RU2664472C1 - 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide salt as substrate for producing 2'-deoxynucleosides by method of enzyme transglycosylation - Google Patents
7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide salt as substrate for producing 2'-deoxynucleosides by method of enzyme transglycosylation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2664472C1 RU2664472C1 RU2017119092A RU2017119092A RU2664472C1 RU 2664472 C1 RU2664472 C1 RU 2664472C1 RU 2017119092 A RU2017119092 A RU 2017119092A RU 2017119092 A RU2017119092 A RU 2017119092A RU 2664472 C1 RU2664472 C1 RU 2664472C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methyl
- nucleosides
- deoxyguanosine
- base
- pnp
- Prior art date
Links
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 12
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 title claims description 7
- RTYPHGYQEUXYFZ-VWZUFWLJSA-O I.C[N+]1=CN([C@H]2C[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C=2N=C(NC(C12)=O)N Chemical compound I.C[N+]1=CN([C@H]2C[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C=2N=C(NC(C12)=O)N RTYPHGYQEUXYFZ-VWZUFWLJSA-O 0.000 title abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 21
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 15
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000013537 Thymidine Phosphorylase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract 2
- 125000000286 phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract 2
- OMQUVUUQUJTKDH-RRKCRQDMSA-O 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-methyl-3h-purin-9-ium-6-one Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C)C=[N+]1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OMQUVUUQUJTKDH-RRKCRQDMSA-O 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 abstract description 47
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 abstract description 36
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 22
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 102100036286 Purine nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010009099 nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 abstract description 7
- 101710132082 Pyrimidine/purine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 108700006317 Purine-nucleoside phosphorylases Proteins 0.000 abstract description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical class I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 abstract 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 abstract 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 32
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 20
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 11
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 10
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 description 10
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- -1 Nelarabin Chemical compound 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 9
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 8
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 6
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 6
- RHIULBJJKFDJPR-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CCC1=CNC(=O)NC1=O RHIULBJJKFDJPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethanol Chemical compound CCO.ClCCl FHHZOYXKOICLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XACKNLSZYYIACO-DJLDLDEBSA-N edoxudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XACKNLSZYYIACO-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 5
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 229960003636 vidarabine Drugs 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YXJDFQJKERBOBM-TXICZTDVSA-N alpha-D-ribose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O YXJDFQJKERBOBM-TXICZTDVSA-N 0.000 description 4
- AYJRCSIUFZENHW-UHFFFAOYSA-L barium carbonate Chemical compound [Ba+2].[O-]C([O-])=O AYJRCSIUFZENHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 4
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 102000006405 Uridine phosphorylase Human genes 0.000 description 3
- 108010019092 Uridine phosphorylase Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 3
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101100241454 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nuc-2 gene Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700023160 Thymidine phosphorylases Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 2
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 2
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 2
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 229940065658 vidaza Drugs 0.000 description 2
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 2
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- AVKSPBJBGGHUMW-XLPZGREQSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methyl-4-sulfanylidenepyrimidin-2-one Chemical compound O=C1NC(=S)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 AVKSPBJBGGHUMW-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBJGQJWNMZDFKL-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC(Cl)=NC2=C1NC=N2 HBJGQJWNMZDFKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- NWNKIJNFNJCAHN-UHFFFAOYSA-N 5-propan-2-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC(C)C1=CNC(=O)NC1=O NWNKIJNFNJCAHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZZXGPGVDJDFCJ-UHFFFAOYSA-N 6-phenylmethoxy-7h-purine Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1OCC1=CC=CC=C1 ZZZXGPGVDJDFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJNXUFOTKNTNPG-IOSLPCCCSA-O 7-methylinosine Chemical compound C1=2NC=NC(=O)C=2N(C)C=[N+]1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VJNXUFOTKNTNPG-IOSLPCCCSA-O 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNUALPPJLMYHDK-UHFFFAOYSA-N C[CH]C Chemical compound C[CH]C HNUALPPJLMYHDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 150000000734 D-arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical class OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002841 Lewis acid Substances 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 102000001853 Pyrimidine Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108030006145 Pyrimidine-nucleoside phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N Triiodomethane Natural products IC(I)I OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- AYJRCSIUFZENHW-DEQYMQKBSA-L barium(2+);oxomethanediolate Chemical compound [Ba+2].[O-][14C]([O-])=O AYJRCSIUFZENHW-DEQYMQKBSA-L 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N ethyl Chemical compound C[CH2] QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229960000961 floxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000007517 lewis acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N methyl Chemical compound [CH3] WCYWZMWISLQXQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002771 monosaccharide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области биотехнологии (применение ферментов для получения природных нуклеозидов и их аналогов) и фармацевтической химии (применение ферментов для получения лекарственных веществ на основе нуклеозидов).The invention relates to the field of biotechnology (the use of enzymes to produce natural nucleosides and their analogues) and pharmaceutical chemistry (the use of enzymes to obtain drugs based on nucleosides).
Анализ источников новых лекарств за период с 1981 по 2010 год показал, что только 36% новых биологически активных веществ были обнаружены без использования природных соединений в качестве родоначальных структур (М.Е. Maier. Design and synthesis of analogues of natural products. Org. Biomol. Chem. 13, 5302-5343, 2015).An analysis of the sources of new drugs for the period from 1981 to 2010 showed that only 36% of new biologically active substances were discovered without the use of natural compounds as the parent structures (M.E. Maier. Design and synthesis of analog of natural products. Org. Biomol Chem. 13, 5302-5343, 2015).
Структура природных нуклеозидов является одной из наиболее плодотворных в разработке новых лекарственных веществ. В настоящее время в клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности: противоопухолевой (Кладрибин, Флударабин, Пентостатин, Неларабин, Видаза, Децитабин и др.), противовирусной (гепатит С, герпес, ВИЧ и др. - Рибавирин, Видарабин, Зидовудин, Ламивудин и др) (W.B. Parker. Enzymology of Purine and Pyrimidine Antimetabolites Used in the Treatment of Cancer. Chem. Rev. 109, 2880-2893, 2009; E De Clercq, G. Li. Clinical Microbiology Reviews, Approved antiviral drugs over the past 50 years, 29, 695-747, 2016). Применение известных лекарственных препаратов в терапевтической практике и поиск новых биологически активных веществ в ряду аналогов природных нуклеозидов тесно связаны с разработкой новых методов синтеза нуклеозидов. В последние годы в развитых странах активно развивается так называемая "зеленая" химия, целью которой является замена традиционного химического синтеза различными каталитическими методами без использования токсичных органических растворителей. Альтернативой химическому синтезу является ферментативный синтез, который позволяет получать как природные нуклеозиды, так и лекарственные препараты нуклеозидной природы (кладрибин, 5-фтордезоксиуридин, флударабин, неларабин, видарабин и др.) и имеет промышленное значение. Для получения практически важных нуклеозидов активно разрабатываются и применяются технологии, основанные на ферментативных реакциях трансгликозилирования - переноса углеводного остатка с одного гетероциклического основания на другое. В настоящем изобретении предлагается новый способ получения ряда 2'-дезоксинуклеозидов из субстрата 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида, основанный на ферментативной реакции трансгликозилирования.The structure of natural nucleosides is one of the most fruitful in the development of new medicinal substances. Currently, in clinical practice, a number of modern drugs are used, created on the basis of modified nucleosides and having a wide range of biological activity: antitumor (Cladribine, Fludarabine, Pentostatin, Nelarabin, Vidaza, Decitabine, etc.), antiviral (hepatitis C, herpes, HIV and et al. - Ribavirin, Vidarabine, Zidovudine, Lamivudine, etc.) (WB Parker. Enzymology of Purine and Pyrimidine Antimetabolites Used in the Treatment of Cancer. Chem. Rev. 109, 2880-2893, 2009; E De Clercq, G. Li. Clinical Microbiology Reviews, Approved antiviral drugs over the past 50 years, 29, 695-747, 2016). The use of known drugs in therapeutic practice and the search for new biologically active substances in a number of analogues of natural nucleosides are closely related to the development of new methods for the synthesis of nucleosides. In recent years, the so-called "green" chemistry has been actively developing in developed countries, the purpose of which is to replace traditional chemical synthesis with various catalytic methods without the use of toxic organic solvents. An alternative to chemical synthesis is enzymatic synthesis, which allows one to obtain both natural nucleosides and nucleoside drugs (cladribine, 5-fluorodeoxyuridine, fludarabine, nonlarabin, vidarabine, etc.) and is of industrial importance. To obtain practically important nucleosides, technologies based on enzymatic transglycosylation reactions - transfer of a carbohydrate residue from one heterocyclic base to another are actively developed and applied. The present invention provides a new method for producing a series of 2'-deoxynucleosides from a substrate of 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide, based on an enzymatic transglycosylation reaction.
Уровень техникиState of the art
В настоящее время в клинической практике используется ряд современных препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности: противоопухолевой (Кладрибин, Флударабин, Пентостатин, Неларабин, Видаза, Децитабин и др.), противовирусной (гепатит С, герпес, ВИЧ и др.- Рибавирин, Видарабин, Зидовудин, Ламивудин и др) (W.B. Parker. Enzymology of Purine and Pyrimidine Antimetabolites Used in the Treatment of Cancer. Chem. Rev. 109, 2880-2893, 2009; E De Clercq, G. Li. Clinical Microbiology Reviews, Approved antiviral drugs over the past 50 years, 29, 695-747, 2016).Currently, in clinical practice, a number of modern drugs are used, created on the basis of modified nucleosides and having a wide range of biological activity: antitumor (Cladribine, Fludarabine, Pentostatin, Nelarabin, Vidaza, Decitabine, etc.), antiviral (hepatitis C, herpes, HIV and Dr. Ribavirin, Vidarabine, Zidovudine, Lamivudine, etc.) (WB Parker. Enzymology of Purine and Pyrimidine Antimetabolites Used in the Treatment of Cancer. Chem. Rev. 109, 2880-2893, 2009; E De Clercq, G. Li. Clinical Microbiology Reviews, Approved antiviral drugs over the past 50 years, 29, 695-747, 2016).
Существуют два основных метода получения аналогов нуклеозидов. Первый метод основан на модификации природных соединений (M.S. Drenichev, V.E. Oslovsky, S.N. Mikhailov. Cytokinin Nucleosides - Natural compounds with a unique spectrum of biological activities. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16, 2562-2576, 2016).There are two main methods for producing nucleoside analogues. The first method is based on the modification of natural compounds (M.S. Drenichev, V.E. Oslovsky, S.N. Mikhailov. Cytokinin Nucleosides - Natural compounds with a unique spectrum of biological activities. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16, 2562-2576, 2016).
Во втором сначала получают производные гетероциклических оснований и моносахаридных производных, а затем получают нуклеозиды (С.Н. Михайлов, Ю.П. Лысов, Г.И. Яковлев. Применение функционально-компетентных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов для изучения фермент-субстратных взаимодействий. Молекулярная биология, 33, 393-407, 1999). В этом методе ключевой стадией синтеза является создание N-гликозидной связи. К настоящему времени разработаны удобные и эффективные методы получения рибонуклеозидов, исходя из триметилсилильных производных гетероциклических оснований и полностью ацилированной рибофуранозы в присутствии кислот Льюиса. (
Ферментативные методы синтеза существенно дополняют химические и, в ряде случаев, имеют несомненные преимущества (I.A. Mikhailopulo, A.I. Miroshnikov, Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 2011, 21, 57-68). В последние годы в промышленно развитых странах активно развивается так называемая «зеленая» химия, целью которой является замена традиционного химического синтеза различными каталитическими методами без использования токсичных органических растворителей. Для получения нуклеозидов используют нуклеозидфосфорилазы (НФ): ферменты, катализирующие обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием α-D-пентафуранозо-1-фосфата и гетероцикличекого основания: нуклеозид + Pi ↔ основание + α-D-пентафуранозо-1-фосфат.Enzymatic synthesis methods substantially supplement chemical ones and, in some cases, have undoubted advantages (I.A. Mikhailopulo, A.I. Miroshnikov, Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 2011, 21, 57-68). In recent years, the so-called "green" chemistry has been actively developing in industrialized countries, the purpose of which is to replace traditional chemical synthesis with various catalytic methods without the use of toxic organic solvents. To obtain nucleosides, nucleoside phosphorylases (NFs) are used: enzymes that catalyze the reversible phosphorolysis of nucleosides to form α-D-pentafuranoso-1-phosphate and a heterocyclic base: nucleoside + Pi ↔ base + α-D-pentafuranoso-1-phosphate.
Нуклеозидфосфорилазы играют ключевую роль в метаболизме нуклеозидов. Эти ферменты обнаружены почти у всех организмов, при этом отличия их первичной структуры сравнительно невелики. Наиболее специфичным ферментом является тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), субстратами которого являются тимидин и 2'-дезоксиуридин. Помимо этих нуклеозидов, уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) осуществляет фосфоролиз и уридина. Субстратами пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) (КФ 2.4.2.1) являются пуриновые нуклеозиды как рибо-, так и 2'-дезоксириборяда (M.J. Pugmire, S.E. Ealick, Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. Biochemical Journal, 361, 1-25, 2002). Равновесие этих реакций сдвинуто в сторону образования нуклеозидов, причем в случае пуриновых более значительно (Goldberg RN, Tewari YB, Bhat TN, "Thermodynamics of Enzyme-Catalyzed Reactions -a Database for Quantitative Biochemistry", Bioinformatics 2004, 20, 2874-2877). На этой особенности и основана эффективность ферментативной реакции трансгликозилирования, в ходе которой происходит перенос углеводного остатка от пиримидинового нуклеозида (B-Nuc) на пуриновое гетероциклическое основание (В') (И.А. Михайлопуло, А.И. Мирошников. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 21, 57-68, 2012; L.E. Iglesias, E.S. Lewkowicz, R. Medici, P. Bianchi, A.M. Iribarren. Biocatalytic approaches applied to the synthesis of nucleoside prodrugs. Biotechnology Advances 33, 412-434, 2015).Nucleoside phosphorylases play a key role in the metabolism of nucleosides. These enzymes are found in almost all organisms, while the differences in their primary structure are relatively small. The most specific enzyme is thymidine phosphorylase (TF) (EC 2.4.2.4), the substrates of which are thymidine and 2'-deoxyuridine. In addition to these nucleosides, uridine phosphorylase (UV) (EC 2.4.2.3) carries out phosphorolysis and uridine. The substrates of purine nucleoside phosphorylase (PNF) (EC 2.4.2.1) are the purine nucleosides of both ribo- and 2'-deoxyriborides (MJ Pugmire, SE Ealick, Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. Biochemical Journal, 361, 1-25, 2002). The equilibrium of these reactions is shifted towards nucleoside formation, and more significantly in the case of purines (Goldberg RN, Tewari YB, Bhat TN, "Thermodynamics of Enzyme-Catalyzed Reactions-a Database for Quantitative Biochemistry", Bioinformatics 2004, 20, 2874-2877). The effectiveness of the enzymatic transglycosylation reaction during which the carbohydrate residue from the pyrimidine nucleoside (B-Nuc) onto the purine heterocyclic base (B ') occurs (IA Mihaylopulo, AI Miroshnikov. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 21, 57-68, 2012; LE Iglesias, ES Lewkowicz, R. Medici, P. Bianchi, AM Iribarren. Biocatalytic approaches applied to the synthesis of nucleoside prodrugs. Biotechnology Advances 33, 412-434, 2015).
Анализ литературных данных позволяет заключить, что ферментативные методы создания гликозидной связи могут конкурировать с химическими при получении фармацевтически важных 2'-дезоксирибонуклеозидов (кладрибин) и β-D- арабинофуранозилнуклеозидов (флударабин и неларабин) (Фиг. 1).An analysis of the literature data allows us to conclude that enzymatic methods for creating a glycosidic bond can compete with chemical ones for the preparation of pharmaceutically important 2'-deoxyribonucleosides (cladribine) and β-D-arabinofuranosyl nucleosides (fludarabine and non-larabin) (Fig. 1).
НФ катализируют реакции расщепления N-гликозидной связи в присутствии фосфата с образованием гетероциклического основания (В1) и α-D-(2-дезокси)рибофуранозо-1-фосфата (Фиг. 2, стадия 1). В процессе используются ферменты: тимидинфосфорилаза, уридинфосфорилаза и пуриннуклеозидфосфорилаза. На следующей стадии (Фиг. 2, стадия 2) происходит перенос углеводного остатка от одного гетероциклического основания (В1) на другое (В2). Анализ реакции трансгликозилирования показал, что выходы искомых нуклеозидов зависят от соотношения констант равновесия реакций фосфоролиза нуклеозидов (Kp1/Kp2). Максимального выхода можно достичь, если равновесие стадии 1 сильно сдвинуто в сторону образования α-D-рибофуранозо-1-фосфата или α-D-(2-дезокси)рибофуранозо-1-фосфата, а равновесие стадии 2 сдвинуто в сторону целевого нуклеозида (Nuc-2). Поэтому α-D-пентафуранозо-1-фосфаты являются оптимальными субстратами для достижения максимального выхода целевого нуклеозида. α-D-рибофуранозо-1-фосфат и α-D-(2-дезокси)рибофуранозо-1-фосфат являются коммерчески доступными соединениями, а также могут быть получены тремя путями:NFs catalyze the cleavage of the N-glycosidic bond in the presence of phosphate to form a heterocyclic base (B1) and α-D- (2-deoxy) ribofuranose-1-phosphate (Fig. 2, stage 1). The process uses enzymes: thymidine phosphorylase, uridine phosphorylase and purine nucleoside phosphorylase. In the next stage (Fig. 2, stage 2), the carbohydrate residue is transferred from one heterocyclic base (B1) to another (B2). Analysis of the transglycosylation reaction showed that the yields of the desired nucleosides depend on the ratio of the equilibrium constants of nucleoside phosphorolysis reactions (K p1 / K p2 ). The maximum yield can be achieved if the equilibrium of
1. Химический синтез (Н. Komatsu, Н. Awano. First stereoselective synthesis of 2-deoxy-α-D-ribofuranosyl-1-phosphate: novel application of crystallization-induced asymmetric transformation. J. Org. Chem., 2002, 67, 5419-5421).1. Chemical synthesis (N. Komatsu, N. Awano. First stereoselective synthesis of 2-deoxy-α-D-ribofuranosyl-1-phosphate: novel application of crystallization-induced asymmetric transformation. J. Org. Chem., 2002, 67 , 5419-5421).
2. Ферментативный фосфоролиз тимидина в присутствии ТФ (I.V. Fateev, М.I. Kharitonova, K.V. Antonov, I.D. Konstantinova, V.N. Stepanenko, R.S. Esipov, F. Seela, K.W. Temburnikar, K.L. Seley-Radtke, V.A. Stepchenko, Y.A. Sokolov, A.I. Miroshnikov, I.A. Mikhailopulo. Recognition of Artificial Nucleobases by E. coli Purine Nucleoside Phosphorylase versus its Ser90Ala Mutant in the Synthesis of Base-Modified Nucleosides. Chemistry-A European Journal, 21, 13401-13419, 2015)2. Enzymatic phosphorolysis of thymidine in the presence of TF (IV Fateev, M.I. Kharitonova, KV Antonov, ID Konstantinova, VN Stepanenko, RS Esipov, F. Seela, KW Temburnikar, KL Seley-Radtke, VA Stepchenko, YA Sokolov, AI Miroshnikov , IA Mikhailopulo. Recognition of Artificial Nucleobases by E. coli Purine Nucleoside Phosphorylase versus its Ser90 (Ala Mutant in the Synthesis of Base-Modified Nucleosides. Chemistry-A European Journal, 21, 13401-13419, 2015)
3. Ферментативный синтез из D-(2-дезокси)рибофуранозо-5-фосфата (I.A. Mikhailopulo, A.I. Miroshnikov, Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 2011, Tischer W., Ihlenfeldt H. - G., Barzu O., Sakamoto H., Pistotnik E., Marliere P., Pochet S. Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleosides. US Patent 7,229,797, Jun. 12, 2007).3. Enzymatic synthesis from D- (2-deoxy) ribofuranose-5-phosphate (IA Mikhailopulo, AI Miroshnikov, Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 2011, Tischer W., Ihlenfeldt H. - G ., Barzu O., Sakamoto H., Pistotnik E., Marliere P., Pochet S. Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleosides. US Patent 7,229,797, Jun. 12, 2007).
4. Фосфоролиз 7-метилгуанозина и его аналогов в присутствии НФ (W.J. Hennen, C.H. Wong. A new method for the enzymic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 54, 4692-4695, 1989; C.-H. Wong; W.J. Hennen, process for the enzymatic synthesis of nucleosides US Patent 5075225, Dec. 24, 1991).4. Phosphorolysis of 7-methylguanosine and its analogues in the presence of NF (WJ Hennen, CH Wong. A new method for the enzymic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 54, 4692-4695, 1989; C.- H. Wong; WJ Hennen, process for the enzymatic synthesis of nucleosides US Patent 5075225, Dec. 24, 1991).
α-D-Рибофуранозо-1-фосфат (или α-D-(2-дезокси)рибофуранозо-1-фосфат) далее вводится в реакцию с гетероциклическим основанием В2 в присутствии НФ с образованием нуклеозида Nuc-2. Для получения нуклеозидов как рибо-, так и 2'-дезоксириборяда можно использовать соответствующие продажные пентафуранозо-1-фосфаты (Т. Araki, I. Ikeda, K. Matoishi, R. Abe, Т. Oikawa, Y. Matsuba, H. Ishibashi, K. Nagahara, Y. Fukuiri. Method for producing cytosine nucleoside compounds. US Patent 7,629,457 B2 Dec. 8, 2009).α-D-Ribofuranoso-1-phosphate (or α-D- (2-deoxy) ribofuranoso-1-phosphate) is then reacted with heterocyclic base B 2 in the presence of NF to form Nuc-2 nucleoside. To obtain nucleosides of both ribo- and 2'-deoxyriboride, appropriate commercial pentafuranose-1-phosphates can be used (T. Araki, I. Ikeda, K. Matoishi, R. Abe, T. Oikawa, Y. Matsuba, H. Ishibashi , K. Nagahara, Y. Fukuiri. Method for producing cytosine nucleoside compounds. US Patent 7,629,457 B2 Dec. 8, 2009).
Методы 1 и 3 достаточно трудоемки, а коммерчески доступные пентафуранозо-1-фосфаты имеют высокую стоимость, что, безусловно, отражается на себестоимости целевых продуктов. Поэтому получение пентафуранозо-1-фосфатов фосфоролизом 7-метилгуанозина и его аналогов является наиболее простым и экономически эффективным методом. Достоинством этого метода также является возможность совмещения стадий 1 и 2 (Фиг. 2) без выделения промежуточного лабильного пентафуранозо-1-фосфата.
7-Метилгуанозин используется для получения пуриновых рибонуклеозидов (W.J. Hennen, C.H. Wong. A new method for the enzymic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 54, 4692-4695, 1989; C.-H. Wong; W.J. Hennen, Process for the enzymatic synthesis of nucleosides US Patent 5075225, Dec. 24, 1991; D. Ubiali, C.F. Morelli, M. Rabuffetti, G. Cattaneo, I. Serra, T. Bavaro, G. Speranza. Substrate Specificity of a Purine Nucleoside Phosphorylase from Aeromonas hydrophila. Toward 6-Substituted Purines and its Use as a Biocatalyst in the Synthesis of the Corresponding Ribonucleosides. Curr. Org. Chem. 19, 2220-2225, 2015).7-Methylguanosine is used to produce purine ribonucleosides (WJ Hennen, CH Wong. A new method for the enzymic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 54, 4692-4695, 1989; C.-H. Wong; WJ Hennen, Process for the enzymatic synthesis of nucleosides US Patent 5075225, Dec. 24, 1991; D. Ubiali, CF Morelli, M. Rabuffetti, G. Cattaneo, I. Serra, T. Bavaro, G. Speranza. Substrate Specificity of a Purine Nucleoside Phosphorylase from Aeromonas hydrophila. Toward 6-Substituted Purines and its Use as a Biocatalyst in the Synthesis of the Corresponding Ribonucleosides. Curr. Org. Chem. 19, 2220-2225, 2015).
Было показано, что фосфоролиз 7-метилгуанозина ПНФ протекает количественно с образованием α-D-рибофуранозо-1-фосфата (E. Kulikowska, A. Bzowska, J. Wierzchowski, D. Shugar. Properties of two unusual, and fluorescent, substrates of purine-nucleoside phosphorylase: 7-methylguanosine and 7-methylinosine. Biochimica et Biophysica Acta,, 874, 355-363, 1986), т.е. равновесие стадии 1 полностью сдвинуто в сторону образования 7-метилгуанина. Таким образом, 7-метилгуанозин является недорогой альтернативой α-D-рибофуранозо-1-фосфату. Мы предположили, что фосфоролиз 7-метил-2'-дезоксигуанозина будет протекать аналогично.It was shown that phosphorolysis of 7-methylguanosine PNP occurs quantitatively with the formation of α-D-ribofuranose-1-phosphate (E. Kulikowska, A. Bzowska, J. Wierzchowski, D. Shugar. Properties of two unusual, and fluorescent, substrates of purine -nucleoside phosphorylase: 7-methylguanosine and 7-methylinosine. Biochimica et Biophysica Acta, 874, 355-363, 1986), i.e. the equilibrium of
Использование 7-метил-2'-дезоксигуанозина для ферментативного синтеза нуклеозидов не освещено в литературе, что, по-видимому, связано с его термолабильностью и достаточно низкой устойчивостью в водных растворах (J.W. Jones, R.K. Robins, Purine nucleosides. III. Methylation studies of certain naturally occurring purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 193-201).The use of 7-methyl-2'-deoxyguanosine for enzymatic synthesis of nucleosides is not covered in the literature, which is apparently due to its thermal stability and rather low stability in aqueous solutions (JW Jones, RK Robins, Purine nucleosides. III. Methylation studies of certain naturally occurring purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 193-201).
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Сущность изобретения заключается в применении гидройодной формы 7-метил-2'-дезоксигуанозина для получения 2'-дезоксинуклеозидов (в том числе - лекарственного препарата - кладрибина) по ферментативной реакции транс-гликозилирования в присутствии нуклеозидфосфорилаз НФ (тимидинфосфорилазы Е. coli - ТФ и пуринуклеозидфосфорилазы Е. coli - ПНФ)The essence of the invention lies in the use of the hydroiodic form of 7-methyl-2'-deoxyguanosine for the preparation of 2'-deoxynucleosides (including the drug - cladribine) by the enzymatic trans-glycosylation reaction in the presence of NF nucleoside phosphorylases (E. coli thymidine phosphorylase - TF and purinucleose) E. coli - PNF)
Изобретение решает задачу получения 2'-дезоксинуклеозидов исходя из гидройодной формы 7-метил-2'-дезоксигуанозина (7-Me-dGuo). Применение этого соединения в качестве субстрата ПНФ в реакции трансгликозилирования позволяет получать 2'-дезоксинуклеозиды с высоким выходом, используя небольшой избыток гидройодной формы 7-Me-dGuo (1.5 эквивалента к пуриновому или пиримидиновому основанию) и недостаток фосфата (0.2-0.7 эквивалентов к пуриновому или пиримидиновому основанию). Ближайшими прототипами являются цитированные выше патент и публикация (W.J. Hennen, C.H.Wong. A new method for the enzymic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 54, 4692-4695, 1989; C. - H. Wong; W.J. Hennen, Process for the enzymatic synthesis of nucleosides US Patent 5075225, Dec. 24, 1991).The invention solves the problem of obtaining 2'-deoxynucleosides based on the hydroiodic form of 7-methyl-2'-deoxyguanosine (7-Me-dGuo). The use of this compound as a PNP substrate in the transglycosylation reaction allows to obtain 2'-deoxynucleosides in high yield using a small excess of the 7-Me-dGuo hydroiodic form (1.5 equivalents to purine or pyrimidine base) and a lack of phosphate (0.2-0.7 equivalents to purine or pyrimidine base). The closest prototypes are the patent and publication cited above (WJ Hennen, CHWong. A new method for the enzymic synthesis of nucleosides using purine nucleoside phosphorylase. J. Org. Chem. 54, 4692-4695, 1989; C. - H. Wong; WJ Hennen, Process for the enzymatic synthesis of nucleosides US Patent 5075225, Dec. 24, 1991).
Для успешного проведения ферментативной реакции трансгликозилирования необходимо использование исходных субстратов высокой степени чистоты. Метилирование 2'-дезоксигуанозина (J.W. Jones, R.K. Robins, Purine nucleosides. III. Methylation studies of certain naturally occurring purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 193-201) протекает с частичным разложением образующегося продукта, что подтверждается тонкослойной хроматографией (ТСХ). Для повышения чистоты и стабильности выделяемого 7-метил-2'-дезоксигуанозина этот метод был модифицирован. Добавление в реакционную смесь карбоната бария приводило к заметной стабилизации образующего продукта в условиях реакции. Замена диметилсульфоксида на более низкокипящий растворитель диметилформамид (ДМФА) позволила точнее контролировать протекание химической реакции, что важно при получении лабильных соединений. Продукт выделяли из реакционной смеси фильтрацией от карбоната бария с последующим высаживанием в трихлорметане. Чистота 7-метил-2'-дезоксигуанозина в виде гидройодной формы составляет >98% согласно 1Н-ЯМР спектроскопии. Методика позволяет получать нуклеозид в виде гидройодной формы в граммовых количествах (10-100 грамм).For the successful implementation of the enzymatic transglycosylation reaction, the use of high purity starting substrates is necessary. Methylation of 2'-deoxyguanosine (JW Jones, RK Robins, Purine nucleosides. III. Methylation studies of certain naturally occurring purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 193-201) proceeds with partial decomposition of the resulting product, which confirmed by thin layer chromatography (TLC). To increase the purity and stability of the released 7-methyl-2'-deoxyguanosine, this method was modified. The addition of barium carbonate to the reaction mixture led to a noticeable stabilization of the forming product under the reaction conditions. Replacing dimethyl sulfoxide with a lower boiling solvent dimethylformamide (DMF) made it possible to more accurately control the course of the chemical reaction, which is important in the preparation of labile compounds. The product was isolated from the reaction mixture by filtration from barium carbonate, followed by precipitation in trichloromethane. Purity of 7-methyl-2'-deoxyguanosine as gidroyodnoy shape is> 98% according to 1 H NMR spectroscopy. The technique allows to obtain a nucleoside in the form of a hydroiodic form in gram quantities (10-100 grams).
Гидройодная форма 7-метил-2'-дезоксигуанозина стабильна в твердом агрегатном состоянии при хранении в морозильной камере при температуре ниже 0°С (при -20°С), что согласуется с литературными данными (J.W. Jones, R.K. Robins, Purine nucleosides. III. Methylation studies of certain naturally occurring purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 193-201). Хорошая растворимость (примерно 30 мМ) гидройодной формы 7-Me-dGuo делает ее использование в ферментативной реакции предпочтительным, чем его цвиттер-ионной формы, которая плохо растворима в воде, диметилсульфоксиде и водно-спиртовых смесях.The hydroiodic form of 7-methyl-2'-deoxyguanosine is stable in the solid state when stored in a freezer at temperatures below 0 ° C (at -20 ° C), which is consistent with published data (JW Jones, RK Robins, Purine nucleosides. III Methylation studies of certain naturally occurring purine nucleosides. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 193-201). The good solubility (approximately 30 mM) of the 7-Me-dGuo hydroiodic form makes its use in the enzymatic reaction preferable to its zwitterionic form, which is poorly soluble in water, dimethyl sulfoxide and water-alcohol mixtures.
7-Метилпроизводные гуанозина достаточно стабильны в водных растворах при высокой температуре (t≤90°C) в диапазоне значений рН 2<рН<6. При нагревании до 90°С в кислой среде (рН<2) происходит расщепление N-гликозидной связи, а в основной среде (рН>7) - раскрытие имидазольного цикла (М. Lahti, Н. Santa, Е. Darzynkiewicz, Н.
Свойства 7-метил-2'-дезоксигуанозина и α-D-(2-дезокси)рибофуранозо-1-фосфата определяют выбор условий проведения ферментативных реакций. Раствор гидройодной соли 7-Me-dGuo в 50 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5) хорошо хранится при +8°С в течение недели (гидролиз - 5% через неделю по данным ВЭЖХ). Согласно данным УФ-спектроскопии и ВЭЖХ-анализа, раствор гидройодной соли 7-Me-dGuo в 50 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5) достаточно устойчив при 20°С (по данным ВЭЖХ гидролиз незначителен через час, меньше 10% через сутки и 30% через двое суток). Гидройодная соль 7-Me-dGuo неустойчива в водных растворах при рН 4,1 и 20°С.The properties of 7-methyl-2'-deoxyguanosine and α-D- (2-deoxy) ribofuranoso-1-phosphate determine the choice of conditions for enzymatic reactions. A solution of the 7-Me-dGuo hydroiodic salt in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) is well stored at + 8 ° C for a week (hydrolysis - 5% after a week according to HPLC). According to UV spectroscopy and HPLC analysis, a solution of 7-Me-dGuo hydroiodic salt in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) is quite stable at 20 ° C (according to HPLC, hydrolysis is negligible after an hour, less than 10% after day and 30% after two days). The 7-Me-dGuo hydroiodic salt is unstable in aqueous solutions at pH 4.1 and 20 ° C.
Таким образом, общая схема реакции ферментативного трансгликозилирования (Фиг. 2) существенно упрощается - стадия 1 является необратимой. 7-Метил-2'-дезоксигуанозин, как и 7-метилгуанозин, практически необратимо подвергается фосфоролизу в присутствии ПНФ Е. coli с выходом, близким к количественному (Фиг. 3). Образование пуриновых нуклеозидов протекает в присутствии одного фермента - ПНФ, образование пиримидиновых нуклеозидов протекает в присутствии двух ферментов - ПНФ и ТФ. ПНФ обладает широкой специфичностью, что позволяет получать пуриновые 2'-дезоксинуклеозиды, содержащие атомы хлора, фтора, аминогруппу в положении 2 пуринового основания и группы метиламино-, этиламино-, бензиламино-, фенилэтиламино-, метокси-, этокси-, бензилокси- и другие заместители в положении 6 пуринового основания. ТФ также обладает широкой специфичностью, что дает возможность получать производные 2'-дезоксиуридина, содержащие в 5-м положении атомы водорода (урацил), фтора (5-фторурацил), метил-радикал (тимин), этил-радикал (5-этилурацил), изопропил-радикал (5-изопропилурацил) и другие заместители.Thus, the general scheme of the enzymatic transglycosylation reaction (Fig. 2) is significantly simplified -
Использование небольшого избытка (1,5 экв.) 7-метил-2'-дезоксигуанозина по отношению к основанию и недостатка фосфата (0,2-0,7 экв.) позволяет довести выходы целевых нуклеозидов практически до количественных по данным ВЭЖХ и примерно до 80% (а иногда и до 93-94%) после выделения и хроматографической очистки (таблица 1). Использование небольших избытков упрощает выделение и очистку целевых продуктов хроматографией на силикагеле, также снижает их стоимость.The use of a small excess (1.5 equiv.) Of 7-methyl-2'-deoxyguanosine with respect to the base and a lack of phosphate (0.2-0.7 equiv.) Allows the yields of the target nucleosides to be practically quantified according to HPLC and approximately 80% (and sometimes up to 93-94%) after isolation and chromatographic purification (table 1). The use of small excesses simplifies the isolation and purification of the target products by silica gel chromatography, and also reduces their cost.
Контроль за протеканием ферментативных реакций проводится с помощью ВЭЖХ (Фиг. 4). В момент времени t0 (Фиг. 4, А) в смеси присутствует сигнал исходного основания - 5-этилурацила. При ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте Luna® C18 7-метил-2'-дезоксигуанозин дает сигнал в виде очень широкого пика (иногда RT ~ 4.00-5.50 мин, практически всегда детекция сигнала при указанных выше условиях невозможна), который трудно интегрировать, поэтому реакцию трансгликозилирования удобнее контролировать по соотношению сигналов 5-этилурацила и 5-этил-2'-дезоксиуридина. После установления равновесия в реакции транс-гликозилирования (Фиг. 4, В) наблюдается образование 7-метилгуанина и целевого продукта, а интенсивность сигнала 5-этилурацила заметно снижается.Monitoring the progress of enzymatic reactions is carried out using HPLC (Fig. 4). At time t 0 (Fig. 4, A), the signal contains the signal of the starting base, 5-ethyluracil. During HPLC on a Luna® C 18 reverse phase sorbent, 7-methyl-2'-deoxyguanosine gives a signal in the form of a very broad peak (sometimes RT ~ 4.00-5.50 min, signal detection is almost always impossible under the above conditions), which is difficult to integrate, therefore, it is more convenient to control the transglycosylation reaction by the ratio of the signals of 5-ethyluracil and 5-ethyl-2'-deoxyuridine. After equilibrium is established in the trans-glycosylation reaction (Fig. 4, B), the formation of 7-methylguanine and the target product is observed, and the signal intensity of 5-ethyluracil decreases markedly.
Таким образом, предлагаемый нами метод позволяет получать разнообразные 2'-дезоксирибонуклеозиды, в том числе терапевтически важные нуклеозиды 5-фтор-2'-дезоксиуридин и 2-хлоро-6-аминопурин-2'-дезоксирибозид (противоопухолевый препарат кладрибин). Достоинствами данного метода являются: использование гидройодной соли 7-метил-2'-дезоксигуанозина в качестве донора углеводного остатка, возможность получения с высоким выходом как пуриновых, так и пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов исходя из соответствующих гетероциклических оснований.Thus, our method allows us to obtain a variety of 2'-deoxyribonucleosides, including therapeutically important nucleosides 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 2-chloro-6-aminopurin-2'-deoxyribonoside (antitumor drug cladribine). The advantages of this method are: the use of the hydroiodic salt of 7-methyl-2'-deoxyguanosine as a donor of the carbohydrate residue, the possibility of producing both purine and pyrimidine 2'-deoxynucleosides in high yield based on the corresponding heterocyclic bases.
Краткое описание фигур и таблицBrief description of figures and tables
Фиг. 1. Кладрибин, флударабин, неларабин и видарабин - фармацевтически важные нуклеозиды. На фигуре приведены структуры лекарственных препаратов нуклеозидной природы кладрибина, флударабина, неларабина и видарабина, широко используемых в медицинской практике;FIG. 1. Cladribine, fludarabine, nonlarabin and vidarabine are pharmaceutically important nucleosides. The figure shows the structure of drugs of the nucleoside nature of cladribine, fludarabine, nonlarabine and vidarabine, widely used in medical practice;
Фиг. 2. Реакции ферментативного фосфоролиза нуклеозидов и реакции трансгликозилирования. NP1, NP2 - нуклеозидфосфорилазы, B1 и В2 - гетероциклические основания, R - Н или ОН. На фигуре приведены основные стадии трансгликозилирования;FIG. 2. Enzymatic phosphorolysis reactions of nucleosides and transglycosylation reactions. NP 1 , NP 2 are nucleoside phosphorylases, B 1 and B 2 are heterocyclic bases, R is H or OH. The figure shows the main stages of transglycosylation;
Фиг. 3. Получение 2'-дезоксирибонуклеозидов методом трансгликозилирования в трис-HCl буфере (рН 7.5) при 20°С. Реагенты и условия. ПНФ Е. coli + ТФ Е. coli (для пиримидиновых оснований), 24 ч, 79-94%. Фигура иллюстрирует получение 2'-дезоксирибонуклеозидов из
Фиг. 4. Ферментативный синтез 5-этил-2'-дезоксиуридина методом трансгликозилирования (ВЭЖХ-анализ смеси на обращенно-фазном сорбенте Luna® С18). Фигура иллюстрирует пример ВЭЖХ - анализа протекания реакции ферментативного синтеза 5-этил-2'-дезоксиуридина. А - до добавления ферментов (момент времени t0), В - после установления равновесия (момент времени teq - 24 ч). 1-5-этилурацил, 2-7-метилгуанин, 3-5-этил-2'-дезоксиуридин.FIG. 4. Enzymatic synthesis of 5-ethyl-2'-deoxyuridine by transglycosylation (HPLC analysis of the mixture on a Luna® C 18 reverse phase sorbent). The figure illustrates an example of HPLC analysis of the progress of the enzymatic synthesis of 5-ethyl-2'-deoxyuridine. A - before the addition of enzymes (time t 0 ), B - after equilibrium (time t eq - 24 hours). 1-5-ethyluracil, 2-7-methylguanine, 3-5-ethyl-2'-deoxyuridine.
Табл. 1. Выходы нуклеозидов, полученных по реакции трансгликозилирования (Трис-HCl буфер, рН 7,5, 20°С, 24 ч). В таблице приведено описание выходов нуклеозидов, полученных по реакции трансгликозилирования.Tab. 1. The outputs of nucleosides obtained by the transglycosylation reaction (Tris-HCl buffer, pH 7.5, 20 ° C, 24 hours). The table describes the yields of nucleosides obtained by the transglycosylation reaction.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Структура заявленных соединений подтверждена методами УФ и ЯМР-спектроскопии. ЯМР-спектры регистрируют на приборе Bruker АМХ 300 (Германия). Химические сдвиги (δ) в 1H-ЯМР приводят в миллионных долях (м.д.) и измеряют относительно остаточного сигнала растворителя: DMSO-d6 - 2,50 м.д., D2O - 4,79 м.д. Величины констант спин - спинового взаимодействия (J) измеряют в герцах (Гц). При описании спектров 1Н-ЯМР принимают следующие сокращения: с - синглет, ус - уширенный синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет. УФ-спектры регистрируют в воде на приборе Cary 300 UV/VIS (Varian, Австралия). Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках Kieselgel 260 F (Merck) с УФ-детекцией (λ=254 нм). ВЭЖХ анализ транс-гликозилирования проводят на хроматографической колонке 4,6×150 мм (диаметр частиц 5 мкм, обращенно-фазный сорбент Luna® C18(2), диаметр пор 100
Пример 1. Синтез 7-Метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида.Example 1. Synthesis of 7-Methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide.
К раствору 5 г (17,5 ммоль) дезоксигуанозина моногидрата в 100 мл сухого ДМФА присыпают 6,9 г (35 ммоль) карбоната бария. К полученной суспензии при интенсивном перемешивании прикапывают 10,9 мл (175 ммоль) йодометана. Реакцию проводят при перемешивании в плотно закрытой колбе при температуре 20°С в течение 5,5 ч. Затем реакционную смесь выдерживают 30 мин на открытом воздухе и фильтруют через целит (Hyflo Super Cel, диаметр фильтра - 40 мм, толщина уплотненного слоя целита - 20 мм). Целит промывают 50 мл ДМФА, полученный отфильтрованный раствор разбавляют 2 л хлороформа и выдерживают при 0°С в течение 16 ч. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают этиловым спиртом (100 мл), хлороформом (100 мл) и сушат 1 ч на масляном насосе. Выход 5,37 г (75%) в виде белого порошка. Rƒ 0,095 (метиленхлорид - этанол, 1:1, v/v). 1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): 11,63 ус (1Н, NH 7-Me-Gua), 9,27 с (1H, Н8 7-Me-Gua), 7,15 ус (2Н, NH2 7-Me-Gua), 6,19 т (1Н, J1'2'a=J1'2'b=6,0, H1'), 5,50-5,25 м (1Н, ОН), 5,25-4,75 м (1Н, ОН), 4,37 ддд (1Н, J3'2'a=5.0, J3'2'b=4,8, J3'4'=3,9, Н3'), 4,00 с (3Н, СН3), 3,92 тд (1Н, J4'3'=3,9, J4'5'a=4,2, J4'5'b=4,2, Н4'), 3,62 дд (1Н, J5'a4'=4,2, J5'a5'b=-12,0, Н5'а), 3,57 дд (1H, J5'b5'a=4,2, J5'b5'a=-12,0, Н5'b), 2,55-2,45 м (1Н, Н2'а), 2,40 ддд (1Н, J2'b2'a=-13,4, J2'b1'=6,0, J2'b3'=4,8, H2'b). УФ (H2O, рН 4,1): λmax (ε)=256 нм (11000); λmax (ε)=281 нм (7600); УФ (Трис-HCl буфер, рН 7,5): λmax (ε)=256 нм (7100); λmax (ε)=281 нм (7600).To a solution of 5 g (17.5 mmol) of deoxyguanosine monohydrate in 100 ml of dry DMF was added 6.9 g (35 mmol) of barium carbonate. To the resulting suspension, 10.9 ml (175 mmol) of iodomethane are added dropwise with vigorous stirring. The reaction is carried out with stirring in a tightly closed flask at a temperature of 20 ° C for 5.5 hours. Then the reaction mixture is kept for 30 minutes in the open air and filtered through celite (Hyflo Super Cel, filter diameter 40 mm, thickness of the compacted celite layer 20 mm). Celite was washed with 50 ml of DMF, the resulting filtered solution was diluted with 2 L of chloroform and kept at 0 ° C for 16 hours. The precipitate was filtered off, washed with ethyl alcohol (100 ml), chloroform (100 ml) and dried for 1 h on an oil pump. Yield 5.37 g (75%) as a white powder. R ƒ 0.095 (methylene chloride - ethanol, 1: 1, v / v). 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): 11.63 ss (1H, NH 7-Me-Gua), 9.27 s (1H, H8 7-Me-Gua), 7.15 ss (2H, NH 2 7-Me-Gua), 6.19 t (1H, J 1'2'a = J 1'2'b = 6.0, H1 '), 5.50-5.25 m (1H, OH ), 5.25-4.75 m (1H, OH), 4.37 ddd (1H, J 3'2'a = 5.0, J 3'2'b = 4.8, J 3'4 ' = 3 9, H3 '), 4.00 s (3H, CH 3 ), 3.92 td (1H, J 4'3' = 3.9, J 4'5'a = 4.2, J 4'5 'b = 4.2, H4'), 3.62 dd (1H, J 5'a4 ' = 4.2, J 5'a5'b = -12.0, H5'a), 3.57 dd ( 1H, J 5'b5'a = 4.2, J 5'b5'a = -12.0, H5'b), 2.55-2.45 m (1H, H2'a), 2.40 ddd (1H, J 2'b2'a = -13.4, J 2'b1 ' = 6.0, J 2'b3' = 4.8, H2'b). UV (H 2 O, pH 4,1): λ max (ε) = 256 nm (11000); λ max (ε) = 281 nm (7600); UV (Tris-HCl buffer, pH 7.5): λ max (ε) = 256 nm (7100); λ max (ε) = 281 nm (7600).
Пример 2. Изучение стабильности 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида в воде.Example 2. The study of the stability of 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide in water.
Для изучения стабильности 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида при 20°С используют водный раствор с концентрацией 1 мМ. Через 1 час, 1, 2, 3, 4 и 7 дней из раствора отбирают аликвоты, разбавляют в 50 раз деионизированной водой (μQ) и анализируют методами УФ-спектроскопии и ВЭЖХ при 20°С. 7-Метил-2'-дезоксигуанозин гидройодид гидролизуется на 73% через двое суток и на 96% через неделю при +20°С по данным ВЭЖХ (время удерживания 7-метилгуанина - RT-6,50 мин., 7-метилдезоксигуанозина - RT 3,10 мин.).To study the stability of 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide at 20 ° C, an aqueous solution with a concentration of 1 mM is used. After 1 hour, 1, 2, 3, 4 and 7 days, aliquots were taken from the solution, diluted 50 times with deionized water (μQ) and analyzed by UV spectroscopy and HPLC at 20 ° C. 7-Methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide is hydrolyzed by 73% after two days and by 96% after a week at + 20 ° C according to HPLC (7-methylguanine retention time - RT-6.50 min., 7-methyldeoxyguanosine - RT 3.10 min.).
Пример 3. Изучение стабильности 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида в трис-HCl буфере (рН 7,5).Example 3. The study of the stability of 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide in Tris-HCl buffer (pH 7.5).
Для изучения стабильности 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида при +20°С и при +8°С используют раствор в Tris-HCl буфере (рН 7,5) с концентрацией 1 мМ. Через 1 час, 1, 2, 3, 4 и 7 дней из раствора отбирают аликвоты, разбавляют в 50 раз Tris-HCl буфером (рН 7,5) и анализируют методами УФ-спектроскопии и ВЭЖХ при 20°С. 7-метил-2'-дезоксигуанозин гидройодид устойчив в 50 мМ Трис-HCl буфере (гидролиз <5% через час и <30% через двое суток и 60% через неделю по данным ВЭЖХ). Раствор гидройодной соли 7-Me-dGuo хорошо хранится при +8°С в течение недели (гидролиз - 5% через неделю по данным ВЭЖХ). Время удерживания 7-метилгуанина - RT-6,50 мин., 7-метилдезоксигуанозина - RT 3,10 мин.To study the stability of 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide at + 20 ° C and at + 8 ° C, use a solution in Tris-HCl buffer (pH 7.5) with a concentration of 1 mm. After 1 hour, 1, 2, 3, 4 and 7 days, aliquots were taken from the solution, diluted 50 times with Tris-HCl buffer (pH 7.5) and analyzed by UV spectroscopy and HPLC at 20 ° C. 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide is stable in 50 mM Tris-HCl buffer (hydrolysis <5% after an hour and <30% after two days and 60% after a week according to HPLC). The solution of the 7-Me-dGuo hydroiodic salt is well stored at + 8 ° C for a week (hydrolysis - 5% after a week according to HPLC). The retention time of 7-methylguanine is RT-6.50 minutes, 7-methyldeoxyguanosine is RT 3.10 minutes.
Пример 4. Синтез 5-фтор-2'-дезоксиуридина (5-F-dUrd)Example 4. Synthesis of 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5-F-dUrd)
5-Фторурацил (227 мг, 1,75 ммоль) растворяют при нагревании в 100 мл 50 мМ Tris-HCl буфера (рН 7,5). К полученному раствору добавляют 119 мг (0,875 ммоль - 0,5 эквивалента к основанию) дигидрофосфата калия, 1,074 г (2,62 ммоль - 1,5 эквивалента к основанию) 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида и разбавляют 50 мМ Tris-HCl буфером (рН 7,5) до объема 250 мл. К раствору добавляют 10 мкл раствора ПНФ Е. coli с активностью 80 ед.акт./мл и 10 мкл раствора тимидинфосфорилазы Е. coli с активностью 1200 ед.акт./мл, медленно перемешивают в течение 10 мин. и оставляют при комнатной температуре на 20 ч без перемешивания. Выход по ВЭЖХ - 95%. Реакционную смесь фильтруют через мембрану Phenomenex (0,2 μ, 47 mm) и упаривают в вакууме до объема ~ 50 мл. Выпавший осадок 7-метилгуанина отфильтровывают через мембрану Phenomenex (0,2 μ, 47 mm). Отфильтрованный раствор упаривают в вакууме, полученный остаток растворяют в этиловом спирте (50 мл), добавляют 20 мл силикагеля, упаривают досуха, соупаривают с этиловым спиртом (2×50 мл) и сухой остаток наносят на колонку для разделения (диаметр колонки - 40 мм, объем сорбента - 150 мл). Колонку промывают системой метиленхлорид : этанол (95:5) (200 мл), продукт элюируют в системах метиленхлорид : этанол (90:10) и метиленхлорид : этанол (85:15). Фракции, содержащие продукт, упаривают в вакууме досуха. Полученный остаток подвергают повторной хроматографической очистке (диаметр колонки 20 мм, объем сорбента - 50 мл). Колонку промывают метиленхлоридом (100 мл) и системой метиленхлорид : этанол (95:5) (100 мл). Продукт элюируют в системе метиленхлорид : этанол (90:10). Выход 349 мг (81%) в виде кристаллов. Выход по ВЭЖХ - 95%. Полученный 5-фтор-2'-дезоксиуридин по физико-химическим свойствам сравним с продажным препаратом. Rƒ 0,23 (метиленхлорид - этанол, 90:10, v/v). 1Н ЯМР (300 МГц, D2O): 8,09 д (1H, 3JH-F=6,5, Н6 5-F-Ura), 6,32 тд (1Н, J1'2'a=J1'2'b=6,6, 5JH-F=6,6, H1'), 4,51 ддд (1H, J3'2'a=6,5, J3'2'b=4,2, J3'4'=4,8, Н3'), 4,10 ддд (1Н, J4'3'=4,8, J4'5'a=3,5, J4'5'b=4,9, Н4'), 3,92 дд (1Н, J5'a4'=3,5, J5'a5'b=-12,5, Н5'а), 3,82 дд (1H, J5'b5'a=4,9, J5'b5'a=-12,5, Н5'b), 2,48 ддд (1Н, J2'b2'a=-14,2, J2'b1'=6,6, J2'b3'=4,2, H2'b), 2,38 ддд (J2'a2'b=-14,2, J2'a1'=6,6, J2'a3'=6,5, Н2'а). УФ (H2O): рН 2-7: λmax(ε)=269 нм (8200); рН 13: λmax(ε)=269 нм (6300).5-Fluorouracil (227 mg, 1.75 mmol) was dissolved by heating in 100 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). To the resulting solution, 119 mg (0.875 mmol - 0.5 equivalent to base) of potassium dihydrogen phosphate, 1.074 g (2.62 mmol - 1.5 equivalent to base) of 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide were added and diluted with 50 mM Tris- HCl buffer (pH 7.5) to a volume of 250 ml. 10 μl of E. coli PNP solution with an activity of 80 units / ml and 10 μl of E. coli thymidine phosphorylase solution with an activity of 1200 units / ml were added to the solution, and they were slowly mixed for 10 min. and left at room temperature for 20 hours without stirring. HPLC yield - 95%. The reaction mixture was filtered through a Phenomenex membrane (0.2 μ, 47 mm) and evaporated in vacuo to a volume of ~ 50 ml. The precipitate of 7-methylguanine was filtered through a Phenomenex membrane (0.2 μ, 47 mm). The filtered solution was evaporated in vacuo, the obtained residue was dissolved in ethyl alcohol (50 ml), 20 ml of silica gel was added, evaporated to dryness, evaporated with ethyl alcohol (2 × 50 ml) and the dry residue was applied to a separation column (column diameter 40 mm, sorbent volume - 150 ml). The column was washed with methylene chloride: ethanol (95: 5) (200 ml), the product was eluted in methylene chloride: ethanol (90:10) and methylene chloride: ethanol (85:15) systems. The fractions containing the product are evaporated to dryness in vacuo. The obtained residue was subjected to repeated chromatographic purification (column diameter 20 mm, sorbent volume 50 ml). The column was washed with methylene chloride (100 ml) and methylene chloride: ethanol (95: 5) (100 ml). The product was eluted in a methylene chloride: ethanol system (90:10). Yield 349 mg (81%) as crystals. HPLC yield - 95%. The obtained 5-fluoro-2'-deoxyuridine is comparable in terms of physicochemical properties with a commercial preparation. R ƒ 0.23 (methylene chloride - ethanol, 90:10, v / v). 1 H NMR (300 MHz, D 2 O): 8.09 d (1H, 3 J HF = 6.5, H6 5-F-Ura), 6.32 td (1H, J 1'2'a = J 1'2'b = 6.6, 5 J HF = 6.6, H1 '), 4.51 ddd (1H, J 3'2'a = 6.5, J 3'2'b = 4.2 , J 3'4 ' = 4.8, H3'), 4.10 ddd (1H, J 4'3 ' = 4.8, J 4'5'a = 3.5, J 4'5'b = 4.9, H4 '), 3.92 dd (1H, J 5'a4' = 3.5, J 5'a5'b = -12.5, H5'a), 3.82 dd (1H, J 5'b5'a = 4.9, J 5'b5'a = -12.5, H5'b), 2.48 ddd (1H, J 2'b2'a = -14.2, J 2'b1 ' = 6.6, J 2'b3' = 4.2, H2'b), 2.38 ddd (J 2'a2'b = -14.2, J 2'a1 ' = 6.6, J 2 'a3' = 6.5, H2'a). UV (H 2 O): pH 2-7: λ max (ε) = 269 nm (8200); pH 13: λ max (ε) = 269 nm (6300).
Пример 5. Синтез 5-этил-2'-дезоксиуридина (5-Et-dUrd)Example 5. Synthesis of 5-ethyl-2'-deoxyuridine (5-Et-dUrd)
Вещество получают аналогично примеру 4, исходя из 245 мг (1,75 ммоль) 5-этилурацила. Выход по ВЭЖХ - 90% Выход 363 мг (81%) в виде пены. Rƒ 0,31 (метиленхлорид - этанол, 90:10, v/v). 1Н ЯМР (300 МГц, D2O): 7,68 т (1Н, 4J=1,1, Н6 5-Et-Ura), 6,36 т (1Н, 7 J1'2'а=J1'2'b=6,7, H1'), 4,53 тд (1Н, J3'2'a=J3'2'b=5,5, J3'4'=4,4 Н3'), 4,09 ддд (1Н, J4'5'а=3,5, J4'5'b=4,7, J4'5'b=4,4, Н4'), 3,91 дд (1H, J5'a5'b=- 12,5, J5'a4'=3,5, Н5'а), 3,83 дд (1Н, J5'b5'a=-12,5, J5'b4'=4,7, H5'b), 2,44 дд (2Н, J2'a1'=J2'b1'=6,7, J2'a3'=J2'b3'=5,5, Н2'), 2,37 кд (2Н, 3J=7,5, 4J=1,1, СН2), 1,14 т (3Н, 3J=7,5, СН3). УФ (H2O): рН 2-7: λmax (ε)=266 нм (9800); рН 13: λmax (ε)=266 нм (7400).The substance is obtained analogously to example 4, starting from 245 mg (1.75 mmol) of 5-ethyluracil. HPLC yield - 90%; Yield 363 mg (81%) as a foam. R ƒ 0.31 (methylene chloride - ethanol, 90:10, v / v). 1 H NMR (300 MHz, D 2 O): 7.68 t (1H, 4 J = 1.1, H6 5-Et-Ura), 6.36 t (1H, 7 J 1'2'a = J 1'2'b = 6.7, H1 '), 4.53 td (1H, J 3'2'a = J 3'2'b = 5.5, J 3'4' = 4.4 H3 ' ), 4.09 ddd (1H, J 4'5'a = 3.5, J 4'5'b = 4.7, J 4'5'b = 4.4, H4 '), 3.91 dd (1H, J 5'a5'b = - 12.5, J 5'a4 ' = 3.5, H5'a), 3.83 dd (1H, J 5'b5'a = -12.5, J 5'b4 ' = 4.7, H5'b), 2.44 dd (2H, J 2'a1' = J 2'b1 ' = 6.7, J 2'a3' = J 2'b3 ' = 5 5, H2 '), 2.37 cd (2H, 3 J = 7.5, 4 J = 1.1, CH 2 ), 1.14 t (3H, 3 J = 7.5, CH 3 ). UV (H 2 O): pH 2-7: λ max (ε) = 266 nm (9800); pH 13: λ max (ε) = 266 nm (7400).
Пример 6. Синтез 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибин)Example 6. Synthesis of 2-chloro-2'-deoxyadenosine (cladribine)
Вещество получают аналогично примеру 4 в присутствии ПНФ, исходя из 296 мг (1,75 ммоль) 2-хлор-6-аминопурина. Выход по ВЭЖХ - 88%. Выход 395 мг (79%) в виде белого порошка. Полученный кладрибин по физико-химическим свойствам сравним с продажным препаратом. Rƒ0,35 (метиленхлорид - этанол, 90:10, v/v). 1Н ЯМР (300 МГц, D2O): 8,27 с (1Н, Н8 - 2-Cl-Ade), 6,38 дд (1Н, J1'2'a=7,4, J1'2'b=6,6, H1'), 4,68 ддд (1Н, J3'2'a=6,2, J3'2'b=3,4, J3'4'=3,0, Н3'), 4,22 ддд (1Н, J4'3'=3,0, J4'5'a=3,3, J4'5'b=4,3 Н4'), 3,90 дд (1Н, J5'a5'b=-12,6, J5'a4'=3,3, Н5'а), 3,82 дд (1Н, J5'b5'a=-12,6, J5'b4'=4,3, Н5'b), 2,81 ддд (1Н, J2'a2'b=-13,9, J2'a1'=7,4, J2'a3'=6,2, Н2'а), 2,60 ддд (1Н, J2'b2'а=-13,9, J2'b1'=6,6, J2'b3'=3,4, Н2'b). УФ (H2O): рН 2: λmax (ε)=265 нм (13600); рН 7-13: λmax (ε)=265 нм (14100).The substance is obtained analogously to example 4 in the presence of PNP, starting from 296 mg (1.75 mmol) of 2-chloro-6-aminopurine. HPLC yield 88%. Yield 395 mg (79%) as a white powder. The resulting cladribine in physicochemical properties is comparable to a commercial drug. R ƒ 0.35 (methylene chloride - ethanol, 90:10, v / v). 1 H NMR (300 MHz, D 2 O): 8.27 s (1H, H8 - 2-Cl-Ade), 6.38 dd (1H, J 1'2'a = 7.4, J 1'2 'b = 6.6, H1'), 4.68 ddd (1H, J 3'2'a = 6.2, J 3'2'b = 3.4, J 3'4 ' = 3.0, H3 '), 4.22 ddd (1H, J 4'3' = 3.0, J 4'5'a = 3.3, J 4'5'b = 4.3 H4 '), 3.90 dd (1H, J 5'a5'b = -12.6, J 5'a4 ' = 3.3, H5'a), 3.82 dd (1H, J 5'b5'a = -12.6, J 5'b4 ' = 4.3, H5'b), 2.81 ddd (1H, J 2'a2'b = -13.9, J 2'a1' = 7.4, J 2'a3 ' = 6 2, H2'a), 2.60 ddd (1H, J 2'b2'a = -13.9, J 2'b1 ' = 6.6, J 2'b3' = 3.4, H2'b ) UV (H 2 O): pH 2: λ max (ε) = 265 nm (13600); pH 7-13: λ max (ε) = 265 nm (14100).
Пример 7. Синтез O6-Бензил-2'-дезоксиинозина (R1=H, R2=OCH2C6H5)Example 7. Synthesis of O 6 -Benzyl-2'-deoxyinosine (R 1 = H, R 2 = OCH 2 C 6 H 5 )
Вещество получают аналогично примеру 4 в присутствии ПНФ, исходя из 395 мг (1,75 ммоль) 6-бензилоксипурина. Выход по ВЭЖХ - 91%. Выход 479 мг (80%) в виде белого порошка. Rƒ0,35 (метиленхлорид - этанол, 90:10, v/v). 1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6: D2O - 4:1 v/v): 8,60 с (1H, H2), 8,31 с (1Н, Н8), 7,50-7,30 м (5Н, Ph), 5,98 т (1Н, J1'2'a= J1'2'b=6,7, H1'), 5,20 с (2Н, СН2), 3,85 тд (1H, J3'2'a= J3'2'b=5,5, J3'4'=4,4 Н3'), 4,41 ддд (1H, J4'5'a=3,5, J4'5'b=4,7, J4'5'b=4,4, Н4'), 3,61 дд (1Н, J3'a5'b=-12,5, J5'a4'=3,5, Н5'а), 3,54 дд (1Н, J5'b5'a=-12,5, J5'b4'=4,7, H5'b), 2,50-2,31 м (2Н, Н2').The substance is obtained analogously to example 4 in the presence of PNP, starting from 395 mg (1.75 mmol) of 6-benzyloxypurine. The output by HPLC is 91%. Yield 479 mg (80%) as a white powder. R ƒ 0.35 (methylene chloride - ethanol, 90:10, v / v). 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6: D 2 O - 4: 1 v / v): 8.60 s (1H, H2), 8.31 s (1H, H8), 7.50-7.30 m (5H, Ph), 5.98 t (1H, J 1'2'a = J 1'2'b = 6.7, H1 '), 5.20 s (2H, CH 2 ), 3.85 td (1H, J 3'2'a = J 3'2'b = 5.5, J 3'4 ' = 4.4 H3'), 4.41 ddd (1H, J 4'5'a = 3 5, J 4'5'b = 4.7, J 4'5'b = 4.4, H4 '), 3.61 dd (1H, J 3'a5'b = -12.5, J 5 'a4' = 3.5, H5'a), 3.54 dd (1H, J 5'b5'a = -12.5, J 5'b4 ' = 4.7, H5'b), 2.50 -2.31 m (2H, H2 ').
* данные для ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте Luna® C18 (диаметр частиц 5 мкм, диаметр пор
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017119092A RU2664472C1 (en) | 2017-06-01 | 2017-06-01 | 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide salt as substrate for producing 2'-deoxynucleosides by method of enzyme transglycosylation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017119092A RU2664472C1 (en) | 2017-06-01 | 2017-06-01 | 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide salt as substrate for producing 2'-deoxynucleosides by method of enzyme transglycosylation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2664472C1 true RU2664472C1 (en) | 2018-08-17 |
Family
ID=63177418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017119092A RU2664472C1 (en) | 2017-06-01 | 2017-06-01 | 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide salt as substrate for producing 2'-deoxynucleosides by method of enzyme transglycosylation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2664472C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109628527A (en) * | 2019-01-21 | 2019-04-16 | 江苏理工学院 | A kind of method for preparing thymidine by gradient pH method |
| RU2836333C1 (en) * | 2023-12-04 | 2025-03-13 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of producing cladribine by enzymatic transglycosylation of 2-chloro-6-azidopurine with successive two-step conversion of azido group |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2368662C1 (en) * | 2008-06-27 | 2009-09-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | METHOD OF OBTAINING 9-(β-D-ARABINOFURANOSYL)-2-FLUOROADENINE |
| RU2569110C2 (en) * | 2009-12-22 | 2015-11-20 | Пласмия Биотек, С.Л | Combination of thermo stable biocatalysts for synthesis of nucleosides |
| EP2993177A1 (en) * | 2014-09-05 | 2016-03-09 | Technische Universität Berlin | A chemo-enzymatic preparation method for purine nucleosides and their deaza- and aza- analogues |
-
2017
- 2017-06-01 RU RU2017119092A patent/RU2664472C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2368662C1 (en) * | 2008-06-27 | 2009-09-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | METHOD OF OBTAINING 9-(β-D-ARABINOFURANOSYL)-2-FLUOROADENINE |
| RU2569110C2 (en) * | 2009-12-22 | 2015-11-20 | Пласмия Биотек, С.Л | Combination of thermo stable biocatalysts for synthesis of nucleosides |
| EP2993177A1 (en) * | 2014-09-05 | 2016-03-09 | Technische Universität Berlin | A chemo-enzymatic preparation method for purine nucleosides and their deaza- and aza- analogues |
Non-Patent Citations (5)
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109628527A (en) * | 2019-01-21 | 2019-04-16 | 江苏理工学院 | A kind of method for preparing thymidine by gradient pH method |
| CN109628527B (en) * | 2019-01-21 | 2021-11-16 | 江苏理工学院 | Method for preparing thymidine by gradient pH method |
| RU2836333C1 (en) * | 2023-12-04 | 2025-03-13 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of producing cladribine by enzymatic transglycosylation of 2-chloro-6-azidopurine with successive two-step conversion of azido group |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11001605B2 (en) | Cyclic dinucleotides containing benzimidazole, method for the production of same, and use of same to activate stimulator of interferon genes (sting)-dependent signaling pathways | |
| US6617106B1 (en) | Methods for preparing oligonucleotides containing non-standard nucleotides | |
| EP3233882B1 (en) | Fluorinated cyclic dinucleotides for cytokine induction | |
| Kamel et al. | Chemo-enzymatic synthesis of α-D-pentofuranose-1-phosphates using thermostable pyrimidine nucleoside phosphorylases | |
| Fateev et al. | The chemoenzymatic synthesis of clofarabine and related 2′-deoxyfluoroarabinosyl nucleosides: The electronic and stereochemical factors determining substrate recognition by E. coli nucleoside phosphorylases | |
| HU199871B (en) | Process for producing deazapurine nucleoside derivatives and antiviral compositions comprising said compounds | |
| Barai et al. | A universal biocatalyst for the preparation of base‐and sugar‐modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation | |
| Rowan et al. | Nucleoside triphosphate mimicry: a sugar triazolyl nucleoside as an ATP-competitive inhibitor of B. anthracis pantothenate kinase | |
| Khandazhinskaya et al. | Novel fleximer pyrazole-containing adenosine analogues: Chemical, enzymatic and highly efficient biotechnological synthesis | |
| Alexeev et al. | Use of nucleoside phosphorylases for the preparation of 5-modified pyrimidine ribonucleosides | |
| Rammler et al. | Nucleoside phosphonic acids. II. The synthesis of 5'-deoxythymidine 5'-phosphonic acid and its pyrophosphate derivatives | |
| RU2664472C1 (en) | 7-methyl-2'-deoxyguanosine hydroiodide salt as substrate for producing 2'-deoxynucleosides by method of enzyme transglycosylation | |
| US11858953B2 (en) | Compositions and methods for synthesis of phosphorylated molecules | |
| JP4601060B2 (en) | Azido amino sugar nucleotides and their applications | |
| Lamiable-Oulaidi et al. | Synthesis and characterization of transition-state analogue inhibitors against human DNA methyltransferase 1 | |
| JP7266896B2 (en) | β-modified phosphate compound precursor, β-modified phosphate compound, reaction inhibitor, drug containing the same, and reaction inhibition method | |
| Merino et al. | Nucleoside diphosphate sugar analogues that target glycosyltransferases | |
| Hassan et al. | 6-Methylpurine derived sugar modified nucleosides: Synthesis and in vivo antitumor activity in D54 tumor expressing M64V-Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase | |
| RU2624023C2 (en) | METHOD FOR PRODUCTION OF PURINE NUCLEOSIDES OF β-D-ARABINOFURANOSE SERIES | |
| Stepchenko et al. | Enzymatic synthesis and phosphorolysis of 4 (2)-thioxo-and 6 (5)-azapyrimidine nucleosides by E. coli nucleoside phosphorylases | |
| RU2708971C1 (en) | Method for producing a salt of α-d-ribofuranoso-1-phosphate or α-d-2-deoxyribofuranoso-1-phosphate | |
| JP2009221168A (en) | Nucleoside or nucleotide derivative, nucleic acid derivative, target substance-capturing material, method for capturing and/or releasing target substance, and hemin aptamer | |
| Ivanov et al. | Synthesis and biological properties of pyrimidine 4′-fluoronucleosides and 4′-fluorouridine 5′-O-triphosphate | |
| Konstantinova et al. | The arsenolysis reaction in the biotechnological method of synthesis of modified purine β-D-arabinonucleosides | |
| RU2836333C1 (en) | Method of producing cladribine by enzymatic transglycosylation of 2-chloro-6-azidopurine with successive two-step conversion of azido group |