RU2664467C2 - Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток - Google Patents
Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2664467C2 RU2664467C2 RU2014140371A RU2014140371A RU2664467C2 RU 2664467 C2 RU2664467 C2 RU 2664467C2 RU 2014140371 A RU2014140371 A RU 2014140371A RU 2014140371 A RU2014140371 A RU 2014140371A RU 2664467 C2 RU2664467 C2 RU 2664467C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- composition
- stem cells
- cell culture
- acid
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 128
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 230
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 64
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 74
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 41
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 41
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 37
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 37
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 37
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 35
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 35
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 35
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 35
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 27
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 27
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 27
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 25
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 20
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 20
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims description 18
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 claims description 18
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 17
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 17
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 16
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 claims description 13
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 5
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 claims description 4
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 claims description 4
- 235000001809 DL-alpha-tocopherylacetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011626 DL-alpha-tocopherylacetate Substances 0.000 claims description 4
- 229910005793 GeO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 4
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 4
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 4
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 4
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 claims description 4
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 claims description 4
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 2
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 claims 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 2
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 claims 1
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims 1
- 229960002969 oleic acid Drugs 0.000 claims 1
- 229940098695 palmitic acid Drugs 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 79
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 46
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 46
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 29
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 26
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 26
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 24
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 22
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 description 22
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 21
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 21
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 21
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 13
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710123134 Ice-binding protein Proteins 0.000 description 9
- 101710082837 Ice-structuring protein Proteins 0.000 description 9
- 101710107540 Type-2 ice-structuring protein Proteins 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 7
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- 206010063092 Trisomy 12 Diseases 0.000 description 6
- 239000000306 component Substances 0.000 description 6
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 101001051969 Bos taurus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 3
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 3
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 3
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 1
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 1
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 1
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 231100000071 abnormal chromosome number Toxicity 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 108010023079 activin B Proteins 0.000 description 1
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000003715 calcium chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены варианты определенного состава культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток. Предложены также варианты способа размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием указанного состава. Культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток сохраняет плюрипотентность и кариотипическую стабильность клеток по меньшей мере в течение 10 пассажей. 8 н. и 21 з.п. ф-лы, 18 ил., 12 табл., 6 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка испрашивает преимущество предварительной заявки на патент США № 61/607706, поданной 7 марта 2012 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки для любых целей.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области пролиферации и обновления плюрипотентных стволовых клеток в условиях среды определенного состава.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Для размножения недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток традиционно использовали питающие клетки, которые обеспечивали достаточно факторов для поддержки иммобилизации, пролиферации и обновления плюрипотентных маркеров. Ранее существовавшие способы образования и культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток требовали использования мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) в качестве питающих клеток. В последующих методиках применяли «кондиционированные среды» и покрытие внеклеточным матриксом для замещения питающих клеток. Под кондиционированными средами понимают такие среды, которые были модифицированы питающими клетками, такими как MEF. Однако недостаток данных способов заключается в расхождениях в партиях кондиционированных сред или культурах питающих клеток для постоянной поддержки размножения плюрипотентных стволовых клеток. Более того, обе системы приводят к появлению неопределенных факторов, которые могут по-разному воздействовать на плюрипотентные стволовые клетки. Соответственно, приготовление недорогой воспроизводимой культуральной среды определенного состава, которая способствует постоянному размножению плюрипотентных стволовых клеток, представляет большой интерес для области регенеративной медицины.
Определяющая характеристика человеческих эмбриональных стволовых клеток (клетки hES) состоит в том, что клетки проявляют тенденцию к дифференцировке в различные линии клеток. Такая нежелательная дифференцировка может препятствовать единообразной и направленной дифференцировке, необходимой для последующего образования желаемых конкретных типов клеток. На самом деле, как питающие клетки, так и условия кондиционированных сред, как правило, обеспечивают определенный уровень нежелательной дифференцировки, в частности, по краям растущей колонии ES-клеток или в центре колонии.
Результаты недавно проведенных исследований привели к замене питающих клеток или кондиционированной среды на целый ряд вариантов замещенных культур, например: заменитель нокаутной сыворотки (KSR) в средах (2005, Nature Methods, 2:185-189). KSR содержит неочищенную фракцию альбумина бычьей сыворотки (БСА) неопределенного состава. В других случаях было продемонстрировано продолжительное сохранение плюрипотентности в среде определенного химического состава с FGF2, активином A и инсулином (Vallier et al., 2005, J Cell Sci, 118:4495-4509). Доступные в продаже составы сред, включая среду mTeSR®1 (StemCell Technologies, г. Ванкувер, Канада) и StemPro™ (Invitrogen, штат Калифорния), также ранее использовали для обновления и пролиферации человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Предшествующий уровень техники по разработкам сред определенного состава также отражен в US7449334, US7442548, US7005252, US2008/0268534, US7410798, US7297539 и US6800480. Более того, в недавних публикациях также улучшался состав среды mTeSR®1 до восьми компонентов (Nature Methods, 2011, 8:424-424), и отмечали, что даже в средах определенного состава присутствует стороннее (-ие) вещество (-а), что может на самом деле замедлять пролиферацию клеток ES или подавлять их плюрипотентное состояние. Улучшенная среда mTeSR®1 содержит основную среду DMEM/F12 с добавками инсулина, селена, трансферрина, аскорбиновой кислоты, FGF2 (bFGF) и TGFβ или ингибиторов нодального сигнала с коррекцией рН с помощью NaHCO3.
Следовательно, очевидно, что по-прежнему существует потребность в полностью определенных условиях среды, которые обеспечивают постоянство в отношении размножения плюрипотентных клеток при одновременном минимальном количестве добавляемых компонентов.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к определенному составу культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, причем определенный состав культивирования клеток содержит основную среду, инсулин, трансферрин, селен, свободный от жирных кислот альбумин, лиганд TGF-β, bFGF и аскорбиновую кислоту; и причем культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности стволовых клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения состав культивирования клеток дополнительно содержит инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения состав культивирования клеток содержит DMEM-F12.
Настоящее изобретение относится к определенному составу культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, причем определенный состав культивирования клеток содержит основную среду, инсулин, трансферрин, селен, свободный от жирных кислот альбумин, лиганд TGF-β, bFGF, аскорбиновую кислоту, следовые количества элементов C, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту, хлорид лития, глюкозу, липиды определенного состава и дипептид L-аланин-L-глутамин; и причем культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности стволовых клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения состав культивирования клеток содержит MCDB-131.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ITS-X представляет инсулин, трансферрин и селен для определенного состава культивирования клеток настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ITS-X присутствует в концентрации от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ITS-X присутствует в концентрации приблизительно 1%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используется химически чистый свободный от жирных кислот альбумин. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химически чистый свободный от жирных кислот БСА присутствует в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 2,5%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химически чистый свободный от жирных кислот БСА присутствует в концентрации приблизительно 2%.
В некоторых вариантах осуществления лиганд TGF-β в определенном составе культивирования клеток представляет собой TGF-β1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения TGF-β1 присутствует в концентрации от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения TGF-β1 присутствует в концентрации приблизительно 1 нг/мл.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения bFGF присутствует в определенном составе культивирования клеток в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения bFGF присутствует в определенном составе культивирования клеток в концентрации приблизительно 50 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения bFGF присутствует в определенном составе культивирования клеток в концентрации приблизительно 100 нг/мл.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) присутствует в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения IGF-1 присутствует в определенном составе культивирования клеток в концентрации приблизительно 20 нг/мл.
В некоторых аспектах настоящего изобретения аскорбиновая кислота присутствует в определенном составе культивирования клеток в концентрации от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 0,3 мМ. В некоторых аспектах настоящего изобретения аскорбиновая кислота присутствует в определенном составе культивирования клеток в концентрации приблизительно 0,25 мМ.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к определенному составу культивирования клеток, который содержит по существу основную среду DMEM-F12, ITS-X (для внесения инсулина, трансферрина и селена), свободный от жирных кислот альбумин, лиганд TGF-β, bFGF, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) и аскорбиновую кислоту.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к определенному составу культивирования клеток, содержащему по существу MCDB-131, ITS-X (как источник инсулина, трансферрина и селена), свободный от жирных кислот альбумин, лиганд TGF-β, bFGF, аскорбиновую кислоту, следовые количества элементов C, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту, хлорид лития, глюкозу, липиды определенного состава и дипептид L-аланин-L-глутамин.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, который включает культивирование человеческих плюрипотентных стволовых клеток на матриксе без питающих клеток в определенном составе культивирования клеток; причем определенный состав культивирования клеток содержит основную среду, инсулин, трансферрин, селен, свободный от жирных кислот альбумин, лиганд TGF-β, bFGF и аскорбиновую кислоту; и причем культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей. В некоторых вариантах осуществления определенный состав культивирования клеток дополнительно содержит инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1). В некоторых вариантах осуществления состав культивирования клеток содержит DMEM-F12.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, который включает культивирование человеческих плюрипотентных стволовых клеток на матриксе без питающих клеток в определенном составе культивирования клеток; причем определенный состав культивирования клеток содержит основную среду, инсулин, трансферрин, селен, свободный от жирных кислот альбумин, лиганд TGF-β, bFGF, аскорбиновую кислоту, IGF-1, следовые количества элементов C, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту, хлорид лития, глюкозу, липиды определенного состава и дипептид L-аланин-L-глутамин. В некоторых вариантах осуществления состав культивирования клеток, который используется в способе для размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, содержит MCDB-131.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является популяция клеток in vitro, причем более 50% популяции клеток являются положительными по экспрессии белков OCT4, SOX2, NANOG, FOXA2 и отрицательными или с низкой экспрессией SSEA-4 и ZFP42. Популяцию получали культивированием плюрипотентных стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток, содержащем основную среду с добавками IGF-1, инсулина, bFGF, лиганда TGF-B и свободного от жирных кислот альбумина; и причем определенный состав культивирования клеток не содержит аскорбиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определенный состав культивирования клеток содержит основную среду DMEM/F12. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определенный состав культивирования клеток содержит инсулин в форме ITS-X. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ITS-X присутствует в концентрации от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%. В некоторых аспектах настоящего изобретения ITS-X присутствует в концентрации приблизительно 1%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используется химически чистый свободный от жирных кислот альбумин. В некоторых аспектах настоящего изобретения химически чистый свободный от жирных кислот альбумин присутствует в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 2,5%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химически чистый свободный от жирных кислот альбумин присутствует в концентрации приблизительно 2%. В некоторых аспектах настоящего изобретения лиганд TGF-B представляет собой TGF-B1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения TGF-В1 присутствует в концентрации от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл. В некоторых аспектах настоящего изобретения TGF-B1 присутствует в концентрации приблизительно 1 нг/мл.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На Фиг. 1A-1D представлены фазоконтрастные изображения клеток H1, культивированных при 3 пассажах в IH-3 (ФИГ. 1A), IH-1 (ФИГ. 1B), IH-6 (ФИГ. 1C) и mTeSR®1 (ФИГ. 1D).
На Фиг. 2A-2C представлены фазоконтрастные изображения клеток H1, культивированных при 10 пассажах в IH-3 (ФИГ. 2A), IH-1 (ФИГ. 2B) и среде mTeSR®1 (ФИГ. 2C).
На Фиг. 3A-3C представлены фазоконтрастные изображения клеток H1, культивированных при 18 пассажах в IH-3 (ФИГ. 3A), IH-1 (ФИГ. 3B) и среде mTeSR®1 (ФИГ. 3C).
На Фиг. 4A-4F представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии следующих генов в клетках линии H1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных в среде, описанной в примере 1, и собранных при пассажах 1-5 (P1-P5); ZFP42 (ФИГ. 4A), SOX2 (ФИГ. 4B), POU5F1 (OCT4) (ФИГ. 4C), Nanog (ФИГ. 4D), FOXA2 (ФИГ. 4E) и AFP (ФИГ. 4F).
На Фиг. 5A-5B представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии Nanog, POU5F1 (OCT4), SOX2 и ZFP42 (ФИГ. 5A), а также AFP и FOXA2 (ФИГ. 5B) в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных в среде, описанной в примере 1, и собранных при пассаже 10.
На Фиг. 6А-6В представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии ZFP42, SOX2, POU5F1 (OCT4) и Nanog (ФИГ. 6A), а также AFP и FOXA2 (ФИГ. 6B) в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных в среде, описанной в примере 1, и собранных при пассаже 18.
На Фиг. 7А-7F представлена гистограмма FACS для профилей экспрессии следующих маркеров в клетках, культивированных при 18 пассажах в среде IH-3, описанной в примере 1: изотипный контроль (ФИГ. 7A); KI-67 (ФИГ. 7B); OCT4 (ФИГ. 7C); SOX17 (ФИГ. 7D); FOXA2 (ФИГ. 7E); и SOX2 (ФИГ. 7F). На каждой гистограмме представлен процент экспрессии каждого маркера.
На Фиг. 8A-8F представлены изображения клеток, культивированных при 18 пассажах в среде IH-3, описанной в примере 1, с иммунным окрашиванием для OCT-4, FOXA2, SOX2 и флуоресцентной меткой для ДНК с использованием DAPI. Изображения, полученные для OCT4 (ФИГ. 8A), FOXA2 (ФИГ. 8B) и окрашенной DAPI ДНК (ФИГ. 8C), регистрировали в одном и том же оптическом поле, но с различными фильтрами. Аналогичным образом изображения, полученные для SOX2 (ФИГ. 8D), FOXA2 (ФИГ. 8E) и окрашенной DAPI ДНК (ФИГ. 8F), регистрировали в одном и том же оптическом поле, но с другими фильтрами.
На Фиг. 9A-9F представлены фазоконтрастные изображения клеток H1, культивированных при пяти пассажах в среде mTeSR®1 (ФИГ. 9A) и в составах IH-3 (ФИГ. 9B), IH-3-1 (ФИГ. 9C), IH-3-2 (ФИГ. 9D), IH-3-3 (ФИГ. 9E) и IH-3-4 (ФИГ. 9F), описанных в примере 2.
На Фиг. 10A-10E представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии следующих генов в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных в среде, описанной в примере 2, и собранных при пассаже 5: ZFP42 (ФИГ. 10A), SOX2 (ФИГ. 10B), FOXA2 (ФИГ. 10C), Nanog (ФИГ. 10 D) и POU5F1 (OCT4) (ФИГ. 10E).
На Фиг. 11A-11D представлены фазоконтрастные изображения клеток H1, культивированных при 20 пассажах в составах сред mTeSR®1 (ФИГ. 1A), IH-3 (ФИГ. 11B), IH-1 (ФИГ. 11C) и IH-3RT (ФИГ. 11D), описанных в примере 3.
На Фиг. 12A-12F представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии следующих генов в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных при 15 пассажах в среде, описанной в примере 3: AFP (ФИГ. 12A), FOXA2 (ФИГ. 12B), SOX2 (ФИГ. 12C), Nanog (ФИГ. 12D), POU5F1 (OCT4) (ФИГ. 12E) и ZFP42 (ФИГ. 12F).
На Фиг. 13A-13F представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии следующих генов в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных при 20 пассажах в среде mTeSR®1 и в средах IH-1 и IH-3, описанных в примере 3: AFP (ФИГ. 13A), FOXA2 (ФИГ. 13B), NANOG (ФИГ. 13C), POU5F1 (OCT4) (ФИГ. 13D), SOX2 (ФИГ. 13E) и ZFP42 (ФИГ. 13F).
На Фиг. 14A-14B представлены фазоконтрастные изображения клеток Н1, культивированных в течение 4 суток в составах сред, описанных в примере 5, которые содержат Sigma БСА (ФИГ. 14A) или свободный от жирных кислот БСА (ФИГ. 14B).
На Фиг. 15A-15B представлены фазоконтрастные изображения для клеток Н1, культивированных при трех пассажах в составах сред, описанных в примере 5, содержащих Sigma БСА (ФИГ. 15A) или свободный от жирных кислот БСА (ФИГ. 15B).
На Фиг. 16A-16C представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии следующих генов в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных при трех пассажах в составах сред, описанных в примере 5 и содержащих Sigma БСА или свободный от жирных кислот БСА: AFP (ФИГ. 16A), MIXL1 (ФИГ. 16B) и T (BRY) (ФИГ. 16C).
На Фиг. 17A-17D представлены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии следующих генов в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных при десяти пассажах в составах сред, описанных в примере 6: SOX2 (ФИГ. 17A), POU5F1 (ФИГ. 17B), NANOG (ФИГ. 17C) и FOXA2 (ФИГ. 17C).
На Фиг. 18A-18E представлены фазоконтрастные изображения клеток Н1, культивированных при 10 пассажах в составах сред IH-3 (ФИГ. 18A), IH-3P-2 (ФИГ. 18B), IH-3P-3 (ФИГ. 18C), IH-3P-4 (ФИГ. 18D) и IH-3P-5 (ФИГ. 18E), описанных в примере 6.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для четкости описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные элементы, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, т.е. способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные преобразоваться в подмножество клеточных линий дифференцировки, но все в рамках конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут образовывать потомство, включая ГСК (самообновление), рестриктированные олигопотентные клетки-предшественники клеток крови и все типы клеток и элементы (например, тромбоциты), представляющие собой стандартные компоненты крови); (4) олигопотентные, т.е. способные преобразоваться в более рестриктированное подмножество клеточных линий дифференцировки, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные преобразоваться в единственную клеточную линию дифференцировки (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, такой как нервная или мышечная клетка. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированной дифференцировкой представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки относится к клетке, дошедшей в процессе дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу клеток. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцировки клетки. При использовании в настоящем документе термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, т.е. определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток интересующей линии дифференцировки, которую можно использовать для оценки дифференцировки некоммитированной клетки в интересующей линии дифференцировки.
При использовании в настоящем документе термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующей клетке. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества способов, известных в данной области.
«Основной средой» называют раствор солей, питательных веществ и витаминов, который может поддерживать рост плюрипотентных стволовых клеток в культуре. В качестве основной среды, помимо прочих, можно использовать модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), среду MCDB, RPMI. DMEM может также представлять собой DMEM/F12 (также называется DM-F12) или DMEM с высоким содержанием глюкозы (также называется DMEM-hg). Среду MCDB можно выбрать из любых доступных сред MCDB, в частности, MCDB-131. В альтернативном варианте осуществления основную среду можно выбрать из смесей перечисленных выше составов основных сред в соответствующих соотношениях, чтобы обеспечить пролиферацию и обновление плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления основной средой в определенных составах культивирования клеток настоящего изобретения является DMEM-F12. В некоторых вариантах осуществления основной средой в определенных составах культивирования клеток настоящего изобретения является MCDB-131.
«Питающими клетками» называют не являющиеся плюрипотентными стволовые клетки, на которые высеваются плюрипотентные стволовые клетки. Питающие клетки обеспечивают достаточно растворимых и нерастворимых факторов, способствующих иммобилизации, пролиферации и обновлению плюрипотентных маркеров плюрипотентными стволовыми клетками.
«Кондиционированной средой» называют среду, которая также дополняется растворимыми факторами, полученными из питающих клеток.
«Внеклеточный матрикс» или «матрикс определенного состава», или «синтетический матрикс» обозначает одно или более веществ, которые могут обеспечивать иммобилизацию, пролиферацию и обновление плюрипотентных маркеров плюрипотентными стволовыми клетками. В настоящем документе термины IGF и IGF-1, которые относятся к инсулиноподобному фактору роста 1, используются взаимозаменяемо. В организме человека данный белок вырабатывается в печени и выполняет по большей части те функции, которые относятся к человеческому гормону роста.
В настоящем документе термины FGF2 и bFGF, которые относятся к человеческому основному фактору роста фибробластов, используются взаимозаменяемо.
В настоящем документе термины «TGF beta», «TGF-B» и «TGF-β» используются взаимозаменяемо. Лиганд TGF-β может быть выбран из костных морфогенетических белков (BMP), фактора роста и дифференцировки (GDF), активинов (активин A, активин AB, активин B, активин C), ингибиторов нодального сигнала и TGF-β. TGF-β может быть выбран из TGF-β1, TGF-β2, активина A и TGF-β3.
Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадиеспецифических эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, поддающиеся обнаружению антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к утрате экспрессирования SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81 (если имеются) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которую можно обнаружить путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, обнаруживаемые с помощью ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток можно подтвердить, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их последующего гистологического исследования на наличие клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. Альтернативно плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на присутствие маркеров, ассоциируемых с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с применением стандартного способа G-бэндинга и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений. Плюрипотентные клетки можно легко размножить в культуре путем использования различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых матриксными белками. Альтернативно химически определенные поверхности в комбинации со средами определенного состава, такими как среды mTeSR® 1 (StemCell Technologies, г. Ванкувер, Канада), можно использовать для обычного размножения клеток. Плюрипотентные клетки можно легко удалить из планшетов с культурой при помощи ферментативной, механической обработки или с использованием различных кальцийхелатирующих агентов, таких как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Альтернативно плюрипотентные клетки можно размножить в суспензии в отсутствие каких-либо матриксных белков или питательного слоя.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
Типы подходящих плюрипотентных стволовых клеток включают в себя устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, включая преэмбриональную ткань (такую как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Не имеющими ограничительного характера примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, такие как, например, линии H1, H7 и H9 эмбриональных стволовых клеток человека (WiCell Research Institute, г. Мэдисон, штат Висконсин). Также возможно использование описываемых в настоящем документе композиций в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в данном случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые непосредственно из тканей-источников. Также подходящими являются клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также подходящими являются индуцибельные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, которые могут быть получены из взрослых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов, относящихся к плюрипотентным транскрипционным факторам, таким как OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12:165-185).
Эмбриональные стволовые клетки человека можно приготовить, как описано в публикации Thomson et al. (патент США № 5843780; Science, 1998; 282:1145-1147; Curr Top Dev Biol, 1998; 38:133-165; 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:7844-7848).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. Маркеры плюрипотентных стволовых клеток включают в себя, например, экспрессию одного или более следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
Маркеры дифференцирования, которые, как правило, присутствуют в культурах эмбриональных стволовых клеток, включают в себя, например, AFP, FOXA2, SOX17, T(BRY) и MIXL1.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения человеческие плюрипотентные стволовые клетки культивируют в среде определенного состава, содержащей аскорбиновую кислоту, IGF, инсулин, bFGF, лиганд TGF-B и свободный от жирных кислот альбумин для поддержки пролиферации плюрипотентных стволовых клеток при одновременном сохранении плюрипотентности и кариотипической стабильности размножающихся клеток по меньшей мере в течение 10 пассажей.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является популяция клеток in vitro, причем более 50% популяции клеток являются положительными по экспрессии белков OCT4, SOX2, NANOG, FOXA2 и положительными, но с низкой экспрессией SSEA-4 и ZFP42.
В другом аспекте настоящего изобретения описан определенный состав культивирования клеток in vitro, содержащий IGF, инсулин, bFGF, TGF-B, свободный от жирных кислот альбумин, но без аскорбиновой кислоты, что позволяет получить популяцию клеток, где более 50% клеточной популяции являются положительными по окрашиванию на белки OCT4, SOX2, NANOG, FOXA2 и с низким уровнем экспрессии белка SSEA-4 и ZFP42.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано, без ограничений, следующими примерами, в которых части и проценты даны в весовом выражении, а градусы приводятся в Цельсиях, если не указано иное. Должно быть понятно, что данные примеры, где представлены предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приводятся исключительно для иллюстрации. Из приведенного выше описания и приведенных ниже примеров специалист в данной области может установить основные характеристики настоящего изобретения и провести различные изменения и модификации настоящего изобретения для адаптации его к различным условиям и типам применения без отклонения от его сущности и объема. Таким образом, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе будут очевидны специалистам в данной области на основании вышеизложенного описания. Такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ путем ссылки.
Пример 1
Испытание различных условий культивирования для идентификации оптимальных компонентов среды для пролиферации недифференцированных эмбриональных стволовых клеток
Клетки линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток (пассажи с 35 по 40), которые культивировали на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30; BD Biosciences, г. Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси) чашках в среде mTeSR®1 (StemCell Technologies, г. Ванкувер, Канада) и пересеивали с помощью ЭДТА, использовали в качестве исходной популяции для испытания различных композиций сред. Клетки пересеивали малыми колониями с обработкой ЭДТА в течение 5-10 минут при комнатной температуре. Культуры стандартным образом делились в соотношении от 1:6 до 1:10 при каждом пассаже. В таблице I перечислены исходные составы сред, испытанные с точки зрения их способности к пролиферации клеток Н1 при одновременном сохранении их недифференцированных маркеров морфологии и плюрипотентности.
| Таблица I | ||
| Номер среды | Основная среда | Добавляемая компоненты* |
| IH-1 | MCDB-131 | 1 × следовые количества элементов C**, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ HEPES, 1 мМ хлорида лития, 10 мМ глюкозы, 1:500 × липиды определенного состава***, 1 × ITS-X, 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 1× GlutaMAX™ |
| IH-2 | MCDB-131 | 1 × следовые количества элементов C**, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ HEPES, 1 мМ хлорида лития, 10 мМ глюкозы, 1:500 × липиды определенного состава***, 1 × ITS-X, 2% обогащенный липидами БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 1× GlutaMAX™ |
| IH-3 | DM-F12 | 1 × ITS-X, 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1 |
| IH-4 | DM-F12 | 1 × следовые количества элементов C**, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ HEPES, 1 мМ хлорида лития, 10 мМ глюкозы, 1:500 × липиды определенного состава***, 1 × ITS-X, 2% БСА (из Новой Зеландии), 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 1× GlutaMAX™ |
| IH-5 | DM-F12 | 1 × следовые количества элементов C**, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ HEPES, 1 мМ хлорида лития, 10 мМ глюкозы, 1:500 × липиды определенного состава***, 1 × ITS-X, 2% БСА стандартной чистоты, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 1× GlutaMAX™ |
| IH-6 | DM-F12 | 1 × неосновные аминокислоты, 1 × ITS-X, 20 нг/мл bFGF, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 0,95 мкМ CHIR99021, 0,4 мкМ PD0325901 и 10 мкМ Y-27632 |
| * Следовые количества элементов C** (Mediatech, г. Манассас, штат Вирджиния), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния), LiCl (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), глюкоза (Sigma), липиды определенного состава*** (Invitrogen), химически чистый свободный от жирных кислот БСА (Proliant, г. Анкени, штат Айова), TGF-β1 (R & D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота), bFGF (R & D Systems), IGF-1 (R & D Systems), GlutaMAX™ (200 мМ дипептида L-аланил-L-глутамин в 0,85% NaCl; Invitrogen), богатый липидами БСА- Albumax (Invitrogen), ITS-X (инсулин, трансферрин, добавка селена-X; Invitrogen), новозеландский БСА стандартной чистоты (Lampire Biological Laboratories, г. Куперсберг, штат Пенсильвания), БСА стандартной чистоты (Lampire), NEAA (Invitrogen), меркаптоэтанол (Invitrogen), CHIR99021 (Stemgent, г. Кембридж, штат Массачусетс), PD0325901 (Sigma), Y2763 (Sigma). ** жидкость 1000× следовых количеств элементов C (Mediatech), № кат. 99-176, содержит: 1,20 мг/л AlCl3 • 6H2O, 0,17 мг/л AgNO3, 2,55 мг/л Ba(C2H3O2)2, 0,12 мг/л KBr, 2,28 мг/л CdCl2, 2,38 мг/л CoCl2 • 6H2O, 0,32 мг/л CrCl3 (безводный), 4,20 мг/л NaF, 0,53 мг/л GeO2, 0,17 мг/л KI, 1,21 мг/л RbCl и 3,22 мг/л ZrOCl2 • 8H2O. *** производимый Invitrogen концентрат липидов определенного состава, № кат. 11905031, содержит 100,0 мл/л этилового спирта (200 градусов) и 2 мг/мл арахидоновой кислоты, 220 мг/л холестерина, 70 мг/л DL-альфа-токоферола ацетата, 0 мг/л этилового спирта 100%, 10 мг/л линолевой кислоты, 10 мг/л линоленовой кислоты, 10 мг/л миристиновой кислоты, 10 мг/л олеиновой кислоты, 10 мг/л пальмитиновой кислоты, 10 мг/л пальмитоолеиновой кислоты, 90000 мг/л Pluronic F-68, 10 мг/л стеариновой кислоты и 2200 мг/л Tween 80™ (ICI Americas, Inc., г. Бриджуотер, штат Нью-Джерси). |
Использование IH-4 и IH-5 для дальнейших оценок было прекращено, поскольку клетки, культивированные с помощью IH-4 и IH-5, не удавалось вырастить после пассажа 2. На пассаже 2 клетки, выращенные в IH-2, демонстрировали существенные изменения в морфологии, которые соответствовали дифференцированным клеткам и потере массы колоний. Среды IH-1, IH-3 и IH-6 выбирали для дальнейшей оценки. На пассаже 3-5 клетки, культивированные в IH-6, демонстрировали морфологические свидетельства дифференцированных клеток на периферии колоний ES (можно сравнить ФИГ. 1C с ФИГ. 1A, ФИГ. 1B и ФИГ. 1D).
После пассажа 5 только среды IH-1 и IH-3 по-прежнему использовали для сравнения с клетками, культивированными в среде mTeSR®1. На пассажах с 5 по 18 отбирали образцы из культур IH-1, IH-3 и mTeSR®1 и анализировали их с помощью FACS, ПЦР, кариотипического анализа (G-бэндинг или FISH) и иммунофлуоресцентного окрашивания. Результаты анализа FISH представлены в таблице II. Данные результаты показывают, что клетки H1, культивированные в среде IH-1 или в среде IH-3, демонстрировали нормальный кариотип, тогда как клетки, культивированные в среде mTeSR®1, проявляли аномальную трисомию 12 на пассаже 10 и 18.
| Таблица II Результаты анализа FISH хромосомы 12 и хромосомы 17 с помощью CellLineGenetics (г. Мэдисон, штат Висконсин) |
|||
| Среда | P5 | P10 | P18 |
| IH-1 | Норма | Норма | Норма |
| IH-3 | Норма | Норма | Норма |
| mTeSR®1 | Норма | 14% трисомия 12, норма 17 | 14% трисомия 12, норма 17 |
Более того, аналогично росту клеток в среде mTeSR®1 клетки, постоянно пересеиваемые в среде IH-1, сохраняли характерную морфологию колонии ES с очень небольшим количеством дифференцированных клеток вокруг колоний. Однако после пассажа 10 клетки, выращенные в среде IH-3, начали утрачивать характерную морфологию колонии ES (см. ФИГ. 1A, ФИГ. 2A и ФИГ. 3A).
Анализ маркеров клеточной поверхности и внутренних маркеров, связанных с плюрипотентностью, использовали для оценки воздействия испытуемых составов на сохранение плюрипотентности. Как показано в таблице III, при пассаже 5 клетки, культивированные в IH-1 и IH-3, демонстрировали профиль маркеров клеточной поверхности, который был аналогичен культурам, выращиваемым в среде mTeSR®1. Однако к пассажу 10 клетки Н1, культивированные в среде IH-3, демонстрировали существенное падение экспрессии SSEA-4 и умеренное падение экспрессии TRA1-60 и 1-81. Клетки H1, культивированные в среде IH-1 при 10 пассажах, сохраняли характеристики экспрессии, которые были аналогичны культивированным в среде mTeSR®1.
| Таблица III Результаты FACS на пассаже 5 и пассаже 10 для маркеров клеточной поверхности, связанных с плюрипотентным состоянием клеток |
||||
| P5 | ||||
| %CD9 | %SSEA-4 | %TRA 1-60 | %TRA 1-81 | |
| IH-1 | 80 | 98 | 50 | 54 |
| IH-3 | 83 | 87 | 39 | 50 |
| mTeSR®1 | 60 | 99 | 56 | 63 |
| P10 | ||||
| IH-1 | 83 | 95 | 55 | 44 |
| IH-3 | 93 | 15,7 | 42 | 31 |
| mTeSR®1 | 58 | 97 | 55 | 62 |
Неожиданно было обнаружено, что аналогично клеткам Н1, культивированным в средах mTeSR®1 и IH-1, клетки H1, культивированные в среде IH-3, сохраняли высокий уровень экспрессии маркеров OCT4 и SOX2 на пассаже 11 (таблица IV). Это наблюдалось несмотря на очень низкий уровень экспрессии SSEA-4 для клеток H1, культивированных в среде IH-3.
| Таблица IV Внутренние маркеры и маркеры клеточной поверхности клеток, культивированных при 11 пассажах в средах IH-1, IH-3 и mTeSR®1 |
|||
| %Sox2 | %SSEA-4 | %Oct3/4 | |
| IH-1 | 97 | 97 | 92 |
| IH-3 | 98 | 4,2 | 96 |
| mTeSR®1 | 98 | 98 | 92 |
Как показано на Фиг. 4, экспрессия мРНК основными маркерами плюрипотентности, например, Nanog (ФИГ. 4D), OCT4 (ФИГ. 4C), SOX2 (ФИГ. 4B) и ZPF42 (ФИГ. 4A), сохранялась в течение всего пассажа 5 для клеток Н1, культивированных в средах IH-1 и IH-3, на том же уровне, что и в клетках Н1, культивированных в mTeSR®1. Однако к пассажам с 10 по 18 отмечали существенное падение экспрессии ZFP42, тогда как экспрессия OCT4, Nanog и SOX2 изменилась незначительно для клеток, выросших в среде IH-3, по сравнению с клетками Н1, культивированными в среде IH-1 или mTeSR®1 (см. ФИГ. 5A и ФИГ. 6A). Более того, анализ FACS клеток Н1, культивированных в среде IH-3 в течение 18 пассажей, показал, что >97% клеток представляли собой OCT4+ (ФИГ. 7C), SOX2+ (ФИГ. 7F) и KI-67+ (ФИГ. 7B). Приблизительно 1% клеток представлял собой SOX17+ (ФИГ. 7D), и ~85% клеток представляли собой FOXA2+ (ФИГ. 7E). На Фиг. 8A-8F приведены изображения иммунофлуоресцентного окрашивания клеток H1, культивированных в среде IH-3 при 18 пассажах. Данные изображения демонстрируют, что существенное количество OCT4 и SOX2 положительных клеток также представляли собой FOXA2+. Клетки H1, культивированные в среде IH3, приобретали фенотип, в котором по меньшей мере 70% клеток представляли собой Oct4+ NANOG+ SOX2+ KI-67+ ZFP42- и FOXA2+. Такая популяция клеток до сих пор была не описана в данной области.
Пример 2
Культивирование клеток Н1 в среде IH-3 с добавкой аскорбиновой кислоты восстанавливает основные свойства недифференцированных эмбриональных стволовых клеток
Для выяснения причины падения SSEA-4 и ZPF42 для клеток Н1, культивированных в IH-3, по сравнению с культивированными в средах IH-1 и mTeSR®1 проводили анализ расхождений, чтобы выявить основные реагенты, присутствующие в mTeSR®1 и IH-1, но отсутствующие в среде IH-3. В среду IH-3, как показано в таблице V, добавляли следовые количества элементов C, аскорбиновую кислоту, хлорид лития или липиды определенного состава.
| Таблица V Модификации среды IH-3 |
|
| Среда | Добавки в среду IH-3 |
| IH-3-1 | 1 × следовые количества элементов C |
| IH-3-2 | 0,25 мМ аскорбиновой кислоты |
| IH-3-3 | 1 мМ хлорида лития |
| IH-3-4 | 1:500 × липиды определенного состава |
Клетки H1, культивированные при 14 пассажах в IH-3, затем культивировали в приведенных выше составах сред, а результаты сопоставляли с клетками, культивированными в среде IH-3. На стадии различных пассажей для клеток Н1, культивированных с использованием различных составов сред, проводили анализ плюрипотентных маркеров. Как показано в таблице VI, после пяти дополнительных пассажей клетки Н1, культивированные в среде IH-3-2 (IH-3 с добавлением аскорбиновой кислоты), восстанавливали незначительный процент своей экспрессии SSEA-4 по сравнению с клетками, культивированными в других испытуемых средах.
| Таблица VI Результаты FACS на пяти пассажах после пассажа 15 для маркеров клеточной поверхности, связанных с плюрипотентными состоянием клеток Н |
||
| CD9 | SSEA-4 | |
| mTeSR®1 | 26 | 96,9 |
| IH-1 | 82,9 | 96,9 |
| IH-3 | 89,7 | 0,8 |
| IH-3-1 | 90,4 | 0,9 |
| IH-3-2 | 91,6 | 4,2 |
| IH-3-3 | 87,6 | 0,7 |
| IH-3-4 | 88,8 | 0,6 |
Как показано на ФИГ. 9D, клетки H1, культивированные в среде IH-3-2, сохраняли характерную морфологию эмбриональных стволовых клеток, аналогичную с клетками, культивированными в среде mTeSR®1 (ФИГ. 9A). Однако клетки Н1, культивированные в IH-3, IH-3-1, IH-3-3 и IH-3-4, демонстрировали рыхлую морфологию колонии (см. ФИГ. 9B, ФИГ. 9C и ФИГ. 9F). Анализ ПЦР для клеток, культивированных в указанных выше составах сред, также подтвердил, что клетки Н1, культивированные в среде IH-3-2, восстанавливали определенный уровень экспрессии ZFP42 и снижали экспрессию FOXA2 (см. ФИГ. 10A-10E). Приведенные выше данные показывают, что присутствие аскорбиновой кислоты необходимо для сохранения плюрипотентности клеток ES наряду с их характерной морфологией колонии/клетки и низкой экспрессии маркеров дифференцирования. На основе полученных данных дальнейшее культивирование клеток Н1 в среде IH-3 проводили с добавлением 0,25 мМ аскорбиновой кислоты.
Клетки, культивированные в IH-3-2, частично восстанавливали определенную характерную морфологию колонии клеток ES, тогда как клетки, культивированные в других составах сред IH, демонстрировали более рыхлую морфологию.
Пример 3
Продолжительное культивирование клеток Н1 в средах IH-3 и IH-1 обеспечивает сохранение плюрипотентности и стабильного кариотипа
Клетки линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток (пассажи с 35 по 40), которые культивировали на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTeSR®1 и пересеивали с помощью ЭДТА, как описано в примере 1, использовали в качестве исходной популяции для оценки продолжительного культивирования с использованием сред IH-1, IH-3-2 и mTeSR®1. Клетки пересеивали малыми колониями с обработкой ЭДТА в течение 5-10 минут при комнатной температуре. Компоненты испытуемых сред перечислены в таблице VII.
| Таблица VII Ингредиенты, использованные в составах сред IH-1, IH-3-2 и IH-3RT |
||
| Номер среды | Основная среда | Добавляемые компоненты* |
| IH-1 | MCDB-131 | 1 × следовые количества элементов C, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ HEPES, 1 мМ хлорида лития, 10 мМ глюкозы, 1:500 × липиды определенного состава, 1 × ITS-X, 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 1× GlutaMAX™ |
| IH-3-2 | DM-F12 | 1 × ITS-X, 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. |
| IH-3RT | DM-F12 | 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 5,5 мкг/мл рекомбинантного человеческого трансферрина (Millipore), 10 мкг/мл инсулин (Invitrogen), 0,0067 мкг/мл селенита натрия (Invitrogen). |
Как показано на ФИГ. 11A-11D, клетки H1, культивированные при 20 пассажах в IH-1, IH-3-2 и IH-3RT, сохраняли характерную морфологию ES. Результаты ПЦР анализа для клеток Н1, культивированных при 15 пассажах в IH-1, IH-3-2 и IH-3RT, представлены на ФИГ. 12A-12F. Результаты ПЦР анализа для клеток Н1, культивированных при 20 пассажах в IH-1, IH-3-2 и IH-3RT, представлены на ФИГ. 13A-13F. Проведенный анализ подтвердил, что аналогично клеткам Н1, культивированным в среде mTeSR®1, клетки, культивированные при 15 или 20 пассажах в средах IH-1, IH-3-2 и IH-3RT (рекомбинантный человеческий трансферрин), сохраняли все основные маркеры плюрипотентности, одновременно демонстрируя очень низкий уровень экспрессии FOXA2 и AFP. Анализ FACS на пассаже 15 и пассаже 20 также подтверждает экспрессию маркеров клеточной поверхности, связанных с плюрипотентными клетками, до тех же уровней, что и в клетках Н1, культивированных в среде mTeSR®1 (см. таблицу VIII).
| Таблица VIII Результаты FACS для клеток, испытанных на пассаже 15 и пассаже 20 для маркеров клеточной поверхности, связанных с плюрипотентным состоянием клеток |
||||
| P15 | ||||
| %CD9 | %SSEA-4 | %TRA 1-60 | %TRA 1-81 | |
| IH-1 | 93 | 99 | 59 | 59 |
| IH-3-2 | 72 | 99 | 55 | 52 |
| IH-3RT | 65 | 99 | 50 | 48 |
| mTeSR®1 | 63 | 99 | 49 | 49 |
| P20 | ||||
| IH-1 | 91 | 96 | 52 | 54 |
| IH-3-2 | 91 | 99 | 49 | 53 |
| mTeSR®1 | 66 | 97 | 57 | 63 |
Клетки H1, постоянно культивированные в IH-1, IH-3-2 и IH-3RT, демонстрировали нормальный кариотип, как показали результаты G-бэндинга и анализа FISH. Однако клетки Н1, культивированные при пассажах с 10 по 20 в mTeSR®1, демонстрировали аномальные количества хромосом (см. таблицу IX).
| Таблица IX Анализ FISH и G-бэндинг для клеток Н1, культивированных в IH-1, IH-3, IH-3RT и mTeSR®1 |
|||
| Среда | P10 (G-бэндинг и FISH) | P15 (FISH) | P20 (FISH) |
| IH-1 | 46 XY, нормальные 12 и 17 хромосомы | норма | норма |
| IH-3-2 | 46 XY, нормальные 12 и 17 хромосомы | норма | норма |
| IH-3RT | 46 XY, нормальные 12 и 17 хромосомы | норма | не определяется |
| mTeSR®1 | 48, XY, +12, +14[2], /46, XY[18]- 20% трисомия 12, данные FISH | 11% трисомия 12, норма 17 | 20% трисомия 12, норма 17 |
Пример 4
Одинаковые скорости пролиферации для клеток Н1, культивированных в средах IH-1, IH-3 и mTeSR®1
Чтобы сравнить скорости пролиферации клеток, культивированных в ранее испытанных средах, клетки Н1, культивированные в средах IH-1, IH-3-2 и mTeSR®1, отделяли с помощью TrypLE (Invitrogen) и высеивали с плотностью 5×105 клеток на 10 см в покрытые MATRIGEL™ чашки. Для снижения апоптоза одиночных клеток и повышения уровня иммобилизации отделенные клетки предварительно обрабатывали 10 мкM ингибитора Rock (Sigma). Среду меняли ежедневно в течение трех суток после высевания. На 3 сутки клетки отделяли в виде единичных клеток и подсчитывали с помощью гемоцитометра. Как показано в таблице X, клетки, культивированные во всех трех составах сред, демонстрировали равные времена удвоения.
| Таблица X Времена удвоения клеток Н1, культивированных в составах сред mTeSR®1, IH-1 и IH-3-2 |
|||
| mTeSR®1 | IH-1 | IH-3-2 | |
| 0 ч | 0,5×106 клеток | 0,5×106 клеток | 0,5×106 клеток |
| 72 ч | 6,7×106 клеток | 4,2×106 клеток | 6,8×106 клеток |
| Время удвоения клетки | 19,23 ч | 23,45 ч | 19,12 ч |
Пример 5
Высокочистый свободный от жирных кислот БСА способствует размножению плюрипотентных клеток
Клетки линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток (пассажи с 35 по 40), культивированные в покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTeSR®1 и пересеиваемые с помощью ЭДТА, использовали в качестве исходной популяции для оценки непродолжительно культивируемых клеток с использованием среды IH-3-2 с добавлением либо 2% БСА Sigma (№ кат. A2153; партия: 061M1804V), либо свободного от жирных кислот БСА (Proliant, № кат. 7500804; партия: 11G54001). Клетки пересеивали малыми колониями с обработкой ЭДТА в течение 5-10 минут при комнатной температуре. На Фиг. 14A и Фиг. 14B представлены фазоконтрастные изображения клеток Н1, культивированных в течение 4 суток в среде составов, которые содержат БСА Sigma (ФИГ. 14A) или свободный от жирных кислот БСА (ФИГ. 14B). На Фиг. 15А и Фиг. 15В представлены фазоконтрастные изображения клеток Н1, культивированных при трех пассажах в среде составов, которые содержат БСА Sigma (ФИГ. 15А) или свободный от жирных кислот БСА (ФИГ. 15В). Как показано на ФИГ. 14A, уже на 4 сутки после высевания наблюдали морфологические признаки дифференцированных клеток в культурах в присутствии БСА Sigma. Однако не наблюдали совокупных признаков морфологии дифференцированных клеток, обработанных свободным от жирных кислот БСА (см. ФИГ. 14B). Такую же тенденцию отмечали на пассаже 3, где регистрировали морфологические признаки дифференцированных клеток в культурах, где использовали БСА Sigma (см. ФИГ. 15A), тогда как не наблюдали совокупных признаков морфологии дифференцированных клеток, культивированных в среде, содержащей свободный от жирных кислот БСА (см. ФИГ. 15B). Более того, наблюдали существенное падение конфлюентности клеток, культивированных в среде, содержащей БСА Sigma, по сравнению с клетками, культивированными в среде, содержащей свободный от жирных кислот БСА (можно сравнить ФИГ. 15A и ФИГ. 15B).
Данные ПЦР в реальном времени для экспрессии AFP (ФИГ. 16A), MIXL1 (ФИГ. 16B) и T (BRY) (ФИГ. 16C) в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных при трех пассажах в составах сред, содержащих БСА Sigma или свободный от жирных кислот БСА, показаны на ФИГ. 16A, 16B и 16C. Данные ПЦР на пассаже 3 четко указывали на существенное повышение экспрессии маркеров, связанных с дифференцированными клетками, для клеток, культивированных в среде, содержащей БСА Sigma. Полученные данные однозначно подтверждают, что использование свободного от жирных кислот БСА является очень важным для сохранения плюрипотентности, морфологии колонии и пролиферации клеток.
Пример 6
Плюрипотентные стволовые клетки могут размножаться и сохранять плюрипотентность в среде IH-3 в присутствии свободного от жирных кислот БСА и bFGF в широком диапазоне концентраций
Клетки линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток (пассажи с 35 по 40), которые культивировали на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr®1 и пересеивали с помощью ЭДТА, использовали в качестве исходной популяции для оценки краткосрочного и продолжительного культивирования с использованием среды IH-3 с добавками, которые приведены в таблице XI.
| Таблица XI Ингредиенты, использованные для среды IH-3 с добавками различных количеств БСА и bFGF |
||
| Номер среды | Основная среда | Добавляемые компоненты* |
| IH-3-2 | DM-F12 | 1×ITS-X, 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты |
| IH-3P-2 | DM-F12 | 1×ITS-X, 2% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 50 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты |
| IH-3P-3 | DM-F12 | 1×ITS-X, 1% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты |
| IH-3P-4 | DM-F12 | 1×ITS-X, 0,5% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты |
| IH-3P-5 | DM-F12 | 1×ITS-X, 0% химически чистый свободный от жирных кислот БСА, 1 нг/мл TGF-B1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. |
На пассаже 10 клетки оценивали морфологически с помощью ПЦР с точки зрения плюрипотентности и генов, связанных с дифференцированием. Более того, клетки оценивали на кариотипическую стабильность с помощью анализа FISH по хромосомам 12 и 17. На Фиг. 17A-17D приведены данные ПЦР в реальном времени для экспрессии SOX2 (ФИГ. 17A), POU5F1 (ФИГ. 17B), NANOG (ФИГ. 17C) и FOXA2 (ФИГ. 17D) в клетках линии Н1 человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных при десяти пассажах в составах среды, приведенных в таблице XI. Как показано на данных фигурах, все из приведенных выше составов сохраняли высокий уровень экспрессии плюрипотентных маркеров по сравнению с клетками, выращенными в среде mTeSR®1. Однако клетки, выращенные при 0-0,5% БСА, демонстрировали более высокий уровень экспрессии FOXA2, что указывает на более высокий уровень спонтанного дифференцирования в данных культурах по сравнению с другими испытуемыми составами. На Фиг. 18A-18E представлены фазоконтрастные изображения клеток Н1, культивированных при 10 пассажах в составах сред IH-3-2 (ФИГ. 18A), IH-3P-2 (ФИГ. 18B), IH-3P-3 (ФИГ. 18C), IH-3P-4 (ФИГ. 18D) и IH-3P-5 (ФИГ. 18E), перечисленных в таблице XI. Как показано на данных фигурах, все испытанные в данном примере составы способствовали образованию колоний ES с минимальными признаками совокупной дифференцированной морфологии.
| Таблица XII Анализ FISH хромосом 12 и 17 с помощью CellLineGenetics |
|
| Среда | P10 |
| IH-3-2 | норма |
| IH-3P-2 | норма |
| IH-3P-3 | норма |
| IH-3P-4 | норма |
| IH-3P-5 | норма |
Как показано в таблице XII, клетки H1, культивированные при десяти пассажах в составах сред, перечисленных в таблице XI, сохраняли нормальное число хромосом 12 и 17, что подтверждается анализом FISH. Приведенные выше данные показывают, что среда определенного состава, содержащая основную среду DMEM/F12 с добавками ITS-X, химически чистого свободного от жирных кислот БСА, TGF-B1, IGF-1 и аскорбиновой кислоты, обеспечивает размножение плюрипотентных клеток, одновременно сохраняя плюрипотентность клеток при использовании свободного от жирных кислот БСА и bFGF в широком диапазоне концентраций.
Claims (31)
1. Определенный состав культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, который представляет собой базовую среду DMEM-F12, дополненную инсулином, трансферрином, селеном, свободным от жирных кислот альбумином, лигандом TGF-β в количестве от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл, bFGF в количестве от 50 нг/мл до 100 нг/мл, инсулиновым фактором роста 1 (IGF-1) в количестве от 10 нг/мл до 50 нг/мл и аскорбиновой кислотой в количестве от 0,2 мМ до 0,3 мМ; и причем культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
2. Определенный состав культивирования клеток по п.1,
где базовая среда DMEM-F12 дополнительно дополнена одним или более из хлорида лития, следовых количеств элементов С или липидов определенного состава, где следовые количества элементов С состоят из AlCl3⋅6H2O, AgNO3, Ba(C2H3O2)2, KBr, CdCl2, CoCl2⋅6H2O,CrCl3 (безводного), NaF, GeO2, KI, RbCl и ZrOCl2⋅8H2O, и
где липиды определенного состава состоят из этилового спирта, арахидоновой кислоты, холестерина, DL-альфа-токоферола ацетата, линолевой кислоты, линоленовой кислоты, миристиновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, пальмитоолеиновой кислоты, Pluronic F-68, стеариновой кислоты и Tween 80®.
3. Определенный состав культивирования клеток по п.1, где базовая среда DMEM-F12 дополнительно дополнена 1,20 мг/л AlCl3⋅6H2O, 0,17 мг/л AgNO3, 2,55 мг/л Ba(C2H3O2)2, 0,12 мг/л KBr, 2,28 мг/л CdCl2, 2,38 мг/л CoCl2⋅6H2O, 0,32 мг/л CrCl3 (безводный), 4,20 мг/л NaF, 0,53 мг/л GeO2, 0,17 мг/л KI, 1,21 мг/л RbCl и 3,22 мг/л ZrOCl2⋅8H2O.
4. Определенный состав культивирования клеток по п.1, где базовая среда DMEM-F12 дополнена от 0,2% до 2,5% свободным от жирных кислот альбумином.
5. Определенный состав культивирования клеток по п.1, где базовая среда DMEM-F12 дополнительно дополнена 100,0 мл/л этилового спирта (200 градусов), 2 мг/мл арахидоновой кислоты, 220 мг/л холестерина, 70 мг/л DL-альфа-токоферола ацетата, 10 мг/л линолевой кислоты, 10 мг/л линоленовой кислоты, 10 мг/л миристиновой кислоты, 10 мг/л олеиновой кислоты, 10 мг/л пальмитиновой кислоты, 10 мг/л пальмитоолеиновой кислоты, 90000 мг/л Pluronic F-68, 10 мг/л стеариновой кислоты и 2200 мг/л Tween 80®.
6. Определенный состав культивирования клеток по п.1, где базовая среда DMEM-F12 дополнена 1 мМ хлорида лития.
7. Определенный состав культивирования клеток по п.1, где среда DMEM-F12 дополнена инсулином, трансферрином, селеном, свободным от жирных кислот альбумином, от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл TGF-β1, от 50 нг/мл до 100 нг/мл bFGF, от 10 до 50 нг/мл IGF-1 и от 0,2 мМ до 0,3 мМ аскорбиновой кислотой.
8. Определенный состав культивирования клеток по п.1, где базовая среда DMEM-F12 дополнена инсулином, трансферрином, селеном, свободным от жирных кислот альбумином, 1 нг/мл TGF-β1, 100 нг/мл bFGF, 20 нг/мл IGF-1 и аскорбиновой кислотой.
9. Определенный состав культивирования клеток по п.5, где среда DMEM-F12 дополнена 0,25 мМ аскорбиновой кислоты или 1 мМ хлорида лития.
10. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.1-9, где инсулин, трансферрин и селен предоставляются как ITS-X.
11. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.1-3 и 5-9, где состав для культивирования дополнен в качестве реагента свободным от жирных кислот альбумином.
12. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.1-6, где лиганд TGF-β представляет собой TGF-β1.
13. Способ размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование человеческих плюрипотентных стволовых клеток на матриксе без питающих клеток в определенном составе культивирования клеток по любому из пп.1-9; причем культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
14. Способ по п.13, где человеческие плюрипотентные стволовые клетки представляют собой индуцибельные плюрипотентные клетки, перепрограммированные плюрипотентные клетки или установленные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток.
15. Определенный состав культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, состоящий из DMEM-F12, инсулина, трансферрина, селена, свободного от жирных кислот альбумина в количестве от 0,2% до 2,5%, TGF-β1 в количестве от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл, bFGF в количестве от 50 нг/мл до 100 нг/мл и IGF-1 в количестве от 10 нг/мл до 50 нг/мл, причем культивирование стволовых клеток в определенном составе культивирования клеток обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
16. Определенный состав культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, состоящий из DMEM-F12, инсулина, трансферрина, селена, свободного от жирных кислот альбумина в количестве от 0,2% до 2,5%, TGF-β1 в количестве от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл, bFGF в количестве от 50 нг/мл до 100 нг/мл, IGF-1 в количестве от 10 нг/мл до 50 нг/мл и аскорбиновой кислоты в количестве 0,25 мМ, причем культивирование стволовых клеток в определенном составе обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
17. Определенный состав культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, состоящий из DMEM-F12, инсулина, трансферрина, селена, свободного от жирных кислот альбумина в количестве от 0,2% до 2,5%, лиганда TGF-β в количестве от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл, bFGF в количестве от 50 нг/мл до 100 нг/мл, IGF-1 в количестве от 10 нг/мл до 50 нг/мл и необязательно аскорбиновой кислоты в количестве от 0,2 мМ до 0,3 мМ или хлорида лития в количестве 1 мМ, причем культивирование стволовых клеток в определенном составе обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
18. Определенный состав культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, состоящий из DMEM-F12, инсулина, трансферрина, селена, свободного от жирных кислот альбумина в количестве от 0,2% до 2,5%, лиганда TGF-β в количестве от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл, bFGF в количестве от 50 нг/мл до 100 нг/мл, IGF-1 в количестве от 10 нг/мл до 50 нг/мл, 1,20 мг/л AlCl3⋅6H2O, 0,17 мг/л AgNO3, 2,55 мг/л Ba(C2H3O2)2, 0,12 мг/л KBr, 2,28 мг/л CdCl2, 2,38 мг/л CoCl2⋅6H2O, 0,32 мг/л CrCl3 (безводный), 4,20 мг/л NaF, 0,53 мг/л GeO2, 0,17 мг/л KI, 1,21 мг/л RbCl и 3,22 мг/л ZrOCl2⋅8H2O, причем культивирование стволовых клеток в определенном составе обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
19. Определенный состав по п.17 или 18, где лиганд TGF-β представляет собой TGF-β1.
20. Определенный состав культивирования клеток для культивирования, обновления и размножения плюрипотентных стволовых клеток, состоящий из DMEM-F12, инсулина, трансферрина, селена, свободного от жирных кислот альбумина в количестве от 0,2% до 2,5%, TGF-β1 в количестве от 0,5 нг/мл до 10 нг/мл, bFGF в количестве от 50 нг/мл до 100 нг/мл, IGF-1 в количестве от 10 нг/мл до 50 нг/мл, 100,0 мл/л этилового спирта (200 градусов), 2 мг/мл арахидоновой кислоты, 220 мг/л холестерина, 70 мг/л DL-альфа-токоферола ацетата, 10 мг/л линолевой кислоты, 10 мг/л линоленовой кислоты, 10 мг/л миристиновой кислоты, 10 мг/л олеиновой кислоты, 10 мг/л пальмитиновой кислоты, 10 мг/л пальмитоолеиновой кислоты, 90000 мг/л Pluronic F-68, 10 мг/л стеариновой кислоты и 2200 мг/л Tween 80®, причем культивирование стволовых клеток в определенном составе обеспечивает сохранение плюрипотентности и кариотипической стабильности клеток в течение по меньшей мере 10 пассажей.
21. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15, 16, 19 или 20, где состав содержит 1 нг/мл TGF-β1.
22. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20, где инсулин, трансферрин и селен предоставляются как ITS-X.
23. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20, где свободный от жирных кислот альбумин представляет собой реагент.
24. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20, где состав содержит трансферрин в количестве 5,5 мкг/мл, инсулин в количестве 10 мкг/мл и селенит натрия в количестве 0,0067 мкг/мл.
25. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20, где состав содержит 100 нг/мл bFGF.
26. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20, где состав содержит 2,5% свободного от жирных кислот альбумина.
27. Определенный состав культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20, где состав содержит 20 нг/мл IGF-1.
28. Способ размножения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование человеческих плюрипотентных стволовых клеток на матриксе без питающих клеток в определенном составе культивирования клеток по любому из пп.15-18 или 20.
29. Способ по п.28, где человеческие плюрипотентные стволовые клетки представляют собой индуцибельные плюрипотентные клетки, перепрограммированные плюрипотентные клетки или установленные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261607706P | 2012-03-07 | 2012-03-07 | |
| US61/607,706 | 2012-03-07 | ||
| PCT/US2013/029360 WO2013134378A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-03-06 | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018128383A Division RU2018128383A (ru) | 2012-03-07 | 2013-03-06 | Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014140371A RU2014140371A (ru) | 2016-04-27 |
| RU2664467C2 true RU2664467C2 (ru) | 2018-08-17 |
Family
ID=49114468
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018128383A RU2018128383A (ru) | 2012-03-07 | 2013-03-06 | Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток |
| RU2014140371A RU2664467C2 (ru) | 2012-03-07 | 2013-03-06 | Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018128383A RU2018128383A (ru) | 2012-03-07 | 2013-03-06 | Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9434920B2 (ru) |
| EP (1) | EP2823037A4 (ru) |
| JP (1) | JP6383292B2 (ru) |
| KR (1) | KR20140131999A (ru) |
| CN (1) | CN104160018A (ru) |
| AR (1) | AR090276A1 (ru) |
| AU (2) | AU2013230020B2 (ru) |
| CA (1) | CA2866590A1 (ru) |
| HK (1) | HK1206058A1 (ru) |
| IN (1) | IN2014DN07036A (ru) |
| MX (1) | MX354775B (ru) |
| PH (1) | PH12014501898A1 (ru) |
| RU (2) | RU2018128383A (ru) |
| SG (1) | SG11201405052RA (ru) |
| WO (1) | WO2013134378A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201407241B (ru) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103088065B (zh) * | 2013-01-25 | 2014-12-10 | 北京银杏德济生物技术有限公司 | 一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法 |
| SG11201509767UA (en) | 2013-05-30 | 2015-12-30 | Ajinomoto Kk | Medium for culturing stem cells |
| WO2015066631A2 (en) * | 2013-11-01 | 2015-05-07 | University Of Notre Dame Du Lac | Cell culture medium and bioprocess optimization |
| EP3129466B1 (en) * | 2014-04-07 | 2020-08-05 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Modulating cell proliferation and pluripotency |
| EP3177302A4 (en) * | 2014-08-07 | 2018-04-11 | Duke University | Compositions and methods for the reprogramming of cells into cardiomyocytes |
| US10597634B2 (en) * | 2014-12-31 | 2020-03-24 | Peking University School And Hospital Of Stomatology | Device and use thereof in cell experiments in vitro |
| CA3017772C (en) * | 2016-03-16 | 2023-02-21 | Cynata Therapeutics Limited | Colony forming medium and use thereof |
| KR102015815B1 (ko) * | 2016-08-10 | 2019-08-29 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 유도만능줄기세포의 분화를 유도하여 각막 상피 세포를 배양하는 방법 및 시스템 |
| TW201825110A (zh) * | 2016-12-21 | 2018-07-16 | 英商波麥堤克藥學Ｓｍｔ有限公司 | 用於預防或最小化上皮─間葉轉變之方法及組成物 |
| CA3051141C (en) | 2017-01-23 | 2021-06-22 | Stemcell Technologies Canada Inc. | Media and methods for enhancing the survival and proliferation of stem cells |
| US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
| US12234484B2 (en) * | 2017-05-31 | 2025-02-25 | Promocell Gmbh | Culture medium for pluripotent stem cells |
| BR112020004856A2 (pt) * | 2017-09-15 | 2020-09-15 | Cynata Therapeutics Limited | método para tratar doença alérgica das vias aéreas (aad)/asma |
| JP7364560B2 (ja) * | 2018-06-15 | 2023-10-18 | 扶桑薬品工業株式会社 | 生殖補助医療用培地 |
| AU2020283056B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-06-08 | Viacyte, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| CA3139591C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-16 | Timothy M. BRUHN | A biocompatible membrane composite |
| EP3976237A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
| EP3975926A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| CN112516291B (zh) * | 2019-09-17 | 2023-07-14 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 含人白蛋白的制剂及其制备方法 |
| US11001810B1 (en) * | 2019-11-11 | 2021-05-11 | Lancell AB | Serum-free human pluripotent stem cell culture medium |
| CN112708591B (zh) * | 2020-12-24 | 2022-04-29 | 南京周子未来食品科技有限公司 | 一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基 |
| CN115141798A (zh) * | 2022-07-18 | 2022-10-04 | 上海食未生物科技有限公司 | 一种无血清培养基及其在培养肌肉干细胞中的用途和方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005065354A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
| WO2007101130A2 (en) * | 2006-02-23 | 2007-09-07 | Novocell, Inc. | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
| RU2342427C2 (ru) * | 2002-05-08 | 2008-12-27 | Юниверсити Оф Эдинбург | Регуляция самообновления es-клеток и спецификации направления дифференцировки и среда для этого |
| US20100304481A1 (en) * | 2004-09-08 | 2010-12-02 | Thomson James A | Medium and culture of embryonic stem cells |
| WO2011067465A1 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
Family Cites Families (229)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
| AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
| US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
| CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
| US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
| US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
| US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
| US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
| US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
| CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
| US5804178A (en) | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
| NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
| EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
| US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
| US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
| GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
| CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
| JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
| WO1994023572A1 (en) | 1993-04-08 | 1994-10-27 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
| US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
| TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
| US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
| US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
| US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
| US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
| CN1075387C (zh) | 1994-12-29 | 2001-11-28 | 中外制药株式会社 | 含有il－6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂 |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
| US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
| PL191111B1 (pl) | 1997-04-24 | 2006-03-31 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Podstawione imidazole, sposób ich wytwarzania, kompozycje zawierające podstawione imidazole oraz ich zastosowanie |
| EP1028737B1 (en) | 1997-07-03 | 2007-04-04 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells from peripheral blood |
| DE69841578D1 (de) | 1997-09-16 | 2010-05-06 | Centocor Inc | Methoden zur kompletten chemischen Synthese und Zusammensetzung von Genen und Genomen |
| US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
| EP1025204A4 (en) | 1997-10-23 | 2001-02-28 | Geron Corp | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
| AR014195A1 (es) | 1997-12-29 | 2001-02-07 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos de trifenilpropanamida utiles para el tratamiento de procesos inflamatorios, composiciones anti-inflamatorias que los comprenden, ymetodos para prepararlos |
| CA2320040C (en) | 1998-03-18 | 2007-05-22 | Osiris Therapeutics, Inc. | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
| MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
| US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
| US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
| US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
| EP1144597A2 (en) | 1999-01-21 | 2001-10-17 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
| US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
| US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
| US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
| EP1224259A4 (en) | 1999-09-27 | 2005-04-27 | Univ Florida | INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES |
| US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
| US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| AU778155B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-11-18 | Scripps Research Institute, The | Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors |
| US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
| US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
| US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
| US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
| EP1302534A4 (en) | 2000-06-26 | 2004-06-16 | Renomedix Inst Inc | CELL FRACTION WITH CELLS WHICH ARE ABLE TO DIFFERENTIATE IN NERVOUS CELLS |
| IL155367A0 (en) | 2000-10-23 | 2003-12-23 | Smithkline Beecham Corp | NOVEL 2,4,8-TRISUBSTITUTED-8h-PYRIDO[2,3,-d]PYRIMIDIN-7-ONE COMPOUNDS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, PROCESSES FOR THE PREPARATION THEREOF, AND USE THEREOF IN THE PREPARATION OF MEDICAMENTS FOR TREATING CSBP/p38 KINASE MEDIATED DISEASES |
| AU2002227371B2 (en) | 2000-12-08 | 2007-05-10 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors |
| IL156339A0 (en) | 2000-12-08 | 2004-01-04 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors |
| US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
| EP1366148A2 (en) | 2001-01-24 | 2003-12-03 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
| EP2251344B2 (en) | 2001-01-25 | 2024-04-24 | THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Formulation of boronic acid compounds |
| US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
| EP1379626A2 (en) | 2001-04-19 | 2004-01-14 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
| CN100516204C (zh) | 2001-04-24 | 2009-07-22 | 味之素株式会社 | 干细胞及其分离方法 |
| EP1393066A4 (en) | 2001-05-15 | 2006-01-25 | Rappaport Family Inst For Res | INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
| US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
| KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
| GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
| US7432104B2 (en) | 2001-08-06 | 2008-10-07 | Bresgen Inc. | Methods for the culture of human embryonic stem cells on human feeder cells |
| US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
| EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
| US20050053588A1 (en) | 2001-10-18 | 2005-03-10 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
| ATE438708T1 (de) | 2001-11-15 | 2009-08-15 | Childrens Medical Center | Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon |
| GB2399823B (en) | 2001-12-07 | 2006-02-15 | Geron Corp | Islet cells from primate pluripotent stem cells |
| US20030161816A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-08-28 | Fraser John K. | Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells |
| WO2003054169A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
| GB2398795A (en) | 2001-12-28 | 2004-09-01 | Cellartis Ab | A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line |
| US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
| US20050208029A1 (en) | 2002-04-17 | 2005-09-22 | Akihiro Umezawa | Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells |
| US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
| DE60319364T2 (de) | 2002-05-08 | 2009-02-19 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
| US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
| CN1662643A (zh) | 2002-05-28 | 2005-08-31 | 贝克顿·迪金森公司 | 人腺泡细胞的扩增和转分化 |
| RU2004135382A (ru) | 2002-06-05 | 2005-06-27 | Янссен Фармацевтика Н.В. (Be) | Замещенные пирролины в качестве ингибиторов киназы |
| GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
| CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
| US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
| US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
| CA2494040A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-02-05 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose |
| WO2004016747A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
| US7371576B2 (en) | 2002-09-06 | 2008-05-13 | Reneuron, Inc. | CD56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
| US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
| US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
| US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
| US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
| US20060040385A1 (en) | 2002-12-05 | 2006-02-23 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
| EP2457999B1 (en) | 2002-12-16 | 2018-10-17 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Culture medium for pluripotent stem cells |
| BRPI0407074A (pt) | 2003-01-29 | 2006-01-24 | Takeda Pharmaceutical | Método para produção de uma preparação revestida, preparação revestida, e, método para melhorar a dissolução do cloridreto de pioglitazona de uma preparação revestida com cloridreto de pioglitazona |
| RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
| WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
| WO2004073633A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
| US20070020242A1 (en) | 2003-03-27 | 2007-01-25 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
| WO2004090110A2 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Bresagen Inc. | Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
| US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
| CA2530421C (en) | 2003-06-27 | 2015-04-21 | Ethicon, Incorporated | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
| IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
| ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
| US20050042595A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Banking of multipotent amniotic fetal stem cells |
| US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
| AU2004269395A1 (en) | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Stemcells California, Inc. | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations |
| CA2550010A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
| US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
| US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
| US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
| KR101221302B1 (ko) | 2003-12-23 | 2013-01-11 | 비아싸이트, 인크. | 완전 내배엽 |
| CN112813019A (zh) | 2003-12-23 | 2021-05-18 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
| TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
| WO2005071066A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
| US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
| WO2005080551A2 (en) | 2004-02-12 | 2005-09-01 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem cells |
| US7964401B2 (en) | 2004-02-19 | 2011-06-21 | Kyoto University | Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance affecting ECAT2 and ECAT3 |
| WO2005086860A2 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
| EP1730261A4 (en) | 2004-03-10 | 2007-11-28 | Univ California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR GROWING EMBRYONIC STEM CELLS |
| WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
| CA2555571C (en) | 2004-04-01 | 2012-10-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
| ES2751095T3 (es) | 2004-04-27 | 2020-03-30 | Viacyte Inc | Endodermo que expresa pdx1 |
| AU2005272078B2 (en) | 2004-07-09 | 2011-04-14 | Viacyte, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
| EP1791952A4 (en) | 2004-08-13 | 2008-06-11 | Univ Georgia Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS OF SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS |
| US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
| DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
| US7442548B2 (en) | 2004-09-08 | 2008-10-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells in medium containing pipecholic acid and gamma amino butyric acid |
| JP2008528038A (ja) | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
| US20060182724A1 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-17 | Riordan Neil H | Method for expansion of stem cells |
| SG160373A1 (en) | 2005-03-04 | 2010-04-29 | John Oaeneil | Adult pancreatic derived stromal cells |
| GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
| WO2006113470A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
| CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
| EP1875234B1 (en) | 2005-04-26 | 2011-06-22 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
| MX2007015610A (es) | 2005-06-10 | 2008-02-21 | Irm Llc | Compuestos que mantienen la fluripotencia de las celulas totipotentes embrionarias. |
| WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
| WO2006137787A1 (en) | 2005-06-21 | 2006-12-28 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for cell culture |
| AU2006262369B2 (en) | 2005-06-22 | 2012-07-05 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Suspension culture of human embryonic stem cells |
| NZ564179A (en) | 2005-06-30 | 2010-09-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Cyclic anilino - pyridinotriazines as GSK-3 inhibitors |
| WO2007016485A2 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Athersys, Inc. | Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells |
| US20090087907A1 (en) | 2005-07-29 | 2009-04-02 | Alice Pebay | Compositions and Methods for Growth of Pluripotent Cells |
| US9101590B2 (en) * | 2005-07-29 | 2015-08-11 | Yale University | Defined culture conditions of human embryonic stem cells |
| WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
| BRPI0617084A2 (pt) | 2005-09-02 | 2011-07-12 | Agency Science Tech & Res | método, linhagem de célula progenitora, célula diferenciada e método para gerar uma célula diferenciada de uma célula-tronco (es) embrionária |
| US9422521B2 (en) | 2005-09-12 | 2016-08-23 | Es Cell International Pte Ltd. | Differentiation of pluripotent stem cells with a kinase inhibitor or PGI2 |
| SG169324A1 (en) | 2005-10-14 | 2011-03-30 | Univ Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
| EP3584311A1 (en) | 2005-10-27 | 2019-12-25 | Viacyte, Inc. | Pdx-1 expressing dorsal and ventral foregut endoderm |
| KR101420740B1 (ko) | 2005-12-13 | 2014-07-17 | 교또 다이가꾸 | 핵초기화 인자 |
| WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
| CA2644468C (en) | 2006-03-02 | 2022-02-01 | Cythera, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
| US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
| US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
| EP2021462B1 (en) | 2006-04-28 | 2019-01-09 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| EP2027258A2 (en) | 2006-05-02 | 2009-02-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
| US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
| US7964402B2 (en) | 2006-05-25 | 2011-06-21 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
| CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
| CA2654196A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems |
| US8415153B2 (en) | 2006-06-19 | 2013-04-09 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
| CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
| US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
| EP2046946B8 (en) * | 2006-06-26 | 2017-01-25 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell culture |
| AU2007270069B2 (en) | 2006-07-06 | 2013-05-16 | Es Cell International Pte Ltd | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
| AU2007277364B2 (en) | 2006-07-26 | 2010-08-12 | Viacyte, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
| KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
| JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
| WO2008039521A2 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Nmt Medical, Inc. | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
| MX2009004096A (es) | 2006-10-17 | 2009-06-16 | Stiefel Laboratories | Metabolitos de talarozol. |
| US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
| CA2666789C (en) | 2006-10-18 | 2016-11-22 | Yong Zhao | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
| EP2088190A4 (en) | 2006-11-09 | 2011-01-05 | Japan Government | METHOD FOR THE CULTURE AND PASSING OF AN EMBRYONAL PRIMATIVE STEM CELL AND METHOD FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF THE EMBRYONAL STEM CELL |
| WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
| AU2008211103B2 (en) | 2007-01-30 | 2014-05-08 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (MMC) |
| GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
| US20090053182A1 (en) | 2007-05-25 | 2009-02-26 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
| BRPI0814425A2 (pt) | 2007-07-18 | 2014-10-21 | Lifescan Inc | Diferenciação de células-tronco embrionárias humanas |
| CA3114827C (en) | 2007-07-31 | 2023-09-05 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine |
| JP6087043B2 (ja) | 2007-07-31 | 2017-03-01 | ライフスキャン・インコーポレイテッドＬｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ． | ヒトフィーダー細胞を用いた多能性幹細胞の分化 |
| AU2008291930B2 (en) | 2007-08-24 | 2014-04-17 | Slotervaart Participaties Bv | Compositions for the treatment of neoplastic diseases |
| US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
| CA2954431C (en) | 2007-11-27 | 2021-08-24 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
| SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
| WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
| EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
| RU2551772C2 (ru) | 2008-02-21 | 2015-05-27 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Способы, поверхностно-модифицированные носители и композиции для иммобилизации, культивирования и открепления клеток |
| WO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
| JP2011514169A (ja) | 2008-03-17 | 2011-05-06 | エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア |
| US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
| EP2283117B1 (en) | 2008-04-21 | 2013-10-23 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
| US8728812B2 (en) | 2008-04-22 | 2014-05-20 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells |
| US7939322B2 (en) * | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
| US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
| US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
| WO2009154606A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
| AU2009267137A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
| DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
| US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
| MX2011004563A (es) | 2008-10-31 | 2011-06-01 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreatico. |
| MX2011004565A (es) | 2008-10-31 | 2011-07-28 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreatico. |
| DK2356213T3 (da) | 2008-11-04 | 2019-09-09 | Viacyte Inc | Stamcelleaggregatsuspensionssammensætninger og fremgangsmåder til differentiering deraf |
| US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
| EP3363444B1 (en) | 2008-11-14 | 2022-09-14 | ViaCyte, Inc. | Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells |
| EP3260534A1 (en) | 2008-11-20 | 2017-12-27 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
| DK2356218T3 (en) * | 2008-12-05 | 2017-08-21 | Inserm (Institut Nat De La Santé Et De La Rech Médicale) | METHOD AND MEDIUM FOR NEURAL DIFFERENTIZATION OF PLURIPOTENT CELLS |
| EP2456862A4 (en) | 2009-07-20 | 2013-02-27 | Janssen Biotech Inc | DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
| KR101786735B1 (ko) | 2009-07-20 | 2017-10-18 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
| BR112012017761A2 (pt) | 2009-12-23 | 2015-09-15 | Centocor Ortho Biotech Inc | diferenciação das células-tronco embrionárias humanas |
| JP5812492B2 (ja) * | 2010-02-03 | 2015-11-11 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用 |
| WO2011108993A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | National University Of Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
| JP2011177140A (ja) * | 2010-03-03 | 2011-09-15 | Nippon Dental Univ | 幹細胞培養用の無血清培地 |
| AU2011235212B2 (en) | 2010-03-31 | 2014-07-31 | The Scripps Research Institute | Reprogramming cells |
| EP2563908B1 (en) | 2010-04-25 | 2019-01-09 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
| RU2663339C1 (ru) | 2010-05-12 | 2018-08-03 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
| KR101829488B1 (ko) | 2010-08-05 | 2018-02-14 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 인간 다분화능 세포 배양을 위한 단순화된 기본 배지 |
| JP6133776B2 (ja) | 2010-08-31 | 2017-05-24 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 多能性幹細胞の分化 |
| MY177150A (en) | 2011-02-28 | 2020-09-08 | Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
| US9133266B2 (en) * | 2011-05-06 | 2015-09-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Vitronectin-derived cell culture substrate and uses thereof |
| WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
| AU2012355698B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
| US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
| RU2018108850A (ru) | 2012-06-08 | 2019-02-26 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в панкреатические эндокринные клетки |
| TW201522637A (zh) | 2013-03-15 | 2015-06-16 | Jackson Lab | 非胚胎幹細胞之單離及其用途 |
-
2013
- 2013-03-06 RU RU2018128383A patent/RU2018128383A/ru not_active Application Discontinuation
- 2013-03-06 SG SG11201405052RA patent/SG11201405052RA/en unknown
- 2013-03-06 HK HK15106542.3A patent/HK1206058A1/xx unknown
- 2013-03-06 MX MX2014010782A patent/MX354775B/es active IP Right Grant
- 2013-03-06 KR KR1020147027965A patent/KR20140131999A/ko not_active Ceased
- 2013-03-06 JP JP2014561075A patent/JP6383292B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-03-06 EP EP13757652.6A patent/EP2823037A4/en not_active Withdrawn
- 2013-03-06 RU RU2014140371A patent/RU2664467C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-03-06 CA CA2866590A patent/CA2866590A1/en not_active Abandoned
- 2013-03-06 US US13/787,173 patent/US9434920B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-03-06 WO PCT/US2013/029360 patent/WO2013134378A1/en not_active Ceased
- 2013-03-06 AU AU2013230020A patent/AU2013230020B2/en not_active Ceased
- 2013-03-06 CN CN201380012670.9A patent/CN104160018A/zh active Pending
- 2013-03-07 AR ARP130100747A patent/AR090276A1/es unknown
-
2014
- 2014-08-21 IN IN7036DEN2014 patent/IN2014DN07036A/en unknown
- 2014-08-22 PH PH12014501898A patent/PH12014501898A1/en unknown
- 2014-10-06 ZA ZA2014/07241A patent/ZA201407241B/en unknown
-
2016
- 2016-05-09 US US15/150,349 patent/US9593307B2/en active Active
-
2017
- 2017-03-13 US US15/457,952 patent/US20170183626A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-11-06 AU AU2018260810A patent/AU2018260810A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2342427C2 (ru) * | 2002-05-08 | 2008-12-27 | Юниверсити Оф Эдинбург | Регуляция самообновления es-клеток и спецификации направления дифференцировки и среда для этого |
| WO2005065354A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
| US20100304481A1 (en) * | 2004-09-08 | 2010-12-02 | Thomson James A | Medium and culture of embryonic stem cells |
| WO2007101130A2 (en) * | 2006-02-23 | 2007-09-07 | Novocell, Inc. | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
| WO2011067465A1 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHOI K.-M. ET AL. Effect of Ascorbic Acid on Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation and Differentiation // Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, Vol. 105, No. 6, pp. 586-594. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1206058A1 (en) | 2015-12-31 |
| AU2013230020B2 (en) | 2018-08-09 |
| SG11201405052RA (en) | 2014-10-30 |
| US20170183626A1 (en) | 2017-06-29 |
| US20160251615A1 (en) | 2016-09-01 |
| JP2015509381A (ja) | 2015-03-30 |
| ZA201407241B (en) | 2016-05-25 |
| RU2018128383A (ru) | 2019-03-14 |
| RU2014140371A (ru) | 2016-04-27 |
| AR090276A1 (es) | 2014-10-29 |
| AU2018260810A1 (en) | 2018-11-22 |
| CN104160018A (zh) | 2014-11-19 |
| US20130236973A1 (en) | 2013-09-12 |
| KR20140131999A (ko) | 2014-11-14 |
| MX2014010782A (es) | 2014-10-14 |
| WO2013134378A1 (en) | 2013-09-12 |
| EP2823037A4 (en) | 2015-09-16 |
| US9593307B2 (en) | 2017-03-14 |
| PH12014501898A1 (en) | 2014-11-24 |
| IN2014DN07036A (ru) | 2015-04-10 |
| JP6383292B2 (ja) | 2018-08-29 |
| US9434920B2 (en) | 2016-09-06 |
| MX354775B (es) | 2018-03-20 |
| RU2018128383A3 (ru) | 2019-04-15 |
| CA2866590A1 (en) | 2013-09-12 |
| AU2013230020A1 (en) | 2014-09-04 |
| EP2823037A1 (en) | 2015-01-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2664467C2 (ru) | Среда определенного состава для размножения и обновления плюрипотентных стволовых клеток | |
| US10876094B2 (en) | Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state | |
| CN105358680B (zh) | 用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物 | |
| KR101837080B1 (ko) | 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양 | |
| ES2610812T3 (es) | Cultivo de células madre pluripotentes | |
| RU2473687C2 (ru) | Культивирование отдельных эмбриональных стволовых клеток | |
| RU2547925C2 (ru) | Способы и композиции для закрепления и культивирования клеток на плоских носителях | |
| CN102695790A (zh) | 多能干细胞 | |
| CN102395672A (zh) | 用于干细胞培养的方法和组合物 | |
| EP3207122A1 (en) | Generation of keratinocytes from pluripotent stem cells and maintenance of keratinocyte cultures | |
| WO2007002210A2 (en) | Embryonic stem cell culture compositions and methods of use thereof | |
| US20200248138A1 (en) | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into germline stem cell-like cells | |
| US20150037883A1 (en) | Method for derivation and long-term establishment of ground state pluripotent embryonic stem cells | |
| CN110392735A (zh) | 胰腺祖细胞的维持和扩增 | |
| JP7520813B2 (ja) | 多能性幹細胞の製造方法 | |
| EP3950933A1 (en) | Cell population including pluripotent stem cells and production method thereof | |
| JP2023501003A (ja) | 無血清ヒト多能性幹細胞培養培地 | |
| WO2008018684A1 (en) | Culture medium for co-culturing of human stem cells and their feeder cells | |
| He et al. | Fibroblast-like cells derived from the gonadal ridges and dorsal mesenteries of human embryos as feeder cells for the culture of human embryonic germ cells | |
| Young et al. | Feeder-free Culture | |
| KR20240131080A (ko) | 배외내배엽 줄기세포의 배양용 배지 조성물 | |
| OJALA | Establishing and optimizing feeder cell-free culture methods for human | |
| Rajala | Development of Human Stem Cell Culture Conditions for Clinical Cell Therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200307 |