RU2672595C2 - Способ диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями - Google Patents
Способ диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями Download PDFInfo
- Publication number
- RU2672595C2 RU2672595C2 RU2015112894A RU2015112894A RU2672595C2 RU 2672595 C2 RU2672595 C2 RU 2672595C2 RU 2015112894 A RU2015112894 A RU 2015112894A RU 2015112894 A RU2015112894 A RU 2015112894A RU 2672595 C2 RU2672595 C2 RU 2672595C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gata
- tbet
- expression
- patient
- cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 34
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 101001066288 Gallus gallus GATA-binding factor 3 Proteins 0.000 claims abstract description 152
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 35
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 101100260032 Mus musculus Tbx21 gene Proteins 0.000 claims description 157
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 101
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 47
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 36
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 26
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 10
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 10
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 7
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 claims description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 4
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 claims description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 206010049153 Allergic sinusitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 claims description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 claims description 2
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 2
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical class C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 238000002483 medication Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 33
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 23
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 16
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 15
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 15
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 13
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102100037765 Periostin Human genes 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 6
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 108010003338 GATA3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004610 GATA3 Transcription Factor Human genes 0.000 description 5
- -1 IL-5 Proteins 0.000 description 5
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 5
- 101710199268 Periostin Proteins 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 208000037884 allergic airway inflammation Diseases 0.000 description 4
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000013313 FeNO test Methods 0.000 description 3
- 101100137243 Homo sapiens POSTN gene Proteins 0.000 description 3
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000013968 STAT6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N Budesonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(CCC)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001095308 Homo sapiens Periostin Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229960004436 budesonide Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- CZVCGJBESNRLEQ-UHFFFAOYSA-N 7h-purine;pyrimidine Chemical group C1=CN=CN=C1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 CZVCGJBESNRLEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004604 Blowing Agent Substances 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039536 Calcium-activated chloride channel regulator 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 108010088742 GATA Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101000888572 Homo sapiens Calcium-activated chloride channel regulator 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100013966 Homo sapiens GATA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000609261 Homo sapiens Plasminogen activator inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713602 Homo sapiens T-box transcription factor TBX21 Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101150069380 JAK3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 201000009053 Neurodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100039419 Plasminogen activator inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007987 Proto-Oncogene Proteins c-maf Human genes 0.000 description 1
- 108010089507 Proto-Oncogene Proteins c-maf Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010065108 RNA-cleaving DNA 10-23 Proteins 0.000 description 1
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000006381 STAT1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 102100036840 T-box transcription factor TBX21 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036428 airway hyperreactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002590 anti-leukotriene effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000004982 autoimmune uveitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003117 fluorescence-linked immunosorbent assay Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 108010085650 interferon gamma receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 229950002183 lebrikizumab Drugs 0.000 description 1
- 102000003835 leukotriene receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000146 leukotriene receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004796 pathophysiological change Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/113—Multiple emulsions, e.g. oil-in-water-in-oil
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/127—DNAzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
- G01N2333/4706—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7095—Inflammation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
Abstract
Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для диагностики молекулярного фенотипа больных, страдающих заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к подгруппам «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» или «Th1-низкая». Предложен лекарственный препарат для лечения таких пациентов, содержащий специфичный к GATA-3 или Tbet ДНК-фермент. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные методы определения молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, и лекарственные средства, обладающие эффективностью для выявленной подгруппы больных. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к способу и набору реагентов для диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, а также к лекарственному препарату для лечения такого пациента.
Хронические воспаления представляют собой все более разрастающийся круг проблем медицинского характера, имеющих большое социоэкономическое значение. К ним, в частности, относятся следующие группы заболеваний: аутоиммунные заболевания и заболевания ревматической клинико-морфологической группы (проявления, например, на коже, легких, почках, кровеносно-сосудистой системе, нервной системе, соединительной ткани, опорно-двигательном аппарате, эндокринной системе), аллергические реакции немедленного типа и астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), атеросклероз, псориаз и контактная экзема и хронические реакции отторжения после трансплантации органов и костного мозга. В последние десятилетия многие из этих заболеваний начинают все более заметно доминировать не только в промышленных регионах, но и отчасти во всем мире. Так, вот уже свыше 20% населения в Европе, Северной Америке, Японии и Австралии страдают аллергическими заболеваниями и астмой. Хроническая обструктивная болезнь легких на сегодняшний день занимает пятое место среди наиболее распространенных причин смерти во всем мире и к 2020 г. по прогнозам ВОЗ займет третье место. Лидирующая позиция в статистике заболеваемости и смертности во всем мире принадлежит атеросклерозу с сопутствующими ему заболеваниями - инфаркту миокарда, инсульту и окклюзии периферических артерий. Псориаз и контактная экзема наряду с нейродерматитом и вовсе являются наиболее распространенными хроническими воспалительными заболеваниями кожи.
Ввиду еще недостаточно изученного на сегодняшний день взаимодействия между факторами окружающей среды и генетической предрасположенностью регулирование иммунной системы в долгосрочной перспективе зачастую происходит неправильно. При этом для таких различных заболеваний можно констатировать следующие общие принципы:
(A) Происходит развитие чрезмерного иммунного ответа на обычно безвредные для человека антигены. Эти антигены могут быть частями окружающей среды (например, аллергены, в т.ч. пыльца, шерсть животных, продукты питания, клещи, химические вещества, в т.ч. консерванты, красители, чистящие и моющие средства). В таких случаях у пациентов развиваются аллергические реакции. Например, у активных и пассивных курильщиков возникает хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). С другой стороны, иммунная система может реагировать и на компоненты собственного организма, воспринимать их как чужеродные и инициировать против них воспалительную реакцию. В таких случаях развивается аутоиммунное заболевание. В каждом таком случае безвредные, нетоксичные антигены ошибочно распознаются как чужеродные или опасные, и запускается неадекватная воспалительная реакция.
(B) Заболевания протекают в несколько фаз, к которым относятся инициирование, прогрессирование, т.е. развитие воспалительной реакции, и связанная с этим деструкция и перестройка с потерей функциональных возможностей органа (так называемое ремоделирование).
(C) Заболевания демонстрируют специфические для конкретного пациента субфенотипические признаки проявления.
(D) В процессах инициирования, поддержания, а также деструкции и перестройки непрерывно задействованы компоненты врожденного и приобретенного иммунитета. Под влиянием врожденного иммунитета (важные компоненты: антигенпредставляющие клетки с их разнообразными популяциями и система комплемента) происходит активация и дифференцировка клеток адаптивной иммунной системы (важные компоненты: Т- и В-лимфоциты). Т-клетки при дальнейшем течении берут на себя центральные функции путем дифференцировки в высокоспециализированные эффекторы.
При этом они активируют и приобретают определенные эффекторные механизмы, к которым, в частности, относятся следующие функции: образование антител, контроль функциональных возможностей эффекторных клеток иммунной системы (например, нейтрофильных, базофильных, эозинофильных гранулоцитов), обратная связь с функциями врожденной иммунной системы, влияние на функциональные возможности негемопоэтических клеток, например, эпителия, эндотелия, соединительной ткани, костей и хрящей и прежде всего нейрональных клеток. Здесь имеет место особое взаимодействие между иммунной и нервной системами, исходя из которого сформировалась концепция нейро-иммунологического взаимодействия при хронических воспалениях.
Поскольку уже упомянутые Т-клетки берут на себя центральные функции при течении болезни, решающую роль играет понимание их специализации. В дифференцировке наивных (неактивированных) клеток CD4+ в Th1- и/или Th2-клетки участвуют сложные каскады передачи сигнала.
Стимуляция соответствующим пептидным ГКГС-комплексом (главным комплексом гистосовместимости) через Т-клеточный рецептор вызывает клональную экспансию и программированную дифференцировку CD4+ Т-лимфоцитов в Т-хелперы [Т-клетки-помощники] Th1- или Тh2-клетки. Два этих подтипа различаются в зависимости от их цитокиновых профилей. Th1-клетки вырабатывают интерферон-γ (INFγ), интерлейкин 2 (IL-2) и фактор некроза опухоли-α, в то время как Тh2-клетки выделяют IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13. Бактериальные и вирусные инфекции вызывают иммунный ответ, в котором преобладают Th1-клетки. С другой стороны, Тh2-клетки регулируют выработку иммуноглобулиновых Ε антител IgE против паразитов. При этом между Th1- и Тh2-клетками имеет место равновесие. Нарушение этого равновесия приводит к возникновению заболеваний, так, чрезмерный ответ Th1-клеток связан с аутоиммунными заболеваниями, в то время как в основе аллергических заболеваний лежит слишком сильный ответ Тh2-клеток.
Известно, что Th1-цитокины вовлечены в патогенез аутоиммунных заболеваний, например, аутоиммунного увеита, экспериментального аллергического энцефаломиелита, сахарного диабета 1 типа или регионарного энтерита (болезни Крона), в то время как Тh2-цитокины (IL-4, IL-5, IL-13 и/или IL-9) участвуют в возникновении хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей, например, эозинофилия дыхательных путей, астма, гиперсекреция слизи и гиперреактивность дыхательных путей. Основой этих заболеваний являются патофизиологические изменения во время образования типичных цитокинов за счет антигенспецифических Th-клеток. Субпопуляции Тh2-клеток в легком и в дыхательных путях вызывают в экспериментальной модели на животном характерные симптомы бронхиальной астмы.
В возникновении аутоиммунных заболеваний и хронических воспалительных реакций задействованы, помимо прочего, два транскрипционных фактора: ТМ-клетко-специфичный транскрипционный фактор Tbet и Тh2-клетко-специфичный транскрипционный фактор GATA-3.
Th1-клетко-специфичный транскрипционный фактор Tbet отвечает, прежде всего, за дифференцировку наивных CD4 +Т-клеток в Тh1-клетки. Его экспрессия контролируется по путям передачи сигнала Т-клеточного рецептора (TCR) и через INFγ-рецептор/STAT1 (рецептор интерферона-гамма). Tbet трансактивирует эндогенный INFγ-ген и вызывает выработку INFγ. Функция Tbet in vivo подтверждается и на нокаутированных мышах (Tbet-/-). У Tbet-дефицитных мышей количество Тh2-цитокинов повышено.
Известна функция Tbet в Т-клетках слизистых при возникновении воспалительных заболеваний кишечника. Транскрипционный фактор Tbet вызывает главным образом развитие Th1-клеток и контролирует выработку в этих клетках интерферона-гамма INFγ. За счет ингибирования Tbet баланс между Th1- и Тh2-клетками смещается в сторону Тh2-клеток.
Многие воспалительные заболевания, например, аллергическая астма, напротив, связаны с активацией Тh2-клеток. Тh2-клетки выполняют существенную функцию при развитии аллергических заболеваний, в частности, различных астматических заболеваний. Требуемая для этого дифференцировка Th0-клеток в Th2- клетки зависит от транскрипционного фактора GATA-3. GATA-3 является членом GATA-семейства транскрипционных факторов.
Тh2-клетко-специфичный транскрипционный фактор GATA-3 отвечает, прежде всего, за дифференцировку наивных CD4+ Т-клеток в Тh2-клетки. При этом управление дифференцировкой Тh2-клеток осуществляется, главным образом, по двум путям передачи сигнала: по пути Т-клеточного рецептора (TCR) и по пути IL-4- рецептора. Переданные от TCR сигналы активируют как Тh2-клетко-специфичные транскрипционные факторы c-Maf и GATA-3, так и транскрипционные факторы NFAT и АР-1. Активация IL-4 рецептора ведет к связыванию STAT6 с цитоплазматическим доменом IL-4- рецептора, где его фосфолируют Jak1- и Jak3-киназы. В свою очередь, фосфорилирование приводит к димеризации и транслокации STAT6 в клеточное ядро, где STAT6 активирует транскрипцию GATA-3 и других генов. GATA-3 представляет собой транскрипционный фактор с доменами типа цинковых пальцев, который выражается исключительно в зрелых Тh2-клетках, но не в Th1-клетках.
Тh2-клетки вырабатывают цитокины, например, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и GM-CSF. Поляризация в Th2 ингибирует Тh1-дифференцировку за счет подавления Tbet и наоборот. Однако экспрессия GATA-3 не ограничивается только Т-клетками. Экспрессию GATA-3 удавалось выявить и в эозинофильных, и базофильных гранулоцитах, лаброцитах (тучных клетках) и клетках эпителия. GATA-3 играет центральную роль в иммунопатогенезе хронических воспалительных заболеваний, в частности, аллергической астмы.
К общепризнанным препаратам для лечения хронических воспалительных заболеваний относятся, помимо прочего, кортикостероиды, антилейкотриены (ингибиторы лейкотриеновых рецепторов), иммуносупрессивные препараты и моноклональные антитела с антиммуноглобулином Е. Однако положительная реакция пациентов-астматиков на эти терапевтические средства проявляется по-разному. Долгое время оставалось неясным, с чем связаны эти различия в эффективности. В конечном счете подходящую пациенту терапию в каждом конкретном случае приходилось подбирать более или менее методом «проб и ошибок».
Однако лишь недавно удалось установить, что, например, пациентов, страдающих астмой, можно распределить по еще более мелким подгруппам (Woodruff et al., 2009, Τ- helper Type 2-driven Inflammation Defines Major Subphenotypes of Asthma («Т-хелпер 2-го типа-зависимое воспаление определяет основные субфенотипы астмы»), Am J Respir Crit Care Med, Vol 180, 388-395). Так, было показано, что среди пациентов с астмой есть, по меньшей мере, две подгруппы, обозначаемые как «Тh2-высокая» (Th2 high) и «Th2-низкая» (Th2 low). При этом для «Тh2-высокой» подгруппы пациентов с астмой характерна, помимо прочего, повышенная экспрессия гена POSTN, кодирующего периостин для протеина, а также генов для IL-13 и IL-5. «Th2-низкая» группа протестированных пациентов с астмой демонстрирует низкую экспрессию гена POSTN по сравнению с контрольной группой здоровых людей. Эти различные молекулярные фенотипы могли бы быть причиной разной эффективности распространенных терапевтических средств. Так, для «Th2-высокой» подгруппы удалось выявить улучшенную реакцию на лечение кортикостероидами.
Кроме того, удалось обнаружить, что две группы пациентов с астмой, а именно «Тh2-высокая» и «Тh2-низкая» демонстрируют разный отклик на терапию гуманизированным моноклональным антителом против IL-13 (Corren et al., 2011, Lebrikizumab Treatment in Adults with Asthma («Лечение астмы у взрослых»), The new england journal of medicine, 10.1056/NEJMoa1106469). При этом пациенты с астмой сначала эмпирическим путем были отнесены к «Th2-высокой» группе, если значения IgE в сыворотке крови были выше 100 МЕ/мл, а число эозинофильных гранулоцитов составляло 0,14×109 клеток на литр или больше. Каждый пациент, показатели которого были ниже этих значений, был отнесен к «Тh2-низкой» группе. В качестве альтернативы классификацию осуществляли в зависимости от уровня периостина в сыворотке крови. Этот уровень служит суррогатным маркером для трудно обнаруживаемых в крови или дыхательных путях Тh2-цитокинов IL-13. При этом используется тот факт, что IL-13, помимо прочего, вызывает экспрессию периостин-кодирующего гена POSTN в клетках эпителия in vitro (Woodruff et al., 2007, Proc Natl Acad Sei USA., 104(40): 15858-63. Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids («Полногеномное профилирование выявляет гены клеток эпителия, связанные с астмой и с эффектом лечения кортикостероидами»). Пациенты с уровнем периостина в сыворотке крови выше среднего согласно классификации Corren et al., 2011, были отнесены к «периостин-высокой» группе. Как правило, для указанных подгрупп «Тh2-высокая» и «периостин-высокая» удавалось описать более эффективный отклик на лечение анти-IL-13- антителами.
Авторы WO 2009/124090 А1 также предложили определенную классификацию пациентов с астмой, причем в этой классификации задействуется экспрессия несколько генов-«кандидатов», например, POSTN, CLCA1 и SERPINB2. Поскольку регулирование этих генов Тп2-цитокинами IL-4 или IL-13, как известно, происходит с повышением экспрессии, этот кластер обозначают также как «IL-4/IL-13-профиль генной экспрессии» («IL-4/IL-13-Signature»). При этом наряду с определением уровня периостина в сыворотке крови, а также соответствующего количества мРНК (матричных, или информационных РНК) описывается определение значений IgE в сыворотке крови и определение количества эозинофильных гранулоцитов.
Недостаток стратификации пациентов на основе этой экспрессии генов, прежде всего POSTN, заключается в том, что наряду с «IL-4/IL-13-профилием генной экспрессии» значительную роль в генезе астмы играет цитокин IL-5. Кроме того, неизвестна роль протеина периостина в каскаде иммунных реакций, а значит, и в возникновении болезни.
Таким образом, поставленная задача заключается в том, чтобы найти биомаркер, подходящий для достоверного и в то же время удобного для применения в клинических условиях определения молекулярного фенотипа больных, страдающих каким-либо заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к группам «Тh2-высокая» или «Тh2-низкая» и/или «Тh1-высокая» или «Тh1-низкая». Далее классифицированный таким образом пациент должен поддаваться лечению терапевтическим средством, обладающим особой эффективностью именно для этой подгруппы. Биомаркер должен сделать возможным индивидуальный прогноз эффективности терапевтического средства применительно к тому или иному пациенту, в частности, пациенту с астмой.
Согласно изобретению указанная задача решается с помощью способа диагностики молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, путем выбора молекулярного фенотипа из группы, в которую входят подгруппы «Тh2-высокая», «Тh2-низкая», «Тh1-высокая» и «Тh1-низкая», и путем количественного определения экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet в биологическом изоляте пациента и ее применения для отнесения к какому-либо молекулярному фенотипу заболевания. При этом более точное отнесение к определенному типу больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, осуществляют путем количественного определения экспрессии генов транскрипционного фактора GATA-3 и/или транскрипционного фактора Tbet. Как уже отмечалось выше во вступительной части, в возникновении аутоиммунных заболеваний и хронических воспалительных реакций участвуют Th1-клетко-специфичный транскрипционный фактор Tbet и Тh2-клетко-специфичный транскрипционный фактор GATA-3. Поляризация в Th2 ингибирует дифференцировку в Th1-клетки за счет подавления Tbet и наоборот. В зависимости от уровня экспрессии GATA-3 и/или Tbet возможно закрепление за тем или иным молекулярным фенотипом, т.е. отнесение к какой-либо подгруппе заболевания, сопровождаемого хроническими воспалениями. Способ диагностики согласно изобретению позволяет с высокой степенью информативности без труда определять молекулярный фенотип в повседневных клинических условиях.
Транскрипционные факторы GATA-3 и Tbet являются центральными ключевыми молекулами при возникновении Th1- и/или Тh2-зависимых хронических воспалительных заболеваний. Поэтому прямое количественное определение экспрессии протеинов и/или мРНК-экспрессии представляет собой наилучший подход к стратификации пациентов, поскольку результат не может быть искажен никакими промежуточными механизмами.
Согласно предпочтительному варианту осуществления способа уровень экспрессии GATA-3 и/или Tbet определяют по количеству протеина или мРНК. При этом количество протеина можно определить с помощью иммуноанализа. Иммуноанализ представляет собой предпочтительно твердофазный иммуноферментный анализ ИФА (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, исследование ELISA), радиоиммунный анализ РИА (radioimmunassay, RIA), электрохемилюминесцентный ЭХЛ иммуноанализ (electrochemiluminescence immunoassay, ECL), твердофазный иммуноферментный анализ с хемилюминесценцией (chemoluminescence-linked Immunosorbent assay, CLIA), твердофазный иммуноанализ с флуоресцентным усилением (fluorescence-linked Immunosorbent assay, FLIA) или мультиплексный иммуноанализ (multiplex-assay).
Преимуществом всех указанных видов анализа, наряду с высокой чувствительностью и специфичностью, является возможность автоматизации, поэтому все они прекрасно подходят для повседневного использования в клинических условиях. Разумеется, в рамках настоящего изобретения при необходимости может быть подобрано любое другое подходящее исследование для количественного учета количества протеинов GATA-3 и/или Tbet. Далее уровень экспрессии GATA-3 и/или Tbet может быть определен масс-спектрометрическими способами, хроматографическими способами, например, с помощью хроматографии в газовой фазе, жидкостными способами с отделением твердой фазы, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), или способами на основе микро- и нанофлюидных технологий.
При необходимости для определения экспрессии GATA-3 или Tbet с помощью анализа ИФА (ELISA) способ может включать следующие этапы:
- получение лизата посредством лизиса клеток;
- добавление лизата в лунку микротитрационного планшета, покрытого слоем первого антитела, специфичного к GATA-3- или Tbet;
- промывка микротитрационного планшета;
- добавление второго специфичного к GATA-3 или Tbet антитела в лунку микротитрационного планшета;
- промывка микротитрационного планшета;
- выявление и количественное определение GATA-3- или Tbet-протеина.
Для выявления второе специфичное антитело может быть маркировано, например, биотином, и может быть отдельно добавлен фермент, связанный со стрептавидином. Однако второе специфичное антитело может быть связано с ферментом напрямую. Если целесообразно, возможно также использование третьего связанного с ферментом антитела, направленного против второго специфичного антитела.
Фермент, которым предпочтительно является пероксидаза или щелочная фосфатаза, переносится подходящим субстратом, пригодным для колориметрии или хемилюминесценции и т.п.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения дополнительно или в качестве альтернативы указанному способу учета количества протеинов возможно определение количества мРНК GATA-3 и/или Tbet. Для этого предпочтительно подходит ПЦР (полимеразная цепная реакция), особенно предпочтительно количественная ПЦР, или микроматричный анализ. Порядок подбора специфических для GATA-3 и Tbet зондов и/или праймеров для указанных способов выявления специалисту в данной области техники известен.
Биологический изолят согласно предпочтительному варианту осуществления способа получали из цельной крови, мочи, мокроты, смывов от бронхоальвеолярного лаважа (BAL), биопсии, щеточной биопсии, ликвора, трахеального секрета, семенной жидкости, водяночной жидкости, слюны, пунктата или лимфатической жидкости. Стандартные методы получения подходящего биологического изолята специалисту известны.
GATA-3 и Tbet - это протеины, проявляющие свое действие в качестве транскрипционных факторов в ядре Т-клеток-хелперов подтипов Тh1 и Th2. Для определения концентрации этих обоих ядерных протеинов в определенном объеме биологического изолята, например, в определенном объеме цельной крови или т.п., клетки, образующие GATA-3 и Tbet, необходимо сначала изолировать, а затем подвергнуть лизису. Прямое выявление этих протеинов из сыворотки или плазмы крови человека едва ли представляется возможным, т.к. они содержатся там в концентрации, не поддающейся обнаружению. Поэтому анализ GATA-3 и Tbet при необходимости осуществляется в четыре этапа:
- отделение и изоляция GАТА-3/Tbet- экспрессирующих клеток от остальных клеточных компонентов цельной крови
- лизис клеток и выделение внутриклеточных / ядерных протеинов
- количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet и
- нормирование обнаруженных концентраций GATA-3 и Tbet.
Согласно предпочтительному доработанному варианту способ согласно изобретению, независимо от того, определяется уровень экспрессии GATA-3 и/или Tbet по количеству протеинов или мРНК, включает также один или несколько следующих этапов:
(i) изоляция лейкоцитов, предпочтительно посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла;
(ii) повышение концентрации лейкоцитов, предпочтительно посредством гель-фильтрации; или
(iii) повышение концентрации Тh1/Th2-клеток, в частности, CD4+-T-клеток с помощью клетко-специфичных антител, которые предпочтительно связаны с магнитными гранулами-микроносителями.
Указанные этапы (i)-(iii) выполняют перед лизисом клеток и в каждом случае позволяют повысить чувствительность, а также информативность способа диагностики, т.к. гены GATA-3 и Tbet особенно в лейкоцитах выражаются по-разному.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Тh2-высокой» подгруппы происходит, когда выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:
a) экспрессия генов GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии генов GATA-3 Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения.
Таким образом, «Тh2-высокая» подгруппа характеризуется высокой абсолютной экспрессией генов GATA-3 по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае определения количества протеинов - может использоваться соответствующее значение содержания протеина GATA-3 в изоляте здорового человека. Однако также возможно использование абсолютных контрольных значений. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения может использоваться соответствующее значение количества GATA-3 мРНК в изоляте здорового человека. Однако опять же возможно применение абсолютных контрольных значений, например, количество копий/мл.
Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Тh2-высокой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к повышенной экспрессии генов GATA-3 отношение уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов GATA-3 в качестве дополнительного параметра выявляется экспрессия генов Tbet. Поскольку, как описано во вступлении, регулирование обоих транскрипционных факторов в процессе их экспрессии, происходит разнонаправленно, включение Tbet представляет собой средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов GATA-3.
Согласно предпочтительному доработанному варианту способ согласно изобретению для отнесения пациента к молекулярному фенотипу «Th2-высокой» подгруппы содержит этапы:
- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;
- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для GATA-3 и/или Tbet;
- включение пациента в «Тh2-высокую» подгруппу, если выполняется, по меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).
В качестве альтернативы дополнительно к указанному определению экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet происходит еще определение других параметров для достоверного включения в «Тh2-высокую» подгруппу. Так, например, можно измерять уровень IgE в сыворотке крови и число эозинофильных гранулоцитов. Закрепление за «Тh2-высокой» подгруппой происходит, если далее уровень IgE в сыворотке крови оказывается выше, чем 100 МЕ/мл и/или если число эозинофильных гранулоцитов составляет 0,14×109 клеток на литр или выше. В качестве альтернативы при необходимости может быть выполнено определение концентрации моноксида азота в выдыхаемом воздухе, т.е. определение значения FeNO.
Еще один предпочтительный вариант осуществления способа согласно изобретению включает отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Тh2-низкой» подгруппы, если выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:
a) экспрессия генов GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения.
Таким образом, «Тh2-низкая» подгруппа характеризуется низкой абсолютной экспрессией генов GATA-3 по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае определения количества протеинов - может использоваться соответствующее значение содержания протеина GATA-3 в изоляте здорового человека. Здесь надо учитывать, что у пациента «Тh2-низкой» подгруппы с заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, абсолютная экспрессия генов GATA-3, тем не менее, будет, как правило, выше, чем в изоляте здорового человека. Однако абсолютная экспрессия генов GATA-3 может быть также ниже, чем у здорового человека. Но, во всяком случае, экспрессия генов GATA-3 не столь высока, как описано для «Тh2-высокой» подгруппы. Таким образом, отнесение пациента к «Тh2-низкой» подгруппе происходит, если у него содержание протеина GATA-3 по сравнению с изолятом здорового человека если и повышено, то умеренно. Однако можно использовать и фиксированные контрольные значения. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение количества GATA-3 мРНК в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Тh2-низкой» подгруппе происходит, когда у него количество GATA-3 мРНК меньше, чем в соответствующем образце здорового человека или, во всяком случае, повышено незначительно. Однако, опять-таки, можно использовать и фиксированные контрольные значения.
Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Th2-низкой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к уменьшенной экспрессии генов GATA-3 отношение уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения может использоваться соответствующее значение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet и здесь повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов GATA-3 в качестве дополнительного параметра устанавливается экспрессия генов Tbet.
Поскольку, как описано во вступлении, регулирование обоих транскрипционных факторов в процессе их экспрессии, происходит разнонаправленно, включение Tbet в некоторой степени представляет собой средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов GATA-3.
Согласно предпочтительному доработанному варианту способ отнесения пациента к молекулярному фенотипу «Тh2-низкой» подгруппы согласно изобретению включает следующие этапы:
- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;
- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для GATA-3 и/или Tbet;
- включение пациента в «Тh2-низкую» подгруппу, если выполняется, меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).
В качестве альтернативы дополнительно к указанному определению экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet опять-таки определяются и другие параметры для достоверного включения в «Тh2-низкую» подгруппу. Так, например, можно измерять уровень IgE в сыворотке крови и число эозинофильных гранулоцитов. Отнесение к «Тh2-низкой» подгруппе происходит в том случае, если уровень IgE в сыворотке крови ниже, чем 100 МЕ/мл, и/или если число эозинофильных гранулоцитов составляет менее 0,14×109 клеток на литр. В качестве альтернативы при необходимости может быть также определена концентрация моноксида азота в выдыхаемом воздухе, т.е. выполнено определение значения FeNO.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Тh1-высокой» подгруппы происходит, если выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:
a) экспрессия генов Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения.
Таким образом, «Th1-высокая» подгруппа характеризуется высокой абсолютной экспрессией генов Tbet по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае количественного определения протеинов - может использоваться соответствующее значение содержания протеина Tbet в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Th1-высокой» подгруппе происходит, если у него повышено содержание протеина Tbet. Однако можно также использовать и фиксированные контрольные значения. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение количества мРНК Tbet в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Тh1-высокой» подгруппе происходит в том случае, если у него повышено количество мРНК Tbet. Однако, опять-таки, можно использовать и фиксированные контрольные значения.
Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Тh1-высокой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к повышенной экспрессии генов Tbet отношение уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение отношения экспрессии генов Tbet: GATA-3 в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 и здесь повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов Tbet в качестве дополнительного параметра устанавливается экспрессия генов GATA-3, а включение GATA-3 представляет собой средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов Tbet.
Согласно предпочтительному доработанному варианту способа отнесения пациента к молекулярному фенотипу «Th1-высокой» подгруппы согласно изобретению включает следующие этапы:
- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;
- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для Tbet и/или GATA-3;
- включение пациента в «Th1-высокую» подгруппу, если выполняется, меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу, позволяющему отнести пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы, если выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:
a) экспрессия генов Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии генов Tbet GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения.
Таким образом, «Th1-низкая» подгруппа характеризуется низкой абсолютной экспрессией генов Tbet по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае количественного определения протеинов - можно использовать соответствующее значение содержания протеина Tbet в изоляте здорового человека. Здесь следует учитывать, что у пациента «Th1-низкой» подгруппы с заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, абсолютная экспрессия генов Tbet, тем не менее, может быть выше, чем в изоляте здорового человека. Однако абсолютная экспрессия генов Tbet может также быть ниже, чем у здорового человека. Но, во всяком случае, экспрессия генов Tbet не столь высока, как описано для «Т1h-высокой» подгруппы. Таким образом, отнесение пациента к «Th1-низкой» подгруппе происходит, если у него содержание протеина Tbet по сравнению с изолятом здорового человека если и повышено, то умеренно. Однако можно использовать и фиксированные контрольные значения. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение количества Tbet мРНК в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Тh1-низкой» подгруппе происходит, когда у него количество Tbet мРНК меньше, чем в соответствующем образце здорового человека или, во всяком случае, повышено незначительно. Однако, опять-таки, можно использовать и фиксированные контрольные значения.
Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к пониженной экспрессии генов Tbet отношение уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения может использоваться соответствующее значение отношения уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 здесь тоже повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов Tbet в качестве дополнительного параметра устанавливается экспрессия генов GATA-3, и включение GATA-3 в некоторой степени представляет средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов Tbet.
Согласно предпочтительному доработанному варианту способ отнесение пациента к молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы согласно изобретению включает несколько этапов:
- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;
- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для Tbet и/или GATA-3;
- включение пациента в «Th1-низкую» подгруппу, если выполняется, меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).
В качестве альтернативы дополнительно к указанному определению экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet могут определяться и другие параметры для достоверного включения в «Тh1-высокую» и «Th1-низкую» подгруппу. Так, например, можно определять число эозинофильных гранулоцитов или количественно определять уровень IgE в сыворотке крови. Отнесение к «Th1-высокой» подгруппе происходит в том случае, если уровень IgE в сыворотке крови ниже, чем 100 МЕ/мл, и/или если число эозинофильных гранулоцитов составляет менее 0,14×109 клеток на литр. В противном случае пациент закрепляется за «Th1-низкой» подгруппой. В качестве альтернативы при необходимости можно еще также определять концентрацию моноксида азота в выдыхаемом воздухе, т.е. определять значение FeNO.
Чтобы учесть различия в подготовке образцов, может быть произведено нормирование концентраций GATA-3 и Tbet. Различия в подготовке образцов могут возникать, например, из-за разного числа клеток, подвергаемых лизису, в результате разных уровней эффективности лизиса в отдельных образцах или за счет разного содержания разных типов клеток в препаратах клеток. Согласно изобретению, помимо прочего, существуют следующие возможности нормирования: нормирование по общему содержанию протеина в клеточном лизате, нормирование по числу лизированных клеток или нормирование по концентрации специфических маркерных протеинов, которые обнаруживаются конкретно в определенных типах клеток.
Пациенты с диагностированным молекулярным фенотипом «Тh2-высокой» подгруппы при определенных обстоятельствах могут одновременно быть помещены в «Th1-низкую» подгруппу. Также пациенты диагностированным молекулярным фенотипом «Th1-высокой» подгруппы при определенных обстоятельствах одновременно могут быть отнесены к «Th2-низкой» подгруппе. Это обусловлено описанным выше фактом, что поляризация в Th2 ингибирует дифференцировку Th1- за счет подавления Tbet и наоборот.
В рамках настоящего изобретения осуществляется диагностика и лечение заболеваний, сопровождающихся хроническими воспалениями, например, аутоиммунных заболеваний, заболеваний ревматической клинико-морфологической группы (проявления, например, на коже, легких, почках, кровеносно-сосудистой системе, нервной системе, соединительной ткани, опорно-двигательном аппарате, эндокринной системе), аллергических реакций немедленного типа и астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), атеросклероза, псориаза и контактной экземы, а также хронических реакций отторжения после трансплантации органов и костного мозга. Согласно изобретению возможны также диагностика и/или лечение опухолевых заболеваний, если GATA-3 или Tbet причастны к возникновению и/или если, как вторичное явление, прекращено их регулирующее действие.
В рамках настоящего изобретения хроническое воспалительное заболевание обусловлено либо Th2, например, аллергическая бронхиальная астма, риноконьюктивит, аллергический синусит, атопический дерматит, пищевые аллергии, пузырчатка, язвенный колит, паразитарные заболевания, либо Тh1, например, псориаз, аллергическая контактная экзема, регионарный энтерит, ХОБЛ, ревматоидный артрит, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет 1 типа или рассеянный склероз.
Далее согласно изобретению упомянутая выше задача решается с помощью лекарственного препарата для лечения заболеваний, сопровождающихся хроническими воспалениями, у больного с тем или иным молекулярным фенотипом, причем молекулярный фенотип определяют с помощью способа в соответствии с одним или несколькими вариантами осуществления указанного способа диагностики согласно изобретению. При этом идентифицированный молекулярный фенотип включает, в частности, группы «Тh1-низкая», «Th1-высокая», «Тh2-низкая» или «Тh2-высокая».
Согласно предпочтительному варианту осуществления упомянутый лекарственный препарат содержит специфическую для GATA-3 или Tbet рибонуклеиновую кислоту или дезоксирибонуклеиновую кислоту, в частности, специфический для GATA-3 или Tbet ДНК-фермент.
Общая модель ДНК-фермента представляет собой модель «10-23» (Sontoro et al., 1997). ДНК-ферменты модели 10-23, именуемые также «10-23 ДНК-ферментами» - содержит каталитический домен из 15 нуклеотидов, у которого по бокам расположены два субстрат-связывающих домена. При этом каталитический домен предпочтительно содержит последовательность ggctagctacaacga (SEQ ID No. 154). Длина субстрат-связывающих доменов может варьироваться, домены могут иметь либо одинаковую, либо разную длину. В одном предпочтительном варианте длина субстрат-связывающих доменов составляет от 6 до 14 нуклеотидов, особенно предпочтительно, чтобы в каждом случае было, по меньшей мере, девять нуклеотидов. Такие ДНК-ферменты содержат общую последовательность nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (SEQ ID NO 155). При этом особенно предпочтительны субстрат-связывающие домены, которые связывают мРНК, с кодированием для протеинов GATA-3 и Tbet.
Упомянутый каталитический центральный домен ggctagctacaacga представляет собой только один предпочтительный вариант осуществления. Специалисту в данной области техники известно, что «10-23 ДНК-ферменты» с сопоставимой биологической активностью могут быть сохранены с видоизмененным каталитическим доменом.
В одном особо предпочтительном варианте субстрат-связывающие домены являются полностью комплементарными по отношению к участку, который сбоку примыкает к сайту расщепления. Однако для связывания и расщепления целевой РНК ДНК-фермент не обязательно должен быть полностью комплементарным. ДНК-фермент типа 10-23 расщепляет целевую мРНК в последовательные пурин-пиримидиновые цепи. В рамках настоящего изобретения ДНК-ферменты предпочтительно содержат активные in vivo ДНК-ферменты против GATA-3 и Tbet согласно документу WO 2005/033314 А2, содержание которого излагается применительно к объему раскрытия настоящего изобретения.
Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии GATA-3 in vivo содержит, в частности, по меньшей мере, один ДНК-фермент, выбранный из группы, в которую входят ДНК-ферменты с одной последовательностью согласно одной из последовательностей от SEQ ID NO 1 до SEQ ID NO 70. Такой ДНК-фермент связывает предпочтительно с мРНК, кодирующей для GATA-3 гена человека с нуклеотидной последовательностью гена, выбранной из последовательностей SEQ ID NO 151 (GATA-3 человека из базы данных №: ХМ 043124), SEQ ID NO 152 (GATA-3 человека из базы данных №: Х58072) и SEQ ID NO 153 (GATA-3 человека, секвенсированная из плазмиды pCR2.1).
Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии GATA-3 in vivo содержит предпочтительно ДНК-фермент hgd40 с последовательностью 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID NO 40).
Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии Tbet in vivo содержит в частности, по меньшей мере, один ДНК-фермент, выбранный из ряда ДНК-ферментов с последовательностью в соответствии с одной из последовательностей от SEQ ID NO 71 до SEQ ID NO 148. Такой ДНК-фермент связывает предпочтительно с мРНК, которая кодирует для гена Tbet человека с нуклеотидной последовательностью гена, выбранной из последовательностей SEQ ID NO 149 (Tbet человека из базы данных №: NM 013351) и SEQ ID NO 150 (Tbet человека, секвенсированный из pBluescript-SK).
Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии Tbet in vivo содержит предпочтительно ДНК-фермент td69 с последовательностью 5'-GGCAATGAAggctagctacaacgaTGGGTTTCT (SEQ ID NO 139) или td70 с последовательностью 5'-TCACGGCAAggctagctacaacgaGAACTGGGT (SEQ ID NO 140).
В качестве альтернативы ДНК-ферментам лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии GATA- 3 или Tbet может содержать подходящую малую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.
Лекарственный препарат предпочтительно имеет состав, который способен вводить пациентам указанные специфические молекулы рибонуклеиновой или дезоксирибонуклеиновой кислоты в виде фармацевтически приемлемой композиции либо перорально, ректально, парентерально, внутривенно, внутримышечно, либо подкожно, интрацистернально, внутривагинально, внутрибрюшинно, интратекально, интраваскулярно, местно (присыпка, мазь или капли) или в форме аэрозоля. Дозировочные формы для местного приема лекарственного препарата согласно этому изобретению включают мази, присыпки, аэрозоли или ингаляционные средства. Активный компонент в стерильных условиях смешивают с физиологически приемлемым наполнителем и, в зависимости от потребностей, с возможными консервантами, буферами или вспенивателями.
Лекарственный препарат может применяться для терапии всех групп заболеваний, сопровождающихся хроническими воспалениями.
Согласно особо предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения лечение пациентов с молекулярным фенотипом «Тh2-высокой» подгруппы осуществляется с помощью GATA-3 специфического ДНК-фермента. Терапия пациента с молекулярным фенотипом «Тh1-высокой» подгруппы осуществляется с помощью специфичного к Tbet ДНК-фермента. Далее, лечение пациента с молекулярным фенотипом «Тh2-низкой» подгруппы осуществляется с помощью специфичного к Tbet ДНК-фермента, а лечение пациента с молекулярным фенотипом «Тh1-низкой» подгруппы может происходить с использованием GATA-3 ДНК-фермента.
Таким образом, лекарственный препарат согласно изобретению с GATA-3-специфическим ДНК-ферментом предусмотрен предпочтительно для лечения пациента с молекулярным фенотипом «Тh2-высокой» подгруппы, а лекарственный препарат с Tbet-специфическим ДНК-ферментом предусмотрен предпочтительно для лечения пациента с молекулярным фенотипом «Th1-высокой» подгруппы.
Согласно изобретению, особое преимущество лекарственного препарата по одному из указанных выше вариантов осуществления для специфической терапии диагностированной согласно изобретению подгруппы пациентов - а именно «Тh2-высокой», «Тh2-низкой, «Тh1-высокой» или «Th1-низкой» - заключается в том, что с помощью специфического лекарственного препарата, в частности, ДНК-фермента и/или малой интерферирующей РНК, происходит функциональная инактивация как раз тех кодирующих РНК-молекул транскрипционных факторов, у которых предварительно была установлена дифференциальная экспрессия, и которые участвуют в возникновении хронических воспалительных реакций и аутоиммунных заболеваний. Эта стратегия явно отличается от традиционных подходов, а также от упомянутого порядка действий, описанного в документе Corren et al., 2011, поскольку там, с одной стороны, определяли количество периостина (суррогатный маркер), но затем предлагали терапию против другой мишени, например, против IL-13 с помощью анти-IL-13 антитела. Лекарственный препарат согласно изобретению, напротив, отличается высокой специфичностью. Он вызывает клетко-специфическое вмешательство и специфичен для отделов и органов.
Формы выпуска лекарственного препарата согласно изобретению включают фармацевтически приемлемые композиции, содержащие модификации и «пролекарственные формы» (неактивные формы лекарства), если по достоверной медицинской оценке они не вызывают избыточной токсичности, раздражений или аллергических реакций у пациента. Термин «пролекарственные препараты» относится к соединениям, для улучшения ввода в организм трансформируемым, например, посредством гидролиза в крови.
Лекарственный препарат согласно изобретению может также применяться в форме гетерогенной эмульсии для аппликации указанных специфических нуклеиновокислотных молекул. Для этого указанная гетерогенная эмульсия включает внешнюю водную фазу W1, диспергированную во внешней водной фазе W1 масляную фазу 0 и диспергированную в масляной фазе 0 внутреннюю водную фазу W2, причем во внутренней водной фазе W2 предусмотрен, по меньшей мере, один электролит, выбранный из ряда щелочные и щелочноземельные галогениды и сульфаты, и, по меньшей мере, одна специфическая молекула рибонуклеиновой кислоты или дезоксирибонуклеиновой кислоты, предпочтительно специфичный к GATA-3 или Tbet ДНК-фермент, причем внешняя водная фаза W1 содержит гидрофильный эмульгатор, являющийся полимером этиленоксида и пропиленоксида, а масляная фаза 0 образована триацилглицеридами и содержит липофильный эмульгатор из ряда диметиконов. С помощью одной такой гетерогенной эмульсии можно, в частности, особенно эффективно защищать от нежелательного разрушения нуклеиновокислотные молекулы.
Вид дозировки определяет лечащий врач с учетом конкретных клинических факторов. Специалисту известно, что вид дозировки зависит от разных факторов, например, от размеров тела, веса, состояния кожных покровов, возраста, пола или общего состояния здоровья пациента, но также и от конкретно принимаемого средства, продолжительности и способа приема, а также от других медикаментов, которые могут даваться параллельно. При этом в соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления количество активного компонента лекарственного препарата может быть адаптировано с учетом измеренного уровня экспрессии. Так, в результате включения в «Тh2-высокую» подгруппу и при выявленной очень высокой экспрессии генов GATA-3 может быть дана повышенная доза активного компонента, в частности, специфического к GATA-3 ДНК-фермента. Соответственно, при после включения в «Th1-высокую» подгруппу и при выявленной очень высокой экспрессии генов Tbet может быть дана повышенная доза активного компонента, в частности, специфического к Tbet ДНК-фермента.
Еще один аспект настоящего изобретения касается набора для диагностики молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, причем набор содержит, по меньшей мере, один специфический компонент для количественного определения протеина или мРНК GATA-3 и/или Tbet в биологическом изоляте пациента.
Набор реагентов для диагностики согласно изобретению может легко предлагаться в виде готового к применению «набора», включающего антитело или антиген, адсорбированный на поверхности носителя, и композицию IgG антител человека, которая, например, в случае с человеком, представляет собой композицию lgG-антител к клеткам человека, маркированных таким образом, что они выявляются посредством каскада реакций типа биотин-стрептавидин- пероксидаза или - щелочная фосфатаза.
В качестве альтернативы набор для диагностики наряду с носителем содержит также буфер и реагенты, например, реагенты, необходимые для подтверждения реакции, например, стрептавидин, который связан с маркером, дающим реакцию окрашивания.
В качестве альтернативы набор дополнительно содержит стандарт-образец GATA-3 и/или T-Bet для калибровки набора, причем для выявления количества протеина или мРНК у GATA-3 и/или Tbet применяется один стандарт-образец.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения для определения количества протеина в каждом случае содержится специфическое к GATA-3 и/или Tbet антитело. При необходимости, согласно одному из вариантов, могут содержаться другие компоненты для проведения какого-либо метода иммунологического анализа, в частности, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Еще один компонент для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) выбирают из ряда: лизирующий буфер для лизиса клеток, микротитрационный планшет, количественные стандарты протеина для GATA-3 и/или Tbet, вторичные антитела и связанный фермент для работы с субстратом для выявления. Наряду с первым специфичным к GATA-3- и/или Tbet антителом предпочтительно использовать еще одно специфичное к GATA-3- или Tbet антитело из набора.
Для количественного определения мРНК набор может содержать в каждом случае сайт-специфический зонд и/или праймер для генов GATA-3 и/или Tbet.
Другие признаки, детали и преимущества изобретения следуют из формулы изобретения, а также из следующего описания примеров вариантов осуществления изобретения с помощью чертежей.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 Влияние разных детергентов на выделение GATA-3 из стимулированных клеток Jurkat,
Фиг. 2a, 2b Результаты количественного определения Tbet и GATA-3 с помощью «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием хромогенного субстрата (ELISA),
Фиг. 3 Градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) GATA-3 для количественного определения образцов
Фиг. 4 Градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Tbet для количественного определения образцов,
Фиг. 5 Нормированное определение Tbet в лизатах мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) у здоровых обследуемых и аллергиков,
Фиг. 6 Значительное улучшение при аллергическом воспалении дыхательных путей после четырехдневного лечения специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hgd40 (SEQ ID NO 40) по сравнению с мышами, не подвергавшимися терапии,
Фиг. 7 Влияние специфичного к GATA-3 ДНК-фермента hgd40 (SEQ ID NO 40) на количество возникающих при хроническом воспалении нейтрофилов, количество эозинофилов в BAL и выделение IL-5 (интерлекин-5) после восьминедельного лечения, и
Фиг. 8 Влияние специфичного к GATA-3 ДНК-фермента hgd40 (SEQ ID NO 40) на перибронхиальное / периваскулярное воспаление и гиперплазию бокаловидных клеток в тканях легких.
Материалы и методы:
Клетки можно изолировать, например, с помощью технологий, основанных на связи специфических антител. Здесь применяются магнитные гранулы-микроносители, поставляемые компаниями Miltenyi (система Macs), Dynal (гранулы-микроносители DynaBeads) или BD-Bioscience (iMAG). В качестве альтернативы это достигается за счет очистки клеток с помощью флюоресцентно-маркированного антитела в клеточных сортерах, например, производства компании Cytomation (MOFLO) или BD-Bioscience (FACS-Vantage). Чистота клеток-мишеней составляет предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%.
Способы изоляции РНК описаны, например, у Sambrook and Russell, Molecular Cloning («Клонирование молекулы нуклеиновых кислот»), A Laboratory Manual, издание 3-е, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), New York, и в документе Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), New York. Кроме того, для изоляции РНК средний специалист в данной области техники может использовать доступные в продаже наборы (технологии на основе диоксида кремния), например, набор реагентов RNeasy от компании Qiagen. Далее предпочтительно, выделять и очищать мРНК из клеток-мишеней путем применения доступных в продаже наборов, например, производства Qiagen (Oligotex mRNA Kit), Promega (система для изоляции мРНК mRNA PolyATract Isolation System) или Miltenyi (mRNAdirect).
Примеры осуществления изобретения
Пример варианта осуществления изобретения 1
GATA-3 и Tbet представляют собой протеины, проявляющие свое действие в качестве так называемых транскрипционных факторов в ядре Т-клеток-хелперов подтипа Th1 и Th2. Для определения концентрации обоих этих нуклеарных протеинов в определенном объеме биологического изолята, в частности, в определенном объеме цельной крови, клетки, образующие GATA-3 и Tbet, необходимо сначала изолировать, а затем лизировать. Прямое выявление этих протеинов из сыворотки или плазмы крови человека невозможно, т.к. они содержатся там в не поддающейся обнаружению концентрации. Поэтому анализ GATA-3 и Tbet выполняется в 4 этапа:
- отделение и изоляция клеток, экспрессирующих GATA-3/Tbet, от остальных клеточных компонентов цельной крови;
- лизис клеток и выделение внутриклеточных / ядерных протеинов;
- количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet;
- нормирование обнаруженных концентраций GATA-3 и Tbet
Отделение и изоляция клеток, экспрессирующих GATA-3/Tbet, от остальных клеточных компонентов цельной крови
Для этого применяются разные по сложности способы, в частности, для отделения и изоляции в рамках настоящего изобретения выполняются следующие этапы:
- изоляция лейкоцитов из цельной крови посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла с последующей афинной очисткой клеточных типов Th1/Th2 с помощью антител к специфичным маркерам клеточной поверхности,
- при необходимости афинную очистку клеточных типов Th1/Th2 с помощью антител к специфичным маркерам клеточной поверхности можно выполнять и в виде 1-ступенчатого способа без предварительного повышения концентрации лейкоцитов; в определенных ситуациях для количественного определения протеинов GATA-3 и Tbet достаточно и изоляции лейкоцитов с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла из цельной крови;
- при необходимости вместо центрифугирования в градиенте плотности фиколла возможно также применение основанной на изучении цепочек гранул афинной очистки клеточных типов Th1/Th2 с использованием антитела к специфичным маркерам клеточной поверхности в планшете с глубокими лунками на 96 лунок;
- при необходимости вместо центрифугирования в градиенте плотности фиколла возможно также применение основанной на изучении цепочек гранул афинной очистки лейкоцитов с помощью антител к специфичным маркерам клеточной поверхности, например, в планшете с глубокими лунками на 96 лунок;
- при необходимости для получения препарата лейкоцитов может выполняться гипоосмотический лизис эритроцитов; или
- при необходимости лизис протеинов может осуществляться и сразу из цельной крови.
Лизис клеток и выделение внутриклеточных / ядерных протеинов
Для этого применяются разные способы и принципы, в частности, в рамках настоящего изобретения выполняются следующие технологические этапы:
- разрушение клеточных мембран лизирующим буфером на основе следующих принципов действия:
a) гипотонические лизирующие буферы, под действием которых клетки лопаются;
b) детергеносодержащие буферы, разрушающие клеточную мембрану и таким образом высвобождающие внутриклеточные протеины
c) буферы с высокой ионной силой и/или осмотически активные буферы, обезвоживающие клетки и за счет этого нарушающие клеточную целостность.
- физические способы, например, нагрев, шоковая заморозка или ультразвук
- механические способы, например, гомогенизация или растирание в ступке.
К возможным примерам детергеносодержащих буферов относятся:
- буферные системы с высокой концентрацией ионных (например, SDS или Cholat и их производные) или неионных (например, Triton или Tween-20) детергентов
- смеси из ионных и неионных детергентов (например, Ripa-буфер с 50 мМ Tris ⋅ HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% додецилсульфата натрия SDS)
- доступные в продаже лизирующие буферы неизвестного состава (например, М- PER)
Влияние разных детергентов на выделение GATA-3 стимулированных клеток Jurkat представлено на фиг. 1. При этом лизис клеток Jurkat (линия Т-клеток человека) посредством разных лизирующих буферов и количественного определения GATA-3 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) обнаружил особенно обильное выделение протеина GATA-3 при использовании буфера RIPA (1% RIPA). Удалось выявить примерно 50 нг/мл GATA-3.
Количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet
Концентрация обоих транскрипционных факторов GATA-3 и Tbet может определяться принципиально разными способами. В рамках настоящего изобретения к ним, в частности, относятся:
- твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) твердофазный иммуноферментный анализ с хемилюминесценцией (CLIA)
- твердофазный иммуноанализ с флуоресцентным усилением (FLIA)
- масс-спектрометрические способы
- хроматографические способы (например, хроматография в газовой фазе)
- жидкостные способы с отделением твердой фазы (например, высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ)
- микро- и нанофлюидные технологии
На фиг. 2а и фиг. 2b приводятся результаты количественного определения Tbet и GATA-3 посредством «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием хромогенного субстрата (ELISA). Клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколла из цельной крови. Клетки (стимулированные мононуклеарные клетки человека) лизировали Ripa-буфером. Лизат исследовали на предмет концентрации GATA-3 и Tbet с помощью двух методов-прототипов твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Концентрация обоих протеинов изображена относительно общей концентрации протеина в клеточных лизатах (нормирование на содержание протеина).
Результаты по фиг. 2а говорят о том, что Тh1-клетки демонстрируют более высокое содержание Tbet (ок. 160 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина) по сравнению Тh2-клетками (ок. 56 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина), и что это обстоятельство явно следует из результатов анализа ИФА (твердофазного иммуноферментного анализа):
Согласно фиг. 2b содержание GATA-3 в Тh2-клетках (приблизительно 10 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина) выше по сравнению с содержанием в Th1-клетках (приблизительно 6 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина). Таким образом, содержание GATA-3- в Тh2-клетках здесь выше более чем в 1,5 раза, а точнее, примерно в 1,7 раза, чем в Th1-клетках.
Кроме того, из фиг. 2а и 2b можно понять, что при нормировании по содержанию протеина количественное соотношение Tbet: GATA-3 в Th1-клетках существенно отличается от соответствующего отношения в Th2-клетках. Так, количественное соотношение Tbet: GATA-3 здесь в Th1-клетках составляет примерно 27, т.е. больше 20, в то время как соответствующее количественное соотношение в Тh2-клетках равно примерно 6, т.е. менее 10.
Количественное определение GATA-3 и Tbet в каждом случае производится с помощью «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Пример варианта осуществления изобретения 2 - GATA-3 твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA):
Для этого лунки микротитрационного планшета на 96 лунок покрыты специфическими к GATA-3 антителами. После добавления пробы и/или эталона GATA-3 образует связь с антителами на 96-луночном планшете. После промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют второе, специфическое биотинилированное антитело к GATA-3. После еще одной промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют маркированный пероксидазой стрептавидин. После промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют субстрат. Цветное проявление заканчивается по истечении заданного промежутка времени путем добавления стоп-реагента. Выполняют количественное определение интенсивности цветного проявления с помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера). Количественное определение образцов выполняют путем сравнения с имеющимися эталонами с известной концентрацией протеина. На фиг. 3 представлена соответствующая градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) GATA-3.
В соответствии с примером варианта осуществления изобретения для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) GATA-3 выполняют, в частности, следующие этапы:
- размещение требуемого количества лунок в рамке 96-луночного планшета
- добавление буферного раствора для исследования в количестве 50 мкл/лунку
- добавление 100 мкл/лунку эталона / контроля / образца инкубация в течение 60 минут в шейкере
- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером каждый раз в количестве 400 мкл/лунку
- добавление биотинилированного анти-GATA-3 антитела в объеме 100 мкл/лунку
- инкубация в течение 60 минут в шейкере
- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку
- добавление маркированного пероксидазой стрептавидина в количестве 100 млк/лунку
- инкубация в течение 30 минут в шейкере
- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку
- добавление субстрата в количестве 100 млк/лунку инкубация в течение 30 минут
- прекращение реакции добавлением 100 мкл стоп-реагента количественное определение оптической плотности при 450 нм с помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера)
Пример варианта осуществления изобретения 3 - твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) Tbet:
Выявление протеина Tbet выполняется в соответствии со следующим принципом исследования: количественное определение Tbet осуществляют с помощью «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Для этого в лунки микротитрационного планшета на 96 лунок наносят слой антител, специфических к Tbet. После добавления образца и/или эталона Tbet образует связь с антителами на 96-луночном планшете. После промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют второе антитело, специфическое к Tbet. После еще одной промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют маркированное пероксидазой антитело, специфичное к Tbet-специфичному антителу. После последней промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют субстрат. Цветное проявление заканчивается по истечении заданного промежутка времени путем добавления стоп-реагента. Количественное определение интенсивности цветного проявления выполняют с помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера). Количественное определение образцов производят путем сравнения с имеющимися эталонами с известной концентрацией протеина. На фигуре 4 изображена соответствующая градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Tbet.
В соответствии с примером варианта осуществления изобретения для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Tbet используют, в частности, следующие этапы:
- размещение требуемого количества лунок в рамке 96-луночного планшета
- добавление буферного раствора для исследования в количестве 50 мкл/лунку
- добавление 100 мкл/лунку эталона / контроля / образца
- инкубация в течение 60 минут в шейкере
- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером каждый раз в количестве 400 мкл/лунку
- добавление анти-Tbet антитела в объеме 100 мкл/лунку
- инкубация в течение 60 минут в шейкере
- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку
- добавление маркированного пероксидазой анти-Tbet-специфического антитела в объеме 100 млк/лунку
- инкубация в течение 30 минут в шейкере
- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку
- добавление субстрата в количестве 100 млк/лунку
- инкубация в течение 30 минут
- прекращение реакции добавлением 100 мкл стоп-реагента
- количественное определение оптической плотности при 450 нм с
помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера)
Нормирование концентраций GATA-3 и Tbet
Чтобы учесть различия в подготовке образцов, можно выполнить нормирование концентраций GATA-3 и Tbet. Различия в подготовке образцов могут возникнуть, например, по следующим причинам:
- разное число клеток, подвергаемое лизису
- разная эффективность лизиса у отдельных образцов, или
- разное содержание различных клеточных типов клеточных препаратов.
Согласно изобретению, помимо прочего, существуют следующие возможности нормирования:
- нормирование по общему содержанию протеина в клеточном лизате (см. пункт «Количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet»)
- нормирование по числу клеток, которое было лизировано (см. фиг. 5), или
- нормирование по концентрации специфических маркерных протеинов, обнаруживаемых конкретно у определенных клеточных типов.
На фиг. 5. представлено нормированное определение Tbet в лизатах мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС). При этом лизису подвергали мононуклеарные клетки периферической крови здоровых обследуемых, а также пациентов, страдающих аллергическими заболеваниями, например, аллергической бронхиальной астмой, риноконьюктивитом, аллергическим синуситом, атопическим дерматитом, пищевыми аллергиями. Концентрацию Tbet нормировали по числу клеток в лизатах. Заболевание зависит от Тh2-клеток, и логично, что у аллергиков удалось выявить меньшую концентрацию Tbet (ок. 12 нг/мл/1 млн. клеток) по сравнению со здоровыми обследуемыми (ок. 27 нг/мл/1 млн. клеток). Таким образом, концентрация Tbet у аллергика была чуть более чем в 2 раза ниже по сравнению со здоровыми обследуемыми. Следовательно, здесь можно легко отнести пациентов к «Th1-низкому» молекулярному фенотипу, т.к. экспрессия генов Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения, здесь - экспрессии генов Tbet здоровых обследуемых.
Пример варианта осуществления изобретения 4
В модификации примеров 2 и 3 в соответствии с примером 4 для подготовки образцов клетки Th1/Th2 обогащаются с помощью магнитных гранул-микроносителей, которые покрыты клетко-специфичными антителами.
Затем производится выявление GATA-3 согласно порядку, описанному в примере 2.
Пример варианта осуществления изобретения 5
В модификации примеров 2 и 3 в соответствии с примером 5 для подготовки образцов лейкоциты обогащаются посредством гель-фильтрации. Затем производят выявление GATA-3 в порядке, описанном в примере 2.
Пример варианта осуществления изобретения 6
Специфичный к GATA-3 ДНК-фермент демонстрирует терапевтические эффекты на мышиной модели овальбумин-индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей «Тh2-высокого» фенотипа.
Чтобы наилучшим образом воспроизвести клинический «Тh2-высокий» фенотип в мышиной модели, мышей линии BALB/c сенсибилизировали модельным аллергеном овальбумином (OVA) в присутствии адъюванта Аl(ОН)3 на 0-е, 14-е и 21-е сутки путем внутрибрюшинной инъекции. На 24-26-е сутки мыши вдыхали овальбумин в форме 1%-ного аэрозоля, чтобы вызвать аллергическую воспалительную реакцию в легком с Тh2-доминированием. На 23-26-е сутки делали внутриносовые аппликации специфичного к GATA-3 ДНК-фермента hgd40 (SEQ ID NO 40), растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе.
При этом линия мышей Balb/c отличается тем, что предпочтительно генерирует мощные Th2-отклики. Этот эффект усиливается за счет применения АL(ОН)3 в качестве адъюванта, ощутимо поддерживающего формирование иммунных ответов с доминированием Th2. Описанная мышиная модель соответствующим образом характеризуется массивной инфильтрацией эозинофильных и Тh2-клеток в дыхательных путях, сопровождаемой гиперплазией слизеобразующих бокаловидных клеток с усиленной выработкой слизи, а также формированием гиперреактивности дыхательных путей. С иммунологической точки зрения, наряду со специфичными к аллергену Th2-клетками, характеризуемыми также вырабатыванием типичных цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13, можно также устанавливать специфичные к овальбумину антитела иммуноглобулиновых классов IgE и lgG1 (у мыши оба Тh2-зависимые). Все эти параметры являются типичными клиническими признаками «Тh2-высокого» фенотипа (Wenzel et al., Am J Respir Crit Care Med. 1999 Sep; 160(3):1001-8; Woodruff et al., 2009). При этом сила реакции по некоторым параметрам в экспериментальной модели на животном проявляется еще даже более выраженно, чем в клинической ситуации у больного; так, например, эозинофильные гранулоциты составляют примерно 60-70% всех лейкоцитов в бронхоальвеолярном смыве (BAL) в мышиной модели, в то время как уже 3-5% этих клеток в мокроте пациента указывают на фенотип с доминированием Тh2.
В соответствии с фиг. 6 после четырехдневного лечения специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hgd40 (SEQ ID NO 40) удалось установить значительное улучшение состояния при аллергическом воспалении дыхательных путей по сравнению с мышами, не подвергавшимися терапии. Прежде всего, сократилось количество эозинофилов в бронхоальвеолярном смыве (BAL). Кроме того, удалось заметно снизить концентрации характерных для «Тh2-высокого» фенотипа цитокинов IL-5 и IL-13 в BAL.
Пример варианта осуществления изобретения 7
Специфичный к GATA-3 ДНК-фермент обнаруживает значимые терапевтические эффекты в мышиной модели хронического аллергического воспаления дыхательных путей с Тh2-доминированием.
Для воспроизведения наилучшим образом клинического «Тh2-высокого» фенотипа в мышиной модели хронического заболевания мышей линии BALB/c сенсибилизировали овальбумином (OVA) в присутствии адъюванта Аl(ОН)3 на 0-е, 14-е и 21-е сутки путем внутрибрюшинной инъекции. Путем проводимых дважды в неделю провокационных тестов овальбумином в форме аэрозоля в течение 14 недель у мышей вызывали хроническое воспаление дыхательных путей. В течение последних восьми недель терапию проводили трижды в неделю путем внутриносовых аппликаций будесонидом или специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hdg40 (до 121-х суток).
В соответствии с фиг. 7 и 8 после восьминедельного лечения специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hgd40 (SEQ ID NO 40) удалось значительно сократить количество эозинофилов в BAL и к тому же констатировать уменьшение количества возникающих при хроническом воспалении нейтрофилов. Одновременно с этим в тканях легких было установлено снижение перибронхиального / периваскулярного воспаления и сокращение гиперплазии бокаловидных клеток. Одновременно в активированных с помощью стимулятора лимфоцитах у лиц, лечение которых осуществляли с применением hgd40, наблюдалось пониженное выделение IL-5. В группе, в которой применялся будесонид, напротив, не было установлено никакого значительного улучшения параметров.
Изобретение не ограничено предусмотренными здесь вариантами осуществления и может быть реализовано в разнообразных модификациях.
Все следующие из формулы, описания и фигур чертежей признаки и преимущества, включая конструктивные детали, конфигурации в пространстве и этапы осуществления способов, могут быть существенными для изобретения как сами по себе, так и в разных комбинациях.
Claims (21)
1. Способ диагностики молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, согласно которому проводят количественное определение экспрессии протеина и/или мРНК GATA-3 и/или Tbet в биологическом изоляте пациента, которое используют для отнесения к тому или иному молекулярному фенотипу заболевания, выбранному из ряда, в который входят подгруппы «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» и «Th1-низкая», отличающийся тем, что
- отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Th2-высокой» подгруппы происходит, если выполняется по меньшей мере одно из следующих условий:
a) экспрессия GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии GATA-3: Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения;
- отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Th2-низкой» подгруппы происходит, если выполняется по меньшей мере одно из следующих условий:
a) экспрессия GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии GATA-3: Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения;
- отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Th1-высокой» подгруппы происходит, если выполняется по меньшей мере одно из следующих условий:
a) экспрессия Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения;
- отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы происходит, если выполняется по меньшей мере одно из следующих условий:
a) экспрессия Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения,
b) отношение уровней экспрессии Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экспрессию протеина количественно определяют с помощью иммуноанализа, предпочтительно твердофазного иммуноферментного анализа ELISA, радиоиммунного анализа, электрохемилюминесцентного иммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа с хемилюминесценцией CLIA, твердофазного иммуноанализа с флуоресцентным усилением FLIA или мультиплексного иммуноанализа; и/или экспрессию мРНК количественно определяют, в частности, с помощью ПЦР или микроматричного анализа.
3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что наряду с определением экспрессии протеина и/или мРНК GATA-3 и/или Tbet определяют уровень IgE в сыворотке крови и/или число эозинофильных гранулоцитов и/или находят значение FeNo.
4. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что сопровождаемое хроническими воспалениями заболевание обусловлено Th2, в частности аллергическая бронхиальная астма, риноконьюктивит, аллергический синусит, атопический дерматит, пищевые аллергии, пузырчатка, язвенный колит, паразитарные заболевания, или обусловлено Th1, в частности псориаз, аллергическая контактная экзема, регионарный энтерит, ХОБЛ, ревматоидный артрит, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет 1 типа или рассеянный склероз.
5. Лекарственный препарат для лечения больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, причем больной имеет молекулярный фенотип, относящийся к ряду подгрупп «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» и «Th1-низкая», определенный согласно способу по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что содержит специфичный к GATA-3 или Tbet ДНК-фермент, и тем, что лекарственный препарат включает гетерогенную эмульсию, содержащую внешнюю водную фазу W1, диспергированную во внешней водной фазе W1 масляную фазу О и диспергированную в масляной фазе О внутреннюю водную фазу W2, причем во внутренней водной фазе W2 предусмотрен по меньшей мере один электролит, выбранный из ряда щелочных и щелочноземельных галогенидов и сульфатов, и по меньшей мере один специфичный к GATA-3 или Tbet ДНК-фермент, причем внешняя водная фаза W1 содержит гидрофильный эмульгатор, являющийся полимером этиленоксида и пропиленоксида, а масляная фаза О образована триацилглицеридами и содержит липофильный эмульгатор из ряда диметиконов.
6. Лекарственный препарат по п. 5, отличающийся тем, что специфичный к GATA-3 ДНК-фермент предусмотрен для лечения пациента с молекулярным фенотипом «Th2-высокой» подгруппы, и что специфичный к Tbet ДНК-фермент предусмотрен для лечения пациента с молекулярным фенотипом «Th1-высокой» подгруппы.
7. Набор для диагностики молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, причем набор содержит по меньшей мере один специфический компонент для количественного определения экспрессии протеина и/или мРНК GATA-3 и/или Tbet в биологическом изоляте пациента согласно способу по одному из пп. 1-4.
8. Набор по п. 7, отличающийся тем, что для количественного определения экспрессии протеина в каждом случае содержит антитело, специфичное к GATA-3 и/или Tbet, причем предпочтительно содержит компоненты для проведения иммуноанализа, в частности твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.
9. Набор по п. 7, отличающийся тем, что для количественного определения экспрессии мРНК содержит сайт-специфический зонд и/или сайт-специфический праймер для генов GATA-3 и/или Tbet.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12184500.2 | 2012-09-14 | ||
| EP12184500.2A EP2708898A1 (de) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | Verfahren zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung leidenden Patienten |
| PCT/EP2013/068317 WO2014040891A2 (de) | 2012-09-14 | 2013-09-04 | Verfahren zur diagnose eines molekularen phänotyps eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden erkrankung leidenden patienten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015112894A RU2015112894A (ru) | 2016-11-10 |
| RU2672595C2 true RU2672595C2 (ru) | 2018-11-16 |
Family
ID=46963488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015112894A RU2672595C2 (ru) | 2012-09-14 | 2013-09-04 | Способ диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9791454B2 (ru) |
| EP (1) | EP2708898A1 (ru) |
| JP (2) | JP6401163B2 (ru) |
| KR (1) | KR102157768B1 (ru) |
| AU (2) | AU2013314510A1 (ru) |
| BR (1) | BR112015005583A2 (ru) |
| CA (2) | CA3199111A1 (ru) |
| RU (1) | RU2672595C2 (ru) |
| WO (1) | WO2014040891A2 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT3093022T (pt) * | 2015-05-15 | 2019-11-11 | Sterna Biologicals Gmbh & Co Kg | Inibidores gata-3 para utilização no tratamento de asma desencadeada por th2 |
| WO2017205506A1 (en) | 2016-05-24 | 2017-11-30 | Emory University | Particles with rna cleaving nucleobase polymers and uses for managing inflammatory disorders |
| EP3501607A1 (de) * | 2017-12-22 | 2019-06-26 | Sterna Biologicals GmbH & Co. KG | Zusammensetzung zur behandlung eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden atemwegserkrankung leidenden patienten sowie herstellungsverfahren und verwendung der zusammensetzung |
| PT3514235T (pt) * | 2018-01-18 | 2024-02-12 | Sterna Biologicals Gmbh | Composição para o tratamento de um doente que sofre de colite ulcerosa, assim como utilização da composição como medicamento |
| EP3603617A1 (de) * | 2018-07-30 | 2020-02-05 | Sterna Biologicals GmbH & Co. KG | Aerosolerzeugungseinrichtung zur inhalativen verabreichung einer antisense-molekül-haltigen zusammensetzung |
| JP2022061491A (ja) * | 2020-10-06 | 2022-04-18 | 国立大学法人福井大学 | 慢性副鼻腔炎の患者を分類するためのデータの取得方法、およびその利用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005033314A2 (de) * | 2003-10-02 | 2005-04-14 | Philipps-Universität Marburg | Verfahren zur herstellung eines zell- und/oder gewebe- und/oder krankheitsphasen-spezifischen arzneimittels |
| RU2440110C2 (ru) * | 2006-08-17 | 2012-01-20 | Юниверсити Оф Чикаго | Лечение воспалительных заболеваний |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8853264B2 (en) * | 2005-01-07 | 2014-10-07 | Newtree Industry Co., Ltd. | Use of lignan compounds for treating or preventing inflammatory disease |
| EP2227232A1 (en) * | 2007-12-07 | 2010-09-15 | Fibrogen, Inc. | Methods for inhibiting t helper cell differentiation |
| RU2607569C2 (ru) | 2008-03-31 | 2017-01-10 | Дженентек, Инк. | Композиции и способы для лечения и диагностики астмы |
| US20120029054A1 (en) * | 2009-03-19 | 2012-02-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA Interference Mediated Inhibition of GATA Binding Protein 3 (GATA3) Gene Expression Using Short Intefering Nucleic Acid (siNA) |
| WO2011013753A1 (ja) * | 2009-07-29 | 2011-02-03 | シスメックス株式会社 | ヒトil-17産生ヘルパーt細胞検出用マーカーおよび試薬、並びにヒトil-17産生ヘルパーt細胞の検出方法 |
-
2012
- 2012-09-14 EP EP12184500.2A patent/EP2708898A1/de not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-09-04 AU AU2013314510A patent/AU2013314510A1/en not_active Abandoned
- 2013-09-04 RU RU2015112894A patent/RU2672595C2/ru active
- 2013-09-04 CA CA3199111A patent/CA3199111A1/en active Pending
- 2013-09-04 JP JP2015531519A patent/JP6401163B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-09-04 KR KR1020157009484A patent/KR102157768B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2013-09-04 BR BR112015005583A patent/BR112015005583A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-09-04 US US14/428,043 patent/US9791454B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-09-04 CA CA2888860A patent/CA2888860C/en active Active
- 2013-09-04 WO PCT/EP2013/068317 patent/WO2014040891A2/de not_active Ceased
-
2017
- 2017-10-12 US US15/782,595 patent/US10591489B2/en active Active
-
2018
- 2018-09-06 JP JP2018167068A patent/JP6662969B2/ja active Active
-
2019
- 2019-06-12 AU AU2019204108A patent/AU2019204108B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005033314A2 (de) * | 2003-10-02 | 2005-04-14 | Philipps-Universität Marburg | Verfahren zur herstellung eines zell- und/oder gewebe- und/oder krankheitsphasen-spezifischen arzneimittels |
| RU2440110C2 (ru) * | 2006-08-17 | 2012-01-20 | Юниверсити Оф Чикаго | Лечение воспалительных заболеваний |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALTER M. Zur Regulation und Expression der Transkriptionsfaktoren T-bet und Gata-3 bei allergisch-entzundlichen Ekzemerkrankungen. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin. Hannover, 2006, 119 с. * |
| CHAKIR H. et al. T-bet/GATA-3 ratio as a measure of the Th1/Th2 cytokine profile in mixed cell populations: predominant role of GATA-3. J Immunol Methods. 2003 Jul; 278(1-2): 157-169. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015112894A (ru) | 2016-11-10 |
| KR102157768B1 (ko) | 2020-09-21 |
| US20150260728A1 (en) | 2015-09-17 |
| WO2014040891A3 (de) | 2014-05-30 |
| US10591489B2 (en) | 2020-03-17 |
| JP2015531482A (ja) | 2015-11-02 |
| BR112015005583A2 (pt) | 2017-08-08 |
| WO2014040891A2 (de) | 2014-03-20 |
| AU2019204108B2 (en) | 2021-11-25 |
| JP2019007977A (ja) | 2019-01-17 |
| US20180031571A1 (en) | 2018-02-01 |
| AU2013314510A1 (en) | 2015-04-09 |
| JP6401163B2 (ja) | 2018-10-03 |
| US9791454B2 (en) | 2017-10-17 |
| CA2888860A1 (en) | 2014-03-20 |
| JP6662969B2 (ja) | 2020-03-11 |
| KR20150064084A (ko) | 2015-06-10 |
| CA2888860C (en) | 2023-07-18 |
| CA3199111A1 (en) | 2014-03-20 |
| AU2019204108A1 (en) | 2019-07-04 |
| EP2708898A1 (de) | 2014-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6662969B2 (ja) | 慢性炎症に伴う疾病の患者の分子表現型を診断する方法 | |
| EP2300829B1 (en) | New biomarker for diagnosis, prediction and/or prognosis of sepsis and uses thereof | |
| JP5619016B2 (ja) | 重症敗血症及び敗血症性ショック中の死亡の危険性が高い患者を迅速に決定するための方法及びキット | |
| JP6097388B2 (ja) | インフルエンザにおけるリスクの階層化 | |
| JP2016506720A (ja) | 炎症性疾患のための抗ｔｎｆ及び抗ｉｌ１７併用治療薬バイオマーカー | |
| JP7344208B2 (ja) | ｐｒｏ－ＡＤＭに基づく抗生物質療法の指導 | |
| Ax et al. | T2 and T17 cytokines alter the cargo and function of airway epithelium-derived extracellular vesicles | |
| Wang et al. | Increased frequencies of T helper type 17 cells in tuberculous pleural effusion | |
| EP3682021B1 (en) | Diagnostic of chronic pathology, lyme disease | |
| Ly et al. | Exploring the imbalance of circulating follicular helper CD4+ T cells in sarcoidosis patients | |
| WO2019195823A1 (en) | Prediction and treatment of immunotherapeutic toxicity | |
| JP2024091650A (ja) | 多発外傷患者の外傷関連合併症の予後診断のためのｐｒｏ－ａｄｍ | |
| JP2025022885A (ja) | 重症急性呼吸器症候群（ｓａｒｓ）における疾患進行を予後診断するためのプロアドレノメデュリン | |
| JP5514733B2 (ja) | 療法に対する応答を予測するための方法 | |
| EP3922641A1 (en) | Methods for detecting and treating covid patients requiring intensive care | |
| Mishra et al. | Role of P-gp and HDAC2 and their Reciprocal Relationship in Uncontrolled Asthma | |
| CN111656189A (zh) | 基于合并症患者的降钙素原的抗生素疗法指导 | |
| Ostalska-Nowicka et al. | SOCS3 and SOCS5 mRNA expressions may predict initial steroid response in nephrotic syndrome children | |
| Al Mashhadani | From Lübeck Institute for Experimental Dermatology (LIED) Supervised by Prof. Hauke Busch | |
| KR20250163550A (ko) | 자폐증 진단 및 치료용 조성물 | |
| Yan et al. | Online Repository Epithelium-derived Cystatin-SN enhances eosinophil activation and infiltration via interleukin-5 in chronic rhinosinusitis with nasal polyps | |
| KR20170105162A (ko) | 천식 진단용 마커 및 이의 용도 | |
| JP2009050232A (ja) | 膠原病診断方法 |