bacteroides spp; SEQ ID NO: 3-4 are intended to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Prevotella spp .; SEQ ID NO: 5-6 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Bifidobacterium spp .; SEQ ID NO: 7-8 are intended to interact with DNA sequences encoding the bacterial Enterobacteriaceae 16S rRNA; SEQ ID NO: 9-10 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Akkermansia spp .; SEQ ID NO: 11-12 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Methanobrevibacter spp .; SEQ ID NO: 13-14 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Streptococcus spp .; SEQ ID NO: 15-16 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Enterococcus spp .; SEQ ID NO: 17-18 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Christensenellaceae; SEQ ID NO: 19-20 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Lactobacillus spp .; SEQ ID NOS: 21-22 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Ruminococcus spp., Belonging to the Lachnospiraceae family (Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]); SEQ ID NOS: 23-24 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Blautia spp; SEQ ID NO: 25-26 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Clostridial Cluster IV; SEQ ID NO: 27-28 are designed to interact with DNA sequences encoding the bacterial 16S rRNA of Clostridial Cluster XIVa; SEQ ID NO: 29-30 are designed to interact with DNA sequences encoding the total bacterial 16S rRNA (used to normalize total prokaryotic DNA). Unless otherwise indicated, all nucleotide sequences are provided herein from the 5'-end to the 3'-end in accordance with conventional designations in the art.

Организмы, содержащие последовательности-мишени для SEQ ID NO: 1-30, приведены в Таблице 1. Эти бактерии обычно присутствуют в ЖКТ человека в значительном количестве, и согласно литературным данным, относительное количество некоторых из них в ЖКТ изменяется в ту или иную сторону при определенных заболеваниях человека (Таблица 1). Таким образом, с помощью комплекта олигонуклеотидных зондов по изобретению, можно в одном тесте получить информацию о количестве индикаторных микроорганизмов в ЖКТ человека. При использовании специально подобранных зондов и праймеров, указанных в таблицах 2-5, описываемый набор для профилирования микробиоты представляет собой эффективное средство диагностики с высокой чувствительностью и точностью.Organisms containing the target sequences for SEQ ID NO: 1-30 are shown in Table 1. These bacteria are usually present in the human gastrointestinal tract in a significant amount, and according to published data, the relative number of some of them in the gastrointestinal tract changes in one direction or another when certain human diseases (table 1). Thus, using the set of oligonucleotide probes according to the invention, it is possible to obtain information on the number of indicator microorganisms in the human gastrointestinal tract in one test. When using specially selected probes and primers specified in tables 2-5, the described set for profiling microbiota is an effective diagnostic tool with high sensitivity and accuracy.

Совокупность геномов организмов, присутствующих в кишечнике человека, содержит в себе важную информацию о представленности метаболических путей и функциональном потенциале. Выбранные биомаркеры на основе бактериальных и архейных таксонов позволяют получать следующую информацию о метаболических путях для данного субъекта:The totality of the genomes of organisms present in the human intestine contains important information about the representation of metabolic pathways and functional potential. Selected biomarkers based on bacterial and archaeal taxa allow the following information on metabolic pathways for this subject to be obtained:

1) Оценка достаточной представленности путей витаминогенеза. Известно, что ряд бактерий способны производить витамины группы В. Эти витамины преимущественно используются самой микробиотой кишечника, однако могут всасываться и через эпителий толстого кишечника человека, влияя на организм хозяина.1) Assessment of a sufficient representation of the pathogenesis. It is known that a number of bacteria are capable of producing B vitamins. These vitamins are mainly used by the intestinal microbiota itself, however, they can also be absorbed through the epithelium of the human large intestine, affecting the host organism.

2) Оценка достаточной представленности путей синтеза короткоцепочечных жирных кислот (КЖК). КЖК являются основными элементами, получаемыми от микробиоты кишечника.2) Evaluation of the sufficient representation of the synthesis of short chain fatty acids (FFA). FFAs are the main elements derived from the intestinal microbiota.

3) Оценка представленности биомаркеров ряда болезней, а именно, диабета второго типа, воспалительных заболеваний кишечника, атеросклероза, ожирения.3) Assessment of the representation of biomarkers of a number of diseases, namely, type 2 diabetes, inflammatory bowel diseases, atherosclerosis, and obesity.

4) Диетологические рекомендации с целью добавления в рацион продуктов, содержащих пищевые волокна, питающие недопредставленные таксоны.4) Dietary recommendations to add to the diet products containing dietary fiber that feed underrepresented taxa.

Для профилирования микробиоты определение уровня микроорганизмов, перечисленных в Таблице 1, производится с помощью проведения количественной ПЦР с использованием специфического зонда и пары праймеров. Предпочтительные варианты зондов перечислены в Таблице 2, а предпочтительные варианты праймеров перечислены в Таблице 3, при этом для каждого используемого зонда должна быть использована специфичная пара праймеров, способная гибридизоваться с той же последовательностью ДНК микроорганизмов, что и указанный зонд, или последовательностью, комплементарной указанной последовательности ДНК. В предпочтительном варианте изобретения для амплификации участков генома указанных микроорганизмов используются следующие пары праймеров, специфичные для каждого используемого зонда: (a) SEQ ID NO: 31-32 вместе с SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 33-34 вместе с SEQ ID NO: 2 для детекции Bacteroides spp.; (б) SEQ ID NO: 35-36 вместе с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 37-38 вместе с SEQ ID NO: 4 для детекции Prevotella spp.; (в) SEQ ID NO: 39-40 вместе с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 41-42 вместе с SEQ ID NO: 6 для детекции Bifidobacterium spp.; (г) SEQ ID NO: 43-44 вместе с SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 45-46 вместе с SEQ ID NO: 8 для детекции Enterobacteriaceae; (д) SEQ ID NO: 47-48 вместе с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 49-50 вместе с SEQ ID NO: 10 для детекции Akkermansia spp.; (e) SEQ ID NO: 51-52 вместе с SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 53-54 вместе с SEQ ID NO: 12 для детекции Methanobrevibacter spp.; (ж) SEQ ID NO: 55-56 вместе с SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 57-58 вместе с SEQ ID NO: 14 для детекции Streptococcus spp.; (з) SEQ ID NO: 59-60 вместе с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 61-62 вместе с SEQ ID NO: 16 для детекции Enterococcus spp.; (и) SEQ ID NO: 63-64 вместе с SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 65-66 вместе с SEQ ID NO: 18 для детекции Christensenellaceae; (к) SEQ ID NO: 67-68 вместе с SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 69-70 вместе с SEQ ID NO: 20 для детекции Lactobacillus spp.; (л) SEQ ID NO: 71-72 вместе с SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 73-74 вместе с SEQ ID NO: 22 для детекции Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (м) SEQ ID NO: 75-76 вместе с SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 77-78 вместе с SEQ ID NO: 24 для детекции Blautia spp; (н) SEQ ID NO: 79-80 вместе с SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 81-82 вместе с SEQ ID NO: 26 для детекции Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 83-84 вместе с SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 85-86 вместе с SEQ ID NO: 28 для детекции Clostridium cluster XIVa; (п) SEQ ID NO: 87-88 вместе с SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 89-90 вместе с SEQ ID NO: 30 для детекции общей (тотальной) прокариотической ДНК.To profile microbiota, the determination of the level of microorganisms listed in Table 1 is carried out by quantitative PCR using a specific probe and a pair of primers. Preferred probe variants are listed in Table 2, and preferred primer variants are listed in Table 3, with a specific pair of primers capable of hybridizing with the same DNA sequence of microorganisms as the specified probe or a sequence complementary to the indicated sequence for each probe used. DNA In a preferred embodiment of the invention, the following primer pairs specific for each probe used are used to amplify the genome regions of these microorganisms: (a) SEQ ID NO: 31-32 together with SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 33-34 together with SEQ ID NO: 2 for the detection of Bacteroides spp .; (b) SEQ ID NO: 35-36 together with SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 37-38 together with SEQ ID NO: 4 for the detection of Prevotella spp .; (c) SEQ ID NO: 39-40 together with SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 41-42 together with SEQ ID NO: 6 for the detection of Bifidobacterium spp .; (d) SEQ ID NO: 43-44 together with SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 45-46 together with SEQ ID NO: 8 for the detection of Enterobacteriaceae; (e) SEQ ID NO: 47-48 together with SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 49-50 together with SEQ ID NO: 10 for the detection of Akkermansia spp .; (e) SEQ ID NO: 51-52 together with SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 53-54 together with SEQ ID NO: 12 for the detection of Methanobrevibacter spp .; (g) SEQ ID NO: 55-56 together with SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 57-58 together with SEQ ID NO: 14 for the detection of Streptococcus spp .; (h) SEQ ID NO: 59-60 together with SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 61-62 together with SEQ ID NO: 16 for the detection of Enterococcus spp .; (i) SEQ ID NO: 63-64 together with SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 65-66 together with SEQ ID NO: 18 for the detection of Christensenellaceae; (k) SEQ ID NO: 67-68 together with SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 69-70 together with SEQ ID NO: 20 for the detection of Lactobacillus spp .; (k) SEQ ID NO: 71-72 together with SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 73-74 together with SEQ ID NO: 22 for the detection of Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (m) SEQ ID NO: 75-76 together with SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 77-78 together with SEQ ID NO: 24 for the detection of Blautia spp; (n) SEQ ID NO: 79-80 together with SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 81-82 together with SEQ ID NO: 26 for the detection of Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 83-84 together with SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 85-86 together with SEQ ID NO: 28 for the detection of Clostridium cluster XIVa; (o) SEQ ID NO: 87-88 together with SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 89-90 together with SEQ ID NO: 30 to detect total (total) prokaryotic DNA.

Нормирование на общую прокариотическую ДНК может быть произведено по различным алгоритмам. В предпочтительном варианте изобретения нормирование на общую прокариотическую ДНК производилось согласно формуле: Х=100%*(2^-c/2^-m),Normalization to total prokaryotic DNA can be performed using various algorithms. In a preferred embodiment of the invention, normalization to total prokaryotic DNA was carried out according to the formula: X = 100% * (2- ^c / 2 ^-m ),

где X - относительная представленность биомаркера,where X is the relative representation of the biomarker,

с - количество циклов амплификации ДНК данного биомаркера в процессе ПЦР в реальном времени,c is the number of DNA amplification cycles of a given biomarker in real-time PCR,

m - количество циклов амплификации ДНК тотальной прокариотической ДНК в процессе ПЦР в реальном времени.m is the number of DNA amplification cycles of total prokaryotic DNA in real-time PCR.

Также изобретение предоставляет и раскрывает любые комбинации различных индивидуальных вариации для каждого компонента из набора для профилирования микробиоты. Подобные вариации, например, включают олигонуклеотиды, способные гибридизоваться с последовательностями из таблицы 2, а также олигонуклеотиды из таблицы 2, или способные с ними гибридизоваться, содержащие одну или две нуклеотидные замены, не ухудшающие их функциональность. Также, олигонуклеотиды из таблицы 2, или способные с ними гибридизоваться, могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных нуклеотидов на 5'-конце, если такая добавка не ухудшает их функциональность. Для среднего специалиста понятно, что подобные вариации компонента также могут быть использованы в описываемом наборе для профилирования микробиоты.The invention also provides and discloses any combination of different individual variations for each component of the microbiota profiling kit. Such variations, for example, include oligonucleotides capable of hybridizing with the sequences of Table 2, as well as oligonucleotides of table 2, or capable of hybridizing with them, containing one or two nucleotide substitutions that do not impair their functionality. Also, the oligonucleotides from table 2, or capable of hybridizing with them, may additionally contain one or more additional nucleotides at the 5'-end, if such an addition does not impair their functionality. It will be appreciated by one of ordinary skill in the art that similar component variations can also be used in the described microbiota profiling kit.

Комплект зондов может включать более одной копии каждого типа выбранного олигонуклеотидного зонда.A probe set may include more than one copy of each type of selected oligonucleotide probe.

Предпочтительно дополнительные олигонуклеотидные зонды позволяют получать информацию о составе микробиоты кишечника, которую предоставляет комплект зондов.Preferably, additional oligonucleotide probes provide information on the composition of the intestinal microbiota provided by the set of probes.

Это могут быть дополнительные зонды, которые предоставляют достоверные сведения о микробиоте кишечника или предоставляют информацию, которая может использоваться в качестве контроля для одного или нескольких других зондов в комплекте зондов, или предоставляют стандартную информацию, которая может позволять количественно оценивать данные, полученные от одного или нескольких других зондов в комплекте зондов. Дополнительные зонды могут быть подобраны на те же самые или другие бактерии, что и один или несколько зондов из комплекта зондов, описанных выше.These can be additional probes that provide reliable information about the intestinal microbiota or provide information that can be used as a control for one or more other probes in the set of probes, or provide standard information that can quantify the data received from one or more other probes in the set of probes. Additional probes can be matched to the same or different bacteria as one or more of the probes from the probe kit described above.

Изобретение также относится к олигонуклеотидному зонду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из Таблицы 2. Применение таких зондов в композициях по изобретению и их получение, и применение таких зондов в способах по изобретению представляют собой дополнительные аспекты изобретения. Изобретение также относится к праймеру, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из Таблицы 3. Применение таких зондов в композициях по изобретению и их получение, и применение таких зондов в способах по изобретению представляют собой дополнительные аспекты изобретения.The invention also relates to an oligonucleotide probe containing a nucleotide sequence selected from Table 2. The use of such probes in the compositions of the invention and their preparation, and the use of such probes in the methods of the invention are additional aspects of the invention. The invention also relates to a primer containing a nucleotide sequence selected from Table 3. The use of such probes in the compositions of the invention and their preparation, and the use of such probes in the methods of the invention are additional aspects of the invention.

Данное изобретение позволяет восстановить профиль микробиоты кишечника человека по наиболее представленным бактериальным и архейным таксонам, а также по таксонам, для которых известны ассоциации с заболеваниями человека, в том числе (но не будучи ограниченными перечисленными): диабет второго типа, ожирение, атеросклероз, воспалительные заболевания кишечника (в том числе болезнь Крона и неспецифический язвенный колит).This invention allows to restore the profile of the microbiota of the human intestine by the most represented bacterial and archaeal taxa, as well as by taxa for which associations with human diseases are known, including (but not limited to the following): type 2 diabetes, obesity, atherosclerosis, inflammatory diseases intestines (including Crohn's disease and ulcerative colitis).

Таким образом, в другом своем аспекте данное изобретение относится к профилированию микробиоты. Для этого используется ПЦР в режиме реального времени с использованием следующих олигонуклеотидных зондов, предпочтительно, из числа указанных в таблице 2, и, возможно, из числа указанных в таблице 4. Для проведения ПЦР в режиме реального времени предпочтительно использовать праймеры, указанные в таблице 3, и, возможно, указанные в таблице 5.Thus, in another aspect, the invention relates to microbiota profiling. For this, real-time PCR is used using the following oligonucleotide probes, preferably from those listed in table 2, and possibly from those listed in table 4. For real-time PCR, it is preferable to use the primers listed in table 3, and possibly listed in table 5.

Данный тест профилирования микробиоты может быть проведен на образцах кала человека, с использованием метода ПЦР в реальном времени. Метод ПЦР включает в себя три этапа: выделение ДНК из образца; амплификацию последовательности ДНК; анализ полученных результатов.This microbiota profiling test can be performed on human stool samples using real-time PCR. The PCR method includes three stages: DNA extraction from the sample; amplification of the DNA sequence; analysis of the results.

Накопление продуктов амплификации ДНК детектируют в режиме реального времени при помощи олигонуклеотидной пробы типа TaqMan, комплементарной центральной части амплифицируемого фрагмента транскрипта. В одном из вариантов осуществления изобретения используется зонд длиной 20-30 нуклеотидов, который несет на 5'-конце флуорофор (FAM, R6G или ROX) и на 3'-конце нефлуоресцентный тушитель (DABCYL, BHQ, FTQ или другие). При этом, олигонуклеотидные зонды в комплекте могут содержать как одинаковые, так и разные пары флуорофор-тушитель, а для одного и того же флуорофора возможно использование различных тушителей. На каждом цикле амплификации гибридизованная проба гидролизуется со стороны 5'-конца, при этом флуорофор пространственно разобщается с тушителем и, как следствие, увеличивается флуоресценция реакционной смеси. Определение количества кДНК выполняют при помощи уравнения калибровочной кривой с учетом эффективности каждой реакции амплификации. Для построения калибровочной кривой одновременно с анализируемыми образцами амплифицируют стандартные образцы ДНК с известной последовательностью, уменьшающейся в три раза концентрацией ДНК. Калибровочную кривую строят в зависимости от значений Ct и Log количества ДНК в стандартном образце. В соответствии с полученным графиком калибровочной кривой при помощи регрессионного анализа определяют коэффициенты линейного уравнения калибровочной кривой. ПЦР в реальном времени проводят на специализированных планшетах с лунками. В оптимальном варианте описываемой системы детекции в каждой лунке содержится по два олигонуклеотидных зонда из Таблицы 2, и по две пары праймеров, выбранных из Таблицы 3, для идентификации соответствующего биомаркера, перечисленного в Таблице 1. Также 2 лунки используются для контрольных измерений: определения тотальной прокариотической ДНК по концентрации кДНК гена 16S рРНК и определения количества ДНК человека. Таким образом, для анализа одного образца необходимо 16 лунок из 96. Одним экспресс-тестом из предлагаемого изобретения можно проанализировать до 6 образцов микробиоты кишечника человека.The accumulation of DNA amplification products is detected in real time using an oligonucleotide sample of the TaqMan type, complementary to the central part of the amplified fragment of the transcript. In one embodiment, a probe of 20-30 nucleotides in length is used that carries a fluorophore (FAM, R6G or ROX) and a non-fluorescence quencher (DABCYL, BHQ, FTQ or others) at the 5'-end. Moreover, the oligonucleotide probes in the kit can contain both the same and different pairs of the fluorophore quencher, and different quenchers can be used for the same fluorophore. At each amplification cycle, the hybridized sample is hydrolyzed from the 5'-end, while the fluorophore is spatially separated from the quencher and, as a result, the fluorescence of the reaction mixture increases. The determination of the amount of cDNA is performed using the equation of the calibration curve, taking into account the effectiveness of each amplification reaction. To construct a calibration curve, standard DNA samples are amplified simultaneously with the analyzed samples with a known sequence that is reduced by three times the concentration of DNA. A calibration curve is constructed depending on the Ct and Log values of the amount of DNA in the standard sample. In accordance with the obtained graph of the calibration curve using regression analysis to determine the coefficients of the linear equation of the calibration curve. Real-time PCR is performed on specialized well plates. In the optimal version of the detection system described, each well contains two oligonucleotide probes from Table 2, and two pairs of primers selected from Table 3 to identify the corresponding biomarker, listed in Table 1. Also, 2 wells are used for control measurements: determination of total prokaryotic DNA by cDNA concentration of the 16S rRNA gene and determining the amount of human DNA. Thus, for the analysis of one sample, 16 out of 96 wells are required. One rapid test from the present invention can analyze up to 6 samples of the human intestinal microbiota.

Предлагаемый набор также может содержать инструкцию по применению этого набора, описание всех его составных частей, руководство по интерпретации результатов.The proposed set may also contain instructions for the use of this set, a description of all its constituent parts, guidance on the interpretation of the results.

Для выявления оптимальных последовательностей зондов и праймеров, способных эффективно и специфично детектировать определенные роды микроорганизмов, авторами был разработан следующий алгоритм:To identify the optimal sequences of probes and primers capable of efficiently and specifically detecting certain types of microorganisms, the authors developed the following algorithm:

1) Из базы данных HITdb v1.00, содержащей репрезентативную выборку из 2473 последовательностей 16S рРНК представителей микробиоты кишечника человека, извлекались последовательности, принадлежащие определенному таксону. Далее проводилось множественное выравнивание отобранных последовательностей с помощью онлайн-сервиса Aligner из набора программ, предоставляемого RDP (http://rdp.cme.msu.edu/). Алгоритм выравнивания, использующийся в Aligner, учитывает особенности вторичной структуры 16S рРНК бактерий.1) From the HITdb v1.00 database, which contains a representative sample of 2473 sequences of 16S rRNA from representatives of the human intestinal microbiota, sequences belonging to a particular taxon were extracted. Next, multiple alignment of the selected sequences was carried out using the Aligner online service from the set of programs provided by RDP (http://rdp.cme.msu.edu/). The alignment algorithm used in Aligner takes into account the secondary structure of bacteria 16S rRNA.

2) Полученное выравнивание использовали для поиска таксон-специфичных мотивов. Для этого, на первом шаге, выравнивание разбивалось на мотивы длиной 20 п. н., из них отбирались такие мотивы, которые обладали высокой консервативностью среди данного таксона (с коэффициентом соответствия каждой позиции в мотиве консенсусной последовательности не менее 90% и с максимальным допустимым числом вырожденных позиций - 2). На втором шаге, отобранные мотивы проверялись на таксон-специфичность путем их выравнивания с помощью BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cqi) против базы данных HITdb v1.00, из которой были исключены последовательности, соответствующие проверяемому таксону.2) The resulting alignment was used to search for taxon-specific motifs. For this, at the first step, alignment was divided into 20 bp motifs, from which motifs that were highly conservative among this taxon (with a matching coefficient of each position in the motive of the consensus sequence of at least 90% and with a maximum allowable number were selected) degenerate positions - 2). In the second step, the selected motifs were checked for taxon specificity by aligning them using BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cqi) against the HITdb v1.00 database, from which sequences were excluded, corresponding to the taxon being checked.

Таксон-специфичными мотивами считали такие мотивы, которые выравнивались со 100% идентичностью и покрытием не более, чем на 1% последовательностей из базы данных. Если таких мотивов не удавалось обнаружить, тогда мотивы, отстоящие друг от друга на расстоянии от 50 до 300 п.н., объединялись попарно и отбирались такие пары мотивов, которые одновременно выравнивались не более чем на 1-2% одних и тех же последовательностей из базы данных.Taxon-specific motifs were considered such motifs that aligned with 100% identity and coverage of no more than 1% of sequences from the database. If such motifs could not be detected, then motifs spaced from each other at a distance of 50 to 300 bp were paired and pairs of motifs were selected that were simultaneously aligned by no more than 1-2% of the same sequences from Database.

3) Далее таксон-специфичные мотивы анализировались в программе Vector NTI (Life Technologies) на соответствие параметрам, требуемых для праймирования данных участков: температура плавления (Тm) праймера - 58-62°С и ДНК-зонда - 65-75°С, GC-состав - 40-65%, отсутствие шпилек со значениями ΔG ниже - 3 kcal/mol и выше 2 kcal/mol и димеров со значениями ΔG ниже - 5 kcal/mol.3) Next, taxon-specific motifs were analyzed in the Vector NTI program (Life Technologies) for compliance with the parameters required for priming these sites: the melting temperature (Tm) of the primer is 58-62 ° C and the DNA probe is 65-75 ° C, GC - composition - 40-65%, the absence of hairpins with ΔG values below - 3 kcal / mol and above 2 kcal / mol and dimers with ΔG values below - 5 kcal / mol.

Все этапы анализа, кроме выравнивания с помощью Aligner и анализа в Vector NTI, были автоматизированы с помощью скриптов, написанных на языке программирования Python.All stages of the analysis, except for alignment using Aligner and analysis in Vector NTI, were automated using scripts written in the Python programming language.

Полученные с помощью этого алгоритма зонды и праймеры представлены в Таблицах 2-5.The probes and primers obtained using this algorithm are presented in Tables 2-5.

Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples are provided in order to disclose the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention.

Пример 1. Выделение ДНК из замороженного образца кала.Example 1. Isolation of DNA from a frozen stool sample.

Для осуществления изобретения выделение ДНК из образцов кала может быть произведено с помощью стандартных методов, стандартных методов, например таких, как описанный ниже. Данный метод относится к средствам для выделения нуклеиновой кислоты из образца кала.To carry out the invention, the isolation of DNA from stool samples can be carried out using standard methods, standard methods, such as those described below. This method relates to means for isolating a nucleic acid from a stool sample.

Вкратце, 150-200 мг замороженного кала помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой, добавляют смесь микрошариков и 1 мл нагретого до 60°С лизисного буфера (500 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 50 мМ EDTA, 4% SDS). Образец гомогенизируют с помощью устройства MiniLys (Bertin corp.) на максимальной скорости в течение 3 мин. Затем полученный лизат инкубируют 15 мин при 70°С, центрифугируют 20 мин при 14000 об/мин, аккуратно отбирают 1 мл супернатанта в стерильную пробирку, не захватывая осадок, и ставят в лед. К осадку повторно добавляют 1 мл лизисного буфера и процедуру повторяют 2-6 раз. Полученные супернатанты объединяют и переносят в 15 мл пробирки для осаждения, содержащие 4 мл 96% этанола и 200 мкл 3М ацетата натрия. Для эффективного осаждения ДНК пробирки инкубируют при -20°С по меньшей мере 1 час. Тотальную ДНК осаждают при помощи центрифугирования при 14000 g в течение 15 мин при +4°С, осадок промывают 80% EtOH и опять осаждают центрифугированием, процедуру повторяют 2 раза. После этого осадок высушивают при комнатной температуре примерно 30-60 мин. Далее осадок растворяют в 200 мкл стерильной milliQ воды; раствор центрифугируют и переносят в новую стерильную пробирку. Далее проводят дополнительную очистку хлороформом путем смешивания и центрифугирования, отбирают водную фазу, содержащую ДНК, и обрабатывают ее раствором РНКазы А (5 мг/мл) в течение 1 часа при 37°С. Полученная таким способом ДНК является достаточно чистой для проведения последующих реакций ПЦР.Briefly, 150-200 mg of frozen feces is placed in a screw cap tube, a mixture of beads and 1 ml of lysis buffer heated to 60 ° C are added (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 4% SDS) . The sample is homogenized using a MiniLys device (Bertin corp.) At maximum speed for 3 minutes. Then the resulting lysate is incubated for 15 min at 70 ° C, centrifuged for 20 min at 14000 rpm, gently select 1 ml of the supernatant in a sterile tube, without capturing the sediment, and put in ice. 1 ml of lysis buffer is re-added to the pellet and the procedure is repeated 2-6 times. The resulting supernatants are combined and transferred into 15 ml precipitation tubes containing 4 ml of 96% ethanol and 200 μl of 3M sodium acetate. To efficiently precipitate DNA, the tubes are incubated at -20 ° C for at least 1 hour. Total DNA is precipitated by centrifugation at 14000 g for 15 min at + 4 ° C, the precipitate is washed with 80% EtOH and again precipitated by centrifugation, the procedure is repeated 2 times. After that, the precipitate is dried at room temperature for about 30-60 minutes. The pellet is then dissolved in 200 μl of sterile milliQ water; the solution is centrifuged and transferred to a new sterile tube. Next, additional purification with chloroform is carried out by mixing and centrifugation, the aqueous phase containing DNA is selected and treated with a solution of RNase A (5 mg / ml) for 1 hour at 37 ° C. The DNA obtained in this way is pure enough for subsequent PCR reactions.

Для выделения ДНК из кала человека можно также использовать коммерческие наборы реагентов для получения препаратов очищенной ДНК, основанные на ее селективной сорбции на поверхности силикогеля из растворов с хаотропными агентами (например, «QIAamp DNA stool kit» (QIAgen), «ДНК-сорб-В», «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» и другие).To isolate DNA from human feces, you can also use commercial reagent kits to obtain purified DNA preparations based on its selective sorption on the surface of the silica gel from solutions with chaotropic agents (for example, QIAamp DNA stool kit (QIAgen), DNA sorb-B ”,“ TEST-GS-GENETICS ”and others).

Пример 2. Скрининг специфичности и эффективности олигонуклеотидных последовательностей в реакциях количественной ПЦР qPCR.Example 2. Screening of the specificity and effectiveness of oligonucleotide sequences in qPCR quantitative PCR reactions.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первичный скрининг специфичности и эффективности выбранных последовательностей олигонуклеотидных праймеров для qPCR оценивали в амплификации с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I с последующим анализом полученных кривых плавления и электрофорезом в акриламидном геле для подтверждения специфичности.In some embodiments, initial screening of the specificity and effectiveness of the selected qPCR oligonucleotide primer sequences was evaluated by amplification using the SYBR Green I intercalating stain, followed by analysis of the obtained melting curves and acrylamide gel electrophoresis to confirm specificity.

Эффективность полимеразной цепной реакции (ПЦР) были определена при помощи калибровочных кривых, полученных путем амплификации последовательных разбавлений ДНК-матрицы в 10 раз. В качестве матрицы служили ДНК, выделенные из человеческих фекалий, либо ДНК, выделенные из клеточных культур. Эффективность оценивалась как для амплификации с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I (система без флуоресцентно-меченого зонда), так и для амплификации с гидролизующимся флюоресцентно меченным зондом.The effectiveness of the polymerase chain reaction (PCR) was determined using calibration curves obtained by amplifying successive dilutions of the DNA template 10 times. As the matrix, DNA isolated from human feces or DNA isolated from cell cultures served. Efficiency was evaluated both for amplification using the SYBR Green I intercalating dye (a system without a fluorescently-labeled probe) and for amplification with a hydrolyzed fluorescently labeled probe.

В первом случае условия ПЦР были следующими:In the first case, the PCR conditions were as follows:

ПЦР проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 65 мМ Трис-HCl (рН 8.9), 16 мМ (NH₄)₂SO₄, 3.0 мМ MgCl₂, 0.05% Tween20, 0.2 мМ раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0.3 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, SYBR Green I (разведение 1:25000), 1 ед. акт.Hot-start Taq-ДНК-полимеразы. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе CFX96 (BioRad, США).PCR was performed in a final volume of 20 μl containing 65 mM Tris-HCl (pH 8.9), 16 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 3.0 mM MgCl ₂ , 0.05% Tween20, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate solution, 0.3 μM oligonucleotide primer solutions, SYBR Green I (dilution 1: 25000), 1 unit Act. Hot-start Taq DNA polymerase. PCR was performed on a CFX96 DNA amplifier (BioRad, USA).

Протокол ПЦР для ДНК-амплификатора CFX96:PCR Protocol for CFX96 DNA Amplifier:

1 96.0 С for 15:001 96.0 S for 15:00

2 96.0 С for 0:052 96.0 C for 0:05

3 60.0 С for 0:053 60.0 C for 0:05

4 72.0 С for 0:054 72.0 C for 0:05

5 75.0 С for 0:105 75.0 C for 0:10

+Plate Read+ Plate Read

6 GOTO 2, 45 more times6 GOTO 2, 45 more times

7 Melt Curve 70.0 to 95.0 C, increment 0.5 C,7 Melt Curve 70.0 to 95.0 C, increment 0.5 C,

0:10 + Plate Read0:10 + Plate Read

Данный метод относится к средствам для проведения амплификации и/или реакции удлинения праимера для одного или нескольких олигонуклеотидов из комплекта зондов.This method relates to means for amplifying and / or extending a primer for one or more oligonucleotides from a set of probes.

8 случае построения калибровочных кривых с использованием зонда условия были такими:In the case of constructing calibration curves using a probe, the conditions were as follows:

ПЦР проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 65 мМ Трис-HCl (рН 8.9), 24 мМ (NH₄)₂SO₄, 3.0 мМ MgCl₂, 0.05% Tween20, 0.2 мМ раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0.3 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 0.1 мкМ растворы зондов, 1 ед. акт. Hot-start Taq-ДНК-полимеразы. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе CFX96 (BioRad, США). Протокол ПЦР для ДНК-амплификатора CFX96:PCR was performed in a final volume of 20 μl containing 65 mM Tris-HCl (pH 8.9), 24 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 3.0 mM MgCl ₂ , 0.05% Tween20, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate solution, 0.3 μM oligonucleotide primer solutions, 0.1 μm probe solutions, 1 unit Act. Hot-start Taq DNA polymerase. PCR was performed on a CFX96 DNA amplifier (BioRad, USA). PCR Protocol for CFX96 DNA Amplifier:

1 96.0 С for 15:001 96.0 S for 15:00

2 96.0 С for 0:082 96.0 C for 0:08

3 60.0 С for 0:403 60.0 C for 0:40

+Plate Read+ Plate Read

4 GOTO 2, 45 more times4 GOTO 2, 45 more times

Эффективность реакции определяли для диапазона концентраций, в котором было возможно получить калибровочные кривые с ожидаемым шагом и хорошим коэффициентом корреляции между повторами.The reaction efficiency was determined for a concentration range in which it was possible to obtain calibration curves with the expected step and a good correlation coefficient between repetitions.

Далее приведены репрезентативные примеры, демонстрирующие осуществление некоторых вариантов изобретения, а именно результаты амплификации ПЦР с использованием разработанных праймеров и зондов, в двух вариантах: с использованием красителя SybrGreen (без зонда) и с парой флурофор-тушитель (HEX и BHQ соответственно) на зонде. В качестве результата представлены графики качества ПЦР и степени амплификации за цикл (см. Фиг. 1-48). В Таблице 6 показаны номера Фигур и используемые зонды и праймеры для детекции определенных биомаркеров. На Фиг. 1-48 изображены по два графика: сверху изображена зависимость достижения порогового значения числа циклов при проведении ПЦР для нескольких разбавлений одного образца и совпадение этих величин с предсказанными, снизу - график зависимости значений относительных флуоресцентных единиц (сила сигнала ПЦР) от числа пройденных циклов ПЦР, для этих же самых разбавлений. Данный вид валидации был призван доказать сохранение линейности результата при исследовании разработанными ПЦР системами различных разбавлений, что было успешно подтверждено. Перечисленные в Таблице 6 зонды и праймеры для детекции общей прокариотической ДНК связываются с большинством прокариотических микроорганизмов, присутствующих в ЖКТ субъекта.The following are representative examples demonstrating the implementation of some variants of the invention, namely, the results of PCR amplification using the developed primers and probes, in two versions: using SybrGreen dye (without probe) and with a pair of fluorophore quencher (HEX and BHQ, respectively) on the probe. As a result, plots of PCR quality and amplification degree per cycle are presented (see Fig. 1-48). Table 6 shows the numbers of the Figures and the probes and primers used to detect specific biomarkers. In FIG. Figures 1-48 show two graphs: the top shows the dependence of reaching the threshold value of the number of cycles during PCR for several dilutions of one sample and the coincidence of these values with the predicted ones, below is a graph of the relative fluorescence units (signal strength of PCR) versus the number of PCR cycles passed, for the same dilutions. This type of validation was intended to prove the preservation of the linearity of the result in the study of various dilution systems developed by PCR, which was successfully confirmed. The probes and primers listed in Table 6 for detection of total prokaryotic DNA bind to most prokaryotic microorganisms present in the gastrointestinal tract of the subject.

Таким образом, по результатам валидации, для всех выбранных мишеней удалось разработать и экспериментально протестировать пару праймеров и флуоресцентно меченный гибридизационный зонд, с помощью которых можно осуществлять qPCR с приемлемой эффективностью (80-105%). Разработанные qPCR системы обладают динамическим диапазоном измерений не менее 4 порядков, который может быть увеличен при дальнейшей оптимизации и валидации.Thus, according to the results of validation, for all selected targets, it was possible to develop and experimentally test a pair of primers and a fluorescently labeled hybridization probe with which qPCR can be performed with acceptable efficiency (80-105%). The qPCR systems developed have a dynamic measurement range of at least 4 orders of magnitude, which can be increased with further optimization and validation.

Построенные калибровочные кривые имеют коэффициент детерминации r² не хуже 0.98, что говорит об их высоком потенциале для проведения с их помощью количественных измерений.The constructed calibration curves have a determination coefficient r ^{2 of} no worse than 0.98, which indicates their high potential for conducting quantitative measurements with their help.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be understood that various modifications are possible without departing from the gist of the present invention.

Claims

1. A kit for determining the level of representation of microorganisms in a sample taken from the gastrointestinal tract (GIT) of a subject, including

a set of oligonucleotide probes having:

a) oligonucleotide sequences, each of which is capable of specifically hybridizing with a portion of the genome of microorganisms having a sequence unique to only one taxon, and the microorganisms are selected from the following group of 14 bacterial and archaeal taxa: Lactobacillus spp .; Bifidobacterium spp .; Bacteroides spp .; Prevotella spp .; Enterobacteriaceae; Akkermansia spp .; Clostridium cluster XIVa, consisting of the genera Roseburia spp., Dorea spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Anaerostipes spp., Butyrivibrio spp., Coprococcus spp., Lachnospira spp., Ruminococcus spp., Collins; Clostridium cluster IV, consisting of the genera Subdoligranulum spp., Faecalibacterium spp., Anaerotruncus spp .; Christensenellaceae; Enterococcus spp .; Streptococcus spp .; Methanobrevibacter spp .; Ruminococcus spp., Belonging to the family Lachnospiraceae; Blautia spp., And

b) oligonucleotide sequences, each of which is capable of specifically hybridizing with a portion of the genome having a sequence common to all prokaryotic microorganisms present in the gastrointestinal tract of a subject,

wherein said set of oligonucleotide probes contains at least one sequence selected from SEQ ID NO: 1-30 or SEQ ID NO: 91-96, or from a group of at least 95% identical to one of these sequences;

and

a set of primers suitable for use in amplification of the genome regions of these microorganisms under conditions of quantitative PCR, and for each probe used a specific pair of primers is included in the set of primers, capable of hybridizing with the same DNA sequence of microorganisms as the specified probe, or a sequence complementary to the specified DNA sequences, wherein said primers contain at least one sequence selected from SEQ ID NO: 31-90 or SEQ ID NO: 97-108, or from the group at least 95% identical to one of these sequences.

2. The kit of claim 1, wherein the genome regions that are involved in hybridization with these probes encode the 16S rRNA gene.

3. The kit according to claim 1, wherein said oligonucleotide probes contain a fluorophore selected from the list of FAM, R6G and ROX, attached at the 5'-end or 3'-end of the probe sequence using a covalent bond, and contain a non-fluorescence quencher selected from the list of DABCYL, BHQ and Eclipse attached at the opposite end of the indicated fluorophore sequence of the specified probe using a covalent bond.

4. Set according to any one of paragraphs. 1-3, characterized in that it further comprises at least one of the following:

(a) means for conducting amplification and / or primer extension reactions for one or more oligonucleotide probes;

(b) means for isolating a nucleic acid from a stool sample.

5. A method for determining the level of representation of microorganisms in a sample taken from the gastrointestinal tract of a subject, using the kit according to claim 1, comprising the following stages:

(i) isolation of the genomic DNA of microorganisms from said sample;

(ii) amplification of certain sections of the genome of microorganisms under quantitative PCR using isolated genomic DNA from (i), a set of oligonucleotide probes having:

and

a set of primers suitable for use in the amplification of genome regions of these microorganisms under conditions of quantitative PCR, and for each probe used a specific pair of primers is included in the set of primers, capable of hybridizing with the same DNA sequence of microorganisms as the specified probe, or a sequence complementary to the specified DNA sequences, wherein said primers contain at least one sequence selected from SEQ ID NO: 31-90 or SEQ ID NO: 97-108, or from groups identical to one of these sequences at least 95%;

(iii) determining the level of representation of microorganisms from these taxa by normalizing the total amount of prokaryotic DNA in the specified sample.

6. The method according to p. 5, in which sections of the genome that are involved in hybridization with these probes encode the 16S rRNA gene.

7. The method of claim 5, wherein the following oligonucleotide probes are used to amplify genome regions of these microorganisms:

(a) SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the detection of Bacteroides spp .; (b) SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for the detection of Prevotella spp .; (c) SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the detection of Bifidobacterium spp .; (d) SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for the detection of Enterobacteriaceae; (e) SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for the detection of Akkermansia spp .; (e) SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for the detection of Methanobrevibacter spp .; (g) SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for the detection of Streptococcus spp .; (h) SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for the detection of Enterococcus spp .; (i) SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for the detection of Christensenellaceae; (k) SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for the detection of Lactobacillus spp .; (k) SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for the detection of Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (m) SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for detection of Blautia spp; (n) SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for the detection of Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 for the detection of Clostridium cluster XIVa; (o) SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 for the detection of total prokaryotic DNA.

8. The method according to p. 7, in which the following pairs of primers specific to each probe used are used to amplify the genome regions of these microorganisms:

(a) SEQ ID NO: 31-32 together with SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 33-34 together with SEQ ID NO: 2 for the detection of Bacteroides spp .; (6) SEQ ID NO: 35-36 together with SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 37-38 together with SEQ ID NO: 4 for the detection of Prevotella spp .; (c) SEQ ID NO: 39-40 together with SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 41-42 together with SEQ ID NO: 6 for the detection of Bifidobacterium spp .; (d) SEQ ID NO: 43-44 together with SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 45-46 together with SEQ ID NO: 8 for the detection of Enterobacteriaceae; (e) SEQ ID NO: 47-48 together with SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 49-50 together with SEQ ID NO: 10 for the detection of Akkermansia spp .; (e) SEQ ID NO: 51-52 together with SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 53-54 together with SEQ ID NO: 12 for the detection of Methanobrevibacter spp .; (g) SEQ ID NO: 55-56 together with SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 57-58 together with SEQ ID NO: 14 for the detection of Streptococcus spp .; (h) SEQ ID NO: 59-60 together with SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 61-62 together with SEQ ID NO: 16 for the detection of Enterococcus spp .; (i) SEQ ID NO: 63-64 together with SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 65-66 together with SEQ ID NO: 18 for the detection of Christensenellaceae; (k) SEQ ID NO: 67-68 together with SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 69-70 together with SEQ ID NO: 20 for the detection of Lactobacillus spp .; (k) SEQ ID NO: 71-72 together with SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 73-74 together with SEQ ID NO: 22 for the detection of Ruminococcus spp. [Lachnospiraceae family]; (m) SEQ ID NO: 75-76 together with SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 77-78 together with SEQ ID NO: 24 for the detection of Blautia spp; (n) SEQ ID NO: 79-80 together with SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 81-82 together with SEQ ID NO: 26 for the detection of Clostridium cluster IV; (o) SEQ ID NO: 83-84 together with SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 85-86 together with SEQ ID NO: 28 for the detection of Clostridium cluster XIVa; (o) SEQ ID NO: 87-88 together with SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 89-90 together with SEQ ID NO: 30 to detect total prokaryotic DNA.