RU2679638C2 - Гидрогели метакриловых производных гиалуроновой кислоты для пероральной ферментной терапии глютеновой энтеропатии - Google Patents
Гидрогели метакриловых производных гиалуроновой кислоты для пероральной ферментной терапии глютеновой энтеропатии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679638C2 RU2679638C2 RU2016147586A RU2016147586A RU2679638C2 RU 2679638 C2 RU2679638 C2 RU 2679638C2 RU 2016147586 A RU2016147586 A RU 2016147586A RU 2016147586 A RU2016147586 A RU 2016147586A RU 2679638 C2 RU2679638 C2 RU 2679638C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- eda
- pep
- hyaluronic acid
- enzyme
- derivatives
- Prior art date
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims description 34
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims description 34
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 title 1
- 125000005641 methacryl group Chemical group 0.000 title 1
- 102000056251 Prolyl Oligopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 100
- 101710178372 Prolyl endopeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 34
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 29
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 claims description 22
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 17
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 13
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 10
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 claims description 10
- 241000736107 Novosphingobium capsulatum Species 0.000 claims description 9
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 claims description 7
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 claims description 7
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000589566 Elizabethkingia meningoseptica Species 0.000 claims description 4
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 claims description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 36
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 4
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 56
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 26
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 24
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 21
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 17
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 15
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 13
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- UTXSFKPOIVELPQ-SFHVURJKSA-N benzyl n-[2-[(2s)-2-[(4-nitrophenyl)carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1NC(=O)[C@H]1N(C(=O)CNC(=O)OCC=2C=CC=CC=2)CCC1 UTXSFKPOIVELPQ-SFHVURJKSA-N 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000006171 gluten free diet Nutrition 0.000 description 4
- 235000020884 gluten-free diet Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 108010015463 ALV003 Proteins 0.000 description 3
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 2
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BPZISIWHZTXXPT-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-2-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound C1=CC(=C(C(=C1)Cl)[N+](=O)[O-])OC(=O)O BPZISIWHZTXXPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000021329 Refractory celiac disease Diseases 0.000 description 1
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N bis(4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N cetyltrimethylammonium ion Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 235000006486 human diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015816 nutrient absorption Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 235000020790 strict gluten-free diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
- A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
- A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/28—Treatment by wave energy or particle radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21026—Prolyl oligopeptidase (3.4.21.26), i.e. proline-specific endopeptidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
- C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области фармацевтики и раскрывает композицию и фармацевтический состав, а также способ приготовления указанной композиции. Композиция характеризуется тем, что содержит гидрогели из функционализированных производных гиалуроновой кислоты, загруженные экзогенными ферментами, выбранными из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП) и эндопротеазы (ЭП). Способ приготовления композиции включает фотосшивку производных гиалуроновой кислоты посредством фото-облучения в водном растворе в присутствии или в отсутствие экзогенного фермента, выбранного из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП), эндопротеазы (ЭП). Композиция обеспечивает защиту ферментов от повреждения в присутствии криопротекторов, высвобождение ферментов в активной форме в имитированных желудочно-кишечных соках и может быть использована для получения пероральных лекарственных форм для лечения глютеновой энтеропатии. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 16 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гидрогели из производных гиалуроновой кислоты, нагруженные, по меньшей мере, одним эндогенным ферментом, где указанный фермент выбран из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП), эндопротеазы (ЭП), и их комбинаций; где указанная композиция предназначена для перорального лечения глютеновой энтеропатии.
Уровень техники
Глютеновая энтеропатия является патологией тонкой кишки, индуцированной глютеном у генетически восприимчивых индивидуумов, даже если факторы окружающей среды также вовлекаются в это комплексное воспалительное заболевание.
Глютен является смесью глиадинов и глютенинов, богатых пролином и глутамином, которые не являются предпочтительными субстратами для ферментов желудочно-кишечного тракта человека. В итоге, глютен не полностью разрушается у человека, с продукцией метастабильных иммуногенных пептидов из 30-40 аминокислот. В частности, последовательность альфа-2-глиадина, типичного белка глютена, расщепляется пепсином в желудке с образованием крупных пептидов, которые в полости тонкой кишки расщепляются панкреатическими протеазами и пептидазами мембраны щеточной каемки тонкой кишки до отдельных аминокислот, ди- и трипептидов для адсорбции. Однако последовательность из 33 аминокислот остается при пищеварении до пересечения эпителиального барьера, и дезаминируется трансглутаминазой-2 (ТГ-2) в избранных глутаминовых остатках. В подлежащей собственной пластинке слизистой оболочки эпитопы, полученные из дезаминированной последовательности из 33 аминокислот, демонстрируют высокую аффинность к человеческому лейкоцитарному антигену (HLA) DQ2. Комплексы дезаминированных глютеновых пептидов-DQ2 на поверхности антиген-презентирующих клеток (АПК) вызывают сильный воспалительный ответ глютен-специфических Т-клеток тонкой кишки, что вызывает разрушение интестинальной архитектуры, нарушение абсорбции нутриентов, диарею и анемию.
Полный рацион, не содержащий глютенов, обеспечивает купирование признаков и симптомов глютеновой энтеропатии у большинства пациентов, и на сегодняшний день является единственным лечением для данной патологии. Очевидно, что из-за повсеместного распространения глютена в рационе человека, это ограничение является трудновыполнимым, и часто связано со снижением качества жизни. Кроме того, безглютеновая диета является очень дорогостоящей; таким образом, помимо неоптимального вкуса, её применению у пациентов часто препятствуют экономические причины.
К сожалению, несоблюдение строгой безглютеновой диеты пациентом, добровольное или вынужденное, вызывает осложнения, такие как остеопороз, вторичные нарушения иммунитета, злокачественные новообразования и т.д., которые могут быть связаны с повышенной заболеваемостью и смертностью.
Таким образом, имеется высокая потребность в терапевтических альтернативах безглютеновой диете, включая, среди прочего, пероральное применение экзогенных пролил-эндопептидаз (ПЭП).
В отличие от ферментов желудочно-кишечного тракта человека, экзогенные ПЭП могут эффективно гидролизовать богатые пролином глютеновые пептиды, и таким образом, предотвращать иммунный ответ.
С этой целью предложены различные ПЭП, такие как ПЭП, полученные из Flavobacterium meninosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) и Aspergillus niger (AN), с различной последовательностью и длиной цепи, специфичностью и стабильностью в кислой среде или в присутствии протеаз желудочно-кишечного тракта (Bethune MT and Khosla C. «Oral enzyme therapy for celiac sprue». Methods Enzymol. 2012; 502:241-271 («Пероральная ферментная терапия спру-целиакии»)).
Однако для перорального применения этих ферментов необходимо выбрать подходящий состав, обеспечивающий как процесс получения без повреждения фермента, так и его высвобождение в желудке и/или тонкой кишке в активной форме и в эффективной дозе, предпочтительно постепенное и постоянное по времени.
На сегодняшний день нет коммерческих пероральных составов, содержащих ПЭП, но имеется лишь несколько примеров клинических испытаний, таких как с комбинацией, обозначенной как ALV003, из ПЭП SC и ЭП-B2 (эндопротеазы ячменя) (Tye-Din JA, Anderson RP, Ffrench RA, Brown GJ, Hodsman P, Siegel M, Botwick W, Shreeniwas R. «The effects of ALV003 pre-digestion of gluten on immune response and symptoms in celiac disease in vivo». Clin Immunol. 2010; 134:289–95 («Влияние предварительного расщепления глютена с ALV003 на иммунный ответ и симптомы глютеновой энтеропатии in vivo»)).
Однако, как кажется, пероральная ферментная терапия, как установлено к настоящему времени, неспособна к достаточному разрушению иммуногенных эпитопов при обычном ежедневном потреблении глютенов в количестве более 13 г, но скорее позволяет устранить вредное влияние от нескольких сотен миллиграмм до нескольких грамм глютена у пациентов с высокой чувствительностью к глютену или с рефрактерной целиакией 1 типа, или позволяет временно нарушать безглютеновую диету.
Наконец, пероральная терапия, предложенная к настоящему времени, вряд ли требует применения ПЭП с каждым приемом пищи, при котором намеренно или случайно употребляется пищевой глютен.
Таким образом, имеется потребность в данной области техники в улучшенном высвобождении экзогенных ПЭП для применения в пероральном лечении глютеновой энтеропатии, не имеющих недостатков предшествующего уровня техники.
Таким образом, настоящее изобретение нацелено на обеспечение новых составов для перорального применения экзогенного фермента, выбранного из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП) и эндопротеазы (ЭП), способных к высвобождению фермента в активной дозировке в желудочно-кишечном тракте и постепенным образом, для обеспечения применения ПЭП и/или ЭП в дозировке один раз в сутки.
Определения и сокращения
ЭДА: этилендиамин
ЭП: эндопротеаза
ГК: гиалуроновая кислота
МА: метакриловый ангидрид
ГК-ЭДА-МА: гиалуроновая кислота, в которой, по меньшей мере, одна гидроксильная группа функционализирована посредством реакции с этилендиамином (ЭДА) и последующей реакции с метакриловым ангидридом (МА)
ПЭП: пролил-эндопептидаза
ПЭП FM: пролил-эндопептидаза, полученная из Flavobacterium meninosepticum
ПЭП МХ: пролил-эндопептидаза, полученная из Myxococcus Xanthus
ПЭП SC: пролил-эндопептидаза, полученная из Sphingomonas capsulate
ПЭП AN: пролил-эндопептидаза, полученная из Aspergillus niger
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую, по меньшей мере, один экзогенный фермент, где указанный фермент выбран из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП), эндопротеазы (ЭП) и их комбинации, где указанный фермент захвачен гидрогелем из фотосшитых метакриловых производных гиалуроновой кислоты (ГК-ЭДА-МА), где производные гиалуроновой кислоты содержат гиалуроновую кислоту (ГК) или её соль с молекулярной массой от 50000 до 1500000 Дальтон, где по меньшей мере одна гидроксильная группа, после активации карбонилирующим агентом, выбранным из фениловых эфиров карбоновых кислот или фениловых эфиров галогенмуравьиной кислоты, функционализирована посредством реакции с этилендиамином (ЭДА) и последующей реакции с метакриловым ангидридом (МА), предпочтительно с применением однореакторного синтеза.
Полученную композицию готовят в виде геля или лиофилизированного порошка.
Фермент, захваченный в гидрогеле, неожиданно оказывается защищенным от разрушения во время процесса лиофилизации, таким образом, обеспечивая получение и стабильность при продолжительном хранении композиции из настоящего изобретения в форме лиофилизированного порошка.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает высвобождение экзогенного фермента в имитированных желудочно-кишечных соках длительным образом, и в виде активной формы для детоксикации глиадинового пептида. Таким образом, композиция в соответствии с настоящим изобретением пригодна для применения в лечении глютеновой энтеропатии, и может быть использована для приготовления обычных пероральных лекарственных форм, таких как гранулы, капсулы или таблетки, с кишечнорастворимой оболочкой или без неё, для перорального применения и пролонгированного высвобождения ферментов (ПЭП, ЭП или их комбинации) в активной форме, способной к детоксикации глиадинового пептида у пациентов с глютеновой энтеропатией. Таким образом, предметом обсуждения из настоящего изобретения является фармацевтический пероральный состав, включающий композицию в соответствии с изобретением и, по меньшей мере, другой фармацевтически пригодный ингредиент, где указанный состав предназначен для применения в лечении глютеновой энтеропатии.
Мукоадгезивные свойства исходного полимера, т.е. гиалуроновой кислоты, обеспечивают адгезию к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта и в результате более продолжительное время устойчивости состава, загруженного ферментами (ПЭП, ЭП или их комбинацией) в месте, где необходимо детоксицировать глиадиновый пептид.
Другой задачей настоящего изобретения является способ приготовления метакриловых производных гиалуроновой кислоты, где гидроксильные группы гиалуроновой кислоты функционализированы этилендиамином, а затем метакриловым ангидридом, где указанный способ является однореакторным способом.
Краткое описание фигур
Фигура 1 демонстрирует 1Н-ЯМР спектр производного ГК-ЭДА-МА.
Фигура 2 показывает схему системы из пробирки и поршня Pyrex, используемую для фото-облучения растворов ГК-ЭДА-МА.
Фигура 3 показывает стабильность ПЭП FM в фосфатном буферном растворе с pH 7,2, выраженную в виде поглощения (ABS) при 380 нм для растворов субстрата (Z-Гли-Про-пНА), обработанных с ферментом при хранении при 4°C до 5 суток.
Фигура 4 показывает активность ПЭП FM, выраженную в виде поглощения (ABS) при 380 нм для растворов субстрата (Z-Гли-Про-пНА), обработанных с ферментом после его облучения при 366 нм в течение разного времени.
Фигура 5 показывает ПЭП FM, высвободившуюся из ГК-ЭДА-МА гелей, при анализе непосредственно после приготовления (а) и после хранения при 4°C в течение 10 суток (b). Изучение высвобождения проводили в имитированных кишечных соках, рН 7,2, от 0 до 24 часов.
Фигура 6 показывает ПЭП FM, высвободившуюся из ГК-ЭДА-МА лиофилизированных порошков, при анализе непосредственно после приготовления (а), после хранения при 4°C в течение 10 суток (b), и после хранения при -20°С в течение 10 суток (с). Изучение высвобождения проводили в имитированных кишечных соках, рН 7,2, от 0 до 24 часов.
Фигура 7 показывает ПЭП FM, высвободившуюся из ГК-ЭДА-МА лиофилизированных порошков в присутствии 1,5 масс.% трегалозы, при анализе непосредственно после приготовления (а), после хранения при 4°C в течение 10 суток (b), и после хранения при -20°С в течение 10 суток (с). Изучение высвобождения проводили в имитированных кишечных соках, рН 7,2, от 0 до 24 часов.
Фигура 8 показывает ПЭП FM, высвободившуюся из ГК-ЭДА-МА лиофилизированных порошков в присутствии 3 масс.% трегалозы, при анализе непосредственно после приготовления (а), после хранения при 4°C в течение 10 суток (b), и после хранения при -20°С в течение 10 суток (с). Изучение высвобождения проводили в имитированных кишечных соках, рН 7,2, от 0 до 24 часов.
Фигура 9 показывает ПЭП FM, высвободившуюся из ГК-ЭДА-МА лиофилизированных порошков в присутствии 3 масс.% трегалозы, при анализе после хранения при 4°C в течение 10 суток (а), 1 месяца (b) и 2 месяцев (с). Изучение высвобождения проводили в имитированных кишечных соках, рН 7,2, от 0 до 24 часов.
Фигура 10 показывает ПЭП FM, высвободившуюся из ГК-ЭДА-МА лиофилизированных порошков в присутствии 3 масс.% трегалозы, при анализе после хранения при -20°C в течение 10 суток (а), 1 месяца (b) и 2 месяцев (с). Изучение высвобождения проводили в имитированных кишечных соках, рН 7,2, от 0 до 24 часов.
Осуществление изобретения
Производные ГК-ЭДА-МА в соответствии с изобретением показывают степень функционализации в ЭДА и МА, по меньшей мере, от одной гидроксильной группы до всех гидроксильных групп гиалуроновой кислоты.
Производные ГК-ЭДА-МА могут быть фотосшиты посредством фото-облучения при длине волны в диапазоне 180-800 нм, в водном растворе при концентрации от 1% м/о до 20 % м/о, и в присутствии по меньшей мере одного экзогенного фермента, предпочтительно ПЭП, в концентрации от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера.
Производные ГК-ЭДА-МА могут быть фотосшиты посредством фото-облучения при длине волны в диапазоне 180-800 нм, в концентрации от 1% м/о до 20% м/о, а затем загружены посредством контакта полученных гидрогелей с раствором, по меньшей мере, одного экзогенного фермента, предпочтительно ПЭП, с концентрацией от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера.
Производные ГК-ЭДА-МА могут быть фотосшиты в водной среде, предпочтительно посредством УФ облучения при длине волны 366 нм в присутствии экзогенного фермента, предпочтительно пролил-эндопептидазы (ПЭП).
В композиции в соответствии с настоящим изобретением ферментом может быть ПЭП или ЭП, полученная из одного микроорганизма, или фермент может быть комбинацией ПЭП и/или ЭП, полученных из различных микроорганизмов или произведенных посредством биотехнологического способа; любые ПЭП или ЭП, известные в данной области техники, и их комбинация, пригодны для захвата в гидрогеле, в соответствии с настоящим изобретением.
ПЭП можно также приготовить посредством рекомбинантной методики в Е.coli, как описано в Bethune et al., Methods Enzymol. 2012, 502, 241-271, и отмечено в настоящей заявке.
В соответствии с настоящим изобретением, ПЭП предпочтительно получают из микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Flavobacterium meningosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) или Aspergillus niger (AN).
В соответствии с настоящим изобретением, ЭП предпочтительно является ЭП ячменя, особо предпочтительно ЭП-В2.
Предпочтительно, в соответствии с настоящим изобретением, указанный фермент захватывается в гидрогеле, в гелевой форме, в концентрации от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера.
ГК-ЭДА-МА гидрогели, загруженные ферментами, можно производить в виде гелей.
ГК-ЭДА-МА гидрогели, загруженные ферментами, можно производить в виде лиофилизированного порошка.
Лиофилизацию можно проводить как при отсутствии, так и в присутствии криопротекторов, в концентрации от 0,1 до 10 масс.% по массе полимера; где указанный криопротектор предпочтительно является трегалозой.
ГК-ЭДА-МА гидрогели, загруженные ПЭП (в частности, ПЭП FM), в соответствии с настоящим изобретением, тестировали в анализах высвобождения ПЭП в имитированных желудочно-кишечных соках, после их хранения в течение различного времени (до шести месяцев после приготовления) и при различных температурах (от -20°С до 37°С).
В предыдущем патенте (Giammona, G., Palumbo, F. S., Pitarresi. G., «Method to produce hyaluronic acid functionalized derivatives and formation of hydrogels thereof», WO 2010/061005 A1 («Способ получения функционализированных производных гиалуроновой кислоты, и получение гидрогелей из них»)), сообщалось о синтезе ГК-ЭДА-МА, но включено исходное получение производных ГК-ЭДА-МА, которые после выделения и очистки применяли для последующей реакции с МА; таким образом, сообщалось о двухреакторном синтезе.
Напротив, в настоящем изобретении заявлен однореакторный синтез, который обеспечивает непосредственное получение производных ГК-ЭДА-МА без выделения производных ГК-ЭДА.
Другим предметом обсуждения настоящего изобретения является процедура, предпочтительно однореакторная, для получения метакриловых производных гиалуроновой кислоты, включающая следующие этапы:
(а) обеспечение контакта соли гиалуроновой кислоты (ГК) в полярном апротонном растворителе с карбонилирующим агентом, выбранным из фениловых эфиров карбоновых кислот или фениловых эфиров галогенмуравьиной кислоты, для достижения активации, по меньшей мере, одной гидроксильной группы ГК, где указанная ГК находится в форме соли, растворимой в указанном полярном апротонном органическом растворителе;
(b) обеспечение контакта активированной соли ГК, полученной на этапе (а), с этилендиамином (NH2-CH2-CH2-NH2, указанным как ЭДА), для получения, посредством нуклеофильного замещения, ГК-ЭДА;
(с) обеспечения контакта ГК-ЭДА, полученного на этапе (b), с метакриловым ангидридом (указанным как МА), для получения, посредством нуклеофильного замещения, ГК-ЭДА-МА;
где предпочтительно все вышеуказанные этапы проводят в одном и том же реакторе.
Соль гиалуроновой кислоты, растворимую в органических растворителях, предпочтительно выбирают из тетрабутиламмонийной соли (указанной как ТБА) или цетилтриметиламмонийной соли (указанной как ЦТА).
Полярный апротонный органический растворитель, применяемый для реакций функционализации, предпочтительно выбирают из диметилсульфоксида, диметилформамида, диметилацетамида и их смесей.
Карбонилирующий агент, применяемый на этапе (а), может быть предпочтительно бис(4-нитрофенилкарбонатом) (фениловым эфиром карбоновой кислоты) и/или хлоронитрофенилкарбонатом.
Этап (с) предпочтительно проводят в присутствии катализатора, выбранного из диэтиламина, триэтиламина, диметиламинопиридина, и их смесей.
Все этапы предпочтительно проводят при температуре от 5 до 60°С.
Степень функционализации в ЭА и МА группах, связанных с ГК, может варьировать от лишь одной гидроксильной группы до всех гидроксильных групп ГК, и зависит (прямо пропорциональным образом) от количества карбонилирующего агента, используемого в вышеописанном процессе. Предпочтительно, степень функционализации варьирует от 5 до 95%, более предпочтительно от 20 до 80%.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение направлено на производные ГК-ЭДА-МА, имеющие молекулярную массу в диапазоне 50000-1500000 Дальтон, полученные способом, описанным выше.
Далее представлена структурная формула ГК-ЭДА-МА, которая просто представляет тип функционализации (ковалентное связывание), которое происходит, когда гидроксильная группа ГК подвергается вышеописанному процессу.
Отмечается, что указанная структура не предназначена для представления степени функционализации, которая, как установлено выше, вместо этого прямо пропорциональна количеству реактивного карбонилирующего агента, использованного в вышеуказанном способе.
В частности, тип функционализации производных ГК-ЭДА-МА может быть представлен следующей структурой, описывающей две последовательных дисахаридных единицы из исходной гиалуроновой кислоты, где, по меньшей мере, одна гидроксильная группа функционализирована.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение направлено на поперечно-сшитые гидрогели, полученные из вышеописанных продуктов, т.е. производные ГК-ЭДА-МА, с применением процедуры фотосшивки, где концентрация вышеупомянутых функционализированных производных в водном или органическом растворе составляет от 1% м/о до 20% м/о. Предпочтительно, гидрогели получают путем облучения с длиной волны от 180 до 800 нм, с радикальным фотоинициатором или без него, со временем облучения от 5 минут до 10 часов.
Такие гидрогели могут быть получены путем гамма-облучения, микроволнового облучения, или путем другого вида ионизирующего облучения.
Такую фотосшивку можно осуществлять также в присутствии подходящих добавок, таких как акриловые и метакриловые мономеры, полиэтиленгликоля метакрилаты и акрилаты, как моно-, так и полифункциональных, или в присутствии других добавок, применяемых для изменения или улучшения пластичности, твердости, гидрофильного и липофильного характера.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение направлено на продукцию гидрогелей ГК-ЭДА-МА, полученных посредством фото-облучения и нагруженных экзогенными пролил-эндопептидазами (ПЭП) с концентрацией фермента от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера, во время и/или после процесса облучения.
В соответствии со специфическим аспектом, настоящее изобретение направлено на получение производных ГК-ЭДА-МА, фотосшитых в водной среде, предпочтительно при 366 нм в течение 10 мин, в присутствии экзогенных пролил-эндопептидаз (ПЭП), предпочтительно ПЭП, полученных из Flavobacterium meningosepticum (FM), с концентрацией фермента от 1 мЕд/мг до 100 Ед./мг полимера.
ГК-ЭДА-МА гидрогели, загруженные ПЭП, получают как в виде гелей, так и в виде лиофилизированных порошков при отсутствии или в присутствии криопротекторов, с концентрацией от 0,1 до 10 масс.% по массе полимера.
Полученные гидрогели, нагруженные ПЭП, использовали для экспериментов по высвобождению в имитированных желудочно-кишечных соках непосредственно после получения и после хранения в течение разного времени (до шести месяцев после приготовления) и при различной температуре (от -20°С до 37°С).
Результаты экспериментов показали, что:
- ПЭП FM по отдельности, растворенная в фосфатном солевом растворе с рН 7,2, постепенно теряет свою активность со временем, даже при хранении при низкой температуре, например, 4°С.
- ПЭП FM по отдельности, растворенная в фосфатном солевом растворе с рН 7,2, полностью теряет свою активность после лиофилизации раствора, также в присутствии криопротекторов;
- ПЭП FM по отдельности, растворенная в фосфатном солевом растворе с рН 7,2 и подвергнутая фото-облучению при 366 нм в течение 10 минут, сохраняет свою активность при фото-облучении, но теряет активность полностью после лиофилизации раствора, также в присутствии криопротекторов;
- ПЭП FM, растворенная в фосфатном солевом растворе с рН 7,2 в присутствии производного ГК-ЭДА-МА и подвергнутая фото-облучению при 366 нм в течение 10 минут, сохраняет свою активность также после лиофилизации, как при отсутствии, так и в присутствии криопротекторов;
- Гидрогели ГК-ЭДФ-МА, загруженные ПЭП FM при фото-облучении и полученные в виде гелей, при анализе непосредственно после приготовления способны к высвобождению устойчивым образом примерно 70% фермента в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов. Количество ПЭП FM, остающейся в ГК-ЭДА-МА гелях, полностью сохраняет свою активность.
- Гидрогели ГК-ЭДФ-МА, загруженные ПЭП FM при фото-облучении и полученные в виде гелей, при анализе после хранения при 4°С в течение 10 суток, способны к высвобождению устойчивым образом примерно 60% фермента в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов, и только частично теряли активность (примерно 20%).
- Гидрогели ГК-ЭДФ-МА, загруженные ПЭП FM при фото-облучении при отсутствии криопротекторов и полученные в виде лиофилизированных порошков, при анализе непосредственно после приготовления способны к высвобождению устойчивым образом примерно 70% фермента в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов. Количество ПЭП FM, остающейся в ГК-ЭДА-МА гелях, полностью сохраняет свою активность.
- Гидрогели ГК-ЭДФ-МА, загруженные ПЭП FM при фото-облучении при отсутствии криопротекторов и полученные в виде лиофилизированных порошков, при анализе после хранения при 4°С или при -20°С в течение 10 суток способны к высвобождению устойчивым образом примерно 50% фермента в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов, и только частично теряют свою активность (примерно 30%). Это очень хороший результат, поскольку ПЭП FM по отдельности, т.е. при отсутствии ГК-ЭДА-МА гидрогеля, полностью теряет свою активность после лиофилизации.
- Гидрогели ГК-ЭДФ-МА, загруженные ПЭП FM при фото-облучении в присутствии трегалозы (в качестве примера криопротектора) в количестве 1,5 масс.% по массе полимера, и полученные в виде лиофилизированных порошков, при анализе непосредственно после приготовления способны к высвобождению устойчивым образом примерно 60% фермента в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов. Количество ПЭП FM, остающейся в ГК-ЭДА-МА гелях, полностью сохраняет свою активность.
Если образцы хранили при 4°С в течение 10 суток, они все еще были способными к высвобождению устойчивым образом примерно 50% ПЭП FM в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов, и только частично теряли свою активность (около 30%).
Если образцы хранили при -20°С в течение 10 суток, они все еще были способными к высвобождению устойчивым образом примерно 50% ПЭП FM в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов, и полностью сохраняли активность ПЭП FM.
- Гидрогели ГК-ЭДФ-МА, загруженные ПЭП FM при фото-облучении в присутствии трегалозы (в качестве примера криопротектора) в количестве 3 масс.% по массе полимера, и полученные в виде лиофилизированных порошков, при анализе непосредственно после приготовления способны к высвобождению устойчивым образом примерно 50% фермента в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов. Количество ПЭП FM, остающейся в ГК-ЭДА-МА гелях, полностью сохраняет свою активность.
Если образцы хранили при 4°С или -20°С в течение 1 и 2 месяцев, они все еще были способными к высвобождению устойчивым образом примерно 50% ПЭП FM в имитированном кишечном соке с рН 7,2, в активной форме до 24 часов, и полностью сохраняли активность ПЭП FM.
Таким образом, в соответствии с вышеуказанными результатами, композиция в соответствии с настоящим изобретением, приготовленная посредством фото-облучения ГК-ЭДА-МА гидрогелей в присутствии ПЭП FM и криопротектора в подходящей концентрации, способна к полной защите активности фермента во время процесса лиофилизации.
ПЭП FM, нагруженные на ГК-ЭДА-МА гидрогели, полученные в виде лиофилизированных порошков, полностью сохраняют свою активность при хранении в течение разного времени и при разной температуре, и высвобождаются в активной форме в имитированном кишечном соке с рН 7,2 до 24 часов из ГК-ЭДА-МА гидрогелей.
Следуя тому же самому подходу, который применялся для нагрузки ПЭП FM, настоящее изобретение направлено на ГК-ЭДА-МА гидрогели, нагруженные другими экзогенными ферментами, выбранными из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП), такой как ПЭП из Myxococcus xanthus (MX), ПЭП из Sphingomonas capsulata (SC) или ПЭП из Aspergillus niger (AN), и эндопротеазы (ЭП), каждая из которых может применяться по отдельности или в комбинации с ПЭП FM, или с другими из них, или с другими ферментами.
В заключение, ГК-ЭДА-МА гидрогели способны:
- к защите нагруженных ферментов при процессе лиофилизации;
- к защите нагруженных ферментов от повреждения при хранении лиофилизированных порошков, в целом в присутствии криопротекторов;
- к обеспечению высвобождения ферментов в имитированном желудочном соке (для ферментов, активных в кислой среде) и в имитированном кишечном соке (для всех ферментов) в активной форме устойчивым образом;
- к применению для приготовления обычной пероральной лекарственной формы, такой как гранулы, капсулы и таблетки, с кишечнорастворимой оболочкой или без неё, для перорального применения и высвобождения ферментов в активной форме, способной к детоксикации глиадинового пептида у больных глютеновой энтеропатией.
Изобретение далее иллюстрировано с помощью следующих примеров, предназначенных для облегчения понимания изобретения, и не предназначенных для специального ограничения изобретения, как описано и заявлено в настоящей заявке.
Эксперименты
Пример 1
Приготовление производного ГК-ЭДА-МА путем синтеза в одном реакторе (однореакторного)
1 г тетрабутиламмонийной соли гиалуроновой кислоты (ГК-ТБА), приготовленной путем нейтрализации раствора гиалуроновой кислоты с применением раствора тетрабутиламмония гидроксида, растворяли в 90 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО) (средневесовая молекулярная масса гиалуроновой кислоты 260 кДа).
Подходящее количество бис(4-нитрофенил) карбоната (4-НФБК), выбранное для получения молярного отношения 4-НФБК/ повторяющиеся единицы ГК-ТБА, равного 0,5, растворяли в 10 мл безводного ДМСО; этот раствор добавляли по каплям в раствор ГК-ТБА при 40°С при перемешивании. Спустя 4 часа 175 мкл этилендиамина (ЭДА) добавляли по каплям, и раствор выдерживали при 40°С в течение еще 3 часов.
Добавляли подходящий объем (900 мкл) метакрилового ангидрида (МА) для получения восьмикратного молярного избытка, по сравнению с молями аминогрупп на ГК-ТБА-ЭДА, затем добавляли 105 мкл катализатора триэтиламина (ТЭА), и итоговый раствор выдерживали 24 часа при 40°С.
Проведение реакции осуществляли вначале добавлением 10 мл насыщенного раствора NaCl, и смесь оставляли на 30 минут при перемешивании при комнатной температуре. Затем реакционный раствор осаждали этанолом, и продукт промывали несколько раз раствором этанола/бидистиллированной воды (9:1) до получения продукта без промежуточных продуктов реакции и NaCl. Полученное твердое вещество обозначали как производное ГК-ЭДА-МА. На Схеме 1 показана однореакторная процедура, используемая для приготовления производного ГК-ЭДА-МА.
Схема 1. Реакция функционализации тетрабутиламмонийной соли гиалуроновой кислоты (ГК-ТБА) с этилендиамином (ЭДА) и метакриловым ангидридом (МА) для получения производного ГК-ЭДА-МА путем однореакторной процедуры.
Производное ГК-ЭДА-МА при анализе посредством 1H-ЯМР (см. фигуру 1) показало следующие пики (D2O): δ 1,9 (s, -CO-CH=CH-CH3); δ 2,0 (s, -NH-CO-CH3); δ 5,5 и 5,7 (m, -CO-CH=CH-CH3).
Степень функционализации оценивали путем сравнения площадей пиков δ 5,5 и 5,7, связанных с виниловыми протонами метакриловой группы, с площадью пика δ 1,9, связанного с метиловой группой N-ацетилглюкозаминовой части повторяющихся единиц ГК. Степень функционализации метакриловых групп, связанных с повторяющимися единицами ГК-ЭДА, приводила к 50 моль%; пик, принадлежащий к свободным аминогруппам ЭДА, отсутствовал, т.е. при δ 3,1 (m, CO-NH-CH2-CH2-NH2) все аминогруппы были дериватизированы метакриловым ангидридом.
Пример 2
Фотосшивка производного ГК-ЭДА-МА
30 мг производного ГК-ЭДА-МА, полученного в примере 1, растворяли в 500 мкл 0,5 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2 при комнатной температуре, до получения итоговой концентрации 6% м/о, и дегазировали под вакуумом. Затем раствор помещали в пробирку Pyrex и облучали с применением УФ фотореактора Rayonet при длине волны 366 нм в течение 10 минут (см. фигура 2). Спустя это время полученный гель извлекали в виде геля или лиофилизировали до получения порошка.
Пример 3
Оценка активности ПЭП FМ
Активность ПЭП, полученной из Flavobacterium meninosepticum (FM), определяли посредством колориметрического анализа, в котором фермент реагирует со своим специфическим субстратом, т.е. карбобензокси-Гли-Про-п-нитроанилидом (Z-Гли-Про-пНА).
В частности, 0,25 мл 2 мМ Z-Гли-Про-пНА в 40% диоксане смешивали с 1,0 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2, и раствор предварительно инкубировали в течение 5 минут при 30°С. Спустя это время, добавляли 0,1 мл фермента в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2 и инкубировали в течение 10 минут при 30°С; реакцию останавливали путем добавления 2,0 мл раствора Тритон-Х100 (10 г Тритон-Х100/95 мл 1М ацетатного буфера, рН 4,0).
Поглощение полученного продукта определяли при 380 нм.
Одна единица ферментативной активности определяется как активность фермента, производящая 1 мкмоль п-нитроанилина в минуту при 30°С, рН 7,2, из Z-Гли-Про-пНА.
Пример 4
Стабильность ПЭП FM в фосфатном буферном растворе с рН 7,2 в зависимости от времени
Готовили аликвоты (1,0 мл) 0,2 Ед./мл ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2 и хранили в холодильнике при 4°С в течение 5 дней для оценки стабильности при хранении. Спустя 1, 2, 3, 4 и 5 суток оценивали активность фермента посредством колориметрического анализа, как показано в примере 3. Каждый пример проводили в трех повторностях. Результаты показаны на фигуре 3.
Пример 5
Лиофилизация ПЭП FM в фосфатном буферном растворе с рН 7,2 и оценка её активности
Лиофилизировали 1 мл 0,2 Ед./мл ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2 при отсутствии или в присутствии трегалозы (7,5 мкг/мл или 15 мкг/мл). Затем оценивали активность фермента посредством колориметрического анализа, как описано в примере 3. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях. Во всех случаях не отмечалось активности.
Пример 6
Фото-облучение ПЭП FM в фосфатном буферном растворе с рН 7,2, и оценка её активности
Проводили фото-облучение 1 мл 0,2 Ед./мл ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2 при длине волны, равной 366 нм, в течение различного времени (от 1 до 20 минут).
После каждого времени облучения оценивали активность фермента посредством колориметрического анализа, как описано в примере 3.
Анализ активности также проводили с не облученными растворами ферментов, используемыми в качестве положительного контроля. Каждый пример проводили в трех повторностях. Результаты показаны на фигуре 4.
Пример 7
Лиофилизация ПЭП FM в фосфатном буферном растворе с рН 7,2 после её фото-облучения, и оценка её активности
1 мл 0,2 Ед./мл ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,2 подвергали фото-облучению при длине волны 366 нм в течение 10 минут.
Облученный раствор лиофилизировали, и оценивали активность фермента колориметрическим анализом, как описано в примере 3.
Эксперимент проводили в трех повторностях, и во всех случаях не было выявлено активности.
Пример 8
Лиофилизация ПЭП FM в фосфатном буферном растворе с рН 7,2 после её фото-облучения в присутствии трегалозы, и оценка её активности
200 мкл 0,2 Ед./мл ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2 смешивали с 800 мкл трегалозы 15 мкг/мл в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Этот раствор подвергали фото-облучению при длине волны 366 нм в течение 10 минут.
Облученный раствор лиофилизировали, и оценивали активность фермента колориметрическим анализом, как описано в примере 3.
Эксперимент проводили в трех повторностях, и во всех случаях не было выявлено активности.
Пример 9
Приготовление ГК-ЭДА-МА геля, загруженного ПЭП FM
30 мг производного ГК-ЭДА-МА растворяли в 400 мкл 0,05 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2. Этот раствор дегазировали под вакуумом, а затем добавляли 100 мкл 0,4 Ед./мг ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном раствора с рН 7,2. Итоговая концентрация полимера составила 6% м/о. Раствор подвергали фото-облучению при длине волны 366 нм в течение 10 минут.
Полученный ГК-ЭДА-МА гель, нагруженный ПЭП FM, анализировали непосредственно после приготовления или после хранения при 4°С в течение 10 суток. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.
Пример 10
Приготовление ГК-ЭДА-МА гидрогеля в виде лиофилизированного порошка, загруженного ПЭП FM
Готовили ГК-ЭДА-МА гидрогель, загруженный ПЭП FM с 0,4 Ед./мг полимера, как описано в примере 9.
После фото-облучения полученный гидрогель лиофилизировали, затем анализировали непосредственно после приготовления или после хранения в течение 10 суток при 4°С или при -20°С. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.
Пример 11
Приготовление ГК-ЭДА-МА гидрогеля в виде лиофилизированного порошка, загруженного ПЭП FM, в присутствии 1,5 масс.% трегалозы
30 мг производного ГК-ЭДА-МА растворяли в смеси 350 мкл 0,05 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2 и 100 мкл 4,5 мг/мл трегалозы в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Этот раствор дегазировали под вакуумом, а затем добавляли 50 мкл 0,4 Ед./мг ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном раствора с рН 7,2. Итоговая концентрация полимера составила 6% м/о. Раствор подвергали фото-облучению при длине волны 366 нм в течение 10 минут.
После облучения полученный гидрогель лиофилизировали, затем анализировали непосредственно после приготовления или после хранения при 4°С или при -20°С в течение 10 суток. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.
Пример 12
Приготовление ГК-ЭДА-МА гидрогеля в виде лиофилизированного порошка, загруженного ПЭП FM, в присутствии 3 масс.% трегалозы
30 мг производного ГК-ЭДА-МА растворяли в смеси 350 мкл 0,05 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2 и 100 мкл 9 мг/мл трегалозы в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Этот раствор дегазировали под вакуумом, а затем добавляли 50 мкл 0,4 Ед./мг ПЭП FM в 0,05 М фосфатном буферном раствора с рН 7,2. Раствор подвергали фото-облучению при длине волны 366 нм в течение 10 минут.
После облучения полученный гидрогель лиофилизировали, затем анализировали непосредственно после приготовления или после хранения в течение 10 суток, 1 или 2 месяцев при 4°С или при -20°С. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.
Пример 13
Изучение высвобождения в имитированном кишечном соке с рН 7,2 из образца из примера 9
Аликвоты (15 мг) загруженного ПЭП FM ГК-ЭДА-МА геля помещали в пробирки, содержащие 10 мл имитированного кишечного сока с рН 7,2 на 24 часа (100 об./мин, 37°С). С предварительно заданными интервалами времени отбирали 0,15 мл среды высвобождения, и анализировали путем определения ферментативной активности, как описано в примере 3. Добавляли равный объем свежей среды, и поддерживали условия достаточного разбавления во время эксперимента. Количество фермента определяли с применением калибровочной кривой (y = 1,5836 x + 0,0537, r2=0,9981). Каждый эксперимент проводили в трех повторностях.
Определение количества фермента, остающегося в ГК-ЭДА-МА геле спустя 24 часа, осуществляли путем применения анализа для определения ферментативной активности, но в этом случае субстрат Z-Гли-Про-пНА помещали непосредственно в контакт с гелем.
В частности, 15 мг геля, используемого для исследований высвобождения, добавляли к 0,5 мл имитированного кишечного сока с рН 7,2 и 4,0 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2, затем образец инкубировали при 100 об./мин, 37°С в течение 24 часов. Спустя это время, 1,25 мл 2 мМ Z-Гли-Про-пНА в 40% диоксане смешивали с 1,0 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,2, и полученный раствор предварительно инкубировали в течение 5 минут при 30°С, затем его добавляли к гелю, и инкубировали в течение 10 минут при 30°С; реакцию останавливали путем добавления 20 мл раствора Тритон-Х100 (10 г Тритон-Х100/95 мл 1М ацетатного буфера, рН 4,0).
Поглощение полученного продукта измеряли в при 380 нм. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях. Результаты экспериментов по высвобождению показаны на фигуре 5.
Пример 14
Исследования высвобождения в имитированном кишечном соке с рН 7,2 из образца из примера 10
Исследования высвобождения ПЭП FM из ГК-ЭДА-МА гидрогеля в виде лиофилизированного порошка, нагруженного ПЭП FM при отсутствии криопротектора (пример 10), проводили, как описано в примере 13. Результаты исследований высвобождения показаны на фигуре 6.
Пример 15
Исследования высвобождения в имитированном кишечном соке с рН 7,2 из образца из примера 11
Исследования высвобождения ПЭП FM из ГК-ЭДА-МА гидрогеля в виде лиофилизированного порошка, нагруженного ПЭП FM в присутствии трегалозы (1,5 масс.%) (пример 11), проводили, как описано в примере 13. Результаты исследований высвобождения показаны на фигуре 7.
Пример 16
Исследования высвобождения в имитированном кишечном соке с рН 7,2 из образца из примера 12
Исследования высвобождения ПЭП FM из ГК-ЭДА-МА гидрогеля в виде лиофилизированного порошка, нагруженного ПЭП FM в присутствии трегалозы (3 масс.%) (пример 12), проводили, как описано в примере 13. Результаты исследований высвобождения показаны на фигурах 8, 9 и 10.
Claims (17)
1. Композиция для перорального лечения глютеновой энтеропатии, содержащая, по меньшей мере, один экзогенный фермент, выбранный из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП), эндопротеазы (ЭП) и их комбинации, где указанный фермент захвачен в гидрогеле из фотосшитых метакриловых производных гиалуроновой кислоты (ГК-ЭДА-МА), где производные гиалуроновой кислоты содержат гиалуроновую кислоту (ГК) или её соль, с молекулярной массой от 50000 до 1500000 Да, где, по меньшей мере, одна гидроксильная группа после активации с карбонилирующим агентом, выбранным из фениловых эфиров карбоновых кислот или фениловых эфиров галогенмуравьиной кислоты, функционализирована посредством реакции с этилендиамином (ЭДА) и последующей реакции с метакриловым ангидридом (МА).
2. Композиция по п. 1, где указанный фермент захвачен в гидрогеле, в концентрации от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера.
3. Композиция по любому из пп. 1, 2 в форме геля.
4. Композиция по любому из пп. 1, 2 в форме лиофилизированного порошка.
5. Композиция по п. 4, дополнительно содержащая по меньшей мере криопротектор в концентрации от 0,1 до 10 масс.% по массе полимера; где указанным криопротектором предпочтительно является трегалоза.
6. Композиция по 1, где экзогенный фермент представляет собой ПЭП, которая получена из микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из Flavobacterium meningosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) или Aspergillus niger (AN) или их комбинации, где ЭП является эндопротеазой из ячменя.
7. Фармацевтический состав для перорального лечения глютеновой энтеропатии, включающий композицию по любому из пп. 1-6.
8. Способ приготовления композиции по п. 1, включающий фотосшивку производных ГК-ЭДА-МА посредством фотооблучения при длине волны в диапазоне 180-800 нм в водном растворе при концентрации от 1% м/о до 20% м/о,
- где указанную фотосшивку проводят в присутствии по меньшей мере одного экзогенного фермента в концентрации от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера; или
- где указанную фотосшивку проводят при отсутствии экзогенного фермента, который затем нагружают путем контакта полученных гидрогелей с раствором экзогенного фермента в концентрации от 1 мЕд./мг до 100 Ед./мг полимера;
- где указанный фермент выбран из группы, состоящей из пролил-эндопептидазы (ПЭП), эндопротеазы (ЭП) и их комбинации;
- где производные ГК-ЭДА-МА содержат гиалуроновую кислоту (ГК) или её соль, с молекулярной массой от 50000 до 1500000 Да, где, по меньшей мере, одна гидроксильная группа функционализирована посредством реакции с этилендиамином (ЭДА) и последующей реакции с метакриловым ангидридом (МА).
9. Способ по п. 8, включающий приготовление производных ГК-ЭДА-МА в соответствии со следующими этапами:
(а) обеспечение контакта соли гиалуроновой кислоты (ГК) в полярном апротонном растворителе с карбонилирующим агентом, выбранным из фениловых эфиров карбоновых кислот или фениловых эфиров галогенмуравьиной кислоты, до достижения активации, по меньшей мере, одной гидроксильной группы ГК, где указанная ГК находится в форме соли, растворимой в указанном полярном апротонном органическом растворителе;
(b) обеспечение контакта активированной соли ГК, полученной на этапе (а), с этилендиамином (NH2-CH2-CH2-NH2 - ЭДА) для получения, посредством нуклеофильного замещения, ГК-ЭДА;
(с) обеспечение контакта ГК-ЭДА, полученного на этапе (b), с метакриловым ангидридом (МА) для получения, посредством нуклеофильного замещения, ГК-ЭДА-МА.
10. Способ по п. 9, где все этапы приготовления производных ГК-ЭДА-МА осуществляют последовательно в одном и том же реакторе.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITFI2014A000106 | 2014-05-07 | ||
| ITFI20140106 | 2014-05-07 | ||
| PCT/EP2015/059941 WO2015169849A1 (en) | 2014-05-07 | 2015-05-06 | Hydrogels of methacrylic hyaluronic acid derivatives for oral enzyme therapy in celiac disease |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016147586A RU2016147586A (ru) | 2018-06-08 |
| RU2016147586A3 RU2016147586A3 (ru) | 2018-10-05 |
| RU2679638C2 true RU2679638C2 (ru) | 2019-02-12 |
Family
ID=51220659
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147586A RU2679638C2 (ru) | 2014-05-07 | 2015-05-06 | Гидрогели метакриловых производных гиалуроновой кислоты для пероральной ферментной терапии глютеновой энтеропатии |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10709787B2 (ru) |
| EP (1) | EP3139961B1 (ru) |
| JP (1) | JP6532483B2 (ru) |
| CN (1) | CN106488772B (ru) |
| CA (1) | CA2946811C (ru) |
| DK (1) | DK3139961T3 (ru) |
| ES (1) | ES2675574T3 (ru) |
| PT (1) | PT3139961T (ru) |
| RU (1) | RU2679638C2 (ru) |
| TR (1) | TR201809421T4 (ru) |
| WO (1) | WO2015169849A1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007044906A2 (en) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Alvine Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced gastrointestinal stability of oligopeptides and polypeptides |
| WO2010061005A1 (en) * | 2008-11-28 | 2010-06-03 | Universita' Degli Studi Di Palermo | Method to produce hyaluronic acid functionalized derivatives and formation of hydrogels thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7320788B2 (en) * | 2002-02-14 | 2008-01-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue |
| EP1790665B1 (en) * | 2004-09-07 | 2014-11-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing water-soluble modified hyaluronic acid |
-
2015
- 2015-05-06 EP EP15725516.7A patent/EP3139961B1/en active Active
- 2015-05-06 US US15/307,790 patent/US10709787B2/en active Active
- 2015-05-06 RU RU2016147586A patent/RU2679638C2/ru active
- 2015-05-06 ES ES15725516.7T patent/ES2675574T3/es active Active
- 2015-05-06 DK DK15725516.7T patent/DK3139961T3/en active
- 2015-05-06 CA CA2946811A patent/CA2946811C/en active Active
- 2015-05-06 TR TR2018/09421T patent/TR201809421T4/tr unknown
- 2015-05-06 CN CN201580022385.4A patent/CN106488772B/zh active Active
- 2015-05-06 WO PCT/EP2015/059941 patent/WO2015169849A1/en not_active Ceased
- 2015-05-06 JP JP2016565378A patent/JP6532483B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-05-06 PT PT157255167T patent/PT3139961T/pt unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007044906A2 (en) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Alvine Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced gastrointestinal stability of oligopeptides and polypeptides |
| WO2010061005A1 (en) * | 2008-11-28 | 2010-06-03 | Universita' Degli Studi Di Palermo | Method to produce hyaluronic acid functionalized derivatives and formation of hydrogels thereof |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CALOGERO FIORICA et al. A new hyaluronic acid pH sensitive derivative obtained by ATRP forpotential oral administration of proteins. Internat.J.of Ph. 457 (2013) 150-157. * |
| CALOGERO FIORICA et al. A new hyaluronic acid pH sensitive derivative obtained by ATRP forpotential oral administration of proteins. Internat.J.of Ph. 457 (2013) 150-157. SHAN L et al. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases: implications for coeliac sprue. Biochem J. 2004 Oct 15, 311-8. CHEN YS et al. Identification and characterization of Lactobacillus helveticus PepO2, an endopeptidase with post-proline specificity. Appl Environ Microbiol. 2003 Feb;69(2):1276-82. STEPNIAK D et al. Highly efficient gluten degradation with a newly identified prolyl endoprotease: implications for celiac disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006 Oct;291(4):G621-9. Epub 2006 May 11. * |
| CHEN YS et al. Identification and characterization of Lactobacillus helveticus PepO2, an endopeptidase with post-proline specificity. Appl Environ Microbiol. 2003 Feb;69(2):1276-82. * |
| SHAN L et al. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases: implications for coeliac sprue. Biochem J. 2004 Oct 15, 311-8. * |
| STEPNIAK D et al. Highly efficient gluten degradation with a newly identified prolyl endoprotease: implications for celiac disease. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006 Oct;291(4):G621-9. Epub 2006 May 11. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT3139961T (pt) | 2018-07-13 |
| CA2946811C (en) | 2022-05-03 |
| WO2015169849A1 (en) | 2015-11-12 |
| CN106488772B (zh) | 2020-11-27 |
| RU2016147586A (ru) | 2018-06-08 |
| JP6532483B2 (ja) | 2019-06-19 |
| EP3139961B1 (en) | 2018-04-04 |
| TR201809421T4 (tr) | 2018-07-23 |
| CA2946811A1 (en) | 2015-11-12 |
| RU2016147586A3 (ru) | 2018-10-05 |
| JP2017514836A (ja) | 2017-06-08 |
| US10709787B2 (en) | 2020-07-14 |
| DK3139961T3 (en) | 2018-07-16 |
| CN106488772A (zh) | 2017-03-08 |
| EP3139961A1 (en) | 2017-03-15 |
| US20170049896A1 (en) | 2017-02-23 |
| ES2675574T3 (es) | 2018-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115066231B (zh) | 合成组织屏障及其用途 | |
| Lu et al. | Mussel-inspired thermoresponsive polypeptide–pluronic copolymers for versatile surgical adhesives and hemostasis | |
| Leichner et al. | Intestinal enzyme delivery: Chitosan/tripolyphosphate nanoparticles providing a targeted release behind the mucus gel barrier | |
| JP6217053B2 (ja) | 新規安定性ペンタデカペプチド塩、その製造方法、医薬製剤の製造におけるその使用及び治療におけるその使用 | |
| US20200215205A1 (en) | An osteoadsorptive fluorogenic substrate of cathepsin k for imaging osteoclast activity and migration | |
| Ribeiro et al. | In Situ Gluten–Chitosan Interlocked Self‐Assembled Supramolecular Architecture Reduces T‐Cell‐Mediated Immune Response to Gluten in Celiac Disease | |
| RU2679638C2 (ru) | Гидрогели метакриловых производных гиалуроновой кислоты для пероральной ферментной терапии глютеновой энтеропатии | |
| US20190275162A1 (en) | Polymers for delivery of factor viii and/or factor ix | |
| JP2632518B2 (ja) | ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体 | |
| Sun et al. | Enzymatically cross-linked arabinoxylan hydrogel: Effect of glucose oxidase on the gel characteristics and oral colon-targeted delivery for Naja atra neurotoxin | |
| Filipović et al. | In Vitro and In Vivo Biocompatibility of Novel Zwitterionic Poly (Beta Amino) Ester Hydrogels Based on Diacrylate and Glycine for Site‐Specific Controlled Drug Release | |
| WO2019131515A1 (ja) | 医薬品原薬用原料又は医薬品用添加物及びこれらを用いた医薬品原薬又は医薬品 | |
| JP2015131805A (ja) | プロテアーゼ阻害のためのシリカ | |
| KR102709709B1 (ko) | 주사 가능한 포도당 산화 효소 고정화 젤라틴 하이드로겔의 종양 재발 억제 용도 | |
| Voisine et al. | Interplay Between Gluten | |
| Tan | Stimulus-Cleavable Linkers for the Controlled Release of Bioactive Molecules: Therapeutic | |
| Al-Salami et al. | Synthesis of peptide derivative as bio adhesive | |
| RS20230390A1 (sr) | Sinteza hidrogelova na bazi poli (metakrilne kiseline) primenom ekološki podobnog inicijatora na bazi vodonik-peroksida, peroksidaze izolovane iz otpadnog materijala i vitamina c | |
| Dwivedi et al. | Fabrication and Evaluation of Colon Targeted Uricase Containing Microbeads for Treatment of Gout | |
| WO2021058818A1 (en) | Novel medical uses of thiol-functionalized polyglycerol derivatives | |
| Lu | Design and feasibility study of calcitonin and cathepsin K inhibitor for colon delivery | |
| Konieczynska | Dissolvable hydrogel-based wound dressings for in vivo applications | |
| ITRM20070327A1 (it) | Vettori colloidali a struttura poliamminoacidica per il rilascio orale di peptidi e proteine e relativo metodo di produzione. |