RU2678175C1 - Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза - Google Patents
Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678175C1 RU2678175C1 RU2018109466A RU2018109466A RU2678175C1 RU 2678175 C1 RU2678175 C1 RU 2678175C1 RU 2018109466 A RU2018109466 A RU 2018109466A RU 2018109466 A RU2018109466 A RU 2018109466A RU 2678175 C1 RU2678175 C1 RU 2678175C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ns80e85a
- tuberculosis
- virus
- strain
- ag85a
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title description 9
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 53
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 claims abstract description 11
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 claims description 21
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 claims description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 2
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 14
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 23
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 23
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 description 12
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Представленное изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Методом обратной генетики получен рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, который является аттенуированным, холодоадаптированным, температурочувствительным и экспрессирует фрагменты антигенов ESAT6 и Ag85A М.tuberculosis. Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A генетически стабилен и обладает высокой репродуктивной активностью в системе развивающихся куриных эмбрионов, а также стимулирует специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ Th1 типа с образованием полифункциональных антиген-специфических Т-клеток при интраназальном введении мышам. Данный рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A депонирован в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под №2863. Изобретение может быть использовано для получения векторной вакцины против туберкулеза. 7 ил., 4 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается создания рекомбинантного штамма, предназначенного для получения векторной вакцины против туберкулеза.
Из уровня техники известен рекомбинантный штамм вируса гриппа, экспрессирующий микобактериальный протективный антиген ESAT-6, предназначенные для профилактики и лечения туберкулеза (патент РФ №2318872, C12N 7/01, опубл. 10.03.2008 г.)
К его недостаткам можно отнести клеточную систему культивирования, которая уступает по урожайности системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), использующейся в настоящее время при производстве противогриппозных вакцин из живых холодоадаптированных вирусов гриппа. Кроме того, аттенуация (безопасность) штамма обеспечена единственным признаком - укорачиванием гена NS1, в отличие от полигенного признака аттенуации холодоадаптированных вирусов гриппа.
Также известен рекомбинантный штамм вируса гриппа ТВ-FLU ESAT6 2А AG85A, предназначенный для профилактики туберкулеза (Патент KZ А4 №28077, C12N 7/00, опубл. 15.01.2014 г.), который также обладает вышеперечисленными недостатками.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, являлось получение холодоадаптированного рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего антигены ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis в составе укороченной рамки считывания NS1 и обладающего высокой репродуктивной активностью в системе РКЭ.
Новизной заявляемого рекомбинантного штамма является его холодоадаптированный фенотип, обеспечивающий дополнительную аттенуацию штамма, и способность штамма активно реплицироваться в системе РКЭ. Данные свойства рекомбинантного штамма были обеспечены за счет использования универсального донора внутренних генов А/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) [Патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение штаммов, обладающих одновременно холодоадаптированным, температурочувствительным и высокорепродуктивным фенотипом.
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А, подтип H1N1. Штамм получен в апреле 2016 года методом обратной генетики, с помощью трансфекции клеток Vero набором из 8 плазмид на основе вектора pHW2000. Штамм прошел несколько пассажей в предельных разведениях в системе РКЭ, в результате которых был получен генетически стабильный вариант вируса.
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A является реассортантом с формулой генома 6:2. Состав генома: 2 гена (НА и NA) от вируса A/PR/8/34 (H1N1); 5 генов внутренних белков (РВ2, РВ1, PA, NP и М) от вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), 1 ген модифицированного неструктурного белка NS1 от вируса А/Гонконг/1/68/162/35(H3N2). Открытая рамка считывания NS1 укорочена до 80 аминокислот, после которых вставлена гетерологичная последовательность, кодирующая антиген ESAT6 (1-73) M.tuberculosis, отделенная глициновыми линкерами, после чего вставлен фрагмент антигена Ag85A (234-295) Рамка считывания NS1 терминирована кассетой из трех стоп-кодонов.
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A антигенно идентичен вирусу гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) является холодоадаптированным, аттенуированным и экспрессирует фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis.
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A генетически стабилен и обладает высокой репродуктивной активностью в системе развивающихся куриных эмбрионов
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A стимулирует специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ Th1 типа с образованием полифункциональных антиген-специфических Т-клеток при интраназальном введении мышам.
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A применим для получения интраназальной векторной вакцины против туберкулеза.
Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A депонирован в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под №2863.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где
на Фиг. 1 представлена карта плазмиды pHW-HK-NS80-E85A, кодирующей модифицированный ген NS вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), в который после 80 аминокислотного остатка рамки NS1 были вставлены туберкулезные антигены Ag85A и ESAT-6;
на Фиг. 2 показана генетическая стабильность штамма A/PR8/HK-NS80-E85A. (А) ПЦР фрагменты гетерологичной вставки в гене NS в плазмиде pHW-HK-NS80-E85A (дорожка 1) и в гене NS штамма PR8/HK-NS80-E85A (дорожка 2). (Б) ПЦР фрагменты гетерологичной вставки в гене NS пассажных вариантов Е1-Е4 штамма PR8/HK-NS80-Е85А (дорожки 1-4, соответственно). ММ - маркер молекулярного веса, п.о.;
на Фиг. 3 приведен результат молекулярно-генетического анализа гена NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A. (А) Положение делении на карте гена NS в плазмиде pHW-HK-NS80-E85A. (Б) Последовательность химерного белка, кодируемого рамкой NS1 A/PR8/HK-NS80E85A. Фрагмент белка NS1 (а.к. 1-80) выделен жирным шрифтом, фрагмент антигена ESAT-6 (а.к. 1-73) подчеркнут, фрагмент антигена Ag85A выделен курсивом, не выделенные а.к. образуют линкер;
на Фиг. 4 показана экспрессия химерных белков при заражении клеток рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85. Окрашивание на NS1 (A), ESAT6 (Б) и Ag85A (В). Номера дорожек и вес белков приведены в таблице 3;
на Фиг. 5 показана экспрессия белка NS1(A) и антигена ESAT-6 (Б) при заражении клеток рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A;
на Фиг. 6 проиллюстрирована безопасность штамма A/PR8/HK-NS80-E85A для мышей (А) График динамики веса мышей после заражения соответствующими вирусами. Потерю веса для каждого животного в % относительно исходного (день 0) определяли индивидуально, затем считали среднее по группе; (Б) Вирусная нагрузка в респираторном тракте мышей после заражения соответствующими вирусами. Значение р дано по результатам многофакторного дисперсионного анализа с последующими попарными сравнениями по методу Тьюкки с поправкой на множественность сравнений;
на Фиг. 7 проиллюстрировна индукция Т-клеточного ответа при иммунизации мышей рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A. (А) Относительное содержание цитокин-продуцирующих CD4+-Т-лимфоцитов (%) в спленоцитах мышей после и/н иммунизации рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A и контрольным вирусом без вставки A/PR8/HK-NS80 (контроль). Значение р критерия дано по результатам t-теста Стьюдента (Б) Доля антиген-специфических CD4+ Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNγ, IL-2 и TNFα в различных сочетаниях после и/н иммунизации рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A.
Способ получения рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A
Рекомбинантный вирус гриппа A/PR8/HK-NS80E85A был получен из 8 плазмид методом обратной генетики в культуре клеток Vero и стабилизирован методом клонирования в предельных разведениях в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Использованные для трансфекции плазмиды кодировали гены НА и NA штамма A/PR/8/34 (H1N1), гены внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М) вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), и модифицированный ген NS вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), в который после 80 аминокислотного остатка рамки NS1 были вставлены туберкулезные антигены Ag85A и ESAT-6 (Фиг. 1).
В результате серии последовательных пассажей в системе РКЭ материала трансфецированных клеток был получен вирус A/PR8/HK-NS80E85A, который характеризовался укороченной длиной гетерологичной вставки по сравнению со вставкой, закодированной в плазмиде pHW-HK-NS80-E85A, по результатам ОТ-ПЦР анализа. Для постановки ОТ-ПЦР анализа вирусную РНК выделяли с использованием набора RNEasy Mini Kit (Qiagen). Амплификацию фрагментов гена NS проводили методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием специально подобранных праймеров HK-NS1-226F (5'-ggattctgaaggaagaatccg) и PR8-NS1-523R (5'-tgacatcctcagcagtatgtcc) (Syntol, Россия) и набора реагентов Ambion AgPath-ID One Step RT-PCR (Thermo). Длину ПЦР-фрагментов определяли методом электрофореза в 1% агарозном геле при окрашивании бромистым этидием, документирование проводили с помощью системы ChemiDoc (Bio Rad). Результаты анализа длины вставки в гене NS вируса A/PR8/HK-NS80E85A и в гене NS, закодированном в плазмиде pHW-HK-NS80-Е85А, представлены на Фиг. 2А.
При последующих пассажах вируса A/PR8/HK-NS80E85A в системе РКЭ длина вставки не изменялась (Фиг. 2Б).
Последовательность модифицированного гена NS полученного рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A была определена методом секвенирования по Сенджеру. Секвенирование ПЦР-продуктов, полученных методом ОТ-ПЦР, проводили с помощью набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) на капиллярном секвенаторе ABI GA3130 (Applied Biosystems). Полученные последовательности анализировали с использованием программы Vector NTI (Invitrogen).
По результатам анализа было определено местоположение делеции в гене NS (Фиг. 3А). Было показано, что делеция не приводит к сдвигу рамки считывания NS1, и что гетерологичная вставка содержит участок 1-73 антигена ESAT-6 и участок 234-295 антигена Ag85A (Фиг. 3Б).
Ниже приведены примеры, подтверждающие заявленные свойства штамма A/PR8/HK-NS80E85A.
Характеристика полученного штамма
Пример 1. Репродуктивные свойства штамма A/PR8/HK-NS80E85A в системе РКЭ
Штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) тестировали на инфекционную активность путем заражения РКЭ 10-дневного возраста. Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости на фосфатно-солевом буфере с добавлением антибиотиков (100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 5 мкг/мл амфотерицин В). Каждым разведением начиная с 10-8 до 10-2 заражали по 3 РКЭ вводя в аллантоисную полость 0,2 мл разведения. Эмбрионы инкубировали 48 часов при температуре 34°С. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли в реакции гемагглютинации (РГА) с 0,5% суспензией куриных эритроцитов. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.
Репродуктивные свойства штамма представлены в таблице 1. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность рекомбинантного вируса A/PR8/HK-NS80E85A составляла от 1:16 до 1:64., инфекционная активность в РКЭ составила 6.94±0,32 lgЭИД50/0,2 мл.
Таблица 1 - Чувствительность к экспериментальной инфекции вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1)
Пример 2. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A является температурочувствительным и холодоадаптированным.
Температурочувствительный (ts-) и холодоадаптированный (са-)фенотипы являются маркерами аттенуации вирусов гриппа, используемых в качестве живых вакцин. Для определения фенотипа рекомбинантного вируса A/PR8/HK-NS80-E85A сравнивали показатели его инфекционной активности в РКЭ при различных температурах инкубации (табл. 2). Штамм A/PR8/HK-NS80-E85A обладает ts и са-фенотипом, так как разница в репродуктивной активности штамма при повышенной и оптимальной температурах (RCT39) составила более 5 lgЭИД50/мл, разница в репродукции при пониженной и оптимальной температурах RCT26 была менее 3 lgЭИД50/мл.
Таблица 2 - Инфекционная активность штамма PR8/HK-NS80-E85A при параллельном титровании в куриных эмбрионах при различных температурах
Пример 3. При заражении клеток MDCK рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80E85A происходит экспрессия туберкулезных антигенов ESAT-6 и Ag85A, сшитых с укороченным белком NS1
Экспрессия гетерологичных антигенов рекомбинантным векторным вакцинным штаммом обеспечивает презентацию антигенов иммунной системе и выработку иммунного ответа нужного типа. Экспрессию антигенов с модифицированной рамки считывания NS1 рекомбинантного вируса PR8/HK-NS80E85A оценивали в цитоплазме клеток MDCK через 6 часов после их заражения с помощью иммунофлуоресценции и Вестер-блот анализа.
Электрофорез и Вестерн-блот
Экспрессию модифицированного белка NS1 и антигенов ESAT-6 и Ag85A изучали через 6 часов после заражения клеток MDCK рекомбинантным штаммом A/PR8/HK-NS80-Е85А и контрольным вирусом A/PR8-NS124-ESAT6 (вирус со вставкой только антигена ESAT-6 из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа»).
Культуру клеток MDCK (#FR-58, получены из коллекции IRR) растили в среде DMEM (Биолот) с 5% эмбриональной сывороткой Sus (Биолот) и 1% GlutaMAX (Gibco) при 37°С, 5% CO2. Суточный монослой клеток заражали вирусами в дозе 1-5 ТИД50/клетку и инкубировали при 34°С, 5% CO2 в течение 6 часов.
Для постановки Вестерн-блот клетки (≈1,2*106) снимали 0,25% трипсином-ЭДТА (Sigma) и ресуспендировали в 1X буфере Лэммли с β-меркаптоэтанолом (Bio-Rad). Затем проводили денатурирующий ЭФ образцов в 8-16% градиентном полиакриламидном геле, после чего белки переносили на нитроцеллулозную мембрану (Bio Rad). Мембрану блокировали 3% BSA (Amresco) в фосфатно-солевом буфере (PBS, Amresco), затем окрашивали антителами, разведенными в блокирующем буфере с добавлением 0,1% Tween-20 (Ferak Berlin). Использовали мышиные моноклональные антитела 1Н7 (ФГБУ «НИИ гриппа») против NS1 (1:5000), ab26246 (Abeam) против ESAT-6 (1:5000), и CSB-PA18279A0Rb (Cusabio) против Ag85A (1:500). В качестве вторичных антител были использованы меченые пероксидазой хрена Goat anti-mouse IgG(H+L) (G21040, Invitrogen) в разведении 1:2000 или Goat anti-rabbit IgG(H+L) (G21234, Invitrogen) в разведении 1:1000. Детекцию осуществляли с использованием Opti-4CN Substrate Kit (Bio Rad).
Результаты оценки экспрессии укороченного белка NS1 сшитого с участками антигенов ESAT-6 и Ag85A при заражении клеток MDCK вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A иллюстрирует Фиг. 4. Результаты окрашивания окрашивания антителами против NS1 (А), ESAT-6 (Б) и Ag85 (В) лизатов клеток MDCK через 6 часов после заражения соответствующими вирусами. Дорожка 1 - клетки, зараженные вирусом A/PR8/HK-NS80-Е85А, дорожка 2 - клетки, зараженные вирусом A/PR8-NS124-ESAT6, дорожка 3 - незараженные клетки. ММ - маркер молекулярного веса, кДа. Стрелка отмечает лизат клеток, зараженных вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A.
Приблизительная молекулярная масса антигенов NS1 и NS1 с гетерологичной вставкой по результатам теоретических расчетов с использованием сервера ExPASy ProtParam [51] приведена в таблице 3. По результатам Вестер-блот анализа видно, что собранный нами штамм экспрессирует туберкулезные антигены ESAT-6 и Ag85A, сшитые с гриппозным белком NS1. Молекулярный вес химерного белка схож с теоретически рассчитанным.
Таблица 3 - Приблизительная молекулярная масса химерных белков на основе NS1 и антигенов M.tuberculosis по результатам теоретических расчетов с использованием сервера ExPASy ProtParam
Иммунофлуоресценция
Экспрессию модифицированного белка NS1 и антигена ESAT-6 изучали через 6 часов после заражения клеток MDCK рекомбинантным штаммом A/PR8/HK-NS80-E85A и контрольными вирусами контрольными вирусами A/PR8/HK 6:2 RG (вирус без вставки) и A/PR8-NS124-ESAT6 (вирус со вставкой только антигена ESAT-6) из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа»).
Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma) в PBS, пермеабилизировали 0,2% Triton Х-100 (Amresco) в PBS, блокировали 3% BSA в PBS. Антитела разводили в блокирующем буфере с добавлением 0,1% Tween-20. Окрашивание первичными антителами, проводили в течение ночи при +4°С, вторичными флуоресцентно-мечеными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Окрашивание с помощью DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Serva) проводили, используя раствор 0,1 мкг/мл по 50 мкл на лунку. Использовали моноклональные мышиные антитела 1Н7 против NS1 (1:200) и поликлональные кроличьи антитела ab45073 (Abeam) против ESAT-6 (1:1000), в качестве вторичных антител использовали флуоресцентно меченые Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 (ab150077, Abeam, 1:1000) и Goat Anti-Mouse pAb to MsIgG Alexa Fluor® 488 (ab150113, Abeam, 1:1000). Клетки фотографировали с использованием Cytell Cell Imaging System (GE Healthcare), с применением цифрового увеличения и увеличения объектива 10Х.
Результаты иммунофлуоресцентного анализа приведены на Фиг. 5. Показано, что клетки, зараженные вирусами, в отличие от незараженньгх клеток, экспрессируют вирусный белок NS1. Также показана экспрессия белка ESAT-6 при заражении вирусами A/PR8-NS124-ESAT6 и A/PR8/HK-NS80-E85A, о чем можно судить по свечению клеток, окрашенных на ESAT-6.
Пример 4. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) аттенуирован для лабораторных мышей
Тестирование рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) на безвредность для лабораторных животных проводили на линейных белых мышах BALB/c, самках, массой 18-20 г. В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Вирус вводили интраназально в объеме 30 мкл по 5.0 lgЭИД50/мышь. Для определения безопасности полученного штамма проводили мониторинг массы тела животных в течение 14 дней после заражения (5 шт/группу) и оценивали вирусную нагрузку в респираторном тракте мышей на 3 день после заражения (3 шт/группу). В качестве контрольных вирусов использовали патогенный для мышей штамм A/PR/8/1934 (H1N1) и частично аттенуированный для мышей штамм A/PR8-NS124-ESAT6 (вирусы из коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России).
В течение 14-дневного периода наблюдения после заражения все животные, зараженные вирусом A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. Масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной. Таким образом, штамм A/PR8/HK-NS80-E85A был полностью аттенуирован, при этом мыши, зараженные патогенным штаммом A/PR/8/1934 (H1N1) в той же дозе, погибли к 8 суткам после заражения (Фиг. 6А).
Для определения вирусной нагрузки в респираторном тракте органы гомогенизировали в PBS с использованием Tissue Lyser (Qiagen, США). Вирусную нагрузку определяли по результатам титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK в присутствии ТРСК-трипсина (2,5 мкг/мл) и амфотерицина В (2,5 мкг/мл). Зараженные клетки инкубировали при 34°С, 5% СО2 в течение 5 суток, результат оценивали в реакции гемагглютинации с 0,5% куриными эритроцитами, титр подсчитывали по методу Рида и Менча.
Титр неаттенуированного штамма A/PR/8/1934 (H1N1) в легких мышей составлял 5,42±0,38 lgТИД50/мл, что существенно превышало (р<0.001) вирусную нагрузку в легких мышей, зараженных частично аттенуированным вирусом A/PR8-NS124-ESAT6 (2,83±0,14 lgТИД50/мл) и полностью аттенуированным штаммом A/PR8/HK-NS80-E85A (1,67±0,29 lgТИД50/мл). При этом, штамм A/PR8/HK-NS80-E85A лучше размножался в носовых ходах мышей (2,58±0,14 lgТИД50/мл), чем в легких (р<0.05), что согласуется с его са-фенотипом (Фиг. 6Б).
Пример 5. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A стимулирует противотуберкулезный Т-клеточный ответ при иммунизации лабораторных мышей
Тестирование штамма вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) на иммуногенность для лабораторных животных проводили на линейных черных мышах C57/black (5 мышей/группу). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Иммунизацию проводили интраназально по 5,0 lgЭИД50/мышь по 30 мкл/мышь вируса. Через 10 суток после иммунизации у мышей выделяли спленоциты. Гомогенизацию селезенки проводили при помощи пластиковых пестиков для ручной гомогенизации в микропробирках (Sarstedt, Германия). Гомогенаты органов фильтровали при помощи шприцевых фильтров 70 мкм в PBS с 2% FCS (Gibco, США). Отбирали 106 клеток в 100 мкл и стимулировали очищенным белком Ag85A (Novus Biologicals) в конечной концентрации 5 мкг/мл в присутствии костимулирующих антител к рецептору CD28 (Biolegend). После 12 часовой инкубации при 37°С, 5% CO2 в лунки добавляли брефельдин A (BD Biosciences). Для детекции живых клеток проводили окрашивание с помощью Zombie Red Fixable Viability kit (BioLegend). Для выделения популяции иммунных клеток использовали TruStain fcx CD 16/32 (BioLegend). Популяции лимфоцитов дифференцировали, используя антитела к поверхностным маркерам CD8-PE/Cy7, CD4-PerCp/Cy5.5 (BD Pharmingen), CD45-APC/Cy7 (BD Biosciences, США). Затем клетки фиксировали и пермеабелизировали с использованием набора реагентов Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permebilization kit with BD Goldgi Stop (BD Biosciences), после чего окрашивали на внутриклеточные цитокины с использованием антител IFNγ-FITS, TNFα-Brilliant Violet 421, IL2-PE (BD Pharmingen). Результаты окрашивания детектировали на проточном цитометре BD FACSCanto II (BD Biosciences) и анализировали в программе Kaluza Analysis 1.05а.
Для оценки способности гриппозного вектора A/PR8/HK-NS80-E85A индуцировать противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ была определена внутриклеточная продукция цитокинов CD4+ Т-клетками иммунизированных мышей. В качестве контрольной группы использовали мышей, иммунизированных «пустым» вектором A/PR8/HK-NS80 (вирус из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа»).
После однократной иммунизации рекомбинантным штаммом A/PR8/HK-NS80-Е85А доля цитокин-продуцирующих CD4+ Т-лимфоцитов в спленоцитах мышей при специфической стимуляции была достоверно выше, чем в контрольной группе животных (3.16±1.25 против 1.43±0.40; р=0.016, t-критерий Стьюдента, рис. 5А) (Фиг. 7А; табл. 4).
Далее была изучена функциональная активность CD4+ Т-клеток, способных под действием специфической стимуляции синтезировать IFN-γ, TNF-α и IL-2 или различные комбинации данных цитокинов. Среди популяции антиген-специфических CD4+ Т-клеток селезенки преобладали Т-клетки, секретирующие один цитокин (IFN-γ (36.85% от общего числа цитокин-продуцирующих CD4+-T-лимфоцитов), TNF-α (31.77%) или IL-2 (4.12%)). В то же время были обнаружены и полифункциональные антиген-специфические Т-клетки, продуцирующие два цитокина (IFN-γ и IL-2 (2.77%); IFN-γ и TNF-α (2.06%); TNF-α и IL-2 (16.32%)), а также минорная популяция тройных продуцентов, секретирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2 (6.10%)) (Фиг. 7Б).
Таким образом, была продемонстрирована способность гриппозного вектора A/PR8/HK-NS80-E85A индуцировать специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ у иммунизированных мышей линии C57/black при однократном интраназальном введении. Кроме того, обнаруженные полифункциональные Т-лимфоциты, благодаря более выраженной эффекторной функции по сравнению с Т-клетками, секретирующими только один цитокин, могут рассматриваться в качестве потенциального иммунологического маркера протективного иммунитета при туберкулезе.
Таблица 4 - Процентное содержание цитокин-продуцирующих CD4+-T-лимфоцитов
Claims (1)
- Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А, подтип H1N1, кодирующий фрагменты антигенов ESAT-6 (1-73) и Ag85A (234-295) M. tuberculosis в составе открытой рамки считывания укороченного белка NS1 (1-80), депонированный в Государственной коллекции вирусов под №2863, предназначенный для получения интраназальной векторной вакцины против туберкулеза.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018109466A RU2678175C1 (ru) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018109466A RU2678175C1 (ru) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2678175C1 true RU2678175C1 (ru) | 2019-01-23 |
Family
ID=65085219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018109466A RU2678175C1 (ru) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2678175C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7988980B2 (en) * | 2003-04-23 | 2011-08-02 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenshaften E. V. | Tuberculosis vaccine with improved efficacy |
| RU2511431C2 (ru) * | 2011-07-25 | 2014-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский Институт гриппа" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (или ФГБУ "НИИ гриппа" Минздравсоцразвития России) | ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)-УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ДОНОР ВНУТРЕННИХ ГЕНОВ ДЛЯ РЕАССОРТАНТОВ И РЕАССОРТАНТНЫЕ ШТАММЫ А/СПБ/ГК/09 (H1N1) И А/НК/Astana/6:2/2010 (H5N1), ПОЛУЧЕННЫЕ НА ЕГО ОСНОВЕ |
-
2018
- 2018-03-16 RU RU2018109466A patent/RU2678175C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7988980B2 (en) * | 2003-04-23 | 2011-08-02 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenshaften E. V. | Tuberculosis vaccine with improved efficacy |
| RU2511431C2 (ru) * | 2011-07-25 | 2014-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский Институт гриппа" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (или ФГБУ "НИИ гриппа" Минздравсоцразвития России) | ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)-УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ДОНОР ВНУТРЕННИХ ГЕНОВ ДЛЯ РЕАССОРТАНТОВ И РЕАССОРТАНТНЫЕ ШТАММЫ А/СПБ/ГК/09 (H1N1) И А/НК/Astana/6:2/2010 (H5N1), ПОЛУЧЕННЫЕ НА ЕГО ОСНОВЕ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pardi et al. | Nucleoside modified mRNA vaccines for infectious diseases | |
| Takasuka et al. | A subcutaneously injected UV-inactivated SARS coronavirus vaccine elicits systemic humoral immunity in mice | |
| WO2021254327A1 (zh) | 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 | |
| Rauch et al. | RNActive® technology: generation and testing of stable and immunogenic mRNA vaccines | |
| Breathnach et al. | Immunization with recombinant modified vaccinia Ankara (rMVA) constructs encoding the HA or NP gene protects ponies from equine influenza virus challenge | |
| US9937252B2 (en) | Induction of cross-reactive cellular response against rhinovirus antigens | |
| Lee et al. | Nucleoprotein vaccine induces cross-protective cytotoxic T lymphocytes against both lineages of influenza B virus | |
| Kreijtz et al. | A single immunization with modified vaccinia virus ankara–based influenza virus H7 vaccine affords protection in the Influenza A (H7N9) pneumonia ferret model | |
| JP2023524990A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する組換えニューカッスル病ウイルス及びその使用 | |
| Kotomina et al. | Live attenuated influenza vaccine viral vector induces functional cytotoxic T-cell immune response against foreign CD8+ T-cell epitopes inserted into NA and NS1 genes using the 2A self-cleavage site | |
| Hemmi et al. | Intranasal vaccination induced cross-protective secretory IgA antibodies against SARS-CoV-2 variants with reducing the potential risk of lung eosinophilic immunopathology | |
| JP2014511119A (ja) | Ｈ１ｎ１亜型インフルエンザパンデミックウイルスに対する新型ワクチン | |
| WO2021206638A1 (en) | Vaccine and/or antibody for viral infection | |
| Zhan et al. | Sendai virus recombinant vaccine expressing a secreted, unconstrained respiratory syncytial virus fusion protein protects against RSV in cotton rats | |
| Jegaskanda et al. | Hemagglutinin head-specific responses dominate over stem-specific responses following prime boost with mismatched vaccines | |
| Bian et al. | A Rift Valley fever mRNA vaccine elicits strong immune responses in mice and rhesus macaques | |
| Arikata et al. | Memory immune responses against pandemic (h1n1) 2009 influenza virus induced by a whole particle vaccine in cynomolgus monkeys carrying mafa-A1* 052∶ 02 | |
| Zhao et al. | Development and efficacy evaluation of remodeled canine parvovirus-like particles displaying major antigenic epitopes of a giant panda derived canine distemper virus | |
| Prokopenko et al. | Truncation of NS1 protein enhances T Cell-mediated cross-protection of a live attenuated influenza vaccine virus expressing wild-type nucleoprotein | |
| Kumar et al. | Mucosal immunization of calves with recombinant bovine adenovirus-3 coexpressing truncated form of bovine herpesvirus-1 gD and bovine IL-6 | |
| Báez-Astúa et al. | Low-dose adenovirus vaccine encoding chimeric hepatitis B virus surface antigen-human papillomavirus type 16 E7 proteins induces enhanced E7-specific antibody and cytotoxic T-cell responses | |
| RU2678175C1 (ru) | Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, экспрессирующий фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза | |
| Stepanova et al. | Amino acid substitutions N123D and N149D in hemagglutinin molecule enhance immunigenicity of live attenuated influenza H7N9 vaccine strain in experiment | |
| WO2014200325A2 (en) | Consortium of the recombinant influenza a viruses flu-ns1-124- l7/l12-h5n1, flu-ns1-124-omp16-h5n1, flu-ns1-124-l7/l12-h1n1 and flu-ns1- 124-omp16-h1n1, family ortomyxoviridae, genus influenzavirus, expressing brucella immunodominant proteins destined to generate a vaccine against brucellosis | |
| Winter et al. | Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus vaccines expressing the HMW1, HMW2, or Hia adhesion protein of nontypeable Haemophilus influenzae |