RU2679846C1 - Олигонуклеотидные ДНК праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы - Google Patents
Олигонуклеотидные ДНК праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679846C1 RU2679846C1 RU2017143441A RU2017143441A RU2679846C1 RU 2679846 C1 RU2679846 C1 RU 2679846C1 RU 2017143441 A RU2017143441 A RU 2017143441A RU 2017143441 A RU2017143441 A RU 2017143441A RU 2679846 C1 RU2679846 C1 RU 2679846C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- synthesis
- phylogenetic analysis
- gene
- glycoprotein
- dna
- Prior art date
Links
- 101800001467 Envelope glycoprotein E2 Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 13
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 title description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title description 7
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims abstract 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 2
- 238000010629 Molecular evolutionary genetics analysis Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложены олигонуклеотидные ДНК-праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы, отличающиеся тем, что две пары олигонуклеотидных ДНК-праймеров имеют следующие последовательности: внешние (1 fwd: 5'TCCAACGCACCCAAAACCCT3'; 1 rev: 5'GCTTTAGTCCCTGTTCCGAC3'), внутренние (2 fwd: 5'TCCTGCCTATCTACTCCGCA3'; 2 rev: 5'ATGCATGGGGTGAGTCCAGT3'). Изобретение может быть использовано диагностическими ветеринарными лабораториями, научно-исследовательскими учреждениями, биотехнологическими компаниями. Техническим результатом предполагаемого изобретения является синтез целевого фрагмента ДНК, кодирующиго фрагмент поверхностного гликопротеина gp70 вируса лейкоза кошек, который может быть использован для проведения филогенетического анализа и синтеза вирусного антигена. 1 ил., 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано для выявления провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, для филогенетического анализа данного вируса, а также для биотехнологического синтеза продукта гена gp70, содержащего иммуногенные эпитопы вируса. Изобретение может быть использовано диагностическими ветеринарными лабораториями, научно-исследовательскими учреждениями, занимающимися эпизоотологией, биотехнологическими компаниями, занимающимися производством рекомбинантных ветеринарных вакцин для мелких домашних животных.
Вирус лейкоза кошек (ВЛК) относится к группе ретровирусов, которые широко распространены среди людей и животных, вызывая тяжелые заболевания и приводя к смерти. Жизненный цикл ретровирусов следующий: сначала РНК-содержащая форма вируса проникает в цитоплазму, где за счет ресурсов клетки хозяина, при помощи обратной транскрипции создает свою комплементарную ДНК-содержащую форму (провирус). В структуре вируса различают белки, связанные с сердцевиной (p10, p12, p15 и p27), и 2 оболочечных белка - гликозилированный 70 кД (gp70) и не гликозилированный 15кД(р15).
Вирусный лейкоз является неизлечимым заболеванием. Профилактика заключается в вакцинации и своевременном выявлении и изоляции животных-носителей. Для своевременного выявления больных животных необходимо проводить скрининговые обследования кошек на присутствие провирусной ДНК. Применение в этих целях полимеразной цепной реакции (ПЦР) является распространенным подходом, зарекомендовавшим себя во всем мире. Целевой фрагмент (мишень) ДНК ограничен двумя олигонуклеотидами (праймерами), которые используют в ПЦР для синтеза множества копий целевого фрагмента. В рамках этого подхода не так важно, какой именно фрагмент генома выбран в качестве мишени.
За прототип взяты синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления ДНК провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа и имеющих следующие последовательности: 5'TGTCTGATGTCTGGAGCC-3', 3'TTTGGCCCATGACGGCTT-5' (патент РФ 2317329 «Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления днк провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа, и условия полимеразной цепной реакции с их использованием».)
Технической проблемой является необходимость создания олигонуклеотидных праймеров для выявления провирусной ДНК вируса лейкоза кошек в целях клинической диагностики с одновременной возможностью типирования вируса по результатам диагностических исследований и с одновременной возможностью использовать продукт диагностической реакции (ПЦР) для создания компонентов вакцин против выявленных циркулирующих штаммов вируса лейкоза кошек.
Техническим результатом предполагаемого изобретения является синтез (в результате реакции ПЦР) целевого фрагмента ДНК, кодирующиго фрагмент поверхностного гликопротеина gp70 вируса лейкоза кошек, который может быть использован для проведения филогенетического анализа и синтеза вирусного антигена.
Сущность предполагаемого изобретения состоит в том, что оно включает амплификацию участка вирусного генома, отвечающего за синтез единственного протективного антигена вируса (гликопротеин gp70). Вирусный гликопротеин gp70 несет протективные антигены и может быть использован в составе рекомбинантных или субъединичных вакцин.
Филогенетический анализ на основе гликопротеина gp70 имеет дополнительный смысл, т.к. генетическое родство или расхождение вирусных изолятов должно иметь корреляцию с антигенным родством.
Антигенные детерминанты гликопротеина gp70 описаны в литературе и испытаны в виде пептидов (Bayer Н, Hunsmann G. Synthetic vaccines against Friend murine leukaemia virus nduced erythroleukaemia: in vivo and in vitro studies with synthetic oligopeptides and sequence-specific antisera. J Gen Virol. 1987 Feb; 68 (Pt 2): 515-22). Они расположены в
следующих позициях: аминокислоты с 6 по 12 (пептид 1), с 124 t по 131 (пептид 2), с 256 t по 262 (пептид 3), с 283 по 290 (пептид 4), с 434 по 441 (пептид 5). Специфические антисыворотки, полученные на каждый из 5 пептидов, не нейтрализовали вирусную репродукцию in vitro. Тем не менее, антитела к пептидам 4 и 5, расположенным на гидрофобной части белковой молекулы, провоцировал комплемент-зависимый лизис клеток, инфицированных схожим ретровирусом мышей FLV (Friend murine leukaemia virus). В опытах по иммунизации мышей-гнотобиотов были испытаны комбинации из трех (1+4+5) и всех пяти пептидов. Применение этих экспериментальных вакцин привело к удлинению инкубационного периода и увеличению доли выживших животных после экспериментального заражения. Таким образом, установлено, что применение комбинации пептидов для иммунизации вызывает иммунный ответ, отличный по механизму от вирус-нейтрализации специфическими иммуноглобулинами, следовательно, относящийся к клеточному типу иммунного ответа. Данный иммунный ответ обеспечивает частичную защиту от лейкемии, что на сегодняшний день удовлетворяет требованиям к противолейкозным вакцинам.
Используемые штаммы вируса лейкоза кошек:
Для подбора олигонуклеотидных праймеров нами были использованы последовательности ДНК гена gp70 из международной базы данных ГенБанк, ниже указаны коды и названия штаммов ВЛК:
М18247.1:5981-7909 Feline leukemia virus, subgroup A (FeLV-FAIDS)
KP728112.1:5988-7916 Feline leukemia virus strain Glasgow-1
AF052723.1:5988-7916 Feline leukemia virus strain Rickard subgroup A
AB060732.3:6071-7999 Feline leukemia virus DNA, gp70, clone: clone33
AB672612.1:6152-8143 Feline leukemia virus DNA, gp70, clone: pJ7E2
Положение олигонуклеотидных праймеров по отношению ко всем перечисленным штаммам вируса лейкоза кошек указаны в Приложении 2.
Нумерацию нуклеотидов и аминокислот мы приводим, основываясь на структуре белка gp70 штамма Glasgow-1. Нахождение гена белка gp70 в полном геноме соответствует следующим нуклеотидным позициям: 5988-7916. В Приложении 1 приведены пары олигонуклеотидных праймеров с размещением их на нуклеотидной последовательности гена gp70 (первый нуклеотид стартового кодона располагается в положении 1 на карте гена, последний нуклеотид стоп-код она - в положении 2300)
Для амплификации кодирующего фрагмента гена, содержащего все пять антигенно значимых пептидов, а также в качестве внешних праймеров для гнездовой диагностической ПЦР используются следующие олигонуклеотиды (1fwd и 1rev):
Для амплификации малого фрагмента гена в качестве внутренних праймеров для гнездовой диагностической ПЦР используются следующие олигонуклеотиды (2fwd и 2rev):
Разработанные праймеры 1fwd, 1rev, 2fwd, 2rev позволяют проводить диагностические исследования по выявлению провирусной ДНК вируса лейкоза кошек методом гнездовой ПЦР, что описано в примере 1.
Разработанные праймеры 1fwd и 1rev позволяют синтезировать методом ПЦР участок гликопротеина gp70 для проведения филогенетического анализа в сравнении с указанными референтными штаммами вируса лейкоза кошек, что описано в примере 2.
Разработанные праймеры 1fwd и 1rev позволяют синтезировать методом ПЦР участок гликопротеина gp70 в виде одной открытой рамки считывания с фланкирующими уникальными сайтами эндонуклеаз рестрикции, годной для немедленного встраивания в экспрессирующие векторы всех типов с целью получения антигенно активного протеина вируса лейкоза кошек, что описано в примере 3.
Праймеры изготавливаются по приведенной в настоящей заявке последовательности при помощи автоматического нуклеотидного синтезатора. Чистота праймеров контролируется методом ВГЖХ и должна составлять не менее 95%.
Праймеры хранятся при -20°С в течение года.
Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
Выявление провирусной ДНК вируса лейкоза кошек методом гнездовой ПЦР.
В качестве ДНК-матрицы использовали геномную ДНК, полученную из крови и органов кошек. ДНК выделяли с помощью набора ДНК-сорб Б для цельной крови и тканей (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва).
Прямая ПЦР:
ПЦР проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 10 ммоль Tris-HCl (рН 9.0), 50 ммоль KCl, 0.1% Triton Х-100, 1.5 ммоль MgCl2, 10 пмоль каждого праймера 1fwd и 1rev, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл выделенной ДНК. Результаты ПЦР анализировали методом электрофореза в агарозном геле. Программа ПЦР: 1 цикл: 95°С - 1 мин.; 40 циклов: 95°С - 20 сек., 55°С - 20 сек., 72°С - 20 сек.; 1 цикл: 72°С - 5 мин. Поверх смеси наслаивали 40 мкл минерального масла. В результате получится фрагмент двуцепочечной ДНК, имеющий в своем составе 1394 нуклеотидных пар. Он применяется для гнездовой ПЦР (в случае, если не ярко выражен), для секвенирования и построения филогенетичевких дендрограмм.
Гнездовая ПЦР:
После проведения реакции прямой ПЦР, материал для нее использовали во второй реакции:
ПЦР проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 10ммоль Tris-HCl (рН 9.0), 50 ммоль КСl, 0.1% Triton Х-100, 1.5 ммоль MgCl2, 10пмоль каждого праймера 2fwd и 2rev, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25ед. Taq-полимеразы и 5 мкл материала из реакции прямой ПЦР (см выше). Результаты ПЦР анализировали методом электрофореза в агарозном геле. Программа ПЦР: 1 цикл: 95°С - 1 мин.; 30 циклов: 95°С - 20 сек., 55°С - 20 сек., 72°С - 20 сек.; 1 цикл: 72С° - 5 мин. Поверх смеси наслаивали 40 мкл минерального масла. В результате получится фрагмент двуцепочечной ДНК, имеющий в своем составе 1394 нуклеотидных пар.
Пример 2
Филогенетический анализ вирусов лейкоза кошек на основе фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70.
Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле.
ПЦР-фрагменты, соответствующие по электрофоретической подвижности размеру в 1394 пар нуклеотидов, вырезали и выделяли из геля при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (TermoScientific) по методике производителя.
Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright © 1997-2004) и пакет программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006).
Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) по методике производителя.
Филогенетические дендрограммы были построены в программе MEGA software v. 6.0 используя метод присоединения ближайшего соседа (MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013) Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729).
Результат филогенетического анализа приведен в Фигуре 1.
Пример 3.
Встраивание фрагмента гена gp70 ВЛК в экспрессирующий вектор pUC19.
Плазмидный вектор обеспечивает экспрессию генов, встраиваемых под контролем промотора lacZ, в штаммах Echserichia coli "top 10", "DH5 alpha" или им подобным. Индукция экспрессии достигается добавлением в ростовую среду изопропилтиогалактозида (IPTG). Полилинкер плазмидного вектора с обозначением кодирующих триплетов, аминокислотами и сайтами узнавания эндонуклеазами рестрикции приведен на фигуре 2
Полилинкер плазмидного вектора pUC19.
Рамка считывания определяется кодирующими триплетами, начиная со стартового кодона в положении 469 на карте вектора.
Для получения кодирующего фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70 вируса лейкоза кошек, проводят прямую ПЦР как описано в примере 1, но с применением модифицированных праймеров 1fwd и 1rev.
В таблице 3 малыми буквами указаны добавленные нуклеотиды, а олигонуклеотиды для наглядности разбиты на кодирующие триплеты. Подчеркиванием и цветом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции PstI и EcoRI. После гидролиза ДНК ПЦР-продукта и вектора с последующим лигированием, получится следующая конструкция приведенная на фигуре 3.
Звездочкой обозначен стоп-кодон. Подчеркиванием и цветом выделены последовательности вируса лейкоза кошек, стоящие в правильной рамке считывания под контролем промотора лактозного оперона. В результате экспрессии данного химерного гена получится белковый продукт, состоящий из 483 аминокислот, причем первые 11 аминокислот будут принадлежать N концевой части β-галактозидазы, а остальные 476 аминокислот - фрагменту поверхностного гликопротеина gp70 вируса лейкоза кошек, содержащему 5 антигенно-значимых доменов.
Список используемой литературы
1. Патент РФ 2317329 «Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления днк провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа, и условия полимеразной цепной реакции с их использованием».
2. Bayer Н, Hunsmann G. Synthetic vaccines against Friend murine leukaemia virus nduced erythroleukaemia: in vivo and in vitro studies with synthetic oligopeptides and sequence-specific antisera. J Gen Virol. 1987 Feb; 68 (Pt 2):515-22
3. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013) Molecular Biology and Evolution 30:2725-2729
Claims (1)
- Набор для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы, включающий олигонуклеотидные ДНК-праймеры, отличающиеся тем, что две пары олигонуклеотидных ДНК-праймеров имеют следующие последовательности: внешние (1 fwd: 5'TCCAACGCACCCAAAACCCT3'; 1 rev: 5'GCTTTAGTCCCTGTTCCGAC3'), внутренние (2 fwd: 5'TCCTGCCTATCTACTCCGCA3'; 2 rev: 5'ATGCATGGGGTGAGTCCAGT3').
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143441A RU2679846C1 (ru) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | Олигонуклеотидные ДНК праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143441A RU2679846C1 (ru) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | Олигонуклеотидные ДНК праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2679846C1 true RU2679846C1 (ru) | 2019-02-13 |
Family
ID=65442576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017143441A RU2679846C1 (ru) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | Олигонуклеотидные ДНК праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2679846C1 (ru) |
-
2017
- 2017-12-12 RU RU2017143441A patent/RU2679846C1/ru active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Alvaro Arjona,Evaluation of a novel nested PCR for the routine diagnosis of feline leukemia virus (FeLV) and feline immunodeficiency virus (FIV), Journal of Feline Medicine and Surgery, 1.02.2018. * |
| Alvaro Arjona,Evaluation of a novel nested PCR for the routine diagnosis of feline leukemia virus (FeLV) and feline immunodeficiency virus (FIV), Journal of Feline Medicine and Surgery, 1.02.2018. M. A. Gomes-Keller, Detection of Feline Leukemia Virus RNA in Saliva from Naturally Infected Cats and Correlation of PCR Results with Those of Current Diagnostic Methods, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Vol.44, номер 3, 2006г, стр. 916-922. Абакин С.С.,НОВЫЕ ПОДХОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ОЗДОРОВЛЕНИИ СТАД ОТ ВИРУСОВ ЛЕЙКОЗА И ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, Ветеринарная патология, номер 1, 2013г.,стр. 36-39. * |
| M. A. Gomes-Keller, Detection of Feline Leukemia Virus RNA in Saliva from Naturally Infected Cats and Correlation of PCR Results with Those of Current Diagnostic Methods, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Vol.44, номер 3, 2006г, стр. 916-922. * |
| Абакин С.С.,НОВЫЕ ПОДХОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ОЗДОРОВЛЕНИИ СТАД ОТ ВИРУСОВ ЛЕЙКОЗА И ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, Ветеринарная патология, номер 1, 2013г.,стр. 36-39. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bochkov et al. | Molecular epizootiology of avian infectious bronchitis in Russia | |
| US7947452B2 (en) | Oligonucleotides originating from sequences coding for the surface component of PTLV envelope proteins and their uses | |
| CN117752779A (zh) | 一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗及其构建方法 | |
| Jabbar et al. | Protection of IFNAR (−/−) mice against bluetongue virus serotype 8, by heterologous (DNA/rMVA) and homologous (rMVA/rMVA) vaccination, expressing outer-capsid protein VP2 | |
| Jeong et al. | Characterization of the DNA nucleotide sequences in the genome of red sea bream iridoviruses isolated in Korea | |
| US10253072B2 (en) | Prophylactic vaccine against egg drop syndrome (EDS) | |
| Li et al. | Isolation, identification, and whole genome sequencing of reticuloendotheliosis virus from a vaccine against Marek's disease | |
| Polacino et al. | Limited breadth of the protective immunity elicited by simian immunodeficiency virus SIVmne gp160 vaccines in a combination immunization regimen | |
| Carrillo et al. | Comparison of vaccine strains and the virus causing the 1986 foot-and-mouth disease outbreak in Spain: epizootiological analysis | |
| KR900701317A (ko) | 장을 통해 전이되는 비-a/비-b형 간염 비루스성 인자 | |
| CN106520809A (zh) | 一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法 | |
| RU2679846C1 (ru) | Олигонуклеотидные ДНК праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы | |
| ES2267553T3 (es) | Secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos del virus de la anemia infecciosa del salmon y sus usos como vacunas. | |
| Jackwood et al. | Identification and comparison of point mutations associated in classic and variant infectious bursal disease viruses | |
| KR20100043714A (ko) | 돼지 Ｅ형 간염바이러스의 ｃａｐｓｉｄ 단백질 및 그를 코딩하는 유전자 | |
| Wang et al. | Sequence analysis for the complete proviral genome of reticuloendotheliosis virus Chinese strain HA9901 | |
| Bartholomä et al. | Bacterial expression of the capsid antigen domain and identification of native gag proteins in spumavirus-infected cells | |
| KR102091280B1 (ko) | Lamp를 이용한 닭빈혈 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| JP4411213B2 (ja) | ネコ白血病ウィルスによるネコ感染症のようなオンコウィルス感染症に対するワクチン | |
| McGirr et al. | Tax and rex sequences of bovine leukaemia virus from globally diverse isolates: rex amino acid sequence more variable than tax | |
| KR102170821B1 (ko) | Lamp를 이용한 마렉병 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| Pistello et al. | AIDS vaccination studies with an ex vivo feline immunodeficiency virus model: analysis of the accessory ORF-A protein and DNA as protective immunogens | |
| Peroulis‐Kourtis et al. | Molecular characterisation of Victorian Newcastle disease virus isolates from 1976 to 1999 | |
| Zeshan et al. | Cloning and Expression of Truncated Spike (S f200) Glycoprotein of Infectious Bronchitis Virus (IBV) in Escherichia coli, and its Immunogenicity to Mice. | |
| RU2345138C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК р-ВМС-gag(A)-hum ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА р55 ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |