RU2678988C1 - Method for isolating extracellular vesicles from biological fluids - Google Patents
Method for isolating extracellular vesicles from biological fluids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678988C1 RU2678988C1 RU2018108011A RU2018108011A RU2678988C1 RU 2678988 C1 RU2678988 C1 RU 2678988C1 RU 2018108011 A RU2018108011 A RU 2018108011A RU 2018108011 A RU2018108011 A RU 2018108011A RU 2678988 C1 RU2678988 C1 RU 2678988C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- kda
- final concentration
- explosives
- minutes
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 49
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- -1 for example Substances 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины и может быть использовано для выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей.The invention relates to the field of molecular biology and diagnostic medicine and can be used to isolate extracellular vesicles from biological fluids.
Внеклеточные везикулы (ВВ) биологических жидкостей представляют собой гетерогенную группу покрытых мембраной микрочастиц различного размера, которые продуцируются клетками разных органов и тканей. В составе ВВ обнаружены поверхностные рецепторы, мембранные и растворимые белки, липиды и нуклеиновые кислоты (1, 2). ВВ принимают участие в межклеточной коммуникации за счет горизонтального переноса белков, нуклеиновых кислот и других биологически активных молекул (3). ВВ были обнаружены во всех биологических жидкостях организма: крови, моче, слюне, семенной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже, желчи, асците, грудном молоке, спинномозговой жидкости и т.д. (4, 5). ВВ отличаются стабильностью в биологических жидкостях, распространяются с током жидкостей по органам и тканям, иммунологически инертны, и, в силу небольшого размера, способны проходить через биологические барьеры.Extracellular vesicles (BB) of biological fluids are a heterogeneous group of membrane-coated microparticles of various sizes, which are produced by cells of different organs and tissues. The composition of explosives revealed surface receptors, membrane and soluble proteins, lipids, and nucleic acids (1, 2). BBs take part in intercellular communication due to the horizontal transfer of proteins, nucleic acids, and other biologically active molecules (3). Explosives were found in all body fluids: blood, urine, saliva, seminal fluid, bronchoalveolar lavage, bile, ascites, breast milk, cerebrospinal fluid, etc. (4, 5). Explosives are stable in biological fluids, spread with the flow of fluids through organs and tissues, are immunologically inert, and, due to their small size, are able to pass through biological barriers.
Содержимое ВВ отражает тип и функциональное состояние родительских клеток, и, в зависимости от состава, ВВ могут оказывать разное влияние на клетки-мишени (6). Созревание эритроцитов, адгезия тромбоцитов, лизис клеток, презентация антигенов - вот далеко не полный список процессов, в которых ВВ играют роль посредников (7). Большое значение имеют ВВ при прогрессии опухолевого процесса, перенося онкогенный материал. Кроме того, ВВ участвуют в патогенезе множества заболеваний: нейродегенеративных и аутоиммунных, кардиоваскулярных нарушениях, вирусных инфекциях, прионных болезнях и т.д. (8, 9). ВВ являются перспективным источником биомаркеров различных заболеваний, например микроРНК, и могут представлять собой интерес с точки зрения неинвазивной/малоинвазивной диагностики, оценки эффективности противоопухолевой терапии и прогноза заболевания (10).The contents of the explosive reflect the type and functional state of the parent cells, and, depending on the composition, the explosive may have different effects on the target cells (6). Red blood cell maturation, platelet adhesion, cell lysis, presentation of antigens - this is not a complete list of processes in which explosives play the role of mediators (7). Of great importance are explosives with the progression of the tumor process, transferring oncogenic material. In addition, explosives are involved in the pathogenesis of many diseases: neurodegenerative and autoimmune, cardiovascular disorders, viral infections, prion diseases, etc. (8, 9). Explosive agents are a promising source of biomarkers of various diseases, for example, miRNAs, and may be of interest from the point of view of non-invasive / minimally invasive diagnosis, evaluation of the effectiveness of antitumor therapy, and disease prognosis (10).
Основным препятствием на пути использования ВВ биологических жидкостей в качестве источника диагностических молекул, является низкая эффективность выделения ВВ, а также высокое содержание примесей в виде биополимеров и иных биологических молекул (белки, липопротеины, липиды и их комплексы), которые ингибируют ферменты, используемые в последующем анализе содержимого микровезикул (например, ПЦР) или затрудняют последующий белковый анализ (например, масс-спектроскопия).The main obstacle to using explosive biological fluids as a source of diagnostic molecules is the low efficiency of explosive isolation, as well as a high content of impurities in the form of biopolymers and other biological molecules (proteins, lipoproteins, lipids and their complexes), which inhibit the enzymes used in the future analysis of the contents of microvesicles (e.g., PCR) or subsequent protein analysis (e.g., mass spectroscopy) makes it difficult.
Стандартные методы выделения ВВ, такие как ультрацентрифугирование, требуют дорогостоящего оборудования, они отличаются трудоемкостью, длительностью процедуры выделения и не пригодны для масштабных клинических исследований или использования в диагностических лабораториях.Standard methods for the isolation of explosives, such as ultracentrifugation, require expensive equipment, they are labor intensive, the duration of the extraction procedure, and are not suitable for large-scale clinical studies or use in diagnostic laboratories.
Таким образом, разработка простых, эффективных, экономичных и производительных методов выделения ВВ, пригодных для последующего анализа (ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ, полногеномное секвенирование, масспектрометрия и протеомные исследования) является актуальной задачей современной молекулярной биологии и диагностической медицины.Thus, the development of simple, effective, economical, and productive methods for extracting explosives suitable for subsequent analysis (RT-PCR, microarray analysis, genome-wide sequencing, mass spectrometry, and proteomic studies) is an urgent task of modern molecular biology and diagnostic medicine.
Известен способ выделения ВВ из биологических жидкостей, включающий центрифугирование образца при 100.000-200.000 g в течение приблизительно 140 минут. Полученный после ультрацентрифугирования осадок ВВ ресуспендируют в физиологическом растворе (11).A known method of separation of explosives from biological fluids, including centrifuging the sample at 100,000-200,000 g for approximately 140 minutes. The explosive precipitate obtained after ultracentrifugation is resuspended in physiological saline (11).
Известен способ выделения ВВ из клеточных культур путем ультрафильтрации, суть которой заключается в использовании фильтров с размером пор 0.8 мкм, 0.45 мкм, 0.22 мкм, 0.1 мкм, позволяющих задерживать частицы диаметром более 800 нм, 450 нм, 200 нм и 100 нм соответственно. Таким образом, концентрируется фракция везикул определенного размера (12).A known method for the separation of explosives from cell cultures by ultrafiltration, the essence of which is to use filters with pore sizes of 0.8 μm, 0.45 μm, 0.22 μm, 0.1 μm, allowing to detain particles with a diameter of more than 800 nm, 450 nm, 200 nm and 100 nm, respectively. Thus, a fraction of a certain size of vesicles is concentrated (12).
Основными недостатками вышеназванных способов являются высокая стоимость, низкая производительность, трудоемкость процесса выделения, зависимость результата выделения от квалификации исполнителя и сложность автоматизации процесса выделения ВВ.The main disadvantages of the above methods are high cost, low productivity, the complexity of the selection process, the dependence of the selection result on the skills of the contractor and the complexity of automating the process of extracting explosives.
Наиболее близким к предлагаемому способу - прототипом, является способ выделения ВВ из сыворотки крови, включающий этап удаления из исследуемого образца клеток и клеточного дебриса, добавление к полученному супернатанту 50% раствора гидрофильного полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол. массой 6000 Да для снижения растворимости и агрегации ВВ, инкубацию смеси в течение 30 минут и последующее осаждение ВВ при помощи низкоскоростного центрифугирования (1500g). Полученный осадок ВВ ресуспензируют в воде и используют для определения концентрации соответствующего биомаркера, например, микроРНК (13). Время выделения целевого продукта составляет 1 час.Closest to the proposed method, the prototype, is a method for extracting explosives from blood serum, including the step of removing cells and cell debris from the test sample, adding to the obtained supernatant a 50% solution of a hydrophilic polymer of polyethylene glycol (PEG) with mol. mass of 6000 Da to reduce the solubility and aggregation of explosives, incubate the mixture for 30 minutes and then precipitate explosives by low-speed centrifugation (1500g). The resulting explosive precipitate is resuspended in water and used to determine the concentration of the corresponding biomarker, for example, miRNA (13). The time of isolation of the target product is 1 hour.
Недостатками прототипа являются недостаточный выход и чистота целевого продукта, а также высокая стоимость его выделения (при использовании коммерческих наборов реактивов, например, ExoQuick). Как следствие, полученные результаты о содержании микроРНК в составе ВВ являются недостоверными.The disadvantages of the prototype are the insufficient yield and purity of the target product, as well as the high cost of its isolation (when using commercial reagent kits, for example, ExoQuick). As a result, the results obtained on the content of microRNAs in the composition of explosives are unreliable.
Задачей изобретения является сокращение длительности способа, увеличение выхода ВВ, сокращение материальных затрат на выделение ВВ.The objective of the invention is to reduce the duration of the method, increase the yield of explosives, reduce material costs for the allocation of explosives.
Технический результат: повышение выхода целевого продукта, сокращение длительности способа.Effect: increasing the yield of the target product, reducing the duration of the method.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The problem is achieved by the proposed method, which consists in the following.
Для уменьшения загрязнения препарата невезикулярными частицами (клетки, клеточный дебрис, апоптические тельца) на первом этапе образец биологической жидкости подвергают низкоскоростномуTo reduce contamination of the drug with non-vesicular particles (cells, cell debris, apoptotic bodies), at the first stage, the biological fluid sample is subjected to a low-speed
центрифугированию сначала при 300-400g в течение 20 минут и 800g в течение 20 минут, затем центрифугированию при 16.000-18.000g в течение 20 минут для крови или 300-400g в течение 20 минут и 16.000-18.000g в течение 20 минут для мочи. Отбирают супернатант и переносят в новую емкость. Затем к полученному супернатанту последовательно добавляют раствор NaCl до концентрации 0,154-0,3М для выделения из мочи или 0,48-0,6М для выделения из плазмы крови, далее добавляют раствор, содержащий 1М TrisHCl рН 7.0 до конечной концентрации 50 мМ, затем раствор декстрана синего (Dextran Blue) с мол. массой 2000 кДа до конечной концентрации 4-8 мкг/мл и полиэтиленгликоль (ПЭГ) с мол. массой 20 кДа до концентрации 1,5-5%. Смесь перемешивают после добавления каждого компонента, инкубируют в течение 20 минут при 4°С и центрифугируют при 16.000-18.000g в течение 20 минут. Полученный супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в PBS и используют для определения концентрации (количественного анализа) требуемых биомаркеров, например, микроРНК. Время выделения ВВ после пробоподготовки, включающей осаждение клеток и клеточного дебриса, составляет 50 минут. Для дальнейшего использования в диагностических тестах из препаратов ВВ выделяют белки, либо мРНК или микроРНК любым пригодным методом.centrifugation first at 300-400g for 20 minutes and 800g for 20 minutes, then centrifugation at 16.000-18.000g for 20 minutes for blood or 300-400g for 20 minutes and 16.000-18.000g for 20 minutes for urine. The supernatant is removed and transferred to a new container. Then, NaCl solution is successively added to the obtained supernatant to a concentration of 0.154-0.3 M for excretion from urine or 0.48-0.6 M for excretion from blood plasma, then a solution containing 1 M TrisHCl pH 7.0 is added to a final concentration of 50 mM, then the solution Dextran Blue (Dextran Blue) with a pier. mass of 2000 kDa to a final concentration of 4-8 μg / ml and polyethylene glycol (PEG) with mol. mass of 20 kDa to a concentration of 1.5-5%. The mixture is stirred after each component is added, incubated for 20 minutes at 4 ° C and centrifuged at 16.000-18.000g for 20 minutes. The resulting supernatant is removed, the pellet is resuspended in PBS and used to determine the concentration (quantitative analysis) of the desired biomarkers, for example, miRNAs. The time for the release of explosives after sample preparation, including the deposition of cells and cell debris, is 50 minutes. For further use in diagnostic tests, proteins are isolated from explosive preparations, either mRNA or miRNA by any suitable method.
Количественный анализ ДНК, мРНК или микроРНК в препаратах ВВ также проводят любым известным методом исследования нуклеиновых кислот, как то: обычная, количественная ПЦР или ОТ-ПЦР, метод измерения концентрации нуклеиновых кислот при помощи флуоресцентных красителей (RiboGreen, SYBR Green II и т.д.). Для определения белков используют как исходный препарат ВВ, так и препараты ВВ, обработанные детергентами. Измерения белков выполняют при помощи стандартных биохимических, иммунохимических методов, методов масс-спектрометрического анализа или цитофлуорометрии.Quantitative analysis of DNA, mRNA or miRNA in BB preparations is also carried out by any known method of nucleic acid research, such as conventional, quantitative PCR or RT-PCR, a method for measuring the concentration of nucleic acids using fluorescent dyes (RiboGreen, SYBR Green II, etc. .). To determine the proteins, both the initial explosive preparation and the explosive preparations treated with detergents are used. Protein measurements are performed using standard biochemical, immunochemical, mass spectrometric or cytofluorometric methods.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:The defining hallmarks of the proposed method, compared with the prototype, are:
К полученному супернатанту последовательно добавляют раствор, содержащий NaCl до конечной концентрации 0,15-0,3М (в моче) или 0,48-0,6М (в плазме крови), затем раствор, содержащий 1М Tris HQ рН 7.0 до конечной концентрации 50 мМ, далее к полученному раствору добавляют декстран синий (Dextran Blue) с мол. массой 2000 кДа до конечной концентрации 4-8 мкг/мл, и полиэтиленгликоль (ПЭГ) с мол. массой 20 кДа до конечной концентрации 1,5-5,0%, что позволяет сократить длительность выделения на 16.67% по сравнению с прототипом, повысить выход и чистоту целевого продукта.To the obtained supernatant is added successively a solution containing NaCl to a final concentration of 0.15-0.3 M (in urine) or 0.48-0.6 M (in blood plasma), then a solution containing 1 M Tris HQ pH 7.0 to a final concentration of 50 mm, then to the resulting solution add Dextran Blue (Dextran Blue) with a mol. mass of 2000 kDa to a final concentration of 4-8 μg / ml, and polyethylene glycol (PEG) with mol. mass of 20 kDa to a final concentration of 1.5-5.0%, which allows to reduce the duration of isolation by 16.67% compared with the prototype, to increase the yield and purity of the target product.
Добавление к полученному супернатанту раствора, содержащего NaCl позволяет уменьшить количество агрегатов и исключить их соосаждение на последующих этапах выделения микрочастиц. Последующее добавление к супернатанту раствора, содержащего 1М Tris HCl рН 7.0, создает оптимальные условия для осаждения ВВ. Использование Dextran Blue с мол. массой 2000 кДа инициирует агрегацию микрочастиц, что позволяет в дальнейшем более эффективно осаждать мембран-покрытые частицы, по сравнению с не содержащими мембран микрочастицами, крупными биополимерами и надмолекулярными комплексами, добавлением в смесь ПЭГ с мол. массой 20 кДа в более низкой концентрации по сравнению с прототипом, позволяет эффективно преципитировать ВВ биологических жидкостей в присутствие Dextran Blue при помощи низкоскоростного центрифугирования и уменьшить соосаждение высокополимерных белков, протеогликанов и надмолекулярных комплексов биополимеров.Adding to the obtained supernatant a solution containing NaCl allows one to reduce the number of aggregates and to exclude their coprecipitation at subsequent stages of microparticle isolation. Subsequent addition to the supernatant of a solution containing 1M Tris HCl pH 7.0 creates optimal conditions for the precipitation of explosives. Using Dextran Blue Mol. mass of 2000 kDa initiates the aggregation of microparticles, which makes it possible to further precipitate membrane-coated particles, compared with membrane-free microparticles, large biopolymers and supramolecular complexes, adding PEG with mol. mass of 20 kDa in a lower concentration compared to the prototype, allows you to effectively precipitate explosive biological fluids in the presence of Dextran Blue using low-speed centrifugation and reduce the coprecipitation of high-polymer proteins, proteoglycans and supramolecular complexes of biopolymers.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и эффективно выделять ВВ из плазмы крови и мочи.Thus, the proposed method allows you to quickly and efficiently allocate explosives from blood plasma and urine.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific performance of the method.
Пример 1. Выделение ВВ из мочи.Example 1. The allocation of explosives from urine.
Образец мочи (30 мл) подвергали низкоскоростному центрифугированию сначала при 300g в течение 20 минут, затем при 16.000 g в течение 20 мин. Отбирали супернатант и переносили в новую пробирку. К 5 мл супернатанта добавляли 2 мл раствора, содержащего 0,54 М NaCl (рН=8,7), 175 мМ TrisHCl рН 7.0, затем добавляли Dextran Blue с мол. массой 2000 кДа с концентрацией 14 мкг/мл и 5.25% ПЭГ с мол. массой 20 кДа, при этом конечные концентрации компонентов осаждающего раствора составляли: 0,154М NaCl, 50 мМ TrisHCl, 4 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 1,5% ПЭГ (20 кДа). Полученный раствор перемешивали на встряхивателе в течение 3-5 секунд и инкубировали в течение 20 минут при 4°С. Затем ВВ осаждали из получившегося преципитата центрифугированием при 16.000 g (Eppendorf 5810 г) в течение 20 минут. Супернатант удаляли, осадок растворяли в 500 мкл раствора PBS (фосфатный буферный раствор).A urine sample (30 ml) was subjected to low-speed centrifugation, first at 300g for 20 minutes, then at 16,000 g for 20 minutes. The supernatant was taken and transferred to a new tube. To 5 ml of the supernatant was added 2 ml of a solution containing 0.54 M NaCl (pH = 8.7), 175 mM TrisHCl pH 7.0, then Dextran Blue with a mol. mass of 2000 kDa with a concentration of 14 μg / ml and 5.25% PEG with mol. mass of 20 kDa, while the final concentrations of the components of the precipitating solution were: 0.154 M NaCl, 50 mm TrisHCl, 4 μg / ml Dextran Blue (2000 kDa), 1.5% PEG (20 kDa). The resulting solution was stirred on a shaker for 3-5 seconds and incubated for 20 minutes at 4 ° C. Then, explosives were precipitated from the resulting precipitate by centrifugation at 16,000 g (Eppendorf 5810 g) for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 500 μl of a solution of PBS (phosphate buffer solution).
Для того, чтобы оценить эффективность выделения ВВ из мочи, в полученном препарате (целевой продукт) определяли концентрацию микроРНК.In order to evaluate the effectiveness of the allocation of explosives from urine, the concentration of microRNA was determined in the resulting preparation (target product).
МикроРНК из ВВ выделяли по описанной ранее методике (14) и переосаждали в присутствие гликогена (конечная концентрация 112 мкг/мл) 2-х кратным объемом изопропанола (30 минут при -20°С, центрифугирование при 13000 g (Eppendorf 5810 г) в течение 15 мин при 4°С). Осадок последовательно промывали 75% и 96% этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 30 мкл воды.MicroRNAs from BB were isolated according to the previously described method (14) and reprecipitated in the presence of glycogen (final concentration 112 μg / ml) with a 2-fold volume of isopropanol (30 minutes at -20 ° С, centrifugation at 13000 g (Eppendorf 5810 g) for 15 min at 4 ° C). The precipitate was washed successively with 75% and 96% ethanol, dried in air and dissolved in 30 μl of water.
Далее, выделенные микроРНК анализировали методом ОТ-ПЦР в реальном времени (15), позволяющим селективно выявлять микроРНК с высокой чувствительностью и специфичностью. Метод ОТ-ПЦР включает в себя обратную транскрипцию микроРНК с помощью праймера со шпилькой, с последующей детекцией полученной кДНК с помощью ПЦР в реальном времени.Further, the isolated miRNAs were analyzed by real-time RT-PCR (15), which allows the selective detection of miRNAs with high sensitivity and specificity. The RT-PCR method involves reverse transcription of miRNAs using a hairpin primer, followed by real-time PCR detection of the resulting cDNA.
Для обратной транскрипции использовали праймеры RT: RT 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTT-3' (hsa-miR-19b) и ревертазу (Fermentas, Vilnius, Lithuania).For reverse transcription, RT primers were used: RT 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTT-3 '(hsa-miR-19b) and revertase (Fermentas, Vilnius, Lithuania).
Условия обратной транскрипции: 16°С - 30 мин, 42°С - 30 мин, 70°С - 10 мин.Reverse transcription conditions: 16 ° С - 30 min, 42 ° С - 30 min, 70 ° С - 10 min.
Для ПЦР использовали: Universal Reverse Primer 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3', Forward: 5'-CGCTGTGCAAATCCATGCAA-3' Probe: 5'-(FAM)-GCACTGGATACGACTCAGTT-(FQ)-3' (hsa-miR-19b).For PCR, we used: Universal Reverse Primer 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3 ', Forward: 5'-CGCTGTGCAAATCCATGCAA-3' Probe: 5 '- (FAM) -GCACTGGATACGACTCAGTT- (FQ) -3' (hsa-miR-19b).
После первоначальной денатурации при 95°С в течение 3 мин, реакции проводили в течение 50 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 45 с. Праймеры и зонды для обратной транскрипции и TaqMan qPCR были синтезированы в лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН, Новосибирск.After initial denaturation at 95 ° C for 3 min, the reactions were carried out for 50 cycles at 95 ° C for 15 s and 60 ° C for 45 s. Primers and probes for reverse transcription and TaqMan qPCR were synthesized at the Laboratory of Medical Chemistry, Institute of Chemistry and Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk.
Пример 2. Выделение ВВ из мочи.Example 2. The allocation of explosives from urine.
Образец мочи (30 мл) подвергали низкоскоростному центрифугированию сначала при 400g в течение 20 минут, затем при 18.000 g в течение 20 мин. Отбирали супернатант и переносили в новую пробирку. К 5 мл супернатанта добавляли 2 мл раствора, содержащего 1.05 М NaCl (рН=8,7), 175 мМ TrisHCl рН 7.0, затем добавляли Dextran Blue с мол. массой 2000 кДа с концентрацией 28 мкг/мл и 17.5% ПЭГ с мол. массой 20 кДа, при этом конечные концентрации компонентов осаждающего раствора составляли: 0,3M NaCl, 50 мМ TrisHCl, 8 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 5,0% ПЭГ (20 кДа).A urine sample (30 ml) was subjected to low-speed centrifugation, first at 400g for 20 minutes, then at 18,000 g for 20 minutes. The supernatant was taken and transferred to a new tube. To 5 ml of the supernatant was added 2 ml of a solution containing 1.05 M NaCl (pH = 8.7), 175 mM TrisHCl pH 7.0, then Dextran Blue with a mol. mass of 2000 kDa with a concentration of 28 μg / ml and 17.5% PEG per mol. mass of 20 kDa, while the final concentrations of the components of the precipitating solution were: 0.3 M NaCl, 50 mm TrisHCl, 8 μg / ml Dextran Blue (2000 kDa), 5.0% PEG (20 kDa).
Полученный раствор перемешивали на встряхивателе в течение 3-5 секунди инкубировали в течение 20 минут при 4°С. Затем ВВ осаждали из получившегося преципитата центрифугированием при 16.000-18.000 g (Eppendorf 5810r) в течение 20 минут. Супернатант удаляли, осадок растворяли в 500 мкл раствора PBS.The resulting solution was stirred on a shaker for 3-5 seconds, incubated for 20 minutes at 4 ° C. Then, explosives were precipitated from the resulting precipitate by centrifugation at 16,000-18,000 g (Eppendorf 5810r) for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 500 μl of PBS solution.
Далее выделяли микроРНК и проводили ОТ-ПЦР аналогично примеру 1.Next, microRNAs were isolated and RT-PCR was carried out analogously to example 1.
Сравнительный анализ эффективности выделения микроРНК из фракции микрочастиц мочи, полученной заявляемым способом, способом-прототипом (выделение ВВ с помощью ПЭГ (6000 Да), а также с различными растворами для осаждения ВВ, представлен в таблице 1, где Ct - значение порогового цикла, ΔCt - разница значений пороговых циклов, SD - стандартное отклонение, * - номер донора. Чем меньше разница значений пороговых циклов, тем больше микроРНК содержится в образце и соответственно выше выход.A comparative analysis of the efficiency of microRNA isolation from the fraction of urine microparticles obtained by the claimed method, the prototype method (the allocation of explosives using PEG (6000 Da), as well as with various solutions for precipitation of explosives, is presented in table 1, where Ct is the value of the threshold cycle, ΔCt - difference in threshold cycle values, SD - standard deviation, * - donor number. The smaller the difference in threshold cycle values, the more microRNA is contained in the sample and, accordingly, the higher the yield.
Из таблицы 1 следует, что наиболее оптимально удаление ингибиторов PCR и выделение ВВ из мочи происходит при следующем составе осаждающего раствора: 0,154М NaCl, 50 мМ TrisHCl, 4 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 1,5% ПЭГ (20 кДа) и 0,3 М NaCl, 50 мМ TrisHCl, 8 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 5,0% ПЭГ (20 кДа).From table 1 it follows that the most optimal removal of PCR inhibitors and the release of explosives from urine occurs with the following composition of the precipitating solution: 0.154 M NaCl, 50 mm TrisHCl, 4 μg / ml Dextran Blue (2000 kDa), 1.5% PEG (20 kDa ) and 0.3 M NaCl, 50 mM TrisHCl, 8 μg / ml Dextran Blue (2000 kDa), 5.0% PEG (20 kDa).
Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом: позволяет выделять ВВ из мочи с большей эффективностью по сравнению с прототипом и ультрацентрифугированием; позволяет сократить время выделения ВВ на 16.67% по сравнению с прототипом и на 65% по сравнению с ультрацентрифугированием.The proposed method has the following advantages compared with the prototype: allows you to allocate explosives from urine with greater efficiency compared with the prototype and ultracentrifugation; allows to reduce the time of the allocation of explosives by 16.67% compared with the prototype and by 65% compared with ultracentrifugation.
Пример 3. Выделение ВВ из плазмы крови.Example 3. Isolation of explosives from blood plasma.
Образец крови (8 мл) подвергали низкоскоростному центрифугированию сначала при 400g в течение 20 минут, затем 800g в течение 20 минут и далее при 16.000 g в течение 20 мин. Отбирали плазму крови и переносили в новую пробирку.A blood sample (8 ml) was subjected to low speed centrifugation, first at 400g for 20 minutes, then 800g for 20 minutes and then at 16,000 g for 20 minutes. Blood plasma was taken and transferred to a new tube.
К 2 мл плазмы крови здоровых доноров добавляли 8 мл раствора, содержащего 2.4М NaCl, 250 мМ TrisHCl рН 7.0, Dextran Blue (20 мкг/мл) и 7.5% раствора ПЭГ(20кДа), при этом конечные концентрации компонентов осаждающего раствора составляли: 0,48М NaCl, 50 мМ TrisHCl, Dextran Blue - 4 мкг/мл, а ПЭГ (20 кДа), - 1,5%. Полученный раствор перемешивали на встряхивателе в течение 3-5 секунд, полученный раствор инкубировали в течение 30 минут при 4°С и осаждали получившийся преципитат центрифугированием при 18.000 g (Eppendorf 5810 г) в течение 20 минут. Супернатант удаляли, осадок растворяли в 500 мкл раствора PBS.To 2 ml of blood plasma from healthy donors was added 8 ml of a solution containing 2.4 M NaCl, 250 mM TrisHCl pH 7.0, Dextran Blue (20 μg / ml) and 7.5% PEG solution (20 kDa), while the final concentrations of the components of the precipitating solution were: 0 , 48 M NaCl, 50 mM TrisHCl, Dextran Blue - 4 μg / ml, and PEG (20 kDa) - 1.5%. The resulting solution was stirred on a shaker for 3-5 seconds, the resulting solution was incubated for 30 minutes at 4 ° C, and the resulting precipitate was precipitated by centrifugation at 18,000 g (Eppendorf 5810 g) for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 500 μl of PBS solution.
Для того, чтобы оценить эффективность выделения ВВ из плазмы крови, в полученном препарате определяли концентрацию микроРНК. МикроРНК из ВВ выделяли по описанной ранее методике (14) и переосаждали в присутствие гликогена (конечная концентрация 112 мкг/мл) 2-х кратным объемом изопропанола (30 минут при -20°С, центрифугирование при 13000 g (Eppendorf 5810 г) в течение 15 мин при 4°С). Осадок последовательно промывали 75% и 96% этанолом, сушили на воздухе и растворяли в 30 мкл воды.In order to evaluate the effectiveness of the release of explosives from blood plasma, the concentration of microRNA was determined in the resulting preparation. MicroRNAs from BB were isolated according to the previously described method (14) and reprecipitated in the presence of glycogen (final concentration 112 μg / ml) with a 2-fold volume of isopropanol (30 minutes at -20 ° С, centrifugation at 13000 g (Eppendorf 5810 g) for 15 min at 4 ° C). The precipitate was washed successively with 75% and 96% ethanol, dried in air and dissolved in 30 μl of water.
Далее проводили ОТ-ПЦР аналогично примеру 1.Next, RT-PCR was carried out analogously to example 1.
Пример 4. Выделение ВВ из плазмы крови.Example 4. Isolation of explosives from blood plasma.
Образец крови (8 мл) подвергали низкоскоростному центрифугированию сначала при 400g в течение 20 минут, затем 800g в течение 20 минут и далее при 16.000-18.000 g в течение 20 мин. Отбирали плазму крови и переносили в новую пробирку.A blood sample (8 ml) was subjected to low-speed centrifugation, first at 400g for 20 minutes, then 800g for 20 minutes and then at 16,000-18,000 g for 20 minutes. Blood plasma was taken and transferred to a new tube.
К 2 мл плазмы крови здоровых доноров добавляли 8 мл раствора, содержащего 3М NaCl, 250 мМ TrisHCl рН 7.0, Dextran Blue (40 мкг/мл) и 25% раствора ПЭГ (20 кДа), при этом конечные концентрации компонентов осаждающего раствора составляли: 0,6М NaCl, 50 мМ TrisHCl, Dextran Blue - 8 мкг/мл, а ПЭГ (20 кДа) - 5,0%. Полученный раствор перемешивали на встряхивателе в течение 3-5 секунд и инкубировали в течение 30 минут при 4°С и осаждали получившийся преципитат центрифугированием при 18.000 g (Eppendorf 5810 г) в течение 20 минут. Супернатант удаляли, осадок растворяли в 500 мкл раствора PBS.To 2 ml of blood plasma from healthy donors was added 8 ml of a solution containing 3M NaCl, 250 mM TrisHCl pH 7.0, Dextran Blue (40 μg / ml) and 25% PEG solution (20 kDa), while the final concentrations of the components of the precipitating solution were: 0 , 6 M NaCl, 50 mM TrisHCl, Dextran Blue - 8 μg / ml, and PEG (20 kDa) - 5.0%. The resulting solution was stirred on a shaker for 3-5 seconds and incubated for 30 minutes at 4 ° C and the resulting precipitate was precipitated by centrifugation at 18,000 g (Eppendorf 5810 g) for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 500 μl of PBS solution.
После добавления каждого компонента смесь тщательно перемешивали на встряхивателе и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Затем ВВ осаждали из получившегося преципитата центрифугированием при 18.000 g (Eppendorf 5810 г) в течение 20 минут. Супернатант удаляли, осадок растворяли в 500 мкл раствора PBS. Далее выделяли микроРНК и проводили ОТ-ПЦР аналогично примеру 3.After adding each component, the mixture was thoroughly mixed on a shaker and incubated for 30 minutes at 4 ° C. Then, explosives were precipitated from the resulting precipitate by centrifugation at 18,000 g (Eppendorf 5810 g) for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in 500 μl of PBS solution. Next, miRNAs were isolated and RT-PCR was carried out analogously to example 3.
В таблице 2 представлен сравнительный анализ эффективности выделения микроРНК из ВВ (фракции микрочастиц) плазмы крови, полученных разными способами, где: Ct - значение порогового цикла, ΔCt - разница значений пороговых циклов, SD - стандартное отклонение, * - номер донора. В таблице представлена относительная экспрессия микроРНК во фракциях микрочастиц, полученных заявляемым способом и способом-прототипом.Table 2 presents a comparative analysis of the efficiency of microRNA isolation from explosives (microparticle fractions) of blood plasma obtained in different ways, where: Ct is the value of the threshold cycle, ΔCt is the difference in the values of threshold cycles, SD is the standard deviation, * is the number of the donor. The table shows the relative expression of microRNA in fractions of microparticles obtained by the claimed method and the prototype method.
Из таблицы 2, следует, что наиболее оптимально удаление ингибиторов PCR и выделение ВВ из плазмы крови происходит при следующем составе осаждающего раствора: 0,48М NaCl, 50 мМ TrisHCl, 4 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 1,5% ПЭГ (20 кДа) и 0,6М NaCl, 50 мМ TrisHCl, 8 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 5,0% ПЭГ (20 кДа).From table 2, it follows that the most optimal removal of PCR inhibitors and the release of explosives from blood plasma occurs with the following composition of the precipitating solution: 0.48 M NaCl, 50 mm TrisHCl, 4 μg / ml Dextran Blue (2000 kDa), 1.5% PEG (20 kDa) and 0.6 M NaCl, 50 mM TrisHCl, 8 μg / ml Dextran Blue (2000 kDa), 5.0% PEG (20 kDa).
Предлагаемый способ позволяет выделять ВВ из плазмы крови с большей эффективностью и позволяет сократить время выделения ВВ на 16.67% по сравнению с прототипом и на 65% по сравнению с ультрацентрифугированием.The proposed method allows to extract explosives from blood plasma with greater efficiency and allows to reduce the time of allocation of explosives by 16.67% compared with the prototype and 65% compared with ultracentrifugation.
Источники информацииInformation sources
1. Camussi G, Deregibus MC, Bruno S, Grange C, Fonsato V, Tetta C. Exosome/microvesicle-mediated epigenetic reprogramming of cells. Am J Cancer Res. 2011; 1:98-110.1. Camussi G, Deregibus MC, Bruno S, Grange C, Fonsato V, Tetta C. Exosome / microvesicle-mediated epigenetic reprogramming of cells. Am J Cancer Res. 2011; 1: 98-110.
2. Abels ER, Breakefield XO. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobio. 2016; 36:301-12.2. Abels ER, Breakefield XO. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobio. 2016; 36: 301-12.
3. Borges FT, Melo SA,
4. Hu G, Drescher KM, MingChen X. Exosomal miRNAs: biological properties and therapeutic potential. Frontiers in genetics. 2012; 3:56.4. Hu G, Drescher KM, MingChen X. Exosomal miRNAs: biological properties and therapeutic potential. Frontiers in genetics. 2012; 3:56.
5. Gonda DD, Akers JC, Kim R, Kalkanis SN, Hochberg FH, Chen CC, Carter BS. Neuro-oncologic applications of exosomes, microvesicles, and other nano-sized extracellular particles. Neurosurgery. 2013; 72:4.5. Gonda DD, Akers JC, Kim R, Kalkanis SN, Hochberg FH, Chen CC, Carter BS. Neuro-oncologic applications of exosomes, microvesicles, and other nano-sized extracellular particles. Neurosurgery. 2013; 72: 4.
6.
7. Kaur A, Leishangthem GD, Bhat P, Mahajan V, Dev Singh N, Banga HS. Role of Exosomes in Pathology. J of Pathol and Toxicol. 2014; 1:7-11.7. Kaur A, Leishangthem GD, Bhat P, Mahajan V, Dev Singh N, Banga HS. Role of Exosomes in Pathology. J of Pathol and Toxicol. 2014; 1: 7-11.
8. Iraci N, Leonardi T, Gessler F, Vega B, Pluchino S. Focus on extracellular vesicles: physiological role and signaling properties of extracellular membrane vesicles. Int J Mol Sci. 2016; 17:171.8. Iraci N, Leonardi T, Gessler F, Vega B, Pluchino S. Focus on extracellular vesicles: physiological role and signaling properties of extracellular membrane vesicles. Int J Mol Sci. 2016; 17: 171.
9. Boukouris S, Mathivanan S. Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers. Proteomics Clin Appl. 2015; 9:358-367.9. Boukouris S, Mathivanan S. Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers. Proteomics Clin Appl. 2015; 9: 358-367.
10. Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; 3:3.22.10. Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; 3: 3.22.
11. Witwer KW, Buzas EI, Bemis LT, et. Al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2013; 2:1-25.11. Witwer KW, Buzas EI, Bemis LT, et. Al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2013; 2: 1-25.
12. Crescitelli R, Lasser C, Szabo GT, Kittel A, Eldh M, Dianzani I, Buza EI, Lotvall J. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. J of Extracell Vesicles. 2013; 2:20677.12. Crescitelli R, Lasser C, Szabo GT, Kittel A, Eldh M, Dianzani I, Buza EI, Lotvall J. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. J of Extracell Vesicles. 2013; 2: 20677.
13. Andreu Z, Rivas E, Sanguino-Pascual A, Lamana A, Marazuela M, Gonzalez-Alvaro I, Sanchez-Madrid F, de la Fuente H, Yanez-Mo M. Comparative analysis of EV isolation procedures for miRNAs detection in serum samples. J of Extracell Vesicles. 2016; 5:31655.13. Andreu Z, Rivas E, Sanguino-Pascual A, Lamana A, Marazuela M, Gonzalez-Alvaro I, Sanchez-Madrid F, de la Fuente H, Yanez-Mo M. Comparative analysis of EV isolation procedures for miRNAs detection in serum samples. J of Extracell Vesicles. 2016; 5: 31655.
14. Lekchnov EA, Zaporozhchenko IA, Morozkin ES, Bryzgunova OE, Vlassov VV, Laktionov PP. Protocol for miRNA isolation from biofluids. Anal Biochem. 2016; 499: 78-84.14. Lekchnov EA, Zaporozhchenko IA, Morozkin ES, Bryzgunova OE, Vlassov VV, Laktionov PP. Protocol for miRNA isolation from biofluids. Anal Biochem. 2016; 499: 78-84.
15. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res., 33 (2005), p. E17915. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res., 33 (2005), p. E179
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108011A RU2678988C1 (en) | 2018-03-05 | 2018-03-05 | Method for isolating extracellular vesicles from biological fluids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108011A RU2678988C1 (en) | 2018-03-05 | 2018-03-05 | Method for isolating extracellular vesicles from biological fluids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2678988C1 true RU2678988C1 (en) | 2019-02-05 |
Family
ID=65273787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018108011A RU2678988C1 (en) | 2018-03-05 | 2018-03-05 | Method for isolating extracellular vesicles from biological fluids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2678988C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741776C1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-01-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for plasma exosome release |
| CN115200969A (en) * | 2021-09-28 | 2022-10-18 | 武汉博越致和生物科技有限公司 | Method and kit for efficiently separating and purifying plasma exosomes |
| RU2801339C1 (en) * | 2022-12-01 | 2023-08-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of using extracellular folicular fluid vesicles to increase human spermatozoa mobility in virtue fertilization programs |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015166414A1 (en) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec | Polimeric substrates with immobilized antibodies and method of production thereof |
| RU2583940C1 (en) * | 2014-12-17 | 2016-05-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of determining composition of individual extracellular vesicles in human blood |
| CN106289927A (en) * | 2016-08-28 | 2017-01-04 | 浙江省中医院 | A kind of from tumor cell supernatant, separate microcapsule bubble and the method for secreting outward body thereof |
| EP3246703A1 (en) * | 2016-05-20 | 2017-11-22 | Unicyte EV AG | Method and kit for capturing extracellular vesicles (evs) on a solid surface |
-
2018
- 2018-03-05 RU RU2018108011A patent/RU2678988C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015166414A1 (en) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec | Polimeric substrates with immobilized antibodies and method of production thereof |
| RU2583940C1 (en) * | 2014-12-17 | 2016-05-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of determining composition of individual extracellular vesicles in human blood |
| EP3246703A1 (en) * | 2016-05-20 | 2017-11-22 | Unicyte EV AG | Method and kit for capturing extracellular vesicles (evs) on a solid surface |
| CN106289927A (en) * | 2016-08-28 | 2017-01-04 | 浙江省中医院 | A kind of from tumor cell supernatant, separate microcapsule bubble and the method for secreting outward body thereof |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741776C1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-01-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for plasma exosome release |
| CN115200969A (en) * | 2021-09-28 | 2022-10-18 | 武汉博越致和生物科技有限公司 | Method and kit for efficiently separating and purifying plasma exosomes |
| RU2806434C1 (en) * | 2022-08-10 | 2023-10-31 | Анастасия Валерьевна Малек | Method for removing extracellular nanovesicles from blood plasma using covalently immobilized dna aptamers |
| RU2801339C1 (en) * | 2022-12-01 | 2023-08-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of using extracellular folicular fluid vesicles to increase human spermatozoa mobility in virtue fertilization programs |
| RU2845376C1 (en) * | 2024-11-07 | 2025-08-18 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Сколковский институт науки и технологий" (Сколковский институт науки и технологий) | Method of extracting exosomes from biological fluids using particles modified with tannic acid |
| RU2846705C1 (en) * | 2024-12-30 | 2025-09-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медицинского медико-биологичекого агентства" | Method of extracting extracellular vesicles from human biological fluids |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9829483B2 (en) | Methods of isolating extracellular vesicles | |
| Rider et al. | ExtraPEG: a polyethylene glycol-based method for enrichment of extracellular vesicles | |
| EP2839278B1 (en) | Methods for exosome isolation | |
| EP2713163B1 (en) | Methods for isolating vesicles | |
| EP2875348B1 (en) | Method for the isolation of microvesicles | |
| CN109355258B (en) | Extracting agent for extracting extracellular vesicles from body fluid and extraction method thereof | |
| CN106399250A (en) | Method and kit for separating exosome | |
| WO2011100458A2 (en) | Methods for fractionating and processing microparticles from biological samples and using them for biomarker discovery | |
| AU2012250498A1 (en) | A method of diagnosing neoplasms | |
| EP4353815A1 (en) | Method for isolating extracellular vesicle using salt fractional precipitation | |
| RU2678988C1 (en) | Method for isolating extracellular vesicles from biological fluids | |
| JP2018518171A (en) | Automatable method for isolation of nucleic acids | |
| US20130052647A1 (en) | Methods for fractionating and processing microparticles from biological samples and using them for biomarker discovery | |
| CN110073195B (en) | Method and kit for extracting exosomes and biomacromolecules bound with exosomes | |
| CN102115739A (en) | Method, reagent and kit for isolating nucleic acid | |
| AU2019271436B2 (en) | Isolation of extracellular vesicles by precipitation or immobilization using polyethylenimine and polyethylenimine-coated solid supports | |
| RU2603098C1 (en) | Method for extracting circulating dna from plasma or blood serum | |
| CN116970560A (en) | Extracellular vesicles and method for extracting EV-RNA | |
| RU2824663C1 (en) | Exosome recovery kit | |
| Kügler | Role of extracellular vesicles mRNA in neuroinflammation in a mouse model of stroke | |
| CN109182328B (en) | Mitochondrial DNA extraction kit and method | |
| Magnus et al. | Role of extracellular vesicles mRNA in neuroinflammation in a mouse model of stroke |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200306 |