RU2669937C1 - Pharmaceutical antitumoral composition of paclitaxel with histone n1.3 as a carrier and a method for preparing the composition - Google Patents
Pharmaceutical antitumoral composition of paclitaxel with histone n1.3 as a carrier and a method for preparing the composition Download PDFInfo
- Publication number
- RU2669937C1 RU2669937C1 RU2017136637A RU2017136637A RU2669937C1 RU 2669937 C1 RU2669937 C1 RU 2669937C1 RU 2017136637 A RU2017136637 A RU 2017136637A RU 2017136637 A RU2017136637 A RU 2017136637A RU 2669937 C1 RU2669937 C1 RU 2669937C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- paclitaxel
- histone
- composition
- carrier
- applicant
- Prior art date
Links
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 title claims abstract description 123
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 title claims abstract description 121
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 title claims abstract description 120
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 title description 26
- 102100027368 Histone H1.3 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 101710192072 Histone H1.3 Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 101001009450 Homo sapiens Histone H1.3 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 36
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 30
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 22
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 22
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 22
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 18
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 18
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 16
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 16
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 12
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 12
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 6
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- 108010012934 Albumin-Bound Paclitaxel Proteins 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- USBHFGNOYVOTON-UHFFFAOYSA-K bis(dimethylcarbamothioylsulfanyl)bismuthanyl n,n-dimethylcarbamodithioate Chemical compound [Bi+3].CN(C)C([S-])=S.CN(C)C([S-])=S.CN(C)C([S-])=S USBHFGNOYVOTON-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000005421 electrostatic potential Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010014703 oncohist Proteins 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N taxol® Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(CC(C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3(C21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-XAZOAEDWSA-N 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CHMNMRMSFMQHGI-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-diphenyl-1H-tetrazol-1-ium-3-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole 2H-tetrazol-1-ium dibromide Chemical group [Br-].[Br-].[NH2+]1C=NN=N1.S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]C(C=2C=CC=CC=2)=N1 CHMNMRMSFMQHGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 229940122957 Histamine H2 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102100039856 Histone H1.1 Human genes 0.000 description 1
- 101710192082 Histone H1.1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022653 Histone H1.5 Human genes 0.000 description 1
- 101710192088 Histone H1.5 Proteins 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241001116495 Taxaceae Species 0.000 description 1
- 241001116500 Taxus Species 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 229940028652 abraxane Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000513 bioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037368 penetrate the skin Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
- B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и касается создания новой фармацевтической противоопухолевой композиции, которая представляет собой комплекс, состоящий из известного гидрофобного фармацевтического препарата паклитаксела (слаборастворимого в воде фармацевтического вещества) и носителя - протеина (белка) гистона Н1.3 (вещества, облегчающего доставку фармацевтического препарата к органам и тканям), а также способа получения новой фармацевтической композиции. Изобретение может быть использовано для производства в последующем лекарственной композиции, которая может найти применение в медицине, ветеринарии, биологии, при этом наиболее эффективно может быть использована в области лечения онкологических заболеваний.The invention relates to medicine and relates to the creation of a new pharmaceutical antitumor composition, which is a complex consisting of the well-known hydrophobic pharmaceutical preparation paclitaxel (a poorly water-soluble pharmaceutical substance) and a carrier - histone H1.3 protein (protein) that facilitates the delivery of the pharmaceutical preparation to organs and tissues), as well as a method for producing a new pharmaceutical composition. The invention can be used for the production of a subsequent medicinal composition, which can find application in medicine, veterinary medicine, biology, and can be most effectively used in the field of cancer treatment.
На дату подачи заявки в мире существует задача повышения эффективности химической терапии злокачественных новообразований. Недостаточная эффективность терапии обусловлена преимущественно тем, что некоторые используемые в химиотерапии важнейшие фармацевтические препараты обладают низкой растворимостью в воде, и, соответственно, низкой биодоступностью, обусловленной неспособностью переноса нерастворимых в воде кристаллов вещества кровеносными сосудами. Одним из таких выявленных заявителем противоопухолевых фармацевтических препаратов является широко известный паклитаксел, впервые выделенный из коры тиса коротколистного (Taxaceae) (Mead Johnson Oncology Products. Taxol package insert (Листок-вкладыш для пациента), Princeton, N.J. 1993).At the filing date in the world there is a task of increasing the effectiveness of chemical therapy of malignant neoplasms. The lack of effectiveness of therapy is mainly due to the fact that some of the most important pharmaceutical preparations used in chemotherapy have low solubility in water, and, accordingly, low bioavailability due to the inability to transfer water-insoluble crystals of the substance to the blood vessels. One such antitumor pharmaceutical agent identified by the applicant is the well-known paclitaxel, first isolated from the yew bark (Taxaceae) (Mead Johnson Oncology Products. Taxol package insert, Patient Leaflet, Princeton, N.J. 1993).
Заявителем проведен анализ существующего уровня техники. Из исследованного заявителем уровня техники выявлено, что одним из наиболее действенных способов для повышения эффективности химической терапии злокачественных образований является создание композиции, состоящей из противоопухолевого фармацевтического препарата и вещества - носителя, которое способствовало бы эффективной доставке фармацевтического препарата непосредственно в опухоль.The applicant has analyzed the current level of technology. From the prior art examined by the applicant, it was revealed that one of the most effective ways to increase the effectiveness of chemical therapy of malignant tumors is to create a composition consisting of an antitumor pharmaceutical preparation and a carrier substance that would facilitate the effective delivery of the pharmaceutical preparation directly to the tumor.
Паклитаксел, являясь хорошо известным по литературным источникам лекарственным средством и обладающий достаточно высокой клинической активностью в отношении таких опухолей, как рак молочной железы, яичников, шейки матки, легких и поджелудочной железы, в свободном состоянии имеет существенный недостаток, связанный с низкой биодоступностью, обусловленной неспособностью переноса нерастворимых в воде кристаллов паклитаксела кровеносными сосудами при внутривенном вливании (Flora, К. P., et al., NCI investigational drugs chemical information (Информация Национального Института Рака о химических свойствах лекарственных препаратов), Bethesda, Md.: National Cancer Institute, pp. 218, 1992).Paclitaxel, being a well-known drug by literature and having a sufficiently high clinical activity against tumors such as breast, ovary, cervical, lung, and pancreatic cancer, has a significant drawback in its free state due to low bioavailability due to inability transport of water-insoluble paclitaxel crystals by blood vessels during intravenous infusion (Flora, K. P., et al., NCI investigational drugs chemical information (National Information about the Cancer Institute on the chemical properties of drugs), Bethesda, Md .: National Cancer Institute, pp. 218, 1992).
Далее в представленном заявителем источнике (S. В. Horwitz, Taxol (paclitaxel): mechanisms of action (Таксол (паклитаксел): механизм действия), Annals Oncol., 5, 1994) описан механизм действия паклитаксела, как противоопухолевого средства. Паклитаксел действует, связываясь с микротрубочками из димеров тубулина в клетках, и препятствует процессу деления (митозу) во время G2/M фазы клеточного цикла.Further, the source submitted by the applicant (S. B. Horwitz, Taxol (paclitaxel): mechanisms of action (Taxol (paclitaxel): mechanism of action), Annals Oncol., 5, 1994) describes the mechanism of action of paclitaxel as an antitumor agent. Paclitaxel acts by binding to microtubules from tubulin dimers in cells and interferes with the division process (mitosis) during the G2 / M phase of the cell cycle.
Заявителем выявлен источник, свидетельствующий, что паклитаксел нерастворим в воде, что затрудняет его применение в клинической практике в качестве противоопухолевого препарата без специальных носителей (Flora, К. P., et al., NCI investigational drugs chemical information (Информация Национального Института Рака о химических свойствах лекарственных препаратов), Bethesda, Md.: National Cancer Institute, pp. 218, 1992).The applicant has identified a source indicating that paclitaxel is insoluble in water, which makes it difficult to use in clinical practice as an antitumor drug without special carriers (Flora, K. P., et al., NCI investigational drugs chemical information (Information from the National Cancer Institute on Chemical drug properties), Bethesda, Md .: National Cancer Institute, pp. 218, 1992).
Более того, паклитаксел не имеет функциональных групп, которые можно было бы ионизировать в физиологических условиях. Соответственно, изменение рН и солевого состава водного раствора не способны оказывать влияние на его растворимость в воде (Straubinger, R.M. Biopharmaceutics of paclitaxel (taxol): formulation, activity, and pharmacokinetics (Биофармацевтика паклитаксела (таксола): состав, активность и фармакокинетика). In: Suffhess, М. (Ed.), Taxol®: Science and Applications. CRC press, NY, pp. 237-254, 1995).Moreover, paclitaxel does not have functional groups that could be ionized under physiological conditions. Accordingly, changes in the pH and salt composition of an aqueous solution are not able to affect its solubility in water (Straubinger, RM Biopharmaceutics of paclitaxel (taxol): formulation, activity, and pharmacokinetics (Composition, activity and pharmacokinetics of paclitaxel (taxol). In : Suffhess, M. (Ed.), Taxol®: Science and Applications. CRC press, NY, pp. 237-254, 1995).
Чтобы сделать паклитаксел подходящим для противоопухолевой терапии, его смешивают с поверхностно-активным агентом - полиэтоксилированным касторовым маслом, известным под зарегистрированным названием Кремофор (Cremophor EL), находящимся в равной доле с безводным этанолом, в качестве носителей (Mead Johnson Oncology Products. Taxol package insert (Листок-вкладыш для пациента), Princeton, N.J., 1993). Эта смесь (композиция) является зарегистрированным торговым наименованием Paclitaxel (Паклитаксел) (ранее Taxol (таксол)) фирмой Bristol-Myers Squibb. Непосредственно перед внутривенным вливанием данная композиция смешивается с водным раствором (нормальным физиологическим раствором), который в присутствии поверхностно-активного вещества Кремофора образует с паклитакселом стабильную микроэмульсию, размеры частиц которой и другие физические характеристики обеспечивают паклитакселу беспрепятственное прохождение по кровеносным сосудам к опухолевым тканям.To make paclitaxel suitable for antitumor therapy, it is mixed with a surface-active agent, a polyethoxylated castor oil, known under the registered name Cremophor EL, which is in equal proportion with anhydrous ethanol, as carriers (Mead Johnson Oncology Products. Taxol package insert (Patient Leaflet), Princeton, NJ, 1993). This mixture (composition) is the registered trade name Paclitaxel (Paclitaxel) (formerly Taxol (Taxol)) by Bristol-Myers Squibb. Immediately before intravenous infusion, this composition is mixed with an aqueous solution (normal physiological saline), which in the presence of a cremophor surfactant forms a stable microemulsion with paclitaxel, the particle sizes of which and other physical characteristics ensure paclitaxel unhindered passage through the blood vessels to the tumor tissues.
Недостатком известного технического решения является то, что введение Кремофора связано с побочными эффектами, которые могут быть тяжелыми, включая анафилактические и другие реакции гиперчувствительности (аллергии) и которые требуют предварительного лечения кортикостероидами, противогистаминными препаратами и Н2-блокаторами (Gelderblom et al., Cremophor EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation (Кремофор EL: недостатки и преимущества выбора в качестве носителя для лекарственного средства). Eur. J. of Cancer, 37, 1590-1598, 2001).A disadvantage of the known technical solution is that the introduction of Cremophor is associated with side effects that can be severe, including anaphylactic and other hypersensitivity reactions (allergies) and which require prior treatment with corticosteroids, antihistamines and H2 blockers (Gelderblom et al., Cremophor EL : the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation (Cremophor EL: disadvantages and advantages of choosing as a carrier for a drug). Eur. J. of Cancer, 37, 1590-1598, 2001).
Также выявлено, что Кремофор вызывает оксидативный стресс (A.Ilinskaya et al. Induction of oxidative stress by Taxol® vehicle Cremophor-EL triggers production of interleukin-8 by peripheral blood mononuclear cells through the mechanism not requiring de novo synthesis of mRNA (Оксидативный стресс, вызванный носителем для таксола Кремофором-EL, запускает производство интерлейкина-8 периферическими мононуклеарными клетками крови с помощью механизма, не требующего синтеза мРНК de novo), Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11, 1925-1938, 2015).Cremophor has also been found to cause oxidative stress (A. Ilinskaya et al. Induction of oxidative stress by Taxol® vehicle Cremophor-EL triggers production of interleukin-8 by peripheral blood mononuclear cells through the mechanism not requiring de novo synthesis of mRNA (Oxidative stress caused by the carrier for taxol Cremophor-EL, starts the production of interleukin-8 by peripheral mononuclear blood cells using a mechanism that does not require de novo mRNA synthesis), Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11, 1925-1938, 2015).
Указанные недостатки ограничивают более широкое применение паклитаксела в виде композиции с Кремофором и этанолом в клинической практике.These disadvantages limit the wider use of paclitaxel in the form of a composition with Cremophor and ethanol in clinical practice.
Учитывая вышеизложенное, возможно сделать вывод, что имеется необходимость разработки новых носителей для производства композиций паклитаксела, свободных от побочных эффектов.Given the above, it is possible to conclude that there is a need to develop new carriers for the production of paclitaxel compositions that are free from side effects.
На дату подачу заявки заявителем выявлены технические решения, направленные на поиск альтернативных носителей для паклитаксела, включая белки, улучшающие терапевтические свойства паклитаксела.As of the filing date, the applicant has identified technical solutions aimed at finding alternative carriers for paclitaxel, including proteins that improve the therapeutic properties of paclitaxel.
Наиболее близким по сущности к заявленному техническому решению, выбранным заявителем в качестве прототипа по отношению к композиции, является лекарственный препарат Абраксан (Abraxane®), содержащий человеческий альбумин (Desai N, Trieu V, Yao Z, Louie L, Ci S, Yang A, et al. Increased antitumor activity, intratumor paclitaxel concentrations, and endothelial cell transport of cremophor-free, albumin-bound paclitaxel, ABI-007, compared with cremophor-based paclitaxel (Повышенная противоопухолевая активность, внутриопухолевая концентрация паклитаксела и эндотелиальный перенос с помощью не содержащего Кремофор паклитаксела, связанного с альбумином, ABI-007, по сравнению с паклитакселом на основе кремофора). Clin Cancer Res. 12(4), 1317-24, 2006), одобренный в 2005 году агентством по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в качестве лекарственного средства для терапии рака молочной железы, а в 2013 году для лечения рака поджелудочной железы. Сущностью препарата Абраксан является композиция (наночастицы), содержащая человеческий альбумин в качестве носителя и паклитаксел. Альбумин является белком-носителем, т.е. служит в качестве носителя для действующего вещества - паклитаксела, делая его более подходящим для противоопухолевой терапии, так как позволяет избежать присутствия в составе смеси токсичного растворителя (сурфактанта), коим является полиэтоксилированное касторовое масло (Cremophor EL), применяемое в описанном выше известном техническом решении (Mead Johnson Oncology Products. Taxol package insert (листок-вкладыш для пациента), Princeton, N.J. 1993).The closest in essence to the claimed technical solution, selected by the applicant as a prototype in relation to the composition, is the drug Abraxan (Abraxane®) containing human albumin (Desai N, Trieu V, Yao Z, Louie L, Ci S, Yang A, et al. Increased antitumor activity, intratumor paclitaxel concentration, and endothelial cell transport of cremophor-free, albumin-bound paclitaxel, ABI-007, compared with cremophor-based paclitaxel (Increased antitumor activity, intratumor concentration of paclitaxel and non-endothelial transfer using Cremophor paclitaxel bound to albumin, AB I-007 compared to cremophor-based paclitaxel.) Clin Cancer Res. 12 (4), 1317-24, 2006), approved by the US Food and Drug Administration (FDA) in 2005 as a medicinal product funds for the treatment of breast cancer, and in 2013 for the treatment of pancreatic cancer. The essence of the drug Abraxan is a composition (nanoparticles) containing human albumin as a carrier and paclitaxel. Albumin is a carrier protein, i.e. It serves as a carrier for the active substance - paclitaxel, making it more suitable for antitumor therapy, as it avoids the presence of a toxic solvent (surfactant) in the mixture, which is polyethoxylated castor oil (Cremophor EL), used in the above-described known technical solution ( Mead Johnson Oncology Products. Taxol package insert (Patient Leaflet), Princeton, NJ 1993).
Человеческий альбумин в качестве носителя, в отличие от Кремофора, является нетоксичным и не имеет значительных побочных эффектов в терапевтических концентрациях (Mendez CM, McClain С J, Marsano LS: Albumin Therapy in Clinical Practice (Терапия альбумином в клинической практике). Nutrition in Clinical Practice, 20, 314-320, 2005).Human albumin as a carrier, unlike Cremophor, is non-toxic and has no significant side effects in therapeutic concentrations (Mendez CM, McClain C J, Marsano LS: Albumin Therapy in Clinical Practice. Nutrition in Clinical Practice , 20, 314-320, 2005).
При анализе существующего уровня техники выявлен источник, указывающий на важность размера комплексов (композиций) фармацевтического препарата с носителем, используемых в противоопухолевой терапии. Согласно теории об эффекте усиления проницаемости и удерживания (от англ. enhanced permeability and retention effect (EPR-эффект)) лекарственные средства определенных размеров за счет особого строения кровеносной и лимфатической систем опухолевых тканей по сравнению со здоровой имеют тенденцию накапливаться в опухолевых клетках (см. обзор: Mark Е. Davis et al. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer (Терапия наночастицами: новый метод лечения рака). Nature Reviews Drug Discovery, 7, 771-782, 2008).When analyzing the current level of technology, a source was identified that indicates the importance of the size of complexes (compositions) of a pharmaceutical preparation with a carrier used in antitumor therapy. According to the theory of enhanced permeability and retention effect (EPR-effect), drugs of certain sizes due to the special structure of the circulatory and lymphatic systems of tumor tissues compared to healthy ones tend to accumulate in tumor cells (see review: Mark E. Davis et al. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer (Nanoparticle Therapy: A New Cancer Treatment). Nature Reviews Drug Discovery, 7, 771-782, 2008).
Заявителем выявлен источник, свидетельствующий о том, что EPR-эффект действует тогда, когда размер частиц фармацевтической композиции находится в интервале 100-400 нм (Bobe I, Harada М, Nakatomi I. A Revolution in Nanomedicines (переворот в наномедицине). In: Bagchi D (Ed.) Bio-Nanotechnology: A Revolution in Food, Biomedical and Health Science, Wiley-Blackwell press, pp. 107-124, 2013).The applicant has identified a source indicating that the EPR effect is effective when the particle size of the pharmaceutical composition is in the range of 100-400 nm (Bobe I, Harada M, Nakatomi I. A Revolution in Nanomedicines. In: Bagchi D (Ed.) Bio-Nanotechnology: A Revolution in Food, Biomedical and Health Science, Wiley-Blackwell press, pp. 107-124, 2013).
Заявителем также выявлено изобретение по патенту US 7820788 Compositions and methods of delivery of pharmacological agents» («Составы и методы доставки фармакологических агентов»), в котором приводится размер частиц и соотношение паклитаксел/альбумин по массе фармацевтической композиции паклитаксела с человеческим альбумином. В целом сущностью известного изобретения является фармацевтическая композиция для инъекций, содержащая паклитаксел и фармацевтически приемлемый носитель, где фармацевтически приемлемый носитель содержит альбумин, где альбумин и паклитаксел в композиции составлены в виде частиц, причем частицы имеют размер частиц менее примерно 200 нм, и где массовое соотношение альбумина и паклитаксела в композиции составляет от примерно 1:1 до примерно 9:1.The applicant also discovered the invention of US Pat. No. 7,820,788 Compositions and methods of delivery of pharmacological agents ", which describes the particle size and paclitaxel / albumin ratio by weight of the pharmaceutical composition of paclitaxel with human albumin. In General, the essence of the known invention is a pharmaceutical composition for injection containing paclitaxel and a pharmaceutically acceptable carrier, where the pharmaceutically acceptable carrier contains albumin, where the albumin and paclitaxel in the composition are in the form of particles, and the particles have a particle size of less than about 200 nm, and where the mass ratio albumin and paclitaxel in the composition is from about 1: 1 to about 9: 1.
Заявителем также выявлено изобретение по патенту US 6749868 «Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof» («Белки, стабилизирующие фармакологически активные агенты, способы их получения и способы их применения»), сущностью которого является система доставки лекарственного средства, содержащая частицы твердого или жидкого, по существу нерастворимого в воде фармакологически активного агента, покрытого белковой оболочкой, где указанное белковое покрытие имеет связанные с ним молекулы свободного белка таким образом, что часть указанного фармакологически активного агента содержится внутри указанного белкового покрытия, и часть указанного фармакологически активного агента связано с указанным свободным белком, причем средний диаметр указанных частиц не превышает примерно 1 мкм (1 000 нм), система доставки лекарственного средства, в которой средний диаметр указанных частиц составляет менее 200 нм, биозащищенные частицы по существу нерастворимого в воде фармакологически активного агента, покрытого белком, причем указанные частицы окружены связанным с ними свободным белком, причем часть указанного фармакологически активного агента содержится в указанном белковом покрытии, а часть указанного фармакологически активного агента связана с указанным свободным белком, окружающим указанное белковое покрытие, и где средний диаметр указанных частиц не превышает примерно 1 мкм (1000 нм), биозащищенные частицы, в которых средний диаметр указанных частиц составляет менее 200 нм.The applicant also discovered the invention according to patent US 6749868 "Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof" ("Proteins stabilizing pharmacologically active agents, methods for their preparation and methods of their use"), the essence of which is the system a drug delivery containing particles of a solid or liquid, water-insoluble pharmacologically active agent coated with a protein shell, wherein said protein coating has associated free protein molecules such that part of the specified pharmacologically active agent is contained within the specified protein coating, and part of the specified pharmacologically active agent is associated with the specified free protein, the average diameter of these particles not exceeding about 1 μm (1,000 nm), a drug delivery system in which the average diameter of these particles is less than 200 nm, biosafety particles of a substantially water-insoluble pharmacologically active agent coated with a protein, said particles being surrounded by free protein, moreover, part of the specified pharmacologically active agent is contained in the specified protein coating, and part of the specified pharmacologically active agent is associated with the specified free protein surrounding the specified protein coating, and where the average diameter of these particles does not exceed about 1 μm (1000 nm), bioprotective particles in which the average diameter of these particles is less than 200 nm.
Более кратко, с учетом примеров осуществления изобретения, сущность известного изобретения определяется тем, что нерастворимые в воде фармакологически активные агенты могут быть доставлены в ткани в виде микрочастиц или наночастиц в водной суспензии, пригодной для внутривенного введения. Этот способ доставки снимает необходимость использования паклитаксела в виде эмульсии, содержащей этанол и полиэтоксилированное касторовое масло (Кремофор) в физиологическом растворе. В известном техническом решении предлагаются способы получения наночастиц фармакологически активных агентов, таких как паклитаксел, с помощью технологии испарения растворителя из эмульсии «масло-в-воде», полученной в условиях высоких сил (усилий) сдвига (например, ультразвуковая обработка, гомогенизация высокого давления, или тому подобное). В качестве стабилизирующего агента используют белки (например, человеческий сывороточный альбумин).More concisely, in view of embodiments of the invention, the essence of the known invention is determined by the fact that water-insoluble pharmacologically active agents can be delivered to tissues in the form of microparticles or nanoparticles in an aqueous suspension suitable for intravenous administration. This delivery method eliminates the need to use paclitaxel in the form of an emulsion containing ethanol and polyethoxylated castor oil (Cremophor) in physiological saline. The known technical solution provides methods for producing nanoparticles of pharmacologically active agents, such as paclitaxel, using solvent evaporation technology from an oil-in-water emulsion obtained under high shear forces (for example, ultrasonic treatment, high pressure homogenization, or the like). Proteins (e.g., human serum albumin) are used as a stabilizing agent.
При этом описываются способы подготовки компонентов при формировании композиции человеческого альбумина с паклитакселом, при которых используется органический растворитель дихлорметан, и способы получения композиции с использованием высоких сил (усилий) сдвига, таких как гомогенизация под высоким давлением, когда смесь белка и паклитаксела подвергается эмульсификации (перемешиванию для получения эмульсии) под высоким давлением на специальном дорогостоящем оборудовании, чтобы частицы эмульсии достигли наноразмеров.This describes the methods of preparation of the components in the formation of the composition of human albumin with paclitaxel, using an organic solvent dichloromethane, and methods for producing the composition using high shear forces (forces), such as high pressure homogenization, when the mixture of protein and paclitaxel undergoes emulsification (mixing) to obtain an emulsion) under high pressure on special expensive equipment so that the particles of the emulsion reach nanoscale.
Под силой (усилием) сдвига подразумевается физическая величина, характеризующая силу, которая прикладывается касательно поверхности частицы, когда одна ее боковая грань смещается относительно другой (противоположной) грани при деформации сдвига. Сила (усилие) сдвига - одна из основных величин в технических характеристиках смесителей (гомогенизаторов), используемых в фармацевтической промышленности.By shear force (force) is meant a physical quantity characterizing the force that is applied relative to the surface of a particle when one of its side faces is displaced relative to another (opposite) face during shear deformation. Shear force (force) is one of the main values in the technical characteristics of mixers (homogenizers) used in the pharmaceutical industry.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник, в котором описывается токсичность дихлорметана, который воздействует на печень, почки и селезенку, способен проникать через кожу, гематоэнцефалитический и плацентарный барьеры (Bale AS, Barone Jr S, Scott CS, Cooper GS. A review of potential neurotoxic mechanisms among three chlorinated organic solvents (Обзор потенциальных нейротоксических механизмов среди трех хлорированных органических растворителей), Toxicol Appl Pharmacol., 255(1), 113-26, 2011).From the studied prior art, the applicant has identified a source that describes the toxicity of dichloromethane, which affects the liver, kidneys and spleen, is able to penetrate the skin, blood-brain and placental barriers (Bale AS, Barone Jr S, Scott CS, Cooper GS. A review of potential neurotoxic mechanisms among three chlorinated organic solvents (Review of potential neurotoxic mechanisms among three chlorinated organic solvents), Toxicol Appl Pharmacol., 255 (1), 113-26, 2011).
В целом, исходя из изложенного выше, заявителем выявлено, что базовым недостатком применения альбумина в качестве носителя для паклитаксела является то, что при формировании композиции альбумина с паклитакселом используется высокотоксичный органический растворитель дихлорметан.In general, based on the foregoing, the applicant revealed that the main disadvantage of using albumin as a carrier for paclitaxel is that a highly toxic organic solvent dichloromethane is used to form the albumin composition with paclitaxel.
Кроме вышеуказанного, из опубликованных материалов известно, что альбумин, используемый в качестве носителя, является инертным и не обладает собственной противоопухолевой активностью (Mendez CM, McClain СJ, Marsano LS: Albumin Therapy in Clinical Practice (терапия альбумином в клинической практике). Nutrition in Clinical Practice, 20, 314-320, 2005).In addition to the above, from published materials it is known that the albumin used as a carrier is inert and does not have its own antitumor activity (Mendez CM, McClain CJ, Marsano LS: Albumin Therapy in Clinical Practice (clinical therapy with albumin). Practice, 20, 314-320, 2005).
Недостатком способа получения альбумина в качестве носителя для паклитаксела является использование метода гомогенизации под высоким давлением при получении композиции альбумина с паклитакселом, для осуществления которого необходимо специальное оборудование.The disadvantage of the method of producing albumin as a carrier for paclitaxel is the use of a high pressure homogenization method to obtain a composition of albumin with paclitaxel, which requires special equipment.
Таким образом, основываясь на исследованном уровне техники, представляется возможным сделать логический вывод о том, что в мире существует необходимость в разработках новых композиций паклитаксела с новыми носителями, итогом которых было бы сохранение всех полезных качеств, как у аналога-альбумина, который используется для производства Абраксана, с одновременным устранением токсичных компонентов при производстве и упрощением процедуры производства.Thus, based on the studied prior art, it seems possible to draw a logical conclusion that in the world there is a need for the development of new compositions of paclitaxel with new carriers, the result of which would be the preservation of all useful qualities, like the albumin analogue used for production Abraksan, with the simultaneous elimination of toxic components in the production and simplification of the production procedure.
Наиболее подходящим кандидатом для разработки новых композиций паклитаксела с новым носителем, по мнению заявителя, является гистон Н1.3 человека, который обладает рядом преимуществ по сравнению с альбумином, который используется в качестве носителя в препарате Абраксан.The most suitable candidate for the development of new compositions of paclitaxel with a new carrier, according to the applicant, is human histone H1.3, which has several advantages compared to albumin, which is used as a carrier in the drug Abraksan.
Преимуществом гистона Н1.3, по сравнению с прототипом, которое (преимущество) будет подробно описано ниже, является наличие собственной противоопухолевой активности.The advantage of histone H1.3, compared with the prototype, which (advantage) will be described in detail below, is the presence of its own antitumor activity.
Преимуществом способа получения фармацевтической противоопухолевой композиции с использованием гистона Н1.3, по сравнению с прототипом, является возможность гистона Н1.3 самособираться в комплексы с паклитакселом благодаря особенности структурной организации гистона Н1.3, что позволяет избежать использования дополнительных токсичных компонентов и дополнительного оборудования.The advantage of the method for producing a pharmaceutical antitumor composition using histone H1.3, compared with the prototype, is the ability of histone H1.3 to self-assemble into complexes with paclitaxel due to the structural organization of histone H1.3, which avoids the use of additional toxic components and additional equipment.
Под определением гистонный белок (гистон) заявителем подразумеваются гистоны различных типов:The definition of a histone protein (histone) by the applicant means histones of various types:
- Гистоны H2A, Н2В, H3, H4 называются коровыми гистонами (от англ. core - сердцевина), и формируют нуклеосому, представляющую собой белковую глобулу, вокруг которой накручена нить ДНК.- Histones H2A, H2B, H3, H4 are called core histones (from the English core - core), and form a nucleosome, which is a protein globule around which a DNA strand is wound.
- Гистон Н1.1/Н1.5, называемый линкерным гистоном (от англ. link - связь), связывается с внешней стороной нуклеосомы, фиксируя на ней нить ДНК.- Histone H1.1 / H1.5, called the linker histone (from the English link - link), binds to the outside of the nucleosome, fixing a DNA strand on it.
- Гистон Н1.3 представляет собой белок с молекулярной массой 22.5 КДа. Он очень богат остатками лизина (61 а.к. о.), которые придают ему ярко выраженный положительный заряд.- Histone H1.3 is a protein with a molecular weight of 22.5 KDa. It is very rich in lysine residues (61 a.k.a.), which give it a pronounced positive charge.
Из исследованного заявителем уровня техники выявлено, что гистон Н1.3 обладает собственной противоопухолевой активностью.From the prior art examined by the applicant, it was found that histone H1.3 has its own antitumor activity.
Так, заявителем выявлен источник, указывающий на наличие собственной противоопухолевой активности гистона Н1.3 (Medrzycki М, Zhang Y, Zhang W et al. Histone h1.3 suppresses h19 noncoding RNA expression and cell growth of ovarian cancer cells (Гистон H1.3 подавляет экспрессию некодирующей РНК hi9 и рост клеток рака яичника). Cancer Res, 74, 6463-6473, 2014). Сущностью известной статьи является то, что повышенная экспрессия гистона Н1.3 с гена, введенного с помощью плазмиды методом трансфекции в эпителиальные клетки рака яичника OVCAR-3, ингибировала скорость роста и формирование колоний OVCAR-3. Эти данные указывают на роль гистона Н1.3, как внутриклеточного эпигенетического регулятора, подавляющего развитие опухоли в эпителиальных клетках рака яичника.Thus, the applicant has identified a source indicating the presence of its own antitumor activity of histone H1.3 (Medrzycki M, Zhang Y, Zhang W et al. Histone h1.3 suppresses h19 noncoding RNA expression and cell growth of ovarian cancer cells (Histon H1.3 suppresses expression of non-coding hi9 RNA and growth of ovarian cancer cells). Cancer Res, 74, 6463-6473, 2014). The essence of the well-known article is that increased expression of histone H1.3 from a gene introduced by plasmid by transfection into the epithelial cells of ovarian cancer OVCAR-3 inhibited the growth rate and formation of OVCAR-3 colonies. These data indicate the role of histone H1.3 as an intracellular epigenetic regulator that suppresses tumor development in the epithelial cells of ovarian cancer.
Заявителем выявлен источник по международной заявке на предполагаемое изобретение WO 2008122434 А1, по которой получены ряд патентов-аналогов, например - ЕР 2142563, в которых указывается на возможность использования гистона Н1.3 в качестве противоопухолевого препарата (Gross Р, Jornvall Н, Thiry М et al (2008) Bis-Met Histone (Bis-Met гистон). Patent WO 2008122434 Al).The applicant has identified a source from the international application for the alleged invention WO 2008122434 A1, according to which a number of analog patents have been obtained, for example, EP 2142563, which indicate the possibility of using histone H1.3 as an antitumor drug (Gross P, Jornvall H, Thiry M et al (2008) Bis-Met Histone (Bis-Met histone). Patent WO 2008122434 Al).
Сущностью известного технического решения является молекула нуклеиновой кислоты, которая (а) кодирует полипептид, состоящий из (аа) двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со (ab) зрелым эукариотическим гистоном; (b) кодирует полипептид, состоящий из (ba) двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со (bb) зрелым эукариотическим полипептидом, последовательность которого, по крайней мере, на 80% идентична последовательности зрелого эукариотического гистона (а) и существенным образом сохраняет свою биологическую активность; или (с) гибридизуется в жестких условиях с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид (а) или (b), причем указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который имеет, по крайней мере, два N-концевых остатка метионина и существенным образом сохраняет биологическую активность полипептида (а) или (b), способ лечения и/или профилактики заболевания, выбираемого из рака, тромбоцитопении, инфекций, таких как бактериальные, вирусные или грибковые инфекции, аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (SLE) или ревматоидный артрит, язвенного колита или заболеваний, характеризующихся амилоидоподобными фибриллами, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD), лейшманиоза, миопатии или сердечно-сосудистых нарушений, связанных с тромбозами, включающий введение композиции по п. 12 нуждающемуся в этом субъекту, применение молекулы нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, или вектора по п. 5, или хозяина по п. 6 или 7, или полипептида по п. 9 для приготовления композиции для терапевтических и/или диагностических целей, применение по п. 15, где терапевтической целью является лечение рака, тромбоцитопении, инфекций, таких как бактериальные, вирусные или грибковые инфекции, аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (SLE) или ревматоидный артрит, язвенного колита или заболеваний, характеризующихся амилоидоподобньгми фибриллами, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD), лейшманиоза, миопатии или сердечно-сосудистых нарушений, связанных с тромбозами.The essence of the known technical solution is a nucleic acid molecule that (a) encodes a polypeptide consisting of (aa) two methionine residues as the first and second N-terminal amino acid residues connected via a peptide bond to (ab) mature eukaryotic histone; (b) encodes a polypeptide consisting of (ba) two methionine residues as the first and second N-terminal amino acid residues linked via a peptide bond to (bb) a mature eukaryotic polypeptide, the sequence of which is at least 80% identical to the sequence of the mature eukaryotic histone (a) and substantially retains its biological activity; or (c) hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of a nucleic acid molecule encoding polypeptide (a) or (b), said nucleic acid molecule encoding a polypeptide that has at least two N-terminal methionine residues and substantially retains the biological activity of the polypeptide (a) or (b), a method for treating and / or preventing a disease selected from cancer, thrombocytopenia, infections such as bacterial, viral or fungal infections, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) or rheumatoid arthritis, ulcerative colitis or diseases characterized by amyloid-like fibrils, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), leishmaniasis, myopathy or cardiovascular disorders associated with thrombosis, including the introduction of a composition according to claim 12 in need of this subject, the use of a nucleic acid molecule according to claim 1 or 2, or a vector according to claim 5, or a host according to claim 6 or 7, or a polypeptide according to claim 9 for preparing a composition for therapeutic and / or diagnostic purposes application p o p. 15, where the therapeutic goal is the treatment of cancer, thrombocytopenia, infections such as bacterial, viral or fungal infections, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) or rheumatoid arthritis, ulcerative colitis or diseases characterized by amyloid-like fibrils, such like Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), leishmaniasis, myopathy, or cardiovascular disorders associated with thrombosis.
Более кратко, с учетом приведенных в патенте примеров, сущность известного изобретения состоит в том, что сконструированная молекула ДНК кодирует белок -производное гистона Н1.3 (N,N-бисметионилгистон), который имеет на N-конце дополнительный остаток аминокислоты метионина, облегчающий его выделение. Этот белок был использован для создания препарата ONCOHIST, который предварительно показал свою эффективность в противоопухолевой терапии миелолейкоза.More succinctly, taking into account the examples cited in the patent, the essence of the known invention is that the constructed DNA molecule encodes a protein derivative of histone H1.3 (N, N-bismethionyl histone), which has an additional amino acid residue methionine at the N-terminus that facilitates it selection. This protein was used to create the drug ONCOHIST, which previously showed its effectiveness in antitumor therapy of myeloid leukemia.
Из исследованного уровня техники выявлено, что механизм действия гистона Н1.3 на опухолевые клетки основан на его способности образовывать агрегаты с фосфолипидами, которые в опухолевых клетках смещены на внешнюю сторону мембраны, что приводит к серьезным перестройкам в клеточной мембране, образованию пор, и в конечном итоге к программируемой гибели клетки (апоптозу) (Zhao Н., Tuominen ЕК, Kinnunen РК. Formation of amyloid fibers triggered by phosphatidylserine-containing membranes (Образование амилоидных волокон, вызванных фосфатидилсеринсодержащими мембранами). Biochemistry, 43 (32), 10302-10307, 2004).From the studied prior art it was found that the mechanism of action of histone H1.3 on tumor cells is based on its ability to form aggregates with phospholipids, which are displaced in the tumor cells on the outer side of the membrane, which leads to serious rearrangements in the cell membrane, pore formation, and ultimately the result to programmed cell death (apoptosis) (Zhao N., Tuominen EC, Kinnunen PK. Formation of amyloid fibers triggered by phosphatidylserine-containing membranes (Formation of amyloid fibers caused by phosphatidylserine-containing membranes). Biochemistry, 43 (32), 10302-1030, 1030-10-30-30 2004) .
Таким образом, из исследованного уровня техники можно сделать вывод, что гистон Н1.3 человека обладает собственной противоопухолевой активностью в отличие от прототипа альбумина, что делает его (гистон Н1.3) наиболее подходящим кандидатом для использования в качестве нового носителя в композиции с паклитакселом.Thus, from the studied prior art, it can be concluded that human histone H1.3 has its own antitumor activity, unlike the albumin prototype, which makes it (histone H1.3) the most suitable candidate for use as a new carrier in the composition with paclitaxel.
Как было указано выше, одним из недостатков применения альбумина в качестве носителя для паклитаксела является использование метода гомогенизации под высоким давлением при получении композиции альбумина с паклитакселом, для осуществления которого необходимо специальное оборудование, при этом используют дополнительные токсичные компоненты.As mentioned above, one of the drawbacks of using albumin as a carrier for paclitaxel is the use of high pressure homogenization method to obtain a composition of albumin with paclitaxel, which requires special equipment, and additional toxic components are used.
По мнению заявителя, приемлемым методом для устранения указанных недостатков мог бы стать метод самосборки комплексов паклитаксела с белком-носителем как альтернатива использованию известного метода эмульсификации.According to the applicant, the method of self-assembly of paclitaxel complexes with a carrier protein as an alternative to using the known method of emulsification could be an acceptable method for eliminating these shortcomings.
Самосборка в данном случае является общеупотребительным термином. Под самосборкой (англ. self-assembly) понимается процесс образования упорядоченной надмолекулярной структуры или среды, в котором в практически неизменном виде принимают участие компоненты (элементы) исходной структуры, аддитивно составляющие или собирающие, как части целого, результирующую более сложную структуру. Самосборка основана на технологии получения материала «снизу-вверх», когда сборка осуществляется непосредственно из элементов низшего порядка (атомов, молекул, структурных фрагментов биологических клеток и т.п.), располагаемых в требуемом порядке. При осуществлении самосборки не требуется привлечение дополнительных растворителей или компонентов, кроме исходных.Self-assembly in this case is a common term. Self-assembly is understood as the process of formation of an ordered supramolecular structure or medium, in which the components (elements) of the original structure, additively constituting or assembling, as parts of the whole, the resulting more complex structure, take part in an almost unchanged form. Self-assembly is based on the technology of obtaining material “bottom-up”, when the assembly is carried out directly from the lower order elements (atoms, molecules, structural fragments of biological cells, etc.) located in the required order. In the implementation of self-assembly does not require the involvement of additional solvents or components other than the original.
По свидетельству литературных источников, самосборка основана на межмолекулярном взаимодействии участвующих в процессе компонентов, которое специфически зависит от размера, заряда, формы молекул и определяет термодинамическую выгодность взаимодействия, чтобы минимизировать свободную энергию. Для осуществления взаимодействия во многих случаях необходим приток внешней энергии в виде тепловой, электрической, магнитной и т.п. (Alexander Boker, Jinbo Не, Todd Emrick and Thomas P. Russell. Self-assembly of nanoparticles at interfaces (самосборка наночастиц на границах раздела). Soft Matter, 3, 1231-1248, 2007).According to the literature, self-assembly is based on the intermolecular interaction of the components involved in the process, which specifically depends on the size, charge, shape of the molecules and determines the thermodynamic profitability of the interaction in order to minimize free energy. In many cases, the influx of external energy in the form of thermal, electric, magnetic, etc., is necessary for the implementation of the interaction. (Alexander Boker, Jinbo He, Todd Emrick and Thomas P. Russell. Self-assembly of nanoparticles at interfaces. Soft Matter, 3, 1231-1248, 2007).
Разнообразие молекул, способных самособираться в надмолекулярные структуры, используя различные молекулярные механизмы, включая водородные связи, силы Ван-Дер-Ваальса, гидрофобное/гидрофильное взаимодействие и др., не позволяет сформулировать единую универсальную методику самосборки, применимую ко всем случаям. Каждый конкретный случай самосборки требует отдельного теоретического обоснования и экспериментального подбора условий. С этой точки зрения процесс самосборки молекул паклитаксела и гистона Н1.3 также является уникальным и возможность его осуществления предварительно была теоретически обоснована заявителем благодаря анализу большого количества литературных источников в процессе работы над изобретением и практически осуществлена в условиях эксперимента.A variety of molecules that can self-assemble into supramolecular structures using various molecular mechanisms, including hydrogen bonds, Van der Waals forces, hydrophobic / hydrophilic interaction, etc., does not allow us to formulate a single universal self-assembly technique applicable to all cases. Each specific case of self-assembly requires a separate theoretical justification and experimental selection of conditions. From this point of view, the process of self-assembly of paclitaxel and histone H1.3 molecules is also unique and the possibility of its implementation was previously theoretically justified by the applicant due to the analysis of a large number of literature during the work on the invention and was practically carried out under experimental conditions.
Метод самосборки можно считать обратным по отношению к методу миниатюризации «сверху-вниз», когда размеры частиц уменьшаются путем механической или ионной обработки, вплоть до получения объектов с ультрамикроскопическими, нанометровыми параметрами. На указанной технологии «сверху-вниз» и базируется способ получения наночастиц композиции паклитаксела и человеческого альбумина, который является прототипом и используется при производстве препарата Абраксан вышеописанным методом эмульсификации под высоким давлением, указанном в изобретении по патенту США 6749868.The self-assembly method can be considered the opposite of the top-down miniaturization method, when the particle sizes are reduced by mechanical or ion processing, up to obtaining objects with ultramicroscopic, nanometer parameters. The above-mentioned top-down technology is the basis for the production of nanoparticles of the composition of paclitaxel and human albumin, which is a prototype and is used in the manufacture of the Abraxan preparation using the high-pressure emulsification method described above in accordance with US Pat. No. 6,749,868.
При этом в прототипе применяется дополнительный компонент - токсичный органический растворитель дихлорметан и дополнительное оборудование для измельчения частиц (патент США 6749868).In this case, the prototype uses an additional component - a toxic organic solvent dichloromethane and additional equipment for grinding particles (US patent 6749868).
Заявителем выявлен источник, описывающий структуру белка - гистона Н1.3 (Dootz R, Adriana С.Toma AC, Pfohl Т. Structural and dynamic properties of linker histone H1 binding to DNA (структурные и динамические свойства связывания с ДНК линкерного гистона H1). Biomicrofluidics, 5, 024104-12, 2011). Сущностью известной статьи является описание особенности гистонового белка Н1.3, связанной со структурой. Белок имеет в составе гидрофобный домен, образующий глобулу в водном растворе, и гидрофильные N- и С- концевые участки, остающиеся неструктурированными благодаря наличию большого количества аминокислот лизина и аргинина. Кроме того, глобулярный домен содержит два сайта связывания с ДНК, которые расположены на противоположных концах домена (Goytisolo FA, Gerchman SE, Yu X, Rees C, Graziano V, Ramakrishnan V, Thomas JO. Identification of two DNA-binding sites on the globular domain of histone H5 (идентификация двух сайтов связывания с ДНК на глобулярном домене Н5). The EMBO Journal, 15, 3421-3429, 1996).The applicant has identified a source that describes the structure of the protein - histone H1.3 (Dootz R, Adriana C. Toma AC, Pfohl T. Structural and dynamic properties of linker histone H1 binding to DNA (structural and dynamic properties of linking with the DNA of the histone H1). Biomicrofluidics 5, 024104-12, 2011). The essence of the well-known article is the description of the peculiarity of histone H1.3 protein associated with the structure. The protein contains a hydrophobic domain that forms a globule in an aqueous solution, and hydrophilic N- and C-terminal regions that remain unstructured due to the presence of a large number of amino acids lysine and arginine. In addition, the globular domain contains two DNA binding sites that are located at opposite ends of the domain (Goytisolo FA, Gerchman SE, Yu X, Rees C, Graziano V, Ramakrishnan V, Thomas JO. Identification of two DNA-binding sites on the globular domain of histone H5 (identification of two DNA binding sites on the globular domain of H5. The EMBO Journal, 15, 3421-3429, 1996).
При этом в понятие гидрофобность (от греч. hydor-вода и phobos-боязнь, страх) входит физическое свойство молекулы, или отдельного ее участка, который стремится избежать контакта с водой. Сама молекула в этом случае называется гидрофобной. Гидрофобные молекулы не поляризованы и не способны образовывать водородные связи, поэтому вода отталкивает такие молекулы, предпочитая образовывать связи внутри себя, т.е. с гидрофильными молекулами.In this case, the concept of hydrophobicity (from the Greek. Hydor-water and phobos-fear, fear) includes the physical property of the molecule, or its individual section, which seeks to avoid contact with water. The molecule itself in this case is called hydrophobic. Hydrophobic molecules are not polarized and are not able to form hydrogen bonds; therefore, water repels such molecules, preferring to form bonds within themselves, i.e. with hydrophilic molecules.
Согласно теории гидрофобного взаимодействия, между гидрофобными (т.е. не поляризованными молекулами или частицами вещества) возникает сильное притяжение в воде, которое обусловлено термодинамической невыгодностью контакта воды с этими веществами.According to the theory of hydrophobic interaction, between hydrophobic (i.e., non-polarized molecules or particles of a substance) strong attraction occurs in water, which is caused by the thermodynamic disadvantage of contact of water with these substances.
Вышеописанная структура гистона Н.1.3 подразумевает пространственную доступность гидрофобного домена этого белка для взаимодействия с гидрофобными молекулами, такими как паклитаксел, в то время как гидрофобный участок человеческого альбумина, рассматриваемого здесь как прототип, и используемого в качестве носителя для паклитаксела при создании композиции паклитаксела с альбумином, закрыт семнадцатью дисульфидными связями (Не ХМ, Carter DC. Atomic structure and chemistry of human serum albumin (Атомная структура и химия человеческого сывороточного альбумина). Nature, 358, 209-215, 1992) и не может участвовать во взаимодействии без предварительной подготовки (Dawei Ding, Xiaolei Tang, Xiaoli Cao, Jinhui Wu, Ahu Yuan, Qian Qiao, Jing Pan, and Yiqiao Hu. Novel Self-assembly Endows Human Serum Albumin Nanoparticles with an Enhanced Antitumor Efficacy (Инновационная самосборка наделяет наночастицы человеческого сывороточного альбумина повышенной противоопухолевой эффективностью). AAPS Pharm SciTech, 15, 213-222, 2014).The above-described histone structure H.1.3 implies the spatial availability of the hydrophobic domain of this protein for interaction with hydrophobic molecules such as paclitaxel, while the hydrophobic region of human albumin, considered here as a prototype, and used as a carrier for paclitaxel when creating a composition of paclitaxel with albumin , closed seventeen disulfide bonds (Not XM, Carter DC. Atomic structure and chemistry of human serum albumin (Atomic structure and chemistry of human serum albumin). Nature , 358, 209-215, 1992) and cannot participate in interaction without preliminary preparation (Dawei Ding, Xiaolei Tang, Xiaoli Cao, Jinhui Wu, Ahu Yuan, Qian Qiao, Jing Pan, and Yiqiao Hu. Novel Self-assembly Endows Human Serum Albumin Nanoparticles with an Enhanced Antitumor Efficacy (Innovative self-assembly gives nanoparticles of human serum albumin increased antitumor efficacy. AAPS Pharm SciTech, 15, 213-222, 2014).
Из анализа приведенного выше уровня техники заявителем сделан вывод о том, что протеин - гистон Н1.3 имеет особенность структурной организации, а именно -пространственную доступность гидрофобного домена для взаимодействия с гидрофобными молекулами, которая позволит ему самособираться в комплексы с гидрофобным паклитакселом без предварительной активации компонентов, и соответственно, без использования токсичных растворителей и дополнительного оборудования. В случае прототипа - альбумина метод самосборки возможен только при предварительной активации гидрофобного участка, закрытого семнадцатью дисульфидными связями.From an analysis of the above prior art, the applicant concluded that the protein histone H1.3 has a structural organization feature, namely, the spatial availability of the hydrophobic domain for interaction with hydrophobic molecules, which will allow it to self-assemble into complexes with hydrophobic paclitaxel without prior activation of the components , and accordingly, without the use of toxic solvents and additional equipment. In the case of the prototype albumin, the self-assembly method is possible only with the preliminary activation of the hydrophobic site, closed with seventeen disulfide bonds.
В данном случае, в соответствии с вышеуказанным определением «самосборка», заявителем сделано логическое умозаключение, в последующем подтвержденное экспериментально, что исходные компоненты: фармацевтический препарат - паклитаксел и носитель - человеческий гистон Н1.3 по технологии «снизу-вверх» будут собираться в более сложную структуру - композицию, представляющую собой комплекс молекул паклитаксела и гистона.In this case, in accordance with the above definition of "self-assembly", the applicant made a logical conclusion, subsequently confirmed experimentally that the initial components: a pharmaceutical preparation - paclitaxel and a carrier - human histone H1.3 according to the "bottom-up" technology will be collected in more complex structure - a composition representing a complex of paclitaxel and histone molecules.
При этом следует отметить, что технических решений, обладающих заявленной совокупностью отличительных признаков и обеспечивающих достижение заявленных технических результатов, а именно - направленных на получение композиции гистона Н1.3 и паклитаксела с размером частиц в интервале 100-400 нм методом самосборки без дополнительной активации компонентов, а также без использования токсичных компонентов и без применения дополнительного сложного дорогостоящего оборудования, заявителем из уровня техники на дату представления заявочных материалов не выявлено, что, по мнению заявителя, подтверждает новизну заявленного способа для получения заявленной композиции.It should be noted that technical solutions possessing the claimed combination of distinctive features and ensuring the achievement of the claimed technical results, namely, aimed at obtaining a histone H1.3 and paclitaxel composition with a particle size in the range of 100-400 nm by self-assembly without additional activation of the components, as well as without the use of toxic components and without the use of additional complex expensive equipment, the applicant from the prior art on the date of submission of application materials als have been identified, which, according to the applicant, confirms the novelty of the claimed method for obtaining the claimed composition.
При этом заявленный способ, по мнению заявителя, имеет изобретательский уровень, так как его использование для получения заявленной композиции не является очевидным из выявленного заявителем уровня техники, так как каждый конкретный случай самосборки требует отдельного теоретического обоснования и экспериментального подбора условий, то есть не следует явным образом из исследованного уровня техники.Moreover, the claimed method, according to the applicant, has an inventive step, since its use to obtain the claimed composition is not obvious from the prior art revealed by the applicant, since each specific case of self-assembly requires a separate theoretical justification and experimental selection of conditions, that is, it should not be explicit way from the investigated prior art.
Кроме того, заявленное техническое решение позволяет одновременно разрешить казалось бы неразрешимые на дату подачи заявки противоречия, а именно:In addition, the claimed technical solution allows to simultaneously resolve seemingly insoluble contradictions at the filing date of the application, namely:
- обеспечить получение фармацевтической композиции с новым носителем с высокой эффективностью в отношении опухолевых клеток;- to provide a pharmaceutical composition with a new carrier with high efficiency against tumor cells;
- получить фармацевтическую композицию без дополнительной активации компонентов при ее формировании;- to obtain a pharmaceutical composition without additional activation of the components during its formation;
- исключить использование токсичных компонентов на всех этапах формирования фармацевтической композиции;- exclude the use of toxic components at all stages of the formation of the pharmaceutical composition;
- исключить использование дополнительного сложного дорогостоящего оборудования.- eliminate the use of additional complex expensive equipment.
Задачей заявленного технического решения является устранение недостатков прототипа, а именно, формирование противоопухолевой композиции паклитаксела с носителем - гистоном Н1.3 с размером частиц в интервале 100-400 нм и способ ее (композиции) получения методом самосборки без дополнительной активации компонентов, а также без использования токсичных компонентов и дополнительного оборудования в процессе формирования.The objective of the claimed technical solution is to eliminate the disadvantages of the prototype, namely, the formation of an antitumor composition of paclitaxel with a carrier - histone H1.3 with a particle size in the range of 100-400 nm and its method (composition) obtained by self-assembly without additional activation of the components, as well as without using toxic components and additional equipment in the process of formation.
В заявленном техническом решении гистон, являясь белком-носителем, служит альтернативой известным носителям Кремофору и альбумину, который при этом позволяет избежать использования токсичных компонентов при формировании композиции паклитаксела.In the claimed technical solution, histone, as a carrier protein, serves as an alternative to the known carriers Cremophor and albumin, which avoids the use of toxic components in the formation of paclitaxel composition.
Заявленное техническое решение представляет собой достаточно простой и, как следствие этого, доступный способ получения противоопухолевой композиции паклитаксела без дополнительной активации компонентов, а также без использования токсичных компонентов и дополнительного оборудования по сравнению с прототипом.The claimed technical solution is a fairly simple and, as a result, affordable way to obtain an antitumor composition of paclitaxel without additional activation of the components, as well as without the use of toxic components and additional equipment compared to the prototype.
Техническим результатом заявленного технического решения является фармацевтическая противоопухолевая композиция паклитаксела с белком-носителем гистоном Н1.3, с размером частиц в интервале 100-400 нм, не содержащая токсичных компонентов на всех этапах ее формирования, а также способ ее получения методом самосборки без дополнительной активации компонентов и без использования дополнительного сложного дорогостоящего оборудования.The technical result of the claimed technical solution is a pharmaceutical antitumor composition of paclitaxel with a carrier protein histone H1.3, with a particle size in the range of 100-400 nm, not containing toxic components at all stages of its formation, as well as a method for its preparation by self-assembly without additional activation of the components and without the use of additional complex expensive equipment.
Сущностью заявленного технического решения является фармацевтическая противоопухолевая композиция, состоящая из паклитаксела и белка-носителя с размером частиц в интервале 100-400 нм, характеризующаяся тем, что в качестве белка-носителя использован рекомбинантный человеческий гистон Н1.3 при массовом соотношении гистон H1.3 : паклитаксел = 25:1, обладающая противоопухолевой активностью по отношению к опухолевым клеткам меланомы M14, рака простаты РС3, колоректальной карциномы СаСо2, способ получения композиции по п. 1, заключающийся в том, что паклитаксел и гистон Н1.3 подвергают самосборке в следующей последовательности - берут водный раствор гистона Н1.3 с концентрацией 1 мг/мл, добавляют в него раствор паклитаксела в безводном этиловом спирте с концентрацией 10 мг/мл в массовом соотношении гистон Н1.3 : паклитаксел = 25:1, перемешивают и инкубируют в термошейкере в течение 10-60 минут при 23-28°С и скорости вращения не менее 700 об/мин.The essence of the claimed technical solution is a pharmaceutical antitumor composition consisting of paclitaxel and a carrier protein with a particle size in the range of 100-400 nm, characterized in that the recombinant human histone H1.3 is used as the carrier protein in a mass ratio of histone H1.3: paclitaxel = 25: 1, which has antitumor activity against tumor cells of M14 melanoma, PC3 prostate cancer, CaCo2 colorectal carcinoma, a method for producing a composition according to
Поставленная задача и заявленный технический результат достигаются путем формирования композиции паклитаксела с гистоном Н1.3 в качестве белка-носителя методом самосборки.The task and the claimed technical result are achieved by forming a composition of paclitaxel with histone H1.3 as a carrier protein by self-assembly.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1, Фиг. 2.The claimed technical solution is illustrated in FIG. 1, FIG. 2.
На Фиг. 1 приведена Таблица 1, в которой представлены данные о размере и заряде (дзета-потенциале) частиц композиции паклитаксела с гистоном, полученные методом динамического светорассеивания и методом измерения электрофоретической подвижности частиц с использованием эффекта Доплера, соответственно.In FIG. Table 1 is shown in Table 1, which presents data on the size and charge (zeta potential) of particles of a paclitaxel-histone composition obtained by dynamic light scattering and by measuring the electrophoretic mobility of particles using the Doppler effect, respectively.
На Фиг. 2 приведена Таблица 2, в которой представлены данные о цитотоксичности комплексов паклитаксела с гистоном (IC50), полученные с использованием МТТ-теста.In FIG. Table 2, which presents data on the cytotoxicity of paclitaxel complexes with histone (IC 50 ), obtained using the MTT test.
Заявленную композицию с применением белка гистона Н1.3 в качестве носителя для паклитаксела получают в следующей последовательности, приведенной ниже сначала в целом а затем более детально в описании конкретного осуществления:The claimed composition using histone H1.3 protein as a carrier for paclitaxel is obtained in the following sequence, first as a whole and then in more detail in the description of a specific implementation, as follows:
- Первая стадия - приготовление исходных растворов гистона Н1.3 и паклитаксела, соответственно.- The first stage is the preparation of stock solutions of histone H1.3 and paclitaxel, respectively.
- Вторая стадия - формирование самособирающихся комплексов гистона Н1.3 с паклитакселом.- The second stage is the formation of self-assembling complexes of histone H1.3 with paclitaxel.
У полученных на второй стадии комплексов (частиц) паклитаксел/гистон Н1.3 определяют размер и заряд в сравнении с размером и зарядом растворов паклитаксела и гистона для подтверждения формирования композиции.The paclitaxel / histone H1.3 complexes (particles) obtained in the second stage determine the size and charge in comparison with the size and charge of paclitaxel and histone solutions to confirm the formation of the composition.
Полученные на второй стадии комплексы (частицы) изучают на цитотоксичность, используя линии опухолевых клеток.The complexes (particles) obtained in the second stage are studied for cytotoxicity using tumor cell lines.
Ниже приведено описание конкретного осуществления заявленного технического решения. The following is a description of the specific implementation of the claimed technical solution.
Первая стадия:First stage:
Пример 1. Приготовление раствора гистона Н1.3.Example 1. Preparation of a solution of histone H1.3.
Берут навеску 1 мг сухого очищенного препарата гистона H1.3 (ONCOHIST, фирма-производитель - ИБХ РАН, Россия) и растворяют в 1 мл дистиллированной воды при комнатной температуре в микропробирке типа эппендорф.A 1 mg sample of dry purified histone H1.3 preparation was taken (ONCOHIST, manufacturer, IBCh RAS, Russia) and dissolved in 1 ml of distilled water at room temperature in an eppendorf type microtube.
В результате выполнения указанных операций получают водный раствор гистона Н1.3 с концентрацией 1 мг/мл.As a result of these operations, an aqueous solution of histone H1.3 is obtained with a concentration of 1 mg / ml.
Пример 2. Приготовление раствора паклитаксела.Example 2. Preparation of a solution of paclitaxel.
Берут навеску 1 мг сухого чистого препарата паклитаксела (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) и растворяют в 100 мкл безводного этилового спирта при комнатной температуре в микропробирке типа эппендорф.A 1 mg sample of dry pure paclitaxel was taken (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) and dissolved in 100 μl of anhydrous ethyl alcohol at room temperature in an eppendorf type microtube.
В результате выполнения указанных операций получают спиртовый раствор паклитаксела с концентрацией 10 мг/мл.As a result of these operations, an alcohol solution of paclitaxel with a concentration of 10 mg / ml is obtained.
Вторая стадия:Second stage:
Пример 3. Формирование самособирающихся комплексов (частиц) гистона Н1.3 с паклитакселом.Example 3. The formation of self-assembling complexes (particles) of histone H1.3 with paclitaxel.
Берут 1 мл раствора гистона Н1.3, приготовленного по Примеру 1, добавляют в него 4 мкл раствора паклитаксела, приготовленного по Примеру 2, таким образом, что массовое соотношение гистон Н1.3 : паклитаксел становится равным 25:1, быстро и интенсивно перемешивают и инкубируют в термошейкере (Biosan) в течение 10-60 минут при температуре плюс 23-28°С и скорости вращения не менее 700 об/мин.Take 1 ml of a solution of histone H1.3 prepared according to Example 1, add 4 μl of a solution of paclitaxel prepared according to Example 2, so that the mass ratio of histone H1.3: paclitaxel becomes 25: 1, mix rapidly and intensively, and incubated in a thermal shaker (Biosan) for 10-60 minutes at a temperature of plus 23-28 ° C and a rotation speed of at least 700 rpm.
В результате выполнения указанных операций получают целевой продукт - заявленную фармацевтическую композицию, состоящую из рекомбинантного человеческого гистона Н1.3 и паклитаксела при массовом соотношении гистон Н1.3 : паклитаксел = 25:1.As a result of these operations, the target product is obtained - the claimed pharmaceutical composition consisting of recombinant human histone H1.3 and paclitaxel with a mass ratio of histone H1.3: paclitaxel = 25: 1.
В отношении приведенного в Примере 3 режима получения заявленной композиции следует пояснить, что:In relation to the Example 3 regimen for preparing the claimed composition, it should be clarified that:
- время 10-60 минут является оптимальным, поскольку заявителем экспериментально установлено, что времени менее 10 минут недостаточно для формирования композиции, а более 60 минут процесс вести нецелесообразно, так как композиция полностью формируется в течение указанного времени;- the time of 10-60 minutes is optimal, since the applicant experimentally established that less than 10 minutes is not enough time to form the composition, and more than 60 minutes the process is impractical, since the composition is fully formed within the specified time;
- температура 23-28°С является оптимальной, так как заявителем экспериментально установлено, что ниже 23°С процесс замедляется, а выше 28°С могут начаться деструктивные процессы;- the temperature of 23-28 ° C is optimal, since the applicant experimentally established that below 23 ° C the process slows down, and above 28 ° C destructive processes can begin;
- заявителем экспериментально установлено, что скорость вращения платформы термошейкера должна быть не менее 700 об/мин, поскольку меньшая скорость недостаточна для формирования композиции.- the applicant experimentally established that the rotation speed of the thermal shaker platform should be at least 700 rpm, since a lower speed is insufficient to form the composition.
Пример 4. Определение размера и заряда (дзета-потенциала) комплексов паклитаксел/гистон Н1.3 с целью доказательства формирования целевого продукта - заявленной композиции с заявленными потребительскими качествами.Example 4. Determination of the size and charge (zeta potential) of paclitaxel / histone H1.3 complexes in order to prove the formation of the target product - the claimed composition with the claimed consumer qualities.
Размер и заряд частиц композиции паклитаксела и гистона Н1.3 позволяет зафиксировать формирование частиц из исходных компонентов: паклитаксела и гистона по изменению их размера и заряда.The size and charge of the particles of the composition of paclitaxel and histone H1.3 allows you to record the formation of particles from the starting components: paclitaxel and histone by changing their size and charge.
Размер частиц комплексов определяют методом динамического рассеивания света на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) при 25°C.The particle size of the complexes is determined by dynamic light scattering on a Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, UK) at 25 ° C.
Заряд (дзета-потенциал) комплексов определяют, измеряя электростатический потенциал на границе раздела фаз между частицами и жидкостью методом определения электрофоретической подвижности частиц с использованием эффекта Доплера на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) при 25°C.The charge (zeta potential) of the complexes is determined by measuring the electrostatic potential at the interface between particles and a liquid by the method of determining the electrophoretic mobility of particles using the Doppler effect on a Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, UK) at 25 ° C.
Автоматическую обработку полученных данных проводят с использованием программного обеспечения Malvern Zetasizer, v. 2.2 (Malvern Instruments, Великобритания). Каждое измерение выполняют трижды, и вычисляют среднее значение.Automatic processing of the obtained data is carried out using the software Malvern Zetasizer, v. 2.2 (Malvern Instruments, UK). Each measurement is performed three times, and the average value is calculated.
Результаты измерения размера частиц и дзета-потенциала приведены на Фиг. 1 в Таблице 1. Таблица состоит из трех столбцов:The results of measuring the particle size and zeta potential are shown in FIG. 1 in Table 1. The table consists of three columns:
- в первом столбце приведены исследованные препараты - раствор гистона Н1.3, приготовленный по Примеру 1, раствор паклитаксела, приготовленный по Примеру 2, и комплекс композиции паклитаксела с гистоном, приготовленный по Примеру 3.- in the first column shows the investigated drugs - a solution of histone H1.3 prepared according to Example 1, a solution of paclitaxel prepared according to Example 2, and a complex composition paclitaxel with a histone prepared according to Example 3.
- во втором столбце приведены размеры частиц (диаметр, d) исследуемых препаратов в нм;- the second column shows the particle sizes (diameter, d) of the studied drugs in nm;
- в третьем столбце приведен заряд (дзета-потенциал) исследуемых препаратов в мВ.- the third column shows the charge (zeta potential) of the studied drugs in mV.
Из представленных в Таблице 1 (Фиг. 1) экспериментальных данных видно, что значения размера частиц носителя - гистона Н1.3 и фармацевтического препарата паклитаксела изменяются в процессе формирования их комплекса: от 3,5 и 7,1 нм соответственно до 223 нм.From the experimental data presented in Table 1 (Fig. 1), it can be seen that the particle sizes of the carrier — histone H1.3 and the pharmaceutical preparation paclitaxel — change during the formation of their complex: from 3.5 and 7.1 nm, respectively, to 223 nm.
Данные свидетельствуют также, что значения заряда (дзета-потенциала) частиц носителя - гистона Н1.3 и фармацевтического препарата паклитаксела также изменяются в процессе формирования их комплекса: от 11,9 и 0,29 мВ соответственно до 19,2 мВ.The data also indicate that the charge (zeta potential) of the particles of the carrier, histone H1.3 and the pharmaceutical preparation paclitaxel, also change during the formation of their complex: from 11.9 and 0.29 mV, respectively, to 19.2 mV.
Таким образом, на основе анализа полученных данных, приведенных в Таблице 1, можно сделать вывод, что комплексы композиции паклитаксела и гистона Н1.3, полученные по Примеру 3, действительно формируются при указанных условиях.Thus, based on the analysis of the data obtained, shown in Table 1, we can conclude that the complexes of the composition of paclitaxel and histone H1.3, obtained according to Example 3, are indeed formed under the indicated conditions.
При этом размер частиц полученной композиции составляет 223±29 нм, что является приемлемым при использовании в противоопухолевой терапии согласно описанной ранее теории об эффекте усиления проницаемости и удерживания, гласящей, что размер частиц должен находиться в интервале 100-400 нм. Размер полученных частиц сопоставим по этому показателю с прототипом и соответствует заявленному техническому результату.Moreover, the particle size of the obtained composition is 223 ± 29 nm, which is acceptable when used in antitumor therapy according to the previously described theory about the effect of enhancing permeability and retention, which states that the particle size should be in the range of 100-400 nm. The size of the obtained particles is comparable in this indicator with the prototype and corresponds to the claimed technical result.
Пример 5. Исследование цитотоксичности комплексов паклитаксела с гистоном H1.3 (IC50) с помощью МТТ-теста.Example 5. The study of the cytotoxicity of complexes of paclitaxel with histone H1.3 (IC 50 ) using the MTT test.
Как было описано ранее, из уровня техники заявителем выявлено, что рекомбинантный гистон Н1.3, использованный в данном техническом решении в качестве носителя, показал свою безопасность в клинических исследованиях и эффективность при лечении острого миелолейкоза.As described previously, from the prior art, the applicant revealed that the recombinant histone H1.3, used as a carrier in this technical solution, has shown its safety in clinical trials and its effectiveness in the treatment of acute myelogenous leukemia.
Механизм действия гистона Н1.3 на опухолевые клетки основан на его способности образовывать агрегаты с фосфолипидами, которые в опухолевых клетках смещены на внешнюю сторону мембраны, что приводит к серьезным перестройкам в клеточной мембране, образованию пор, и в конечном итоге к программируемой гибели клетки (апоптозу).The mechanism of action of histone H1.3 on tumor cells is based on its ability to form aggregates with phospholipids, which are displaced in the tumor cells on the outer side of the membrane, which leads to serious rearrangements in the cell membrane, pore formation, and ultimately to programmed cell death (apoptosis )
В заявленном техническом решении комплексы (частицы) паклитаксела и гистона Н1.3 исследованы на цитотоксичность с помощью МТТ-теста. Тест на цитотоксичность -один из методов, используемых в лабораторной практике доклинических испытаний фармацевтических субстанций по стандартам GLP (англ. Good Laboratory Practice - Надлежащая лабораторная практика). Национальным аналогом GLP в РФ является стандарт ГОСТ 33044-2014.In the claimed technical solution, the complexes (particles) of paclitaxel and histone H1.3 were tested for cytotoxicity using the MTT test. The test for cytotoxicity is one of the methods used in laboratory practice for preclinical testing of pharmaceutical substances according to GLP standards (English Good Laboratory Practice - Good laboratory practice). The national equivalent of GLP in the Russian Federation is GOST 33044-2014.
Цитотоксичность заявленного комплекса исследована заявителем на трех линиях клеток злокачественных новообразований:The cytotoxicity of the claimed complex was investigated by the applicant on three cell lines of malignant neoplasms:
- M14 (меланома),- M14 (melanoma),
- РС3 (рак простаты)- PC3 (prostate cancer)
- СаСо2 (колоректальная карцинома)- CaCO2 (colorectal carcinoma)
Для сравнения заявителем исследована цитотоксичность промышленного паклитаксела с носителями в виде смеси этилового спирта и Кремофора (Bristol-Myers Squibb).For comparison, the applicant investigated the cytotoxicity of industrial paclitaxel with carriers in the form of a mixture of ethyl alcohol and Cremophor (Bristol-Myers Squibb).
Реактив МТТ представляет собой тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид. Метод основан на том, что дегидрогеназы митохондрий только метаболически активных клеток восстанавливают МТТ в пурпурно-окрашенные кристаллы формазана. Эксперименты проводят, используя культуры клеток M14 (меланома), РС3 (рак простаты), СаСо2 (колоректальная карцинома), полученные из American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA). Культивируют клетки, используя среду α-МЕМ (Панэко, Россия) с добавлением 10% FBS (Gibco, USA), 2мМ L-глутамина, 10 е.б.а./мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина (Панэко). Культивирование клеток производят во влажной атмосфере (5% СО2, 37°С).MTT reagent is a 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide tetrazolium dye. The method is based on the fact that mitochondrial dehydrogenases of only metabolically active cells restore MTT to purple-colored formazan crystals. The experiments were carried out using cell cultures M14 (melanoma), PC3 (prostate cancer), CaCO2 (colorectal carcinoma) obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA). Cells are cultured using α-MEM medium (Paneko, Russia) with the addition of 10% FBS (Gibco, USA), 2 mM L-glutamine, 10 e.b.a./ ml of penicillin and 10 μg / ml streptomycin (Paneko). The cells are cultured in a humid atmosphere (5% CO 2 , 37 ° C).
Для определения цитотоксической активности исследуемых препаратов клетки пассируют (100 мкл/лунку) в 96-ти луночные планшеты с плотностью 2000 клеток/лунку. В лунки помещают по 15 мкл растворов исследуемых препаратов, последовательно увеличивая их концентрацию. Лунки, не содержащие исследуемых препаратов, служат негативным контролем. Инкубацию проводят 72 часа. Для проведения МТТ-теста к культивируемым клеткам добавляют раствор МТТ (Панэко) в концентрации 500 мкг/мл. Затем клетки культивируют еще 3 часа при 37°С. Полученные кристаллы формазана растворяют в 0,1 мл DMSO (ДМСО, диметилсульфоксида) при встряхивании в течение 10 мин. Далее измеряют оптическую плотность полученных окрашенных растворов на мультискане Tecan Infinite М200 PRO (Tecan Trading AG, Switzerland) при длине волны 555 нм. Все эксперименты проводят трижды, и средняя величина относительного ингибирования роста клеток высчитывается по формуле:To determine the cytotoxic activity of the studied drugs, the cells are passaged (100 μl / well) in 96-well plates with a density of 2000 cells / well. 15 μl of the solutions of the studied drugs are placed in the wells, successively increasing their concentration. Wells that do not contain the studied drugs serve as a negative control. Incubation is carried out 72 hours. For the MTT test, a solution of MTT (Paneko) at a concentration of 500 μg / ml is added to the cultured cells. Then the cells are cultured for another 3 hours at 37 ° C. The resulting crystals of formazan were dissolved in 0.1 ml of DMSO (DMSO, dimethyl sulfoxide) with shaking for 10 minutes. Next, the optical density of the obtained colored solutions is measured on a Tecan Infinite M200 PRO multiscan (Tecan Trading AG, Switzerland) at a wavelength of 555 nm. All experiments are carried out three times, and the average value of the relative inhibition of cell growth is calculated by the formula:
D=(1-(A-B)/(C-B))×100, где:D = (1- (A-B) / (C-B)) × 100, where:
А - интенсивность поглощения тестируемых субстанций в заданной концентрации;A is the absorption intensity of the tested substances in a given concentration;
В - интенсивность поглощения в лунках, не содержащих клеток;B is the intensity of absorption in wells that do not contain cells;
С - оптическая плотность клеток в отсутствие тестируемых препаратов;C is the optical density of cells in the absence of tested drugs;
D - относительное ингибирование, %.D - relative inhibition,%.
Используя зависимость доза/эффект, определяют концентрацию полумаксимального ингибирования, IC50 (нМ), которая указывает на концентрацию фармацевтического препарата, при которой выживает 50% клеток.Using the dose / effect relationship, the half-maximal inhibition concentration, IC 50 (nM), is determined, which indicates the concentration of the pharmaceutical preparation at which 50% of the cells survive.
Таким образом, чем меньше концентрация фармацевтического препарата, при которой выживает 50% клеток (IC50), и, соответственно, 50% клеток гибнет, тем сильнее его токсичное действие, т.е. выше цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам.Thus, the lower the concentration of the pharmaceutical preparation at which 50% of the cells survive (IC 50 ) and, accordingly, 50% of the cells die, the stronger its toxic effect, i.e. higher cytotoxicity towards tumor cells.
Результаты приведены в Таблице 2 на Фиг. 2:The results are shown in Table 2 in FIG. 2:
- в первом столбце приведен перечень исследованных препаратов - комплексы (частицы) паклитаксела и гистона Н1.3, приготовленные по Примеру 3, и промышленный паклитаксел с носителями в виде смеси этилового спирта и кремофора (Bristol-Myers Squibb), взятый для сравнения.- the first column contains a list of the studied drugs - complexes (particles) of paclitaxel and histone H1.3, prepared according to Example 3, and industrial paclitaxel with carriers in the form of a mixture of ethyl alcohol and cremophor (Bristol-Myers Squibb), taken for comparison.
- во втором столбце приведены данные о цитотоксичности препаратов (IC50) в отношении опухолевых клеток М14 (меланома);- the second column shows the cytotoxicity of the drugs (IC 50 ) in relation to tumor cells M14 (melanoma);
- в третьем столбце приведены данные о цитотоксичности препаратов (IC50) в отношении опухолевых клеток РС3 (рак простаты);- the third column shows the cytotoxicity of the drugs (IC 50 ) in relation to tumor cells of PC3 (prostate cancer);
- в четвертом столбце приведены данные о цитотоксичности препаратов (IC50) в отношении опухолевых клеток СаСо2 (колоректальная карцинома)- the fourth column contains data on the cytotoxicity of the preparations (IC 50 ) in relation to CaCo2 tumor cells (colorectal carcinoma)
Из представленных в Таблице 2 (Фиг. 2) экспериментальных данных следует, что значения IC50 (концентрации, при которой выживает 50% клеток) частиц композиции паклитаксела с гистоном сопоставимы со значениями промышленного паклитаксела (Bristol-Myers Squibb) в отношении опухолевых клеток M14 и РС3, и значительно различаются в отношении опухолевых клеток СаСо2 (колоректальная карцинома) - 3,22 и 18,12 нМ, соответственно.From the experimental data presented in Table 2 (Fig. 2), it follows that the IC 50 values (concentration at which 50% of the cells survive) of the particles of the paclitaxel composition with histone are comparable with the values of industrial paclitaxel (Bristol-Myers Squibb) in relation to tumor cells M14 and PC3, and significantly differ in relation to tumor cells CaCO2 (colorectal carcinoma) - 3.22 and 18.12 nM, respectively.
Эти данные означают сопоставимость цитотоксичности частиц композиции паклитаксела с гистоном со значениями промышленного паклитаксела (Bristol-Myers Squibb) в отношении опухолевых клеток М14 и РС3 и усиление цитотоксичности частиц композиции паклитаксела с гистоном в отношении опухолевых клеток СаСо2 в 5,6 раза (18,12/3,22=5,6), что является доказательством высокой эффективности использования заявленной композиции по назначению.These data mean that cytotoxicity of particles of the paclitaxel composition with histone is comparable with the values of industrial paclitaxel (Bristol-Myers Squibb) for tumor cells M14 and PC3 and an increase in cytotoxicity of particles of the composition of paclitaxel with histone against tumor cells CaCo2 by 5.6 times (18.12 / 3.22 = 5.6), which is evidence of the high efficiency of the use of the claimed composition for its intended purpose.
Из вышеизложенного можно сделать вывод, что в результате проведенных экспериментов заявителем сформирована композиция паклитаксела с гистоном Н1.3 в качестве носителя, полученная методом самосборки паклитаксела с гистоном Н1.3 без предварительной активации компонентов, с размером частиц 223±29 нм, что является приемлемым при использовании в противоопухолевой терапии согласно известной теории об эффекте усиления проницаемости и удерживания, гласящей, что размер частиц должен находиться в интервале 100-400 нм.From the foregoing, we can conclude that as a result of the experiments the applicant formed a composition of paclitaxel with histone H1.3 as a carrier, obtained by self-assembly of paclitaxel with histone H1.3 without preliminary activation of the components, with a particle size of 223 ± 29 nm, which is acceptable for use in antitumor therapy according to the well-known theory of the effect of enhancing permeability and retention, which states that the particle size should be in the range of 100-400 nm.
Формирование комплексов подтверждено методом динамического рассеивания света и измерением электростатического потенциала частиц композиции.The formation of the complexes is confirmed by dynamic light scattering and by measuring the electrostatic potential of the particles of the composition.
Метод оценки цитотоксичности (МТТ-тест) выявил сопоставимость цитотоксичности комплексов паклитаксела с гистоном в сравнении с промышленным паклитакселом (Bristol-Myers Squibb) в отношении опухолевых клеток меланомы М14 и рака простаты РС3 и значительное усиление цитотоксичности в отношении клеток колоректальной карциномы СаСо2 - в 5,6 раза. Полученные данные указывают на возможность применения заявленного изобретения в медицине.The cytotoxicity assessment method (MTT test) revealed a comparison of the cytotoxicity of paclitaxel complexes with histone in comparison with industrial paclitaxel (Bristol-Myers Squibb) for tumor cells of M14 melanoma and prostate cancer PC3 and a significant increase in cytotoxicity for CaCo2 colorectal carcinoma cells - 5, 6 times. The data obtained indicate the possibility of using the claimed invention in medicine.
Заявленное техническое решение также может быть использовано для разработки лекарственных препаратов посредством стандартных технических устройств и оборудования.The claimed technical solution can also be used to develop drugs through standard technical devices and equipment.
Таким образом, заявителем решена поставленная задача и достигнут заявленный технический результат, а именно - сформирована композиция паклитаксела с белком-носителем гистоном Н1.3 с размером частиц 223±29 нм (то есть в интервале 100-400 нм), не содержащая токсичных компонентов на всех этапах ее формирования, которая получена методом самосборки без дополнительной активации компонентов и без использования дополнительного сложного дорогостоящего оборудования.Thus, the applicant has solved the problem and achieved the claimed technical result, namely, the composition of paclitaxel with a carrier protein histone H1.3 with a particle size of 223 ± 29 nm (i.e. in the range of 100-400 nm), which does not contain toxic components on all stages of its formation, which is obtained by self-assembly without additional activation of the components and without the use of additional complex expensive equipment.
В результате реализации заявленного технического решения представляется возможным сделать общий вывод, что заявителем одновременно решены ряд задач:As a result of the implementation of the claimed technical solution, it seems possible to draw a general conclusion that the applicant has simultaneously solved a number of problems:
- получена новая фармацевтическая композиция паклитаксела с новым носителем;- received a new pharmaceutical composition of paclitaxel with a new carrier;
- показано усиление токсического воздействия заявленной фармацевтической композиции в отношении опухолевых клеток колоректальной карциномы СаСо2 в 5,6 раза по сравнению с промышленным паклитакселом (Bristol-Myers Squibb) при сопоставимом токсическом воздействии в отношении опухолевых клеток меланомы М14 и рака простаты РС3. Это указывает на возможность потенциального применения заявленной композиции для разработки и производства лекарственной композиции, наиболее эффективной против колоректальной карциномы и с сопоставимой с промышленным паклитакселом (Bristol-Myers Squibb) эффективностью против меланомы и рака простаты;- shows an increase in the toxic effect of the claimed pharmaceutical composition against tumor cells of CaCo2 colorectal carcinoma by 5.6 times compared with industrial paclitaxel (Bristol-Myers Squibb) with a comparable toxic effect on tumor cells of M14 melanoma and PC3 prostate cancer. This indicates the potential use of the claimed composition for the development and production of a medicinal composition that is most effective against colorectal carcinoma and comparable to industrial paclitaxel (Bristol-Myers Squibb) against melanoma and prostate cancer;
- разработан способ получения фармацевтической композиции без дополнительной активации компонентов;- developed a method of obtaining a pharmaceutical composition without additional activation of the components;
- исключено использование токсичных компонентов на всех этапах формирования фармацевтической композиции;- the use of toxic components at all stages of the formation of the pharmaceutical composition is excluded;
- исключено использование дополнительного сложного дорогостоящего оборудования.- excluded the use of additional complex expensive equipment.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.The claimed technical solution meets the criterion of "novelty", presented to the invention, since the investigated prior art has not identified technical solutions that have the claimed combination of distinctive features that achieve the stated results.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как заявителем получена принципиально новая композиция с неизвестным до даты представления заявки составом, один из компонентов которого - гистон Н1.3 - является новым носителем для гидрофобного фармацевтического препарата - паклитаксела, позволяющим самособираться с ним в композицию, что обеспечило значительное превосходство по сравнению с возможностями прототипа. При этом частицы полученной композиции обладают приемлемым для применения в противоопухолевой терапии размером, сопоставимым по этому показателю с прототипом. Кроме этого, носитель гистон Н1.3 обладает самостоятельным противоопухолевым действием, что в комплексе с паклитакселом приводит к превышающему техническому результату в отношении противоопухолевой активности заявленной композиции по сравнению с прототипом.The claimed technical solution meets the criterion of "inventive step" for inventions, since the applicant received a fundamentally new composition with an unknown composition prior to the filing date of the application, one of the components of which is histone H1.3, is a new carrier for a hydrophobic pharmaceutical preparation - paclitaxel, which allows self-assemble with him in the composition, which provided significant superiority compared to the capabilities of the prototype. In this case, the particles of the obtained composition have an acceptable size for use in antitumor therapy, comparable in this indicator with the prototype. In addition, the carrier of histone H1.3 has an independent antitumor effect, which, when combined with paclitaxel, leads to an superior technical result with respect to the antitumor activity of the claimed composition compared to the prototype.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных отечественных материалов и технологий.The claimed technical solution meets the criterion of "industrial applicability" to the invention, as it can be implemented at any specialized enterprise using standard equipment, well-known domestic materials and technologies.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136637A RU2669937C1 (en) | 2017-10-17 | 2017-10-17 | Pharmaceutical antitumoral composition of paclitaxel with histone n1.3 as a carrier and a method for preparing the composition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136637A RU2669937C1 (en) | 2017-10-17 | 2017-10-17 | Pharmaceutical antitumoral composition of paclitaxel with histone n1.3 as a carrier and a method for preparing the composition |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2669937C1 true RU2669937C1 (en) | 2018-10-17 |
Family
ID=63862339
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017136637A RU2669937C1 (en) | 2017-10-17 | 2017-10-17 | Pharmaceutical antitumoral composition of paclitaxel with histone n1.3 as a carrier and a method for preparing the composition |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2669937C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2498997C2 (en) * | 2007-04-05 | 2013-11-20 | Зюмбиотек Гезелльшафт Цур Форшунг Унд Энтвиклунг Ауф Дем Гебит Дер Биотехнологи Мбх | VNS-Met-HISTONES |
| EA023175B1 (en) * | 2007-09-28 | 2016-05-31 | Бинд Терапьютикс, Инк. | Cancer cell targeting using nanoparticles |
-
2017
- 2017-10-17 RU RU2017136637A patent/RU2669937C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2498997C2 (en) * | 2007-04-05 | 2013-11-20 | Зюмбиотек Гезелльшафт Цур Форшунг Унд Энтвиклунг Ауф Дем Гебит Дер Биотехнологи Мбх | VNS-Met-HISTONES |
| EA023175B1 (en) * | 2007-09-28 | 2016-05-31 | Бинд Терапьютикс, Инк. | Cancer cell targeting using nanoparticles |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DESAI N. et al. Increased antitumor activity, intratumor paclitaxel concentrations, and endothelial cell transportof cremophor-free, albumin-bound paclitaxel, ABI-007, compared with cremophor-basedpaclitaxel. Clin Cancer Res. 2006 Feb 15; 12(4): 1317-24. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alotaibi et al. | Potential of nanocarrier-based drug delivery systems for brain targeting: A current review of literature | |
| Abdellatif et al. | Approved and marketed nanoparticles for disease targeting and applications in COVID-19 | |
| AbouAitah et al. | Folic acid–conjugated mesoporous silica particles as nanocarriers of natural prodrugs for cancer targeting and antioxidant action | |
| Tartis et al. | Therapeutic effects of paclitaxel-containing ultrasound contrast agents | |
| Chen et al. | pH-responsive chimaeric pepsomes based on asymmetric poly (ethylene glycol)-b-poly (l-leucine)-b-poly (l-glutamic acid) triblock copolymer for efficient loading and active intracellular delivery of doxorubicin hydrochloride | |
| Kayani et al. | Doughnut-shaped bovine serum albumin nanoparticles loaded with doxorubicin for overcoming multidrug-resistant in cancer cells | |
| Kastantin et al. | Thermodynamic and kinetic stability of DSPE-PEG (2000) micelles in the presence of bovine serum albumin | |
| Hu et al. | Tumor microenvironment and angiogenic blood vessels dual-targeting for enhanced anti-glioma therapy | |
| Kanugo et al. | Recent advances of nanotechnology in the diagnosis and therapy of triple-negative breast cancer (TNBC) | |
| De | Decapeptide modified doxorubicin loaded solid lipid nanoparticles as targeted drug delivery system against prostate cancer | |
| Baehr et al. | Transformable amyloid-beta mimetic peptide amphiphiles for lysosomal disruption in non-small cell lung cancer | |
| Abdel-Bar et al. | Hexosomes as efficient platforms for possible fluoxetine hydrochloride repurposing with improved cytotoxicity against HepG2 cells | |
| Soll et al. | Protein-coated corrole nanoparticles for the treatment of prostate cancer cells | |
| Zhang et al. | Denatured protein-coated docetaxel nanoparticles: Alterable drug state and cytosolic delivery | |
| Tang et al. | Sorafenib-loaded PLGA-TPGS nanosystems enhance hepatocellular carcinoma therapy through reversing P-glycoprotein-mediated multidrug resistance | |
| Kaplan et al. | Development of recombinant protein-based nanoparticle systems for inducing tumor cell apoptosis: In vitro evaluation of their cytotoxic and apoptotic effects on cancer cells | |
| Khonsari et al. | Brain targeted delivery of rapamycin using transferrin decorated nanostructured lipid carriers | |
| Mei et al. | Redox-responsive self-assembled peptide hydrogel for mitochondrial-targeted anticancer drug delivery | |
| Ajdari et al. | Characterization and Evaluation of Nano-niosomes Encapsulating Docetaxel against Human Breast, Pancreatic, and Pulmonary Adenocarcinoma Cancer Cell Lines | |
| Choi et al. | Drug‐loaded nanogel for efficient orchestration of cell death pathways by intramitochondrial disulfide polymerization | |
| Fu et al. | Tuneable redox-responsive albumin-hitchhiking drug delivery to tumours for cancer treatment | |
| Jourdain et al. | Investigating the functionalization of liposomes with NFL-TBS. 40-63 peptide as a promising drug delivery system | |
| RU2669937C1 (en) | Pharmaceutical antitumoral composition of paclitaxel with histone n1.3 as a carrier and a method for preparing the composition | |
| Nautiyal et al. | Nano-based therapeutic strategies in management of rheumatoid arthritis | |
| Zhang et al. | Deliver anti-inflammatory drug baicalein to macrophages by using a crystallization strategy |