RU2673718C1

RU2673718C1 - Nutrient medium for cultivation of transplanted mammalian cell lines

Info

Publication number: RU2673718C1
Application number: RU2018102493A
Authority: RU
Inventors: Сергей Вячеславович Генералов; Марина Владимировна Антонычева; Елена Геннадьевна Абрамова; Константин Игирович Холматов; Иван Михайлович Жулидов; Алексей Дмитриевич Белоусов; Юлия Кирилловна Гаврилова; Алексей Константинович Никифоров
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2018-01-22
Publication date: 2018-11-29

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention is a nutrient medium for cultivation of transplantable mammalian cell cultures, including dry enzymatic fibroly hydrolyzate, bovine serum, balanced salt solution in the following ratio, vol. %: dry enzymatic hydrolyzate of fibrin (content of amino nitrogen from 2.6 to 3.0 %) – from 0.1 to 0.25; blood serum of cattle – from 5 to 10; saline solution – up to 1 l.

EFFECT: invention allows for the rational disposal of waste generated in the production of immunobiological preparations.

1 cl, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и может быть использовано при разработке питательной среды для культивирования клеток млекопитающих, в частности, перевиваемых клеточных линий Vero и ВНК, и вирусов, в том числе при получении in vitro биомассы аттенуированного штамма вируса бешенства «Москва 3253».The invention relates to biotechnology, virology and can be used in the development of a nutrient medium for the cultivation of mammalian cells, in particular, transplantable Vero and BHK cell lines, and viruses, including the in vitro production of biomass of the attenuated strain of rabies virus "Moscow 3253".

Известны питательные среды для культивирования клеточных культур определенного химического состава, используемые как с добавлением сыворотки КРС, так и без нее: минимальная среда Игла MEM, основная среда Игла MEM, среда Игла MEM в модификации Дульбекко, среда 199 (среда Хенкса), среда Хэма, среда Мак-Коя, среда Лейбовица [1]. Указанные среды являются коммерчески доступными, их производство существует на территории России, однако они имеют высокую стоимость. Учитывая, что питательная среда должна содержать достаточное количество питательных веществ для поддержания высокой плотности клеток и репликации вируса, оптимальным способом снижения стоимости является использование гидролизатов белков растительного и животного происхождения в качестве основы сред [2, 3], поскольку в их состав входят низкомолекулярные пептиды, микроэлементы и другие биологически активные соединения, обеспечивающие обменные процессы в клетках.Nutrient media for culturing cell cultures of a certain chemical composition are known, used both with and without cattle serum: minimal medium Needle MEM, basic medium Needle MEM, medium Needle MEM in Dulbecco modification, medium 199 (Hanks medium), Ham medium, Wednesday McCoy, Wednesday Leibovitz [1]. These media are commercially available, their production exists in Russia, but they are of high cost. Given that the nutrient medium should contain a sufficient amount of nutrients to maintain high cell density and virus replication, the best way to reduce the cost is to use hydrolysates of protein of plant and animal origin as the basis of the media [2, 3], since they contain low molecular weight peptides, trace elements and other biologically active compounds that provide metabolic processes in cells.

Известен способ получения питательной среды [4] для культивирования клеток млекопитающих, в частности для клеток MDCK и Vero, содержащая сбалансированный солевой раствор, ферментативный гидролизат рисовой муки, аминокислоты и витамины.A known method of obtaining a nutrient medium [4] for the cultivation of mammalian cells, in particular for MDCK and Vero cells, containing a balanced saline solution, enzymatic hydrolyzate of rice flour, amino acids and vitamins.

Известна питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков рыб и отходов рыбного производства [5], которая предлагается для культивирования клеток эукариот.A known nutrient medium based on an enzymatic hydrolyzate of fish proteins and fish waste products [5], which is proposed for the cultivation of eukaryotic cells.

Известны способы получения и питательные среды для культивирования клеток эукариот, основой для которых являются ферментативные гидролизаты шкур ластоногих и/или шкур крупного рогатого скота (КРС) [6, 7].Known production methods and culture media for the cultivation of eukaryotic cells, the basis for which are enzymatic hydrolysates of pinnipeds and / or cattle hides (cattle) [6, 7].

Известен способ получения и питательная среда для культивирования клеток эукариот, основой для которой служит ферментативный гидролизат обезжиренной и обезвоженной мозговой ткани КРС, являющейся отходом производства медицинского препарата «Липоцеребрин» [8].There is a method of obtaining and a nutrient medium for the cultivation of eukaryotic cells, the basis for which is an enzymatic hydrolyzate of fat-free and dehydrated brain tissue of cattle, which is a waste product of the medicinal product "Lipocerebrin" [8].

Известны составы питательных сред для суспензионного культивирования клеток млекопитающих на основе ферментативных гидролизатов лактальбумина и мышечных белков [9, 10].Nutrient medium compositions for suspension cultivation of mammalian cells based on enzymatic hydrolysates of lactalbumin and muscle proteins are known [9, 10].

Известна сухая стерильная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков мышц для культивирования клеток млекопитающих, в частности клеток карциномы гортани человека Нер-2 и суспензионной культуры клеток лимфомы Беркита Namalva [11].Known dry sterile low-serum nutrient medium based on enzymatic hydrolyzate of muscle proteins for culturing mammalian cells, in particular, human laryngeal carcinoma cells Nep-2 and suspension culture of Burkit Namalva lymphoma cells [11].

Известна питательная среда для выращивания культур клеток животных, основой для которой является ферментативный гидролизат белков молока [12].A known nutrient medium for growing animal cell cultures, the basis for which is an enzymatic hydrolyzate of milk proteins [12].

Перечисленные среды применяют для культивирования конкретных клеточных линий и для работы с малыми культуральными массами с низкой плотностью.The listed media are used for the cultivation of specific cell lines and for working with small culture masses with low density.

Использование ценного пищевого сырья для приготовления питательных сред иррационально и экономически неэффективно.The use of valuable food raw materials for the preparation of nutrient media is irrationally and economically inefficient.

Задачей изобретения является разработка эффективной питательной среды для культивирования перевиваемых клеточных культур млекопитающих на примере клеточных линий Vero и BHK и репродукции вирусов на примере аттенуированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» на основе гидролизата белка фибрина крови лошадей, что позволит решить задачу рациональной утилизации отходов производства иммунобиологических препаратов.The objective of the invention is to develop an effective nutrient medium for the cultivation of transplantable mammalian cell cultures using the example of Vero and BHK cell lines and reproducing viruses using the attenuated rabies virus of the strain Moscow 3253 as an example based on the hydrolyzed protein of horse blood fibrin, which will allow the rational utilization of waste products from immunobiological preparations.

Технический результат изобретения заключается в расширении ассортимента питательных сред и обеспечении рациональной утилизации отходов, образующихся при производстве иммунобиологических препаратов. Экономический эффект использования изобретения состоит в снижении стоимости питательных сред при сохранении эффективности наращивания биологического материала.The technical result of the invention is to expand the assortment of culture media and ensure the rational utilization of waste generated during the production of immunobiological preparations. The economic effect of using the invention is to reduce the cost of nutrient media while maintaining the effectiveness of building biological material.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда в объеме 1 л содержит компоненты в следующем соотношении, об. %:The specified technical result is achieved in that the nutrient medium in a volume of 1 liter contains components in the following ratio, vol. %:

сухой ферментативный гидролизат фибринаdry fibrin enzymatic hydrolyzate (содержание аминного азота от 2,6 до 3,0%)(amine nitrogen content from 2.6 to 3.0%) от 0,1 до 0,25from 0.1 to 0.25 сыворотка крови КРСcattle blood serum от 5 до 10from 5 to 10 солевой раствор (Эрла или Хенкса)saline solution (Earl or Hanks) остальной объемthe rest of the volume

Сухой ферментативный гидролизат фибрина получают путем выпаривания жидкого ферментативного гидролизата фибрина (содержание аминного азота от 2,6 до 3,0%), который получают по существующему способу: патент RU 2425866 [13].Dry fibrin enzymatic hydrolyzate is obtained by evaporation of the liquid fibrin enzymatic hydrolyzate (amine nitrogen content from 2.6 to 3.0%), which is obtained by the existing method: patent RU 2425866 [13].

Концентрирование гидролизата осуществляют методом выпаривания на установке вакуум-выпарной УВВ-50. Высушивание на установке распылительного типа КЯУЛ 101325.002 - методом «псевдокипящего слоя». По агрегатному состоянию ферментативный гидролизат фибрина -мелкодисперсный порошок с нежно-желтым оттенком и белковым запахом. Физико-химические показатели сухого гидролизата: содержание общего азота - (7,5±0,3) %; аминного азота - (2,8±0,2) %; процент расщепления белка - (50,7±1,68) %; содержание пептона (по шкале Дифко) - (53,67±1,53) %; следы белка - отсутствуют; сухой остаток - (10,7±0,2) %; хлориды - (0,2±0,05) %; влажность - (2,4±0,2) %; рН - (6,7±0,2).Concentration of the hydrolyzate is carried out by evaporation on a vacuum-evaporation unit UVV-50. Drying on a spray-type apparatus KYAUL 101325.002 - by the “pseudo-boiling layer” method. According to the state of aggregation, the fibrin enzymatic hydrolyzate is a finely dispersed powder with a pale yellow tint and a protein smell. Physico-chemical parameters of the dry hydrolyzate: total nitrogen content - (7.5 ± 0.3)%; amine nitrogen - (2.8 ± 0.2)%; the percentage of protein breakdown is (50.7 ± 1.68)%; peptone content (on the Difco scale) - (53.67 ± 1.53)%; traces of protein are absent; dry residue - (10.7 ± 0.2)%; chlorides - (0.2 ± 0.05)%; humidity - (2.4 ± 0.2)%; pH - (6.7 ± 0.2).

Питательную среду для культивирования клеточных культур на основе сухого ферментативного гидролизата фибрина готовят, соблюдая асептические условия, в стерильной посуде, изготовленной из стекла или лабораторной пластмассы. Навеску сухого ферментативного гидролизата фибрина растворяют в стерильном сбалансированном солевом растворе (Эрла или Хенкса) до конечной концентрации 10% и последовательно фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм. Полученный концентрат разбавляют стерильным сбалансированным солевым раствором до концентрации от 0,1 до 0,25%. Уровень рН корректируют до значения 7,2±0,2 с помощью раствора гидроксида натрия в концентрации 0,1 моль/л или ацетатного буферного раствора (рН 4,5) в концентрации 0,1 моль/л.A nutrient medium for culturing cell cultures based on a dry enzymatic fibrin hydrolyzate is prepared under aseptic conditions in a sterile dish made of glass or laboratory plastic. A portion of dry fibrin enzymatic hydrolyzate is dissolved in sterile balanced saline solution (Earl or Hanks) to a final concentration of 10% and sequentially filtered through membrane filters with pore diameters of 0.45 and 0.22 μm. The resulting concentrate is diluted with sterile balanced saline to a concentration of from 0.1 to 0.25%. The pH level is adjusted to a value of 7.2 ± 0.2 using a solution of sodium hydroxide at a concentration of 0.1 mol / L or acetate buffer solution (pH 4.5) at a concentration of 0.1 mol / L.

Рабочая концентрация ферментативного гидролизата фибрина в заявляемой питательной среде - от 0,1 до 0,25%. Ростовые свойства питательной среды проверяют при выращивании клеток млекопитающих в течение 3 последовательных пассажей, оценивая рост через 3 и 7 суток [1]. При одинаковой посевной концентрации рост клеток Vero и BHK на заявляемой питательной среде с ферментативным гидролизатом фибрина и среде Игла MEM с содержанием сыворотки КРС 5 или 10%, и среде 199 с содержанием сыворотки КРС 5 или 10% практически одинаков, сроки формирования монослоя и его сохранения одни и те же. Перевиваемые клетки, выращенные на заявляемой питательной среде, сохраняют первоначальную морфологию.The working concentration of the enzymatic fibrin hydrolyzate in the claimed nutrient medium is from 0.1 to 0.25%. The growth properties of the nutrient medium is checked when mammalian cells are grown for 3 consecutive passages, assessing growth after 3 and 7 days [1]. At the same inoculum concentration, Vero and BHK cell growth on the claimed nutrient medium with an enzymatic fibrin hydrolyzate and Eagle MEM medium with a cattle serum content of 5 or 10%, and medium 199 with a cattle serum of 5 or 10% are almost the same, the monolayer formation time and its conservation same. Transplanted cells grown on the claimed nutrient medium retain their original morphology.

Характеристика роста монослойной культуры перевиваемых линий Vero и BHK при выращивании на различных питательных средах приведена в таблице 1.The growth characteristic of the monolayer culture of the Vero and BHK transplanted lines when grown on various nutrient media is shown in Table 1.

Выращенная на питательной среде с ферментативным гидролизатом фибрина клеточная культура Vero, использованная для культивирования аттенуированного вируса бешенства штамма «Москва 3253», сохраняла чувствительность к данному вирусу.The Vero cell culture grown on a nutrient medium with an enzymatic hydrolyzate of fibrin, used to cultivate the attenuated rabies virus of the strain Moscow 3253, remained sensitive to this virus.

Результаты ИФА по выявлению уровня накопления фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на клетках Vero, выращенных в средах с содержанием фибрина (от 0,1 до 0,25%), Игла MEM и 199 с добавлением 5% сыворотки КРС, приведены в таблице 2.The ELISA results for the detection of the accumulation level of the fixed rabies virus "Moscow 3253" on Vero cells grown in media with fibrin content (from 0.1 to 0.25%), MEM Needle and 199 with the addition of 5% cattle serum are shown in Table 2 .

Заявляемая питательная среда с ферментативным гидролизатом фибрина может быть также использована для многократного пассирования перевиваемых линий клеток.The inventive nutrient medium with an enzymatic fibrin hydrolyzate can also be used for multiple passaging of transplanted cell lines.

Использование в заявляемой питательной среде ферментативного гидролизата фибрина решает проблему утилизации отходов производства иммунобиологических препаратов и удешевляет стоимость целевого продукта.The use of the inventive nutrient medium of an enzymatic hydrolyzate of fibrin solves the problem of waste disposal of the production of immunobiological preparations and reduces the cost of the target product.

Изготовление питательной среды на основе ферментативного гидролизата фибрина не требует сложного оборудования и может осуществляться на биотехнологических и фармацевтических предприятиях.The production of a nutrient medium based on an enzymatic fibrin hydrolyzate does not require sophisticated equipment and can be carried out at biotechnological and pharmaceutical enterprises.

Пример 1.Example 1

Культивирование клеточной культуры Vero или BHK на среде, содержащей 0,1% ферментативного гидролизата фибрина и 10% сыворотки КРС.Culturing a Vero or BHK cell culture in a medium containing 0.1% fibrin enzymatic hydrolyzate and 10% cattle serum.

К навеске сухого ферментативного гидролизата фибрина в количестве 0,5 г добавляют до 5 мл стерильного сбалансированного солевого раствора Эрла. Полученный раствор профильтровывают с помощью мембранных фильтров 0,45 мкм и 0,22 мкм. Полученный фильтрат стерильно разводят сбалансированным солевым раствором Эрла в соотношении 1:100 и добавляют сыворотку КРС в концентрации 10%, а также антибиотики (смесь пенициллина и стрептомицина). Манипуляции следует проводить с соблюдением правил асептики.To a sample of dry fibrin enzymatic hydrolyzate in an amount of 0.5 g add up to 5 ml of sterile balanced Earle's salt solution. The resulting solution was filtered using 0.45 μm and 0.22 μm membrane filters. The resulting filtrate was sterilely diluted with a balanced Earl salt solution in a ratio of 1: 100 and cattle serum was added at a concentration of 10%, as well as antibiotics (a mixture of penicillin and streptomycin). Manipulations should be carried out in compliance with the rules of asepsis.

Подготовленный клеточный монослой (Vero или BHK) отмывают от питательной среды раствором DPBS с последующим удалением жидкой фракции. Добавляют к клеткам раствор трипсина и версена (соотношение 2:1), затем клетки инкубировать при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа в течение 3-5 минут. После открепления клеток во флакон добавляют необходимое количество среды на основе ферментативного гидролизата фибрина, а клетки тщательно ресуспендируют с помощью пипетки. После подсчета количества клеток, добавляют необходимое количество клеточной суспензии и указанной среды. Рекомендуемая начальная концентрация клеток составляет 5-10×10⁴ кл./мл. Клетки инкубируют при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа в течение 4-5 суток. Питательная среда на основе гидролизата фибрина обеспечивает накопление клеток перевиваемых линий Vero и BHK. Конфлюэнтный монослой сохраняется не менее 2 суток с момента образования. Клетки Vero и BHK, выращенные в экспериментальной среде в течение пятнадцати пассажей, сохраняли форму, характерную для данного вида клеток, с четко выраженными границами, без признаков дегенерации и морфологически не отличались от клеток, выращенных на средах сравнения (199 и Игла MEM).The prepared cell monolayer (Vero or BHK) is washed from the nutrient medium with a DPBS solution, followed by removal of the liquid fraction. Trypsin and versene solution (2: 1 ratio) is added to the cells, then the cells are incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% carbon dioxide for 3-5 minutes. After the cells are detached, the necessary amount of medium based on the enzymatic fibrin hydrolyzate is added to the vial, and the cells are carefully resuspended using a pipette. After counting the number of cells, add the required amount of cell suspension and the specified environment. The recommended initial cell concentration is 5-10 × 10 ⁴ cells / ml. Cells are incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% carbon dioxide for 4-5 days. Fibrin hydrolyzate-based culture medium provides the accumulation of Vero and BHK transplantable cell lines. The confluent monolayer persists for at least 2 days from the date of formation. Vero and BHK cells grown in the experimental medium for fifteen passages retained the shape characteristic of this type of cells, with clearly defined boundaries, without signs of degeneration, and did not morphologically differ from cells grown on comparison media (199 and Needle MEM).

Культивирование клеточной культуры Vero или BHK на среде, содержащей 0,25% ферментативного гидролизата фибрина и 10% сыворотки КРС проводят аналогично культивированию клеточной культуры Vero или BHK на среде, содержащей 0,1% ферментативного гидролизата фибрина. Результат представлен в таблице 1.The cultivation of a Vero or BHK cell culture on a medium containing 0.25% fibrin enzymatic hydrolyzate and 10% cattle serum is carried out similarly to the cultivation of a Vero or BHK cell culture on a medium containing 0.1% fibrin enzymatic hydrolyzate. The result is presented in table 1.

Пример 2.Example 2

Накопление фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на клетках Vero, выращенных в среде на основе ферментативного гидролизата фибрина.The accumulation of fixed rabies virus "Moscow 3253" on Vero cells grown in a medium based on an enzymatic fibrin hydrolyzate.

Вируссодержащий материал вносят в суспензию клеток Vero, выращенную в экспериментальной среде, приготовленной по Примеру 1. Рекомендуемая заражающая доза составляет от 0,1 до 1,0 lg ИД₅₀/мл. Культивирование вируса на клетках осуществляют при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение от 5 до 7 суток. Рекомендуемая концентрация клеток составляет от 0,5-1,5×10⁶ кл./мл.The virus-containing material is introduced into a Vero cell suspension grown in the experimental medium prepared according to Example 1. The recommended infectious dose is from 0.1 to 1.0 log ID ₅₀ / ml. The cultivation of the virus on the cells is carried out at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ for 5 to 7 days. The recommended cell concentration is from 0.5-1.5 × 10 ⁶ cells / ml.

Показатели уровня накопления фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на клетках Vero, выращенных в средах с содержанием ферментативного гидролизата фибрина (от 0,1 до 0,25%), Игла MEM и 199 с добавлением 5% сыворотки КРС, сопоставимы друг с другом при исследовании в ИФА. Титр вируса через 7 суток культивирования соответствовал 1:16, что свидетельствует о возможности применения питательной среды с фибрином для накопления вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток.The accumulation rates of the fixed rabies virus “Moscow 3253” on Vero cells grown in media containing enzymatic fibrin hydrolyzate (from 0.1 to 0.25%), MEM Needle and 199 with 5% cattle serum supplemented are comparable with each other research in ELISA. The virus titer after 7 days of cultivation corresponded to 1:16, which indicates the possibility of using a nutrient medium with fibrin for the accumulation of rabies virus in the culture of transplanted cells.

Таким образом, заявляемая питательная среда для культивирования перевиваемых клеточных линий млекопитающих на основе сухого ферментативного гидролизата фибрина расширяет ассортимент питательных сред и обеспечивает рациональную утилизацию отходов, образующихся при производстве иммунобиологических препаратов. Экономический эффект использования изобретения состоит в снижении стоимости питательных сред при сохранении эффективности наращивания биологического материала.Thus, the claimed nutrient medium for the cultivation of transplantable mammalian cell lines based on a dry enzymatic fibrin hydrolyzate expands the range of nutrient media and ensures the rational utilization of waste generated during the production of immunobiological preparations. The economic effect of using the invention is to reduce the cost of nutrient media while maintaining the effectiveness of building biological material.

Литература:Literature:

1. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство, 2014 г., М.: Бином. 718 с.1. Freshney R.Ya. Animal cell culture: a practical guide, 2014, M.: Binom. 718 p.

2. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты: Получение, состав, применение, 2000 г., М.: Аграрная наука. 295 с.2. Telishevskaya L.Ya. Protein hydrolysates: Preparation, composition, application, 2000, M .: Agricultural science. 295 p.

3. Богрянцева М.П. Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов: диссертация … кандидата биологических наук: 03.00.23., Кольцово, 1999. 30 с.3. Bogryantseva M.P. Manufacturing technology and properties of a dry sterile nutrient medium based on hydrolysates: the dissertation ... candidate of biological sciences: 03.00.23., Koltsovo, 1999. 30 p.

4. Трошкова Г.П., Сумкина Т.П., Мартынец Л.Д., Мазуркова Н.А. Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих. Патент 2377295. Опубл. 27.12.2009. Бюл. 36.4. Troshkova G.P., Sumkina T.P., Martynets L.D., Mazurkova N.A. Nutrient medium for the cultivation of mammalian cells. Patent 2377295. Publ. 12/27/2009. Bull. 36.

5. Ермишина И.Г., Мейнерт А.Г., Ермолин Г.А., Дудкин С.М. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата. Патент 2103360. Опубл. 27.01.19985. Ermishina I.G., Meinert A.G., Ermolin G.A., Dudkin S.M. Nutrient medium for the cultivation of eukaryotic cells and a method of obtaining the basis of a nutrient medium - proteolytic hydrolyzate. Patent 2103360. Publ. 01/27/1998

6. Ермишина И.Г., Мейнерт А.Г., Ермолин Г.А. Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда «Эпидермат-2» для культивирования клеток эукариотов. Патент 2068879. Опубл. 11.10. 1996.6. Ermishina I.G., Meinert A.G., Ermolin G.A. A method of obtaining an enzymatic hydrolyzate and nutrient medium "Epidermate-2" for the cultivation of eukaryotic cells. Patent 2068879. Publ. 11.10. 1996.

7. Ермишина И.Г., Мейнерт А.Г., Власова Т.Ф. Способ получения ферментативного гидролизата из мышечной ткани ластоногих и питательная среда «Целат» для культивирования клеток эукариотов. Патент 2074249. Опубл. 27.02.1997.7. Ermishina I.G., Meinert A.G., Vlasova T.F. A method of obtaining an enzymatic hydrolyzate from pinniped muscle tissue and the Celat culture medium for culturing eukaryotic cells. Patent 2074249. Publ. 02/27/1997.

8. Искендеров Р.И., Егоров Б.Б., Ермишина И.Г., Сасунов Н.Ш., Власова Т.Ф., Кирьянова Е.А., Попова Н.А., Джавадов С.А., Эюбов Э., Мирошникова Е.Б., Ермолин Г.А. Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда для культивирования клеток эукариотов. Патент 2020153. Опубл. 30.09.1994.8. Iskenderov RI, Egorov BB, Ermishina I.G., Sasunov N.Sh., Vlasova T.F., Kiryanova E.A., Popova N.A., Javadov S.A., Eyubov E., Miroshnikova E.B., Ermolin G.A. A method of obtaining an enzymatic hydrolyzate and a culture medium for the cultivation of eukaryotic cells. Patent 2020153. Publ. 09/30/1994.

9. Елисеев А.К., Мельник Н.В., Зенов Н.И., Михеева Г.Ф. Литенкова И.Ю., Шмаленко Т.Г., Красуткин С.Н. Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих. Патент 2300563 Опубл. 10.06.2007 Бюл. №34.9. Eliseev A.K., Melnik N.V., Zenov N.I., Mikheeva G.F. Litenkova I.Yu., Shmalenko T.G., Krasutkin S.N. Nutrient medium for suspension cultivation of mammalian cells. Patent 2300563 Publ. 06/10/2007 Bull. Number 34.

10. Елисеев А.К. Красуткин С.Н., Зенов Н.И., Литенкова И.Ю., Мельник Н.В., Шмаленко Т.Г., Маслов Е.В., Ельников В.В., Крюкова Е.Н. Питательная среда для суспензионногоо культивирования клеток млекопитающих. Патент 2558253. Опубл. 27.07.2015. Бюл. №21.10. Eliseev A.K. Krasutkin S.N., Zenov N.I., Litenkova I.Yu., Melnik N.V., Shmalenko T.G., Maslov E.V., Elnikov V.V., Kryukova E.N. Nutrient medium for suspension cultivation of mammalian cells. Patent 2558253. Publ. 07/27/2015. Bull. No. 21.

11. Трошкова Г.П., Богрянцева М.П., Мазуркова Н.А., Мартынец Л.Д., Кирова Е.В., Юдин А.В. Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих. Патент 2201958 РФ. Опубл. 10.04.2003, Бюл. №1011. Troshkova G.P., Bogryantseva M.P., Mazurkova N.A., Martynets L.D., Kirova E.V., Yudin A.V. Dry sterile low-serum culture medium for the cultivation of mammalian cells. RF patent 2201958. Publ. 04/10/2003, Bull. Number 10

12. Богрянцева М.П., Трошкова Г.П., Мазуркова Н.А., Ночевный В.Т., Мартынец Л.Д., Сироткина Т.Б. Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата. Патент 2161649. Опубл. 10.01.2001. Бюл. 112. Bogryantseva M.P., Troshkova G.P., Mazurkova N.A., Nochevny V.T., Martynets L.D., Sirotkina T.B. A method of obtaining a sterile liquid nutrient medium based on an enzymatic hydrolyzate. Patent 2161649. Publ. 01/10/2001. Bull. one

13. Антонычева М.В., Нижегородцев С.А. Еремин С.А., Аленкина Т.В., Шульгина И.В., Бахрушина Н.И., Белоусов А.Д., Жулидов И.М., Никифоров А.К. Питательная среда для глубинного культивирования холерного вибриона. Патент 2425866. Опубл. 10.08.2011. Бюл. №22.13. Antonycheva M.V., Nizhegorodtsev S.A. Eremin S.A., Alenkina T.V., Shulgina I.V., Bakhrushina N.I., Belousov A.D., Zhulidov I.M., Nikiforov A.K. Nutrient medium for deep cultivation of cholera vibrio. Patent 2425866. Publ. 08/10/2011. Bull. Number 22.

Claims

Nutrient medium for the cultivation of transplantable cell cultures of mammals, including dry enzymatic fibrin hydrolyzate, cattle serum, balanced saline in the following ratio, vol. %:

dry fibrin enzymatic hydrolyzate (amine nitrogen content from 2.6 to 3.0%) from 0.1 to 0.25 cattle blood serum from 5 to 10 saline solution up to 1 liter