RU2656148C2

RU2656148C2 - Маркеры риска для сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с хроническим заболеванием почек

Info

Publication number: RU2656148C2
Application number: RU2016111308A
Authority: RU
Inventors: Эдуардо САЛАС; Сара ПИЧ; Мануэль АРИАС; Роберто ЭЛОСУА; Серхио КАСТИЛЬО
Original assignee: Хендиаг.Эксе, С.Л.
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2018-05-31
Also published as: JP2016528907A; EP2843056B1; PE20160603A1; EP3039156B1; EP3039156A1; EP2843056B8; MX2016002529A; CL2016000447A1; SG11201601490XA; UY35719A; WO2015028612A1; AU2014314097A1; EP2843056A1; RU2016111308A; CA2922329A1; US20160215341A1; AR097489A1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ оценки риска сердечно-сосудистых событий у субъекта, включающий стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, присутствия полиморфизмов в положении 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:1-8, или в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-8, где присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID N0:6, T в SEQ ID NO:7 и G в SEQ ID NO:8, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем риска наличия сердечно-сосудистого события. Изобретение также относится к наборам для практического осуществления вышеуказанного способа. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 1 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области сердечно-сосудистых заболеваний или нарушений. Более конкретно, оно относится к маркерам и способам для определения того, подвержен ли субъект, в частности, субъект-человек, страдающий от хронического заболевания почек, риску развития сердечно-сосудистого заболевания, наличия сердечно-сосудистого заболевания или испытывания осложнений сердечно-сосудистого заболевания. Настоящее изобретение также относится к применению таких маркеров и способов для мониторирования статуса риска сердечно-сосудистого заболевания и/или сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, страдающего хроническим заболеванием почки, или эффектов профилактических и/или терапевтическим мер/средств на субъектов, страдающих хроническим заболеванием почек с риском сердечно-сосудистого заболевания или сердечно-сосудистого заболевания.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Хроническое заболевание почек

Хроническое заболевание почек представляет собой проблему для мирового здравоохранения. Существует увеличивающаяся заболеваемость и распространенность почечной недостаточности, с неблагоприятным исходом и высокими затратами. Существует даже более высокая распространенность более ранних стадий хронического заболевания почек (Am J Kidney Dis 39:S1-S266, 2002 suppl 1).

Возрастающее количество доказательств, накопленных в последние десятилетия, указывает на то, что неблагоприятный исход хронического заболевания почек, такой как почечная недостаточность, сердечно-сосудистое заболевание и преждевременная смерть, можно предотвращать или задерживать. Более ранние стадии хронического заболевания почек можно детектировать посредством лабораторного тестирования. Лечение более ранних стадий хронического заболевания почек является эффективным для замедления прогрессирования почечной недостаточности. Начало лечения против факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний на более ранних стадиях хронического заболевания почек должно являться эффективным для уменьшения случаев сердечно-сосудистого заболевании как до, так и после начала почечной недостаточности (Am J Kidney Dis 39:S1-S266, 2002 suppl 1).

К сожалению, хроническое заболевание почек является «недостаточно диагностируемым» и «недостаточно подвергаемым лечению», что приводит к недостаточному предотвращению сердечно-сосудистых заболеваний (Am J Kidney Dis 39:S1-S266, 2002 suppl 1, J Am Coll Cardiol 2007; 50: 217).

Критериями для определения хронического заболевания почек (CKD) являются: повреждение почек в течение ≥3 месяцев, как определено по структурным или функциональным аномалиям почек, с уменьшением или без уменьшения уровня клубочковой фильтрации (GFR), которые могут приводить к уменьшению GFR, проявляемым либо посредством патологических аномалий, либо посредством маркеров повреждения почек, включая аномалии при тестировании изображений, или GFR <60 мл/мин/11,73 м² в течение ≥3 месяцев, с повреждением или без повреждения почек (Am J Kidney Dis 39:S1-S266,2002 suppl 1, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки). Определено пять стадий CKD (Am J Kidney Dis 39:S1-S266,2002 suppl 1):

		Классификация по тяжести
Стадия	Описание	GFR, мл/мин/1,73 м²	Родственные термины
1	Повреждение почек с нормальным или GFR	≥90	Альбуминурия, протеинурия, гематурия
2	Повреждение почек со слабым ↓ GFR	60-89	Альбуминурия, протеинурия, гематурия
3	Умеренное ↓ GFR	30-59	Хроническая почечная недостаточность, почечная недостаточность на ранних стадиях
4	Тяжелое ↓ GFR	15-29	Хроническая почечная недостаточность, почечная недостаточность на поздних стадиях, пре-ESRD
5	Почечная недостаточность	<15 (или диализ)	Почечная недостаточность, уремия, заболевание почек на терминальной стадии

Устанавливали также распространенность каждой стадии CKD (Am J Kidney Dis 32:992-999, 1998, erratum 35:178, 2000, US Renal Data System. USRDS 1998 Annual Data Report, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD, 1998):

Стадия	Распространенность (возраст ≥20)
1	3,3%
2	3,0%
3	4,3%
4	0,2%
5	0,1%

2. Лечение CKD

При лечении CKD также в общем следуют нескольким стадиям, всесторонне описанным в Harrison's Principles of Internal Medicine. 18th ed. New York: McGraw-Hill; 2012):

Стадия	Описание	GFR, мл/мин/ на 1,73м ²	Действие*
1	Повреждение почек с нормальным или GFR	≥90	Диагностика и лечение, лечение сопутствующих заболеваний, замедление прогрессирования, уменьшение риска CVD
2	Повреждение почек со слабым ↓ GFR	60-89	Оценка прогрессирования
3	Умеренное ↓ GFR	30-59	Оценка и лечение осложнений
4	Тяжелое ↓ GFR	15-29	Подготовка к заместительной почечной терапии
5	Почечная недостаточность	<15 (или диализ)	Заместительная почечная терапия (если присутствует уремия)

Способы лечения, нацеленные на специфические причины CKD, включают в себя оптимизированный контроль глюкозы при сахарном диабете, иммуномодулирующие средства при гломерулонефрите и появляющиеся специфические виды терапии для задержки цитогенеза при поликистозном заболевании почек. Оптимальное расписание как специфической, так и неспецифической терапии, как правило, располагается задолго до того, как возникло поддающееся измерению уменьшение GFR и безусловно, до развития CKD. Целесообразно последовательно измерять и наносить на график скорость уменьшения GFR у всех пациентов. Любое увеличение скорости уменьшения должно служить поводом для поиска сочетанных острых или подострых процессов, которые могут являться обратимыми. Они включают в себя истощение объема внеклеточной жидкости (ECFV), неконтролируемую гипертензию, инфекцию мочевыводящих путей, возникшую обструктивную уропатию, воздействие нефротоксичных средств [таких как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) или радиографический краситель] и повторную активацию или приступ исходного заболевания, такого как волчанка или васкулит.

Следующие вмешательства следует рассматривать при попытке стабилизировать или замедлить снижение функции почек:

- Уменьшение внутриклубочковой гипертензии и протеинурии

- Замедление прогрессирования диабетической нефропатии

• Контроль уровня глюкозы в крови

• Контроль артериального давления и протеинурии

- Ограничение количества белка

- Контроль других осложнений хронического заболевания почек

- Коррекция дозы лекарственного средства

- Подготовка к заместительной почечной терапии

Временного облегчения симптомов и признаков приближающейся уремии, таких как анорексия, тошнота, рвота, утомляемость и зуд, можно иногда достигать с помощью ограничения количества белка. Однако это обладает значительным риском белково-энергетической недостаточности, и таким образом, вместо этого должны существовать планы для более длительного контроля. Поддержание диализа и трансплантация почки продлевает жизнь сотен тысяч пациентов с CKD по всему миру. Явные показания для начала заместительной почечной терапии для пациентов с CKD включают в себя уремический перикардит, энцефалопатию, некупируемые мышечные судороги, анорексию и тошноту, которые невозможно приписать обратимым причинам, таким как пептическая язва, доказательство нарушения питания и аномалии жидкостей и электролитов, преимущественно, гиперкалиемию или избыток объема ECF, устойчивые к другим мерам.

Рекомендации для оптимального времени начала заместительной почечной терапии установлены Национальным Почечным Фондом в его руководстве KDOQI и основаны на недавних доказательствах того, что задержка начала заместительной почечной терапии до того, как пациенты будут истощены или будут обладать тяжелыми уремическими осложнениями, приводит к худшему прогнозу для диализа или трансплантации. Из-за межиндивидуальной изменчивости тяжести уремических симптомов и функции почек, является неблагоразумным оценивать произвольно выбранный уровень азота мочевины или креатинина для необходимости начала диализа. Кроме того, пациенты могут привыкать к хронической уремии и отрицать симптомы, только с обнаружением того, что они чувствуют себя лучше с диализом, и пониманием в ретроспективе, насколько плохо они чувствовали себя до его начала.

Предыдущие исследования позволяют предполагать, что начало диализа до начала тяжелых симптомов и признаков уремии являлось ассоциированным с продлением выживаемости. Это привело к концепции «здорового» старта и согласуется с философией, что лучше поддерживать у пациентов хорошее самочувствие все время, вместо того, чтобы позволять им становиться больными уремией до попыток возвращать им лучшее состояние здоровья с помощью диализа или трансплантации. Хотя недавние исследования не подтвердили явной ассоциации раннего начала диализа с улучшенной выживаемостью пациента, у этого способа все еще существуют достоинства. На практическом уровне, предварительная подготовка может помочь избежать проблем с самим процессом диализа (например, с плохо функционирующей фистулой для гемодиализа или с неудовлетворительно действующим катетером для перитонеального диализа) и таким образом, предвосхищать заболеваемость, ассоциированную с прибеганием к установке временного доступа для гемодиализа с сопутствующим этому риску сепсиса, кровотечения и тромбоза.

Трансплантация почки человека является терапией выбора для хронической почечной недостаточности на поздних стадиях. По всему миру проведены десятки тысяч этих процедур. Когда азатиоприн и преднизон первоначально использовали в качестве иммуносупрессивных лекарственных средств в 1960-е, результаты для точно совпадающих родственных доноров превосходили результаты для органов от покойных доноров: 75-90% по сравнению с 50-60% коэффициентов выживаемости трансплантата в течение 1 года. В ходе 1970-х и 1980-х, процент успеха к 1-летней отметке для трансплантатов от покойных доноров прогрессивно возрастал. В настоящее время, трансплантаты от покойных доноров обладают 89% 1-летней выживаемостью и трансплантаты от живых доноров обладают 95% 1-летней выживаемостью. Хотя присутствовало улучшение длительной выживаемости, оно не было столь впечатляющим, как кратковременная выживаемость, и в настоящее время «средняя» (t1/2) продолжительность жизни трансплантата от живого донора составляет приблизительно 20 лет, и продолжительность жизни трансплантата от покойного донора является близкой к 14 годам.

Уровни смертности после трансплантации являются наивысшими в первый год и связаны с возрастом: 2% для возраста 18-34 лет, 3% для возраста 35-49 лет, и 6,8% для возраста ≥50-60 лет. Эти уровни выигрывают в сравнении с уровнями в популяции с хроническим диализом даже после поправок на факторы риска возраст, диабет и состояние сердечно-сосудистой системы. Иногда, острое необратимое отторжение может возникать после многих месяцев хорошего функционирования, особенно, если пациент пренебрегает приемом назначенных иммуносупрессивных лекарственных средств. Большинство трансплантатов, однако, погибает с различной скоростью от хронических процессов, состоящих из интерстициального фиброза, атрофии канальцев, васкулопатии и гломерулопатии, патогенез которых не полностью понятен. В общем, трансплантация возвращает большинство пациентов к улучшенному качеству жизни и улучшенной продолжительности жизни по сравнению с пациентами с диализом. Существует по меньшей мере 100000 пациентов с функционирующими трансплантатами почки в Соединенных Штатах Америки.

Пациенты как с хроническим диализом, так и с трансплантатами почки, обладают более высокой смертностью от инфаркта миокарда и инсульта, чем во всей популяции, и это особенно справедливо для пациентов с диабетом. Вносящими вклад факторами являются применение глюкокортикоидов и сиролимуса, а также гипертензия. Реципиенты трансплантатов почки обладают высокой распространенностью заболеваний коронарной артерии и периферических сосудов. Процентное содержание смертей по этим причинам медленно увеличивается с увеличением количества подвергнутых трансплантации пациентов с диабетом и с увеличением среднего возраста всех реципиентов. Более 50% смертности реципиентов трансплантации почки можно отнести к сердечно-сосудистым заболеваниям. В дополнение к строгому контролю артериального давления и уровней липидов в крови, строгое мониторирование пациентов по показаниям для дополнительного медицинского или хирургического вмешательства является важной частью их ведения.

3. Сердечно-сосудистое заболевание

Сердечно-сосудистое заболевание (CVD) представляет собой термин для заболеваний сердца и кровеносных сосудов, включая - среди прочих - ишемическую болезнь сердца (представляющую собой наиболее распространенное CVD в промышленно развитых странах; это нарушение относится к проблемам с циркуляцией крови к сердечной мышце), цереброваскулярное заболевание (относится к проблеме с циркуляцией крови в кровеносных сосудах головного мозга), и заболевание периферических сосудов (поражающее циркуляцию преимущественно в ногах). У субъектов с CVD может развиваться ряд осложнений (далее в настоящем документе, обозначаемых как осложнения CVD) включая в качестве неограничивающих примеров, инфаркт миокарда, инсульт, стенокардию, транзиторные ишемические атаки, застойную сердечную недостаточность, аневризму аорты и смерть.

Framingham Heart Study (Kamel WB et al. Am J Cardiol 1988;62:1109-1112., Wilson PWF et al., Circulation 1988;97:1837-1847, Grundy S.M. et al. Circulation 1988;97:1876-1887) являлось новаторским исследованием в разработке концепции факторов риска, широко используемой и принятой в настоящее время. Установлено, что несколько независимых факторов риска являются непосредственной причиной коронарного заболевания и являются частыми в популяции, и их модификация уменьшает риск коронарных (т.е. сердечно-сосудистых) событий (Grundy S.C. et al., Circulation 2000; 101:e3-e11). Основными модифицируемыми факторами риска являются курение, высокое артериальное давление, гиперхолестеринемия (в частности высокий уровень LDL-холестерина) и сахарный диабет (Circulation 2000;101:e3-e11).

Адаптация всех действий в соответствии с абсолютным риском (вероятностью того, что у субъекта разовьется коронарное заболевание в конкретный период времени) является важной, поскольку позволяет достигать подходящего баланса между эффективностью, безопасностью и стоимостью терапии. Оценка абсолютного риска требует суммирование вклада каждого фактора риска и результат представляет собой «определение глобального риска». В Framingham Heart Study, как указано выше, проводили количественную оценку глобального риска на основании вклада каждого фактора риска.

Хотя общепринятые факторы риска являются важными прогностическими факторами кардиологических событий у индивидуумов с CKD, Фремингемские уравнения неточно определяют значимость этих факторов риска в предсказании событий ишемической болезни сердца при CKD (J Am Coll Dardiol 2007; 50:217-224). Во многом эта несостоятельность вызвана конкурирующими событиями со смертью, а также со значительно более высокой частотой кардиологических событий у пациентов с CKD. В то время как является возможным до некоторой степени улучшить прогноз ишемической болезни сердца у индивидуумов с CKD, особенно, у женщин, посредством перекалибровки уравнений и посредством приписывания различной важности общепринятым Фремингемским факторам риска, по-видимому, дополнительные прогностические уравнения с адекватным размером выборки для разработки и валидации прогностической модели при CKD необходимы для исследования как кардиологических событий, так и смертности в этой популяции высокого риска с целью идентификации общих модифицируемых факторов риска для неблагоприятных исходов.

Соответственно, существует необходимость новых маркеров, включая новые генетические маркеры и их сочетания, которые могут успешно и с предоставлением преимуществ определять риск сердечно-сосудистых событий для субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, и прогнозировать, кто подвержен высокому риску развития сердечно-сосудистого заболевания и/или осложнений сердечно-сосудистого заболевания, таких как - но без ограничения - смертельный или несмертельный инфаркт миокарда, или стенокардия, или инсульт, или транзиторная ишемическая атака или периферическая артериопатия, таким образом, что можно принимать профилактические и/или терапевтические меры для удержания этого риска на самом низком возможном уровне.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к способу, подходящему для преодоления ограничений шкал/способов, используемых в настоящее время для расчета риска сердечно-сосудистых событий у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек. Способ, представленный по настоящему изобретению, преодолевает вышеупомянутые ограничения посредством определения риска сердечно-сосудистых событий у субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, и прогнозирует риск развития у него/нее сердечно-сосудистых заболевания и/или осложнений сердечно-сосудистого заболевания, включая в себя стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, присутствия полиморфизма, где указанный полиморфизм находится в положении 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1-8, или указанный полиморфизм находится в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-8, где присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, и/или G в SEQ ID NO:8, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем риска наличия сердечно-сосудистого события.

Например, rs1746048, представленный в настоящем документе посредством SEQ ID NO:49, находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120; или например, rs2133189, представленный в настоящем документе посредством SEQ ID NO:48, находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637, Эти последовательности можно, таким образом, также использовать для целей настоящего изобретения, как и rs, находящийся в сильном неравновесном сцеплении с любым из упомянутых rs, как описано в настоящем документе. В любой из указанных последовательностей rs, находящихся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью rs, упомянутой в настоящем документе, полиморфизм может, например, находится в положении 27, Специалист в данной области может получить доступ к последовательностям rs в базе данных SNP NCBI («dbSNP», http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp).

В преимущественных вариантах осуществления, является возможным использование комбинации SEQ ID NO: 1-7 или 1-8, или 1-11, для вышеуказанного способа.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения риска сердечно-сосудистых событий у субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, и страдающего от одного или нескольких сердечно-сосудистых событий, для прогноза риска развития сердечно-сосудистого заболевания и/или осложнений сердечно-сосудистого заболевания, включающему в себя стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, присутствия полиморфизма, где указанный полиморфизм находится в положении 27 в нуклеотидных последовательностях из SEQ ID NO:1-11, или указанный полиморфизм находится в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-11, где указанный полиморфизм в указанном положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, G в SEQ ID NO:8, A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и/или G в SEQ ID NO:11, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем риска наличия неблагоприятного сердечно-сосудистого заболевания или нарушения.

В преимущественном варианте осуществления, является возможным использование комбинации SEQ ID NO: 1-7 или 1-8 или 1-11, для вышеуказанного способа.

Изобретение, кроме того, относится к способу идентификации субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, нуждающегося в ранней и/или более агрессивной терапии сердечно-сосудистого заболевания или нуждающегося в профилактической терапии сердечно-сосудистого заболевания, включающему в себя стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, присутствия по меньшей мере одного аллеля полиморфизма, где указанный полиморфизм находится в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты из любого из SEQ ID NO:1-11, или указанный полиморфизм находится в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с любой из SEQ ID NO:1-11, где присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, G в SEQ ID NO:8, A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и/или G в SEQ ID NO:11, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем необходимости ранней и/или более агрессивной терапии сердечно-сосудистого заболевания или необходимости профилактической терапии сердечно-сосудистого заболевания. В преимущественном варианте осуществления, является возможным применение комбинации SEQ ID NO: 1-7 или 1-8 или 1-11, для вышеуказанного способа.

«Профилактическая» терапия обозначает терапию, которую начинают до симптоматического начала заболевания.

«Ранняя или более агрессивная» терапия обозначает терапию, которую начинают на ранней стадии заболевания или с использованием более высоких количеств или большей частоты, чем в среднем, например, из-за присутствия более высокого риска развития CHD при применении этого изобретения, и таким образом, терапевтические задачи необходимо адаптировать в соответствии с руководством. Эти новые задачи могут требовать более агрессивной терапии.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего хроническим заболеванием почек и страдающего сердечно-сосудистым заболеванием, с помощью терапии сердечно-сосудистых заболеваний, где пациента выбирают для указанной терапии на основании присутствия в образце, выделенном от указанного субъекта, полиморфизма, где указанный полиморфизм находится в положении 27 нуклеотидных последовательностей из SEQ ID NO:1-11, или указанный полиморфизм находится в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-11, где присутствие в указанном положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, G в SEQ ID NO:8, A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и/или G в SEQ ID NO:11, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, указывает на то, что пациента выбирают для указанной терапии. В преимущественном варианте осуществления, является возможным применение комбинации SEQ ID NO: 1-7 или 1-8 или 1-11, для вышеуказанного способа.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения риска сердечно-сосудистых событий у субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек на любой из стадий 1-5 хронического заболевания почек, и/или подвергаемого заместительной терапии с помощью диализа (гемодиализа или перитонеального диализа) и/или с помощью трансплантации почки, для прогнозирования, кто подвержен высокому риску развития сердечно-сосудистого заболевания и/или осложнений сердечно-сосудистого заболевания и/или для определения ответа на терапию сердечно-сосудистых заболеваний, включающему в себя стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, присутствия полиморфизма, где указанный полиморфизм находится в положении 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:1-11, или указанный полиморфизм находится в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-11, где присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, G в SEQ ID NO:8, A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и/или G в SEQ ID NO:11 что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем повышенного риска наличия неблагоприятных сердечно-сосудистых заболеваний или нарушений, или низкого ответа на терапию сердечно-сосудистых заболеваний.

В преимущественном варианте осуществления, является возможным применение комбинации SEQ ID NO: 1-7 или 1-8 или 1-11, для вышеуказанного способа.

В дополнительных аспектах, изобретение относится к способам определения вероятности для индивидуума, страдающего CKD, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии в течение 10-летнего периода на основании присутствия одного или нескольких из полиморфизмов, упомянутых выше, в комбинации с одним или несколькими клиническими/биохимическими факторами риска, где относительный вклад каждого полиморфизма или фактора риска в вероятность корректируют с использованием отношений рисков. Отношение рисков является показателем того, насколько часто коронарное событие происходит в группе с каждым из полиморфизмов или факторов риска по сравнению с тем, насколько часто оно происходит в группе без каждого из полиморфизмов или факторов риска, с течением времени).

В преимущественном варианте осуществления, является возможным применение комбинации SEQ ID NO: 1-7 или 1-8, или 1-11, для вышеуказанного способа.

«Улучшенную оценку риска сердечно-сосудистых событий» в контексте этой заявки следует понимать как прогноз вероятности развития сердечно-сосудистого события, соответствующий лучше, чем оценка риска, выполненная посредством шкал/способов, используемых в настоящее время, таких как, но без ограничения, Фремингемская шкала риска, адаптированная Фремингемская шкала риска (такая как, но без ограничения Regicor), Score, HeartScore, Procam, Reynolds, QRisk, с помощью количества событий, которые конкретный пациент претерпел (в контексте ретроспективного исследования) или будет претерпевать, и конструкции калькулятора MACE и смертности по всем причинам с использованием данных расширенного исследования ALERT, включающих в себя в качестве представляющих интерес переменных возраст, предшествующую ишемическую болезнь сердца, курение, уровень креатинина в сыворотке, сахарный диабет, LDL-холестерин (только для MACE), общее время заместительной почечной терапии (только для MACE) и количество трансплантатов (только для смертности), где доступ к калькулятору можно получить на http://www.anst.uu.se/insov254/calculator/(Transplantation 2013; 95:142-147). Улучшение можно измерять как увеличение площади под кривой ROC, измеренной как наивысшее статистическое значение с, рассчитанное в соответствии с Acad Radiol 1997; 4:49-58., где улучшение остаточного индекса реклассификации и/или интегрированное улучшение дискриминации рассчитано в соответствии с Statist Med 2008; 27:157-172.

Валидацию маркеров, включенных в настоящее изобретение, выполняли в соответствии с рекомендациями AHA (Circulation 2009;119:2408-2416).

Таблица 1
Рекомендации по опубликованию новых маркеров риска

1. Публикация основного дизайна и исходов исследования в соответствии с принятыми стандартами для наблюдательных исследований⁴

2. Публикация уровней стандартных факторов риска и результатов для модели риска с использованием этих установленных факторов

3. Оценка нового маркера в популяции и публикация:

a. Относительного риска, отношения шансов или отношения рисков, сообщаемых только новым маркером, с ассоциированными доверительными интервалами и значением P

b. Относительного риска, отношения шансов или отношения рисков для нового маркера после статистической поправки на установленные факторы риска, с ассоциированными доверительными интервалами и значением P

c. Значения P для добавления нового маркера в модель, содержащую стандартные факторы риска

5. Публикация ограничения нового маркера:

а. C-индекса и его доверительных интервалов для модели с установленными маркерами риска

b. C-индекса и его доверительных интервалов для модели, включающей новый маркер и установленные маркеры риска

c. Интегрированного индекса дискриминации, показателя дискриминации или бинарного R ² для модели с новым маркером риска и без него

d. Графического или табличного представления прогнозированного риска для случаев и контроля отдельно, до и после включения нового маркера

4. Публикация точности нового маркера:

a. Представление наблюдаемых по сравнению с ожидаемыми частот событий в диапазоне прогнозированного риска для моделей с новым маркером риска и без него

b. Применение общепринятых пределов риска, публикация количества переклассифицированных субъектов и частот событий в переклассифицированных группах

Полное содержание всех вышеуказанных ссылок включено, таким образом, в качестве ссылки, и, в частности, по отношению к упомянутым конкретным расчетам.

«Улучшенную оценку риска сердечно-сосудистых событий» в контексте этой заявки используют взаимозаменяемо с «уточненной оценкой риска сердечно-сосудистых событий».

Настоящие способы, как описано на всем протяжении этой заявки, в предпочтительном варианте осуществления все осуществляют ex vivo.

В предпочтительном варианте осуществления определяют присутствие следующих аллелей полиморфизма: полиморфизм в положении 27 в специфических последовательностях нуклеиновой кислоты, в частности, присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, G в SEQ ID NO:8, A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и G в SEQ ID NO:11 с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно. Присутствие полиморфизма или аллеля полиморфизма также можно определять в любом другом rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs или SEQ ID NO. Например, присутствие полиморфизма или аллеля полиморфизма можно определять в положении 27 любого такого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым rs или SEQ ID NO, упомянутыми в настоящем документе.

В предпочтительном варианте осуществления определяют присутствие следующих аллелей полиморфизма: полиморфизм в положении 27 в специфических последовательностях нуклеиновой кислоты, в частности, присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, G в SEQ ID NO:8, A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и G в SEQ ID NO:11 с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно. Присутствие полиморфизма или аллеля полиморфизма также можно определять (например, в положении 27) в любом другом rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs или SEQ ID NO. A в SEQ ID NO:9, A в SEQ ID NO:10 и G в SEQ ID NO:11 с номером доступа в db SNP rs10507391, rs9315051, и rs17222842, соответственно (или полиморфизм в любом другом rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs), вместе формируют гаплотип В ALOX5AP, и их рассматривают как один из генетических компонентов риска в дополнение к другим 8 последовательностям.

Эти варианты осуществления, т.е. конкретные комбинации SNP, в частности, комбинация SEQ ID NO 1-7 или 1-8 или 1-11, представляют собой предпочтительные варианты осуществления всех аспектов этого изобретению, описанных ниже.

В другом аспекте изобретение относится к способам оценки вероятности (известной как риск сердечно-сосудистых событий) у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки, или периферической артериопатии в десятилетний период и/или на протяжении жизни на основании присутствия одного или нескольких из полиморфизмов, упомянутых выше, в комбинации с одним или несколькими клиническими и/или биохимическими факторами риска, где относительный вклад полиморфизмов приведен как показатель генетического риска.

В другом аспекте изобретение относится к способам оценки вероятности (известной как риск сердечно-сосудистых событий) у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки или периферической артериопатии в десятилетний период и/или на протяжении жизни на основании присутствия одного или нескольких из полиморфизмов, упомянутых выше, предпочтительно, в комбинации с одним или несколькими клиническими и/или биохимическими факторами риска, где относительный вклад полиморфизмов приведен как показатель генетического риска. Применение настоящего изобретения может повлечь за собой реклассификацию риска сердечно-сосудистых событий по сравнению с классическим способом оценки риска у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек (например, среди прочих, калькуляторов MACE или общего риска смертности Фремингем, Regicor, Score), где риск оценивают без учета генетических и/или клинических/биохимических данных, учитываемых по настоящему изобретению. Реклассификация означает, что с учетом настоящего изобретения, новый риск может быть ниже или выше, чем риск, рассчитанный классическими способами.

«Сердечно-сосудистое событие» в контексте этой заявки используют взаимозаменяемо с «сердечно-сосудистым осложнением».

«AHA» в контексте этой заявки следует понимать как Американскую кардиологическую ассоциацию.

«GWAS» в контексте этой заявки следует понимать как полногеномные исследования ассоциаций.

Термин «заболевание» и «нарушение» следует интерпретировать в контексте этой заявки взаимозаменяемо.

Термин «хроническое заболевание почек» понимают как определение повреждение почки в течение ≥3 месяцев, как определено по структурным или функциональным аномалиям почек, с уменьшением или без уменьшения уровня клубочковой фильтрации (GFR), которые могут приводить к уменьшению GFR, проявляемым либо посредством патологических аномалий, либо посредством маркеров повреждения почек, включая аномалии при тестировании изображений, или GFR <60 мл/мин/11,73 м² в течение ≥3 месяцев, с повреждением или без повреждения почек (Am J Kidney Dis 39:S1-S266,2002 suppl 1, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки).

В другом аспекте изобретение относится к способам реклассификации вероятности (известной как риск сердечно-сосудистых событий) у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, классифицированного как обладающего умеренным риском пострадать от сердечно-сосудистого события (смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки, или периферической артериопатии) в десятилетний период и/или на протяжении жизни, в соответствии со способами, используемыми в настоящее время, на основании присутствия одного или нескольких из полиморфизмов, упомянутых выше, в комбинации с одним или несколькими общепринятыми факторами риска, где относительный вклад полиморфизмов приведен как показатель генетического риска.

В дополнительных аспектах, изобретение относится к способам определения вероятности у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки, или периферической артериопатии в десятилетний период или на протяжении жизни на основании присутствия одного или нескольких из полиморфизмов, упомянутых выше, в комбинации с одним или несколькими общепринятыми факторами риска, где относительный вклад полиморфизмов приведен как показатель генетического риска. В дополнительных аспектах, изобретение относится к способам определения вероятности у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, и страдающего одним или несколькими из несмертельного инфаркта миокарда или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки или периферической артериопатии, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки, или периферической артериопатии в десятилетний период или на протяжении жизни на основании присутствия одного или нескольких из полиморфизмов, упомянутых выше, предпочтительно, в комбинации с одним или несколькими общепринятыми факторами риска, где относительный вклад полиморфизмов приведен как показатель генетического риска.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к компьютерной программе или машиночитаемым носителям, содержащим средства для осуществления любого из способов по изобретению.

В еще одном дополнительном аспекте, изобретение относится к набору, содержащему реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO:1-11. В еще одном дополнительном аспекте, изобретение относится к набору, содержащему реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO:1-8, и при следующих SEQ ID NO: 9, 10 и/или 11, рассматриваемых как гаплотип В ALOX5AP, и аллелях AAG в этих SEQ, рассматриваемых как один аллель риска.

В еще одном дополнительном аспекте, изобретение относится к набору, содержащему реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и/или 8. В еще одном дополнительном аспекте, изобретение относится к набору, содержащему реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и/или 7. В дополнительном аспекте, изобретение относится к компьютерной программе или машиночитаемым носителям, содержащим средства для осуществления любого из способов по изобретению.

Изобретение также дополнительно определено посредством фигур, где на фигуре 1 показан обзор предпочтительных генов и SNP, и на фигуре 2 показано, как популяция с CKD обладает более высоким риском сердечно-сосудистых и коронарных событий, чем общая испанская популяция без CKD (Rev Esp Cardiol 2003;56(3):253).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения идентифицировали серию маркеров однонуклеотидного полиморфизма (SNP), которые, при использовании в комбинации, ассоциированы с риском CVD и/или с риском осложнений CVD, включая, в качестве неограничивающих примеров, инфаркт миокарда, инсульт, стенокардию и периферическую артериопатию, у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек. Эти полиморфные маркеры превосходят полиморфизмы или комбинацию полиморфизмов, используемые в настоящее время.

Авторы настоящего изобретения разрешили проблему, указанную выше, для шкал/способов/оценок, используемых в настоящее время для расчета риска у субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, развития сердечно-сосудистого заболевания, сердечно-сосудистых событий и/или сердечно-сосудистых осложнений, включая в качестве неограничивающих примеров, смертельный и несмертельный инфаркт миокарда, инсульт, стенокардию, транзиторные ишемические атаки и периферическую артериопатию.

Настоящая заявка, таким образом, относится также к способу преодоления ограничений существующих шкал/способов/уравнений, которые неточно прогнозируют сердечно-сосудистые заболевания у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек.

Настоящая заявка, таким образом, относится также к способу преодоления ограничений существующих шкал/способов/уравнений, которые все еще позволяют возникновение значительного количества сердечно-сосудистых событий у субъектов, страдающих хроническим заболеванием почек, только с промежуточным риском, рассчитанным с использованием инструментов, используемых в настоящее время для риска сердечно-сосудистых событий.

Настоящая заявка, таким образом, относится также к способу преодоления ограничений существующих шкал/способов/уравнений, которые неточно прогнозируют сердечно-сосудистые заболевания у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек, в частности, у тех, кто уже страдает одним или несколькими сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Настоящая заявка преодолевает описанные выше ограничения шкал/способов/уравнений, используемых в настоящее время для расчета риска сердечно-сосудистых событий, посредством предоставления способа для точного расчета риска сердечно-сосудистых событий у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек. Используют конкретную комбинацию генетических маркеров (как описано выше). Особенно преимущественной комбинацией является комбинация SNP в SEQ ID NO: 1-7 или 1-8, а именно, rs 17465637, rs 6725887, rs 9818870, rs 12526453, rs 1333049, rs 501120, rs 9982601 и rs 10455872. Даже более предпочтительной и преимущественной является комбинация, как перечислено в таблице 1 (см. фигуру 1), выбранная и оцененная авторами изобретения после комплексного и оригинального анализа тысяч возможных маркеров. Из различных возможностей конструирования показателя генетического риска (GRS), авторы изобретения добились успеха в идентификации одной конкретной, благодаря чему эта комбинация обеспечивала наилучшие возможные результаты. Для расчета пунктуации генетического риска, учитывают накопленное количество аллелей риска из этих SNP, перечисленных в таблице 1, которое присутствует у каждого индивидуума. Для каждого из исследованных вариантов, каждый индивидуум может иметь 0, 1 или 2 аллеля риска. После расчета сумматора аллелей риска, накопленных в различных наборах из выбранных вариантов (n=9 или 8), для каждого индивидуума, приведен балл, который может составлять от 0 до 18 или 16, соответственно. Авторы изобретения получили новые алгоритмы для оценки риска сердечно-сосудистых событий. Этот инновационный способ позволяет точную оценку риска сердечно-сосудистых событий и дополнительно позволяет реклассификацию пациентов с отличными значениями улучшения остаточного индекса реклассификации.

Предпочтительные варианты осуществления этого изобретения обозначены следующим образом:

1. Способ оценки риска сердечно-сосудистых событий у субъекта, включающий в себя в себя стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, присутствия полиморфизма, где указанный полиморфизм находится в положении 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:1-8, или указанный полиморфизм находится в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-8, где присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID NO:6, T в SEQ ID NO:7, и/или G в SEQ ID NO:8, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем риска наличия сердечно-сосудистого события.

2. Способ по пункту 1, где, кроме того, определяют присутствие в положении 27 A в SEQ ID NO: 9, A в SEQ ID NO:10, и/или G в SEQ ID NO:11 с no. доступа в db SNP rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно, или любого другого rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

3. Способ по пункту 1 и/или 2 выше, для реклассификации субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, для улучшенной оценки риска по сравнению с оценкой, полученной с использованием шкал/способов для такой оценки риска, таких как, в качестве неограничивающих примеров, калькулятор MACE, общего риска смертности Фремингем, Regicor, Score, Procam. Qrisk.

4. Способ по любому из пунктов 1-3 выше для идентификации субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, нуждающегося в терапии сердечно-сосудистых заболеваний или нуждающегося в профилактической терапии сердечно-сосудистых заболеваний/наблюдении сердечно-сосудистых событий или нуждающегося в решении конкретных терапевтических задач.

5. Способ по любому из пунктов 2-4 выше, где последние три SEQ (SEQ ID NO 9-11) и rs формируют гаплотип В ALOX5AP, и их рассматривают как один из генетических компонентов риска в дополнение к другим 8 последовательностям.

6. Способы по любому из пунктов 1-5 выше для определения вероятности у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек и страдающего от одного или нескольких из несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки, или периферической артериопатии, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда или стенокардии, или инсульта, или транзиторной ишемической атаки, или периферической артериопатии.

7. Способ по любому из пунктов 1-6 выше для определения терапевтических задач для профилактического и/или терапевтического лечения пациента, страдающего хроническим заболеванием почек и с наличием сердечно-сосудистого события или с подозрением на наличие предрасположенности к сердечно-сосудистому событию, где пациента и/или терапевтические задачи выбирают для указанной терапии на основании присутствия в образце, выделенном от указанного субъекта, полиморфизма, определенного выше.

8. Способ по любому из пунктов 1-7 выше, для определения вероятности у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии в 10-летний период на основании присутствия от 1 до P клинических и/или биохимических факторов риска, и от 1 до J полиморфизмов в положении 27 в вышеуказанных нуклеотидных последовательностях из SEQ ID NO:1-11, с использованием формулы 1a:

, где

вероятность(события_i|CRF_p,i, SNP_j,i) представляет собой вероятность проявления коронарного события с учетом комбинации факторов риска коронарных событий (CRF) и генетических характеристик (SNP_j,i),

- событие_i: коронарное событие (смертельный и несмертельный инфаркт миокарда или стенокардия) в 10-летний период для индивидуума «i»,

- CRF_p,i: значение каждого фактора риска коронарных событий «p», включенное в уравнение для индивидуума «i». Список факторов риска коронарных событий, включенных в модель, показан в таблице A,

- SNP_j,i: количество аллелей риска (0, 1, 2) для конкретного генетического варианта «j», включенное в уравнение для индивидуума «i». Варианты, в настоящее время включенные в модель, показаны в таблице B,

Ŝ представляет собой среднюю выживаемость без коронарных событий в популяции. Эту выживаемость адаптируют для региональных или национальных частот,

exp: возведение в натуральную степень

представляет собой сумматорную функцию для P классических факторов риска,

представляет собой логарифм отношения рисков, соответствующий фактору риска коронарных событий «p», как показано в таблице A,

CRF_p,i представляет собой значение каждого фактора риска коронарных событий «p», включенное в уравнение для индивидуума «i»,

представляет собой сумматорную функцию для J генетических вариантов,

представляет собой логарифм отношения рисков, соответствующий генетическому варианту «j», как показано в таблице B,

SNP_j,i представляет собой количество аллелей риска (0, 1, 2) для конкретного генетического варианта «j», включенное в уравнение для индивидуума «i»,

представляет собой среднее значение для клинического/биохимического фактора риска «p» в популяции,

представляет собой среднее количество копий аллелей риска для генетического варианта «j» в популяции.

9. Способ по любому из пунктов 1-7 выше для определения вероятности у индивидуума, страдающего хроническим заболеванием почек, проявления смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, или стенокардии в 10-летний период на основании присутствия от 1 до P различных клинических/биохимических факторов риска и от 1 до J различных генетических вариантов, где указанный генетический вариант представляет собой вышеуказанный полиморфизм в положении 27 в нуклеотидных последовательностях из SEQ ID NO:1-11, с использованием формулы 1b:

, где

вероятность(события_i|CRF_p,i, GRS_i) представляет собой вероятность проявления коронарного события с учетом комбинации факторов риска коронарных событий (CRF_p,i) и генетических характеристик (GRS_i),

- GRS_i: показатель генетического риска, определенный как взвешенное количество аллелей риска (0, 1, 2) для генетических вариантов, включенное в уравнение для индивидуума «i». Варианты, включенные в показатель генетического риска, показаны в таблице A. Вес является пропорциональным бета для каждого SNP, включенного в показатель (показаны в таблице B), и диапазон GRS продолжается от 0 до двойного количества SNP, включенных в показатель,

Ŝ: средняя выживаемость без коронарных событий в популяции,

exp: возведение в натуральную степень,

, где

представляет собой сумматорную функцию для «p» клинических/биохимических факторов риска,

представляет собой логарифм отношения рисков, соответствующий клиническому/биохимическому фактору риска «p». Значения β для каждого фактора риска коронарных событий «p» показаны в таблице A.

CRF_p,i представляет собой значение каждого фактора риска коронарных событий «p», включенное в уравнение для индивидуума «i».

β_GRS представляет собой логарифм отношения рисков, соответствующий увеличению на одну единицу значения показателя генетического риска. Значение этого ^βGRS составляет 0,104, где диапазон значений продолжается от 0,010 до 0,500,

GRS_i представляет собой значение показателя генетического риска для индивидуума «i»,

представляет собой среднее значение для клинического/биохимического фактора риска «p» в популяции. Это среднее значение адаптируют для региональной или национальной распространенности,

представляет собой среднее значение для показателя генетического риска в популяции;

и другие переменные определяют, как по пункту 8.

10. Способ, как определено по любому из пунктов 1 до 9, где сердечно-сосудистое событие выбрано из группы из смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, инсульта, стенокардии, транзиторной ишемической атаки, периферической артериопатии или их сочетания.

11. Способ, как определено по любому из пунктов 1-10, дополнительно включающий в себя определение одного или нескольких фактора(факторов) риска сердечно-сосудистого заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из возраста, расы, пола, индекса массы тела, систолического артериального давления, диастолического артериального давления, статуса и анамнеза курения, уровня общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL) или липопротеинов высокой плотности (HDL), триглицеридов, дислипидемии в анамнезе, сердечной недостаточности в анамнезе, предшествующего коронарного заболевания сердца, сахарного диабета, гликемии, гликозилированного гемоглобина, гемоглобина A1c, клубочковой фильтрации, статуса заболевания почек (CKD статуса 1-4, заболевания почек на терминальной стадии (ESRD) при заместительной почечной терапии или трансплантации почки), гипертензии, почечной недостаточности и ее статуса (1-5), хронического заболевания почек и его статуса (перед диализом, диализ, трансплантация, отторжение трансплантата), общего времени заместительной почечной терапии, количества трансплантатов, гипертрофии левого желудочка, употребления алкоголя, проявления физической активности, диеты и семейного анамнеза сердечно-сосудистых или коронарных заболеваний, уровней креатинина, кальция, фосфора, паратгормона, альбумина и 24-часовой протеинурии.

12. Способ по любому из пунктов 1-11, где образец представляет собой образец ткани ротовой полости, соскоб или смыв, или образец биологической жидкости, предпочтительно, слюны, мочи или крови.

13. Способ по одному или нескольким из пунктов 1-12, где присутствие или отсутствие полинуклеотида идентифицируют по амплификации или невозможности амплификации продукта амплификации из образца, где продукт амплификации предпочтительно расщепляют рестрикционным ферментом перед анализом, и/или где SNP идентифицируют посредством гибридизации образца нуклеиновой кислоты с праймером, меченным поддающейся детекции группой.

14. Способ, как определено по пунктам 1-13, где используют множество классических факторов риска «p», где указанное множество выбрано из группы из:

- Пола, возраста, общего холестерина, HDL-холестерина, артериального давления, диабета и курения,

- Возраста, LDL-холестерина, HDL-холестерина, триглицеридов, систолического артериального давления, семейного анамнеза инфаркта миокарда и диабета,

- Пола, Log(возраста/10), общего холестерина/HDL-холестерина, индекса массы тела, семейного анамнеза ранних CVD, курения, показателя Таунсенда для областей вывода, систолического артериального давления, лечения гипертензии и взаимодействия систолического кровяного давления (SBP)*лечения гипертензии (HTN),

- Статуса заболевания почек (CKD стадий 1-4, ESDR при заместительной почечной терапии или трансплантации почки),

- Возраста, пола, HDL-холестерина, диабетического состояния, состояния гипертензии, гемоглобина A1c,

- Возраста, предшествующего коронарного заболевания сердца, курения, креатинина в сыворотке, сахарного диабета, LDL-холестерина, общего времени заместительной почечной терапии,

- Возраста, предшествующего коронарного заболевания сердца, курения, креатинина в сыворотке, сахарного диабета, LDL-холестерина, общего времени заместительной почечной терапии, количества трансплантатов.

15. Способ, как определено по пунктам 1-14, где вероятность определяют для периода от 15 до 85 лет возраста субъекта.

16. Способ, как определено по пунктам 1-14, где вероятность определяют для периода от 35 до 75 лет возраста субъекта.

17. Способ, как определено по пунктам 1-14, где вероятность определяют для периода от фактического возраста субъекта и до возраста субъекта 75 лет.

18. Способ, как определено по пунктам 1-17, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

19. Компьютерная программа или машиночитаемые носители, содержащие средства для осуществления способа, как определено по любому из пунктов 1-18.

20. Набор, содержащий реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO: 1-11.

21. Набор, содержащий реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO: 1-8.

22. Набор, содержащий реагенты для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы из SEQ ID NO: 1-7.

23. Набор, как определено по пункту 20 или 22, содержащий одну или несколько пар праймеров, специфических для амплификации области, содержащей по меньшей мере положение 27 в последовательности нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1-7 или SEQ ID NO: 1-8, или SEQ ID NO: 1-11.

24. Набор, как определено по пункту 20 или 23, где выбранные последовательности представляют собой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051 и rs17222842, соответственно, или любой другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

25. Набор, как определено по пункту 21 или 23, где выбранные последовательности представляют собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601 и rs10455872, соответственно, или любой другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

26. Набор, как определено по пункту 22 или 23, где выбранные последовательности представляют собой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7, с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120 и rs9982601, соответственно, или любой другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

27. Набор, как определено по пунктам 24-26, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

28. Набор зондов/праймеров, выбранных из следующей группы:

SEQ ID NO: 12 и 13 (rs1333049), и

SEQ ID NO: 14 и 15 (rs1333049);

SEQ ID NO: 16 и 17 (rs10455872) и

SEQ ID NO: 18 и 19 (rs10455872);

SEQ ID NO: 20 и 21 (rs6725887) и

SEQ ID NO: 22 и 23 (rs6725887);

SEQ ID NO: 24 и 25 (rs9818870) и

SEQ ID NO: 26 и 27 (rs9818870);

SEQ ID NO: 28 и 29 (rs10507391) и

SEQ ID NO: 30 и 31 (rs10507391);

SEQ ID NO: 32 и 33 (rs9982601)и

SEQ ID NO: 34 и 35 (rs9982601);

SEQ ID NO: 36 и 37 (rs9315051) и

SEQ ID NO: 38 и 39 (rs9315051);

SEQ ID NO: 40 и 41 (rs12526453) и

SEQ ID NO: 42 и 43 (rs12526453);

SEQ ID NO: 44 и 45 (rs17222842) и

SEQ ID NO: 46 и 47 (rs17222842);

SEQ ID NO: 50 и 51 (rs17465637) и

SEQ ID NO: 52 и 53 (rs17465637);

SEQ ID NO: 54 и 55 (rs501120) и

SEQ ID NO: 56 и 57 (rs501120);

SEQ ID NO: 58 и 59 (rs2133189) и

SEQ ID NO: 60 и 61 (rs2133189);

SEQ ID NO: 62 и 63 (rs1746048) и

SEQ ID NO: 64 и 65 (rs1746048);

SEQ ID NO: 66 и 67 (rs2133189) и

SEQ ID NO: 68 и 69 (rs2133189).

Все значения, как получено в функции(функциях), адаптируют для региональной или национальной распространенности, по необходимости. Наиболее предпочтительной комбинацией SNP для всех способов и наборах, как описано в настоящем документе, является, таким образом, комбинация SNP из SEQ ID NO: 1-7 или комбинация SNP из SEQ ID NO: 1-8, или комбинация SNP из SEQ ID NO: 1-11.

Термины «полиморфизм» и «однонуклеотидный полиморфизм» (т.е. SNP) используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к варианту нуклеотидной последовательности, возникающему, когда отдельный нуклеотид в геноме или другой общей последовательности отличается между членами вида или между парными хромосомами у индивидуума. SNP можно также обозначать как мутацию с низкой частотой аллеля более приблизительно 1% в определенной популяции. Однонуклеотидные полиморфизмы по настоящей заявке могут попадать в кодирующие последовательности генов, некодирующие области генов или в интронные области между генами.

Список полиморфизмов, используемых в этом способе по настоящему изобретению, приведен в таблице 1, включенной в настоящем документе как Фиг. 1, и представляют собой предпочтительно SNP из SEQ ID No 1-8, SNP из SEQ ID No 1-7, более предпочтительно, SNP из SEQ ID No 1-11.

В настоящем документе, сильное неравновесное сцепление можно определять посредством значения r². Неравновесное сцепление представляет собой характеризацию распространения гаплотипов в паре локусов. Оно описывает ассоциацию между парой хромосомных локусов в популяции. Значение r² считают особенно подходящим для описания неравновесного сцепления.

Показатель неравновесного сцепления r² определяют как

(1),

где p _ab представляет собой частоту гаплотипов, обладающих аллелем a в локусе 1 и аллелем b в локусе 2 (Hill & Robertson. 1968). Так как квадрат коэффициента корреляции, r ² (p _a ·p _b ·p _ab ) может лежать в диапазоне от 0 до 1, p _a ·p _b и p _ab меняются.

«Hill & Robertson, 1968» представляет собой Theor Appl Genetics 1968; 38:226-231.

Сильное неравновесное сцепление представляет собой сцепление с значением r² более 0,7, предпочтительно, более 0,8, более предпочтительно, более 0,9, включая, например, значения r² 1.

Термин «сердечно-сосудистое заболевание или нарушение», как применяют в настоящем документе, включает в себя заболевания, поражающие сердце или кровеносные сосуды, или и то, и другое, или заболевания, связанные с сердечно-легочной и кровеносной системами, включая, - но без ограничения - ишемию, стенокардию, отечные состояния, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, окисление LDL, адгезию моноцитов к эндотелиальным клеткам, образование пенистых клеток, развитие липидных полосок, адгезию и агрегацию тромбоцитов, пролиферацию гладкомышечных клеток, реперфузионное повреждение, высокое артериальное давление, тромботическое заболевание, аритмию (предсердную или желудочковую, или обе); нарушения частоты сердечных сокращений; ишемию миокарда; инфаркт миокарда; аневризму сердца или сосудов; васкулит, инсульт; периферическую обструктивную артериопатию конечности, органа или ткани; реперфузионное повреждение после ишемии головного мозга, сердца или другого органа или ткани, эндотоксический, хирургический или травматический шок; гипертензию, порок клапана сердца, сердечную недостаточность, аномальное артериальное давление; шок; вазоконстрикцию (включая ассоциированную с мигренью); сосудистые аномалию, воспаление и/или недостаточность, ограниченные отдельным органом или тканью.

В предпочтительном варианте осуществления сердечно-сосудистое заболевание или сердечно-сосудистое событие, риск которого подлежит детекции, выбрано из группы из смертельного и несмертельного инфаркта миокарда, инсульта, стенокардии, транзиторных ишемических атак, периферической артериопатии или их сочетания.

Термин «образец», как применяют в настоящем документе, относится к любому образцу из биологического источника и включает в себя, в качестве неограничивающих примеров, культуры клеток или их экстракты, материал, полученный при биопсии от млекопитающего, или его экстракты, и кровь, слюну, мочу, фекалии, семенную жидкость, слезы, или другие жидкости организма или их экстракты.

Когда используют прогностические модели, как в конкретном случае, для принятия решений относительно лечения, прогнозируемые риски категоризируют с использованием отсекающих порогов риска. Термин «реклассификация», как применяют в настоящем документе, относится к приписыванию субъекта к другой категории риска согласно новой модели по сравнению с первоначальной моделью оценки риска. Реклассификацию, как правило, обозначают как процент реклассифицированных субъектов.

Термин «улучшение остаточного индекса реклассификации (NRI)» как применяют в настоящем документе, относится к оценке общего улучшения в классификации риска. NRI рассчитывают как сумму различий в доле индивидуумов, передвинутых выше, минус доля передвинутых ниже для случаев и в доле индивидуумов, передвинутых ниже, минус доля передвинутых выше для контроля. Компоненты NRI показывают общее преимущество от улучшения при реклассификации для случаев и контроля. Положительные и отрицательные значения представляют общее процент индивидуумов с улучшенной или улучшенной классификацией, соответственно. В общем, на улучшение при реклассификации указывает NRI значимо выше 0.

Термин «терапия сердечно-сосудистых заболеваний», как применяют в настоящем документе, относится к любому типу лечения, которое приводит к облегчению любого из вышеупомянутых сердечно-сосудистых заболеваний или снижает риск пострадать от любого из вышеупомянутых сердечно-сосудистых заболеваний. Подходящие виды терапии для применения по настоящему изобретению включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, антикоагулянты, антитромбоцитарные средства, тромболитические средства, противотромботические средства, противоаритмические средства, средства, продлевающие реполяризацию, средства против гипертензии, сосудорасширяющие средства, антигипертензивные средства, диуретики, инотропные средства, средства против стенокардии, средства с гиполипемическим действием или гиполипемические средства и т.п.

Неограничивающие примеры антикоагулянтов включают в себя аценокумарол, анкрод, анизиндион, броминдион, хлориндион, куметарол, циклокумарол, декстрансульфат натрия, дикумарол, дифенадион, этилбискумацетат, этилиден дикумарол, флуиндион, гепарин, гирудин, лиаполат натрия, оксазидион, полисульфат пентозана, фениндион, фенпрокумон, фосвитин, пикотамид, тиокломарол и варфарин.

Неограничивающие примеры антитромбоцитарных средств включают в себя аспирин, декстран, дипиридамол (персантин), гепарин, сульфинпиранон (антуран), кропидрогел и тиклопидин (тиклид).

Неограничивающие примеры тромболитических средств включают в себя тканевой активатор плазминогена (активазу), плазмин, проурокиназу, урокиназу (аббокиназу), стрептокиназу (стрептазу), антистреплазу/APSAC (эминазу). Неограничивающие примеры противотромботических средств включают в себя анагрелид, аргатробан, цилстазол, далтробан, дефибротид, эноксапарин, фраксипарин, индобуфен, ламопаран, озагрел, пикотамид, плафибрид, теделпарин, тиклопидин и трифлузал. Неограничивающие примеры антиаритмических средств включают в себя антиаритмические средства класса I (блокаторы натриевых каналов), антиаритмические средства класса II (блокаторы бета-адренергических рецепторов), антиаритмические средства класса III (продлевающие реполяризацию лекарственные средства), антиаритмические средства класса IV (блокаторы кальциевых каналов) и смешанные антиаритмические средства.

Неограничивающие примеры блокаторов натриевых каналов включают в себя антиаритмические средства класса IA, класса IB и класса IС. Неограничивающие примеры антиаритмических средств класса IA включают в себя диспирамид (норпейс), прокаинамид (пронестил) и хинидин (хинидекс). Неограничивающие примеры антиаритмических средств класса IB включают в себя лидокаин (ксилокаин), токайнид (тонокард) и мексилетин (мекситил).

Неограничивающие примеры антиаритмических средств класса IC включают в себя энкаинид (энкаид) и фиекаинид (тамбокор). Неограничивающие примеры бета-блокаторов, которые иначе известны как блокаторы бета-адренергических рецепторов, антагонисты бета- адренергических рецепторов или антиаритмические средства класса II, включают в себя ацебутолол (сектрал), алпренолол, амосулалол, аротинолол, атенолол, бефунолол, бетаксолол, бевантолол, бисопролол, бопиндолол, букумолол, буфетолол, буфуралол, бунитролол, бупранолол, гидрохлорид бутидрина, бутофилолол, каразолол, картеолол, карведилол, целипролол, цетамолол, клоранолол, дилевалол, эпанолол, эсмолол (бревиблок), инденолол, лабеталол, левобунолол, мепиндолол, метипранолол, метопролол, мопролол, надолол, надоксолол, нифеналол, инпрадилол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, практолол, пронеталол, пропанолол (индерал), соталол (бетапейс), сульфиналол, талинолол, тетратолол, тимолол, толипролол и ксибинолол. В конкретных вариантах осуществления бета-блокатор содержит производное арилоксипропаноламина.

Неограничивающие примеры производных арилоксипропаноламина включают в себя ацебутолол, алпренодол, аротинолол, атенолол, бетаксолол, бевантолол, бисопролол, бопиндолол, бунитролол, бутофилолол, каразолол, картеолол, карведилол, целипролол, цетамолол, эпанолол, инденолол, мепиндолол, метипранолол, метопролол, мопролол, надолол, нипрадилол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, пропанолол, талинолол, тертатолол, тимолол и толипролол.

Неограничивающие примеры средств с гиполипемическим действием в качестве неограничивающих примеров включают в себя секвестранты желчных кислот, такие как четвертичные амины (например, холестирамин и колестипол); никотиновую кислоту и ее производные; ингибиторы HMG-CoA редуктазы, такие как мевастатин, правастатин и симвастатин; гемфиброзил и другие фиброевые кислоты, такие как клофибрат, фенофибрат, бензафибрат и ципофибрат; пробукол; ралоксифен и их производные. Неограничивающие примеры средств, продлевающих реполяризацию, также известных как антиаритмические средства класса III, включают в себя амиодарон (кордарон) и соталол (бетапейс).

Неограничивающие примеры блокаторов кальциевых каналов, иначе известных как антиаритмические средства класса IV, включают в себя арилалкиламин (например, бепридил, дилтиазем, фендилин, галлопамил, прениламин, теродилин, верапамил), производное дигидропиридина (фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, нимодипин, нисолдипин, нитрендипин) производное пиперазинида (например, циннаризин, флунаризин, лидофлазин) или смешанные блокаторы кальциевых каналов, такие как бенциклан, этафенон, магний, мибефрадил или пергексиллин. В конкретных вариантах осуществления блокатор кальциевых каналов содержит длительно действующий дигидропиридиновый (нифедипинового типа) антагонист кальция.

Неограничивающие примеры смешанных антиаритмических средств включают в себя аденозин (аденокард), дигоксин (ланоксин), ацекаинид, аймалин, амопроксан, априндин, тозилат бретилия, бунафтин, бутобендин, капобеновую кислоту, цифенлин, дизопиранид, гидрохинидин, индекаинид, бромид ипатропия, лидокаин, лораймин, лоркаинид, меобентин, морицизин, пирменол, праймалин, пропафенон, пиринолин, полигалактуронат хинидина, сульфат хинидина и виквидил.

Неограничивающие примеры антигипертензивных средств включают в себя симпатолитики, альфа/бета-блокаторы, альфа-блокаторы, средства против ангиотензина II, бета-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, сосудорасширяющие средства и смешанные антигипертензивные средства.

Неограничивающие примеры альфа-блокаторов, также известных как блокаторы альфа-адренергических рецепторов или антагонисты альфа-адренергических рецепторов, включают в себя амосулалол, аротинолол, дапипразол, доксазозин, мезилаты эрголоида, фенспирид, индорамин, лабеталол, ницерголин, празозин, теразозин, толазолин, тримазозин и йохимбин. В конкретных вариантах осуществления блокатор может содержать производное хиназолина.

Неограничивающие примеры производных хиназолина включают в себя альфузозин, буназозин, доксазозин, празозин, теразозин и тримазозин. В конкретных вариантах осуществления антигипертензивное средство является антагонистом как α-, так и бета-адренергических рецепторов. Неограничивающие примеры альфа/бета-блокаторов включают в себя лабеталол (нормодин, трандат).

Неограничивающие примеры средств против ангиотензина II включают в себя ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента и антагонисты рецепторов ангиотензина II. Неограничивающие примеры ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (ингибиторы ACE) включают в себя алацеприл, эналаприл (вазотек), каптоприл, цилазаприл, делаприл, эналаприлат, фозиноприл, лизиноприл, мовелтоприл, периндоприл, хинаприл и рамиприл. Неограничивающие примеры блокаторов рецепторов ангиотензина II, также известных как антагонисты рецепторов ангиотензина II, блокаторы рецепторов ANG или блокаторы рецепторов блокаторы рецепторов ANG-II типа 1 (ARBS), включают в себя ангиокандесартан, эпросартан, ирбесартан, лозартан и валсартан. Неограничивающие примеры симпатолитических средств включают в себя симпатолитические средства центрального действия или симпатолитические средства периферического действия. Неограничивающие примеры симпатолитических средств центрального действия, также известных как симпатолитические средства, действующие на центральную нервную систему (ЦНС), включают в себя клонидин (катапрес), гуанабенз (витензин) гуанфацин (тенекс) и метилдопа (альдомет). Неограничивающие примеры симпатолитических средств периферического действия включают в себя блокирующие ганглии средства, адренергические блокирующие нейроны средства, блокирующие бета-адренергические рецепторы средства или блокирующие α-адренергические рецепторы средства. Неограничивающие примеры блокирующих ганглии средств включают в себя мекамиламин (инверсин) и триметафан (арфонад). Неограничивающие примеры адренергических блокирующих нейроны средств включают в себя гуанетидин (исмелин) и резерпин (серпазил). Неограничивающие примеры блокаторов бета-адренергических рецепторов включают в себя аценитолол (сектрал), атенолол (тенормин), бетаксолол (керлон), картеолол (картрол), лабеталол (нормодин, трандат), метопролол (лопрессор), наданол (коргард), пенбутолол (леватол), пиндолол (вискен), пропранолол (индерал) и тимолол (блокадрен). Неограничивающие примеры блокаторов альфа-адренергических рецепторов включают в себя празозин (минипресс), доксазоцин (кардура) и теразозин (гитрин).

В конкретных вариантах осуществления лекарственное средство против сердечно-сосудистых заболеваний может содержать сосудорасширяющее средство (например, церебральное сосудорасширяющее средство, коронарное сосудорасширяющее средство или периферическое сосудорасширяющее средство). В конкретных предпочтительных вариантах осуществления сосудорасширяющее средство содержит коронарное сосудорасширяющее средство. Неограничивающие примеры коронарных сосудорасширяющих средств включают в себя амотрифен, бендазол, гемисукцинат бенфуродила, бензиодарон, хлорацизин, хромонар, клобенфурол, клонитрат, дилазеп, дипиридамол, дропрениламин, эфлоксат, эритритилтетранитран, этафенон, фендилин, флоредил, ганглефен, бис(бета-диэтиламиноэтиловый простой эфир) герестрола, гексобендин, тозилат итрамина, кхеллин, лидофланин, гексанитрат маннита, медибазин, никорглицерин, тетранитрат пентаэритритола, пентринитрол, пергексилин, пимефиллин, трапидил, трикромил, триметазидин, фосфат тролнитрата и виснадин.

В конкретных вариантах осуществления сосудорасширяющее средство может содержать сосудорасширяющее средство для хронической терапии или сосудорасширяющее средство против гипертонического криза. Неограничивающие примеры сосудорасширяющего средства для хронической терапии включают в себя гидралазин (апрезолин) и миноксидил (лонитен). Неограничивающие примеры сосудорасширяющего средства против гипертонического криза включают в себя нитропруссид (ниприд), диазоксид (гиперстат IV), гидралазин (апрезолин), миноксидил (лонитен) и верапамил. Неограничивающие примеры смешанных антигипертензивных средств включают в себя аймалин, гамма-аминомасляную кислоту, буфениод, циклетаинин, циклозидомин, a таннат криптенамина, фенолдопам, флозехинан, кетансерин, мебутамат, мекамиламин, метилдопа, метил-4-пиридилкетонтиосемикарбазон, музолимин, паргилин, пемпидин, пинацидил, пипероксан, примаперон, протовератрин, раубазин, ресциметол, рилмениден, саралазин, нитроруссид натрия, тикринафен, камзилат триметафана, тирозиназу и урапидил.

В конкретных вариантах осуществления антигипертензивное средство может содержать производное арилэтаноламина, производное бензотиадиазина, производное 7N-карбоксиалкил(пептида/лактама), производное дигидропиридина, производное гуанидина, гидразины/фталазины, производное имидазола, соединение четвертичного аммония, производное резерпина или производное сульфонамида. Неограничивающие примеры производных арилэтаноламина включают в себя амосулалол, буфуралол, дилевалол, лабеталол, пронеталол, соталол и сульфиналол. Неограничивающие примеры производных бензотиадиазина включают в себя алтизид, бендрофлуметиазид, бензтиазид, бензилгидрохлортиазид, бутиазид, хлортиазид, хлорталидон, циклопентиазид, циклотиазид, диазоксид, эпитиазид, этиазид, фенхизон, гидрохлортизид, гидрофлуметизид, метилклотиазид, метикран, метолазон, парафлутизид, политизид, тетрахлорметиазид и трихлорметиазид. Неограничивающие примеры производных N-карбоксиалкил(пептида/лактама) включают в себя алацеприл, каптоприл, цилазаприл, делаприл, эналаприл, эналаприлат, фозиноприл, лизиноприл, мовелтиприл, периндоприл, хинаприл и рамиприл. Неограничивающие примеры производных дигидропиридина включают в себя амлодипин, фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, нилвадипин, нисолдипин и нитрендипин. Неограничивающие примеры производных гуанидина включают в себя бетанидин, дебризохин, гуанабенз, гуанаклин, гуанадрел, гуаназодин, гуанетидин, гуанфацин, гуанохлор, гуаноксабенз и гуаноксан. Неограничивающие примеры гидразинов/фталазинов включают в себя будралазин, кадралазин, дигидралазин, эндралазин, гидракарбазин, гидралазин, фенипразин, пилдралазин и тодралазин. Неограничивающие примеры производных имидазола включают в себя клонидин, лофексидин, фентоламин, тиаменидин и толонидин. Неограничивающие примеры соединений четверичного аммония включают в себя бромид азаметония, хлорид хоризондамина, гексаметоний, бис(метилсульфат) пентациния, бромид пентаметония, тартрат пентолиния, хлорид фенактропиния и метосульфат триметидиния. Неограничивающие примеры производных резерпина включают в себя биетазерпин, десерпидин, ресциннамин, резерпин и сиросингопин. Неограничивающие примеры производных сульфонамида включают в себя амбузид, клопамид, фуросемид, индапамид, хинетазон, трипамид и ксипамид. Сосудосуживающие средства, как правило, используют для повышения кровяного давления при шоке, который может произойти во время хирургической операции. Неограничивающие примеры сосудосуживающих средств, также известных как антигипотензивные средства, включают в себя метилсульфат амезиния, амид ангиотензина, диметофрин, дофамин, этифелмин, этилефрин, гепефрин, метараминол, мидодрин, норэпинефрин, фоледрин и синефрин. Неограничивающие примеры средств для лечения застойной сердечной недостаточности включают в себя средства против ангиотензина II, лекарственные средства, уменьшающие постнагрузку-преднагрузку на сердце, диуретики и инотропные средства.

В конкретных вариантах осуществления пациента - животное, например, человека, который не может переносить лечения антагонистом ангиотензина, можно лечить с помощью комбинированной терапии. Такая терапия может комбинировать введение гидралазина (апресолина) и динитрата изосорбида (изордила, сорбитрата).

Неограничивающие примеры диуретиков включают в себя производное тиазида или бензотиадиазина (например, алтиазид, бендрофлуметазид, бензтиазид, бензилгидрохлортиазид, бутиазид, хлортиазид, хлорталидон, циклопентиазид, эпитиазид, этиазид, фенхизон, гидрохлоротиазид, гидрофлуметазид, метилклотиазид, метикран, метолазон, парафлутизид, политизид, тетрахлорметиазид, трихлорметиазид), ртутьорганические соединения (например, хлормеродрин, мераллурид, меркамфамид, меракптомерин натрия, меркумаллиловая кислота, меркуматиллиндодий, хлорид ртути, мерсалил), птеридин (например, фуртерен, триамтерен), пурины (например, ацефиллин, 7-морфолинометилтеофиллин, памобром, протеобромин, теобромин), стероиды, включая антагонисты альдостерона (например, канренон, олеандрин, спиронолактон), производные сульфонамида (например, ацетазоламид, амбузид, азосемид, буметанид, бутазоламид, хлораминофенамид, клофенамид, клопамид, клорексолон, дифенилметан-4,4'-дисульфонамид, дисульфамид, этоксзоламид, фуросемид, индапамид, мефрузид, метазоламид, пиретанид, хинетазон, торасемид, трипамид, ксипамид), урацил (например, аминометрадин, амизометрадин), истощающий калий антагонист (например, амилорид, триамтерен) или смешанные диуретики, такие как аминозин, арбутин, хлоразанил, этакриновая кислота, этозолин, гидракарбазин, изосорбид, маннит, метохалькон, музолимин, пергексилин, тикорнафен и мочевина.

Неограничивающие примеры положительных ионотропных средств, также известных как кардиотонические средства, включают в себя ацефиллин, ацетилдигитоксин, 2-амино-4-пиколин, амринон, гемисукцинат бенфуродила, букладезин, церберозин, камфотамид, конваллотоксин, цимарин, денопамин, десланозид, дигиталин, дигиталис, дигитоксин, дигоксин, добутамин, дофамин, допексамин, эноксимон, эритрофлеин, феналкомин, гиталин, гитоксин, гликоциамин, гептаминол, гидрастинин, ибопамин, ланатозид, метамивам, милринон, нерифолин, олеандрин, оубаин, оксифедрин, преналтерол, просцилларидин, резибуфогенин, сцилларен, сцилларенин, строфантин, сулмазол, теобромин и ксамотерол.

В конкретных вариантах осуществления инотропное средство представляет собой сердечный гликозид, агонист бета-адренергических рецепторов или ингибитор фосфодиэстеразы. Неограничивающие примеры сердечных гликозидов включают в себя дигоксин (ланоксин) и дигитоксин (кристодигин). Неограничивающие примеры агонистов бета-адренергических рецепторов включают в себя альбутерол, бамбутерол, битолтерол, карбутерол, кленбутерол, клорпреналин, денопамин, диоксетедрин, добутамин (добутрекс), дофамин (интропин), допексамин, эфедрин, этафедрин, этилнорэпинефрин, фенотерол, формотерол, гексопреналин, ибопамин, изоэтарин, изопротеренол, мабутерол, метапротеренол, метоксифенамин, оксифедрин, пирбутерол, прокатерол, протокилол, репротерол, римитерол, ритодрин, сотеренол, тербуталин, третохинол, тулобутерол и ксамотерол. Неограничивающие примеры ингибиторов фосфодиэстеразы включают в себя амринон (инокор).

Средства против стенокардии могут содержать органические нитраты, блокаторы кальциевых каналов, бета-блокаторы и их сочетания. Неограничивающие примеры органических нитратов, также известных как нитровазодилататоры, включают в себя нитроглицерин (нитробид, нитростат), динитрат изосорбида (изордил, сорбитрат) и амилнитрат (аспирол, вапорол). Эндотелин (ET) представляет собой пептид из 21 аминокислоты, обладающий сильными физиологическими и патофизиологическими эффектами, которые, по-видимому, вовлечены в развитие сердечной недостаточности. Эффекты ET опосредованы взаимодействием с двумя классами рецепторов клеточной поверхности. Рецептор типа A (ET-A) ассоциирован с сужением сосудов и ростом клеток, в то время как рецептор типа В рецептор (ET-8) ассоциирован с опосредованным эндотелиальными клетками расширением сосудов и с высвобождением других нейрогормонов, таких как альдостерон. Фармакологические средства, которые могут ингибировать либо продукцию ET, либо его способность стимулировать соответствующие клетки, известны в данной области. В ингибирование продукции ET вовлечено использование средств, которые блокируют фермент, называемый эндотелин-превращающим ферментом, вовлеченный в процессинг активного пептида из его предшественника. В ингибирование способности ET стимулировать клетки вовлечено использование средств, которые блокируют взаимодействие ET с его рецепторами. Неограничивающие примеры антагонистов рецепторов эндотелина (ERA) включают в себя бозентан, енрасентан, Амбрисентан, дарусентан, тезосентан, атрасентан, авосентан, клазосентан, эдонентан, ситаксентан, TBC 3711, BQ 123 и BQ 788.

Специалистам в данной области понятно, что анализ присутствующих нуклеотидов способом по изобретению в нуклеиновой кислоте индивидуума можно осуществить любым методом или способом, способными определять нуклеотиды, присутствующие в полиморфном участке. Как очевидно в данной области, нуклеотиды, присутствующие в полиморфных маркерах, можно определять по любой цепи нуклеиновой кислоты или по обеим цепям.

После получения биологического образца от субъекта (например, жидкости организма, такой как моча, слюна, плазма, сыворотка или образец ткани, такой как образец буккальной ткани или буккальные клетки), как правило, осуществляют детекцию варианта последовательности или аллельного варианта SNP. Можно использовать фактически любой способ, известный специалисту в данной области. Возможно, наиболее прямой способ состоит в фактическом определении последовательности либо геномной ДНК, либо кДНК, и сравнении этих последовательностей с известными аллелями SNP гена. Это может представлять собой достаточной дорогой и длительный процесс. Однако эта технология является вполне распространенной и хорошо известной. Любой из множества способов, существующих для детекции вариантов последовательности, можно использовать в способах по изобретению. Конкретный используемый способ не является важным для оценки риска сердечно-сосудистых событий или выбора лечения.

Существуют другие возможные коммерчески доступные способы для высокопроизводительной идентификации SNP, в которых не используют технологии прямого секвенирования. Например, технология Illumina's Veracode, химические реагенты для генотипирования SNP Taqman® и химические реагенты для генотипирования SNP KASPar.

Вариантом способа прямого определения последовательности является способ Gene Chip™, доступный из Affymetrix. Альтернативно, являются также коммерчески доступными надежные и менее дорогостоящие способы детекции вариантов последовательности ДНК. Например, в Perkin Elmer адаптировали свой анализ TAQman(™) для детекции вариантов последовательности. Orchid Biosciences обладает способом, называемым SNP-IT(™) (SNP-Identification Technology), в котором используют достройку праймера с использованием меченых аналогов нуклеотидов для того, чтобы определить, какой нуклеотид встречается в положении непосредственно на 3' от олигонуклеотидного зонда, затем достроенное основание идентифицируют с использованием прямой флуоресценции, непрямого колориметрического анализа, масс-спектрометрии или поляризации флуоресценции. В Sequenom используют технологию захвата гибридизацией плюс MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы) для детекции генотипов SNP с помощью своей системы MassARRAY(™). Promega предоставляет систему SNP/генотипирования READIT(™) (патент США № 6159693). По этому способу зонды ДНК или РНК probes гибридизуют с последовательностями нуклеиновой кислоты - мишенями. Зонды, комплементарные каждому основанию последовательности-мишени, деполимеризуют с использованием запатентованной смеши ферментов, в то время как зонды, которые отличаются от мишени в рассматриваемом положении, остаются интактными. В способе используют химическую реакцию пирофосфорилирования в комбинации с детекцией посредством люциферазы для обеспечения высоко чувствительной и адаптируемой системы оценки SNP. Third Wave Technologies обладает способом Invader OS(™), в котором используют запатентованные ферменты Cleavaseg, которые узнают и расщепляют только конкретную структуру, сформированную в ходе процесса Invader. Invader OS основан на линейной амплификации сигнала, генерируемого процессом Invader, а не на экспоненциальной амплификации мишени. В анализе Invader OS не используют ПЦР ни в одной части анализа. Кроме того, существует ряд аналитических лабораторий для тестирования ДНК и множество исследовательских лабораторий, в которых используют геноспецифическую ПЦР с последующим расщеплением рестрикционной эндонуклеазой и электрофорезом в геле (или другой технологией разделения по размеру) для детекции полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP).

В различных вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов, присутствие или отсутствие SNP идентифицируют посредством амплификации или невозможности амплификации продукта амплификации из образца. Способы амплификации полинуклеотидов, как правило, являются зависимыми от матрицы. Такие способы амплификации в общем опираются на существование матричной цепи для получения дополнительных копий матрицы. Праймеры представляют собой короткие нуклеиновые кислоты, которые способны выполнять роль затравки для синтеза образующейся нуклеиновой кислоты в зависимом от матрицы процессе, которые гибридизуются с матричной цепью. Как правило, праймеры составляют от десяти до тридцати пар оснований в длину, но можно использовать более длинные последовательности. Праймеры можно предоставлять в двухцепочечной и/или одноцепочечной форме, несмотря на то что одноцепочечная форма, как правило, является предпочтительной. Часто пары праймеров разрабатывают для избирательной гибридизации с отдельными участками матричной нуклеиновой кислоты, и приводят их в контакт с матрицей ДНК в условиях, позволяющих избирательную гибридизацию. В зависимости от желательного применения, можно выбирать условия гибридизации с высокой строгостью, позволяющие только гибридизацию с последовательностями, полностью комплементарными праймерам. В других вариантах осуществления гибридизация может происходить при сниженной строгости, чтобы позволять амплификацию нуклеиновых кислот, содержащих одно или несколько несоответствий с последовательностями праймеров. После гибридизации комплекс матрица-праймер приводят в контакт с одним или несколькими ферментами, которые содействуют зависимому от матрицы синтезу нуклеиновой кислоты. Проводят множество раундов амплификации, также обозначаемых как «циклы», пока не будет получено достаточное количество продукта амплификации.

Полимеразная цепная реакция

Для амплификации олигонуклеотидных последовательностей, присутствующих в данном образце матрицы, доступен ряд зависимых от матрицы процессов. Одним из наиболее известных способов амплификации является полимеразная цепная реакция. В ПЦР пары праймеров, которые избирательно гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, используют в условиях, позволяющих избирательную гибридизацию. Термин «праймер», как применяют в настоящем документе, охватывает любые нуклеиновые кислоты, способные служить затравкой для синтеза образующейся нуклеиновой кислоты в зависимом от матрицы процессе. Праймеры можно предоставлять в двухцепочечной или одноцепочечной форме, хотя одноцепочечная форма является предпочтительной. Праймеры используют в любом из ряда зависимых от матрицы процессов для амплификации последовательности гена-мишени, присутствующей в данном образце матрицы. Одним из наиболее известных способов амплификации является ПЦР, которая подробно описана в патентах США No. 4683195; 4683202 и 4800159, содержание каждого из которых включено в настоящий документ в качестве ссылки. Для ПЦР получают две последовательности праймеров, комплементарные участкам на противоположных комплементарных цепях последовательности гена(генов)-мишени(мишеней). Праймеры гибридизуются с образованием комплекса нуклеиновая кислота:праймер, если последовательность гена(генов)-мишени(мишеней) присутствует в образце. В реакционную смесь добавляют избыток дезоксирибонуклеозидтрифосфатов вместе с ДНК полимеразой, например, полимеразой Taq, которая содействует зависимому от матрицы синтезу нуклеиновой кислоты. Если сформирован комплекс последовательности гена(генов)-мишени(мишеней) с праймером, полимераза достраивает праймеры вдоль последовательности гена(генов)-мишени(мишеней) посредством присоединения нуклеотидов. При повышении и понижении температуры реакционной смеси, достроенные праймеры и ген(ы)-мишень(мишени) диссоциируют с образованием продуктов реакции, избыток праймеров связывается с геном(генами)-мишенью(мишенями) и с продуктами реакции, и процесс повторяется. Это множество раундов амплификации, обозначаемых как «циклы», проводят до тех пор, пока не будет получено достаточное количество продукта амплификации.

Перед анализом продукт амплификации можно расщеплять рестрикционным ферментом. В других вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов, присутствие или отсутствие SNP идентифицируют посредством гибридизации образца нуклеиновой кислоты с праймером, меченным поддающейся детекции группой. В других вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов, поддающуюся детекции группу детектируют в ферментативном анализе, радиоизотопном анализе, иммунологическом анализе или посредством детекции флуоресценции. В других вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов, праймер метят поддающимся детекции красителем (например, SYBR Green 1, YO-PRO-1, тиазол оранжевый, Hex, пико зеленый, эданс, флуоресцеин, FAM, или TET). Можно использовать также нефлуоресцентные хромофоры, например, гасители, например, темные гасители, например, гаситель Black Hole-1 (BHQ-1). В других вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов, праймеры локализованы на чипе. В других вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов, праймеры для амплификации являются специфическими для указанных SNP.

Например, в некоторых вариантах осуществления зонды, описываемые в настоящем документе, можно метить для применения в способах на основе флуоресценции, как указано выше, на одном конце (например, 5‘-конце) с помощью красителя (например, флуоресцентного красителя; например, FAM или Hex), и на другом конце (например, 3‘-конце) с помощью гасителя, например, с помощью BHQ-1. Например, для SEQ ID NO:58 и 59, соответственно, таким способом можно получать молекулы, представленные как FAM-AATGGAAGTATcATACACTGCTGATGG-BHQ1 и

HEX-AAATGGAAGTATtATACACTGCTGATGG-BHQ1. Например, для SEQ ID NO: 64 и 65, соответственно, таким способом можно получать молекулы, представленные как

FAM-AGGATTGAGcGAGTCAGGC-BHQ1 и

HEX-TAGGATTGAGtGAGTCAGGC-BHQ1.

Другим способом амплификации является лигазная цепная реакция («ЛЦР»). ЛЦР отличается от ПЦР, поскольку она амплифицирует молекулу зонда, а не создает ампликон посредством полимеризации нуклеотидов. Для ЛЦР получают две пары комплементарных зондов, и в присутствии последовательности-мишени каждая пара связывается с противоположными комплементарными цепями мишени так, что они примыкают друг к другу. В присутствии лигазы, две пары зондов связываются с формированием одного блока. Посредством циклического изменения температуры, как в ПЦР, связанные легированные блоки и мишень диссоциируют, а затем служат в качестве «последовательностей-мишеней» для легирования избытка пар зондов. В патенте США No. 4883750, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки, описан способ, сходный с ЛЦР, для связывания пар зондов с последовательностью-мишенью.

Изотермическая амплификация

Способ изотермической амплификации, в котором рестрикционные эндонуклеазы и лигазы используют для осуществления амплификации молекул-мишеней, которые содержат нуклеотид 5'-[[α]-тио]-трифосфаты в одной цепи участка рестрикции, также можно использовать в амплификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления способ изотермической амплификации с формированием петель (LAMP) используют для типирования однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

Амплификация с замещением цепей

Амплификация с замещением цепей (SDA) является другим способом осуществления изотермической амплификации нуклеиновых кислот, включающим в себя множество раундов замещения цепей и синтеза, т.е. ник-трансляцию. Сходный способ, называемый репаративной цепной реакцией (RCR), включает в себя гибридизацию нескольких зондов на всем протяжении области, являющейся мишенью для амплификации, с последующей реакцией репарации, в которой присутствуют только два из четырех оснований. Другие два основания можно добавлять в форме биотинилированных производных для простоты детекции.

Амплификация на основе транскрипции

Другие способы амплификации нуклеиновых кислот включают в себя системы амплификации на основе транскрипции, включая амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты. В амплификации на основе последовательности нуклеиновой кислоты, нуклеинов кислоты получают для амплификации посредством стандартной экстракции фенолом/хлороформом, тепловой денатурации клинического образца, обработки лизирующим буфером и колонок для миницентрифугирования для выделения ДНК и РНК или экстракции РНК хлоридом гуанидина. Эти способы амплификации включают в себя гибридизацию праймера, который обладает длинной последовательностью, специфической для мишени. После полимеризации гибриды ДНК/РНК расщепляют РНКазой H, в то время как молекулы двухцепочечной ДНК снова подвергают тепловой денатурации. В любом случае одноцепочечную ДНК превращают в полностью двухцепочечную посредством добавления второго праймера со специфичностью к мишени с последующей полимеризацией. Затем молекулы двухцепочечной ДНК многократно подвергают транскрипции посредством полимеразы, такой как T7 или SP6. В изотермической циклической реакции РНК подвергают обратной транскрипции в двухцепочечную ДНК и транскрибируют еще раз с использованием полимеразы, такой как T7 или SP6. Получаемые продукты, усеченные или полноразмерные, представляют последовательности, специфические для мишени. Другие способы амплификации можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. В одном из вариантов осуществления «модифицированные» праймеры используют в подобном ПЦР синтезе, зависимом от матрицы и фермента. Праймеры можно модифицировать посредством мечения с помощью связывающей группы (например, биотина) и/или детекторной группы (например, фермента). В присутствии последовательности-мишени происходит связывание и каталитическое расщепление зонда. После расщепления происходит высвобождение интактной последовательности-мишени, подлежащей связыванию избытком зонда. Расщепление меченного зонда является сигналом присутствия последовательности-мишени. В другом способе, процесс амплификации нуклеиновой кислоты включает в себя циклический синтез одноцепочечной РНК («оцРНК»), оцДНК и двухцепочечной ДНК (дцДНК), которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. ОцРНК представляет собой первую матрицу для первого олигонуклеотидного праймера, который подвергается достройке посредством обратной транскриптазы (РНК- зависимой ДНК-полимераза). Затем РНК удаляют из получаемого дуплекса ДНК:РНК посредством действия рибонуклеазы H (РНКазы H, РНКазы, специфической для РНК в дуплексе либо с ДНК, либо с РНК). Получаемая оцДНК представляет собой вторую матрицу для второго праймера, который также содержит последовательности промотора РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразы T7) на 5' от его гомологии с матрицей. Затем этот праймер достраивают посредством ДНК полимеразы (например, большого фрагмента «Кленова» ДНК полимеразы I E. coli), с получением молекулы двухцепочечной ДНК («дцДНК»), обладающей последовательностью, идентичной последовательности исходной РНК, между праймерами и обладающей дополнительно, на одном конце, последовательностью промотора. Эту последовательность промотора может использовать подходящая РНК-полимераза для создания множества РНК-копий ДНК. Затем эти копии могут входить обратно в цикл, что приводит к очень быстрой амплификации. При правильном выборе ферментов, эту амплификацию можно осуществлять изотермически без добавления ферментов в каждом цикле. В силу циклических свойств этого процесса, начальная последовательность может быть выбрана в форме либо ДНК, либо РНК.

Способы выделения нуклеиновых кислот

Может являться желательным отделять продукты нуклеиновых кислот от других веществ, таких как матрица и избыток праймеров. В одном из вариантов осуществления продукты амплификации выделяют посредством электрофореза в агарозном, агарозно-акриламидном или полиакриламидном геле с использованием стандартных способов (Sambrook et al., 1989, см. ниже). Выделенные продукты амплификации можно вырезать и элюировать из геля для дальнейших манипуляций. С использованием гелей из агарозы с низкой температурой плавления, выделенную полосу можно удалить посредством нагревания геля с последующей экстракцией нуклеиновой кислоты. Выделение нуклеиновых кислот также можно осуществлять посредством хроматографических способов, известных в данной области. Существует множество видов хроматографии, которые можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, включая адсорбционную, распределительную, ионообменную, гидроксиапатитовую хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах, с обращенной фазой, колоночную, бумажную, тонкослойную и газовую хроматографию, а также ВЭЖХ. В конкретных вариантах осуществления визуализируют продукты амплификации. Типичный способ визуализации включает в себя окрашивание геля бромидом этидия и визуализацию полос в УФ-свете. Альтернативно, если продукты амплификации являются меченными интегрированными радиоактивно или флуорометрически меченными нуклеотидами, можно подвергать рентгеновскую пленку воздействию выделенных продуктов амплификации или визуализировать их с использованием света, содержащего соответствующие спектры возбуждения.

Альтернативно, присутствие полиморфных положений в соответствии со способами по изобретению можно определять посредством гибридизации или отсутствия гибридизации с подходящим зондом нуклеиновой кислоты, специфическим для полиморфной нуклеиновой кислоты, но не для нуклеиновой кислоты без мутации. Под «гибридизовать» подразумевают, что пара образует двухцепочечную молекулу между комплементарными полинуклеотидными последовательностями или их частями в условиях различной строгости. Например, строгая концентрация солей, как правило, составляет менее приблизительно 750 мМ NaCl и 75 мМ цитрата тринатрия, предпочтительно менее приблизительно 500 мМ NaCl и 50 мМ цитрата тринатрия, и более предпочтительно, менее приблизительно 250 мМ NaCl и 25 мМ цитрата тринатрия. Низкую строгость гибридизации можно получать в отсутствие органического растворителя, например, формамида, в то время как высокую строгость гибридизации можно получать в присутствии по меньшей мере приблизительно 35% формамида, и более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 50% формамида. Строгие температурные условия, как правило, включают в себя температуру по меньшей мере приблизительно 30°C, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 37°C и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 42°C. Различные дополнительные параметры, такие как время гибридизации, концентрация детергента, например, додецилсульфата натрия (SDS), и включение или исключение носителя ДНК, хорошо известны специалистам в данной области. Различные уровни строгости получают посредством комбинации этих различных условий по мере необходимости. В предпочтительном варианте осуществления гибридизация происходит при 30°C в 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрате тринатрия и 1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления гибридизация происходит при 37°C в 500 мМ NaCl, 50 мМ цитрате тринатрия, 1% SDS, 35% формамиде и 100 мкг/мл денатурированной ДНК (оцДНК) спермы лосося. В наиболее предпочтительном варианте осуществления гибридизация происходит при 42°C в 250 мМ NaCl, 25 мМ цитрате тринатрия, 1% SDS, 50% формамиде и 200 мкг/мл оцДНК. Варианты этих условий, которые можно использовать, очевидны специалистам в данной области. Для большинства применений, можно менять также строгость стадий отмывки, следующих за гибридизацией. Строгость условий отмывки можно определять посредством концентрации солей и посредством температуры. Как выше, строгость отмывки можно увеличивать посредством уменьшения концентрации солей или посредством увеличения температуры. Например, строгая концентрация солей для стадий отмывки предпочтительно составляет менее приблизительно 30 мМ NaCl и 3 мМ цитрат тринатрия, и наиболее предпочтительно, менее приблизительно 15 мМ NaCl и 1,5 мМ цитрат тринатрия. Строгие температурные условия для стадий отмывки, как правило, включают в себя температуру по меньшей мере приблизительно 25°C, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 42°C и даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 68°C. В предпочтительном варианте осуществления стадии отмывки происходят при 25°C в 30 мМ NaCl, 3 мМ цитрате тринатрия и 0,1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления стадии отмывки происходят при 42°C в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрате тринатрия и 0,1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления стадии отмывки происходят при 68°C в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрате тринатрия и 0,1% SDS. Дополнительные варианты этих условий очевидны специалистам в данной области. Способы гибридизации хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в Benton and Oavis (Science 196:180,1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad, Sci., USA 72:3961,1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для гибридизации в способах по изобретению, включают в себя включают любые молекулы нуклеиновой кислоты, которые обладают существенной идентичностью, чтобы быть способными к специфической гибридизации с нуклеиновыми кислотами-мишенями. Полинуклеотиды, обладающие «существенной идентичностью» с эндогенной последовательностью, как правило, способны к гибридизации по меньшей мере с одной цепью молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Под «по существу идентичным» подразумевают полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, обладающие по меньшей мере 50% идентичностью с эталонной аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, такая последовательность является по меньшей мере на 60%, более предпочтительно, на 80% или 85%, и более предпочтительно, на 90%, 95% или даже на 99% идентичной на уровне аминокислот или нуклеиновой кислоты с последовательностью, используемой для сравнения. Идентичность последовательности, как правило, измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, Sequence Analysis Software Package из Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, программы BLAST, BESTFIT, GAP или PILEUP/PRETTYBOX). Такое программное обеспечение сопоставляет идентичные или сходные последовательности посредством присвоения степеней гомологии различным заменам, делециям и/или другим модификациям. Консервативные замены, как правило, включают в себя замены внутри следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. В иллюстративном способе для определения степени идентичности, можно использовать программу BLAST, с вероятностной оценкой между e<"3> и e<"100>, указывающей на близкородственную последовательность.

Можно использовать систему детекции для измерения отсутствия, присутствия и уровня гибридизации для всех отдельных последовательностей одновременно. Предпочтительно, используют сканер для определения уровней и картин флуоресценции.

Способ реклассификации пациентов по более подходящему статусу риска.

Другой задачей настоящего изобретения является улучшение шкал/способов/функций риска сердечно-сосудистых событий, используемых в настоящее время, посредством конкретной комбинации клинических/биохимических данных и маркеров SNP, как указано в таблице 1 (или SEQ ID No. 1-7, или SEQ ID No. 1-8, или SEQ ID No. 1-11 из таблицы 1, как объяснено выше), ассоциированной с риском сердечно-сосудистого заболевания/нарушения и/или с риском осложнений сердечно-сосудистого заболевания или события, включая в качестве неограничивающих примеров, инфаркт миокарда, инсульт, стенокардию, транзиторные ишемические атаки, застойную сердечную недостаточность, аневризму аорты и смерть. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, используемые в настоящее время, включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, оригинальную Фремингемскую функцию, адаптированную Фремингемскую функцию (такую как, но без ограничения, функцию REGICOR), функцию PROCAM, функцию SCORE, функцию QRISK и калькулятор риска MACE и общей смертности. Улучшения Фремингемской функции, функций PROCAM, REGICOR, QRISK, и калькулятора риска MACE и общей смертности получают, когда маркеры SNP, показанные в таблице 1, и новые клинические/биохимические данные, соответствующие переменным, перечисленным в таблице С, включают в исходные уравнения. Например, уравнение 2a

w_i=β_{холестерин} *(холестерин _i-6)+β_SBP*(SBPi-120)+β_{курение}*текущий_i

трансформируется в уравнение 2b

w_i=β_{холестерин} *(холестерин _i-6)+β_SBP*(SBPi-120)+β _{курение}*текущий_i+

Риск сердечно-сосудистых событий рассчитывают с использованием уравнения 2b с использованием функции риска SCORE, следуя нескольким стадиям:

Первая стадия: расчет линейной комбинации факторов риска:

w_i=β_{холестерин} *(холестерин _i-6)+β_SBP*(SBPi-120)+β_{курение}*текущий_i+

, где

β_{холестерин}: логарифм отношения рисков, соответствующий холестерину (таблица D),

холестерин _i: уровень холестерина для индивидуума «i» в ммоль/л,

β_SBP: логарифм отношения рисков, соответствующий систолическому артериальному давлению (таблица D),

SBPi: систолическое артериальное давление для индивидуума «i» в мм рт.ст.,

β _{курение}: логарифм отношения рисков, соответствующий принадлежности к курящим (таблица D),

текущий_i: текущий статус курения для индивидуума «i» (1:действительный, 0:бывший/никогда не курил),

βn _i: представляет собой логарифм отношения рисков, соответствующий клинической/биохимической переменной «n» из данных, показанных в таблице A, у субъекта «i».

n_i: значение каждой для индивидуума «i»,

: представляет собой среднее значение клинической/биохимической переменной «n» в популяции

β_GRS: - логарифм отношения рисков, соответствующий увеличению на одну единицу значения показателя генетического риска. Значение этого β_GRS составляет 0,140, где диапазон значений продолжается от 0,010 до 0,500,

GRS_i: генетический риск для индивидуума «i», определенный как взвешенное количество аллелей риска (0, 1, 2) для генетических вариантов, включенное в уравнение для индивидуума «i». Варианты, в настоящее время включенные в показатель генетического риска, показаны в таблице A. Вес является пропорциональным бета для каждого SNP, включенного в показатель (показаны в таблице B), и диапазон GRS продолжается от 0 до двойного количества SNP, включенных в показатель,

: среднее значение показателя генетического риска в популяции,

Вторая стадия: расчет исходной выживаемости.

S₀(возраст)=exp {-exp(α)*(возраст-20)^p}

S₀(возраст+10)=exp {-exp(α)*(возраст-10)^p}, где

α, p: параметры формы и масштаба распределения Вейбулла, Их значения представлены в таблице E (параметры)

exp: возведение в натуральную степень

Третья стадия: расчет 10-летней выживаемости

S(возраст)={S₀ (возраст)}^exp(w)

S(возраст+10)={S₀ (возраст+10)}^exp(w)

S₁₀(возраст)=S(возраст+10)/S(возраст)

Четвертая стадия: расчет вероятности наличия события во время 10-летнего наблюдения.

Риск ₁₀ (возраст)=1-S₁₀(возраст)

Пятая стадия: расчет вероятности наличия сердечно-сосудистого события во время 10-летнего наблюдения как суммы риска коронарных и некоронарных сердечно-сосудистых событий.

CVDРиск ₁₀=[CHDРиск ₁₀(возраст)]+[Не-CHDРиск ₁₀(возраст)]

Таблица A Список факторов риска коронарных событий, включенных в настоящую инновационную модель, логарифм отношения рисков, βCRFp для каждого клинического/биохимического фактора риска коронарных событий, диапазон средних значений для клинического/биохимического фактора риска коронарных событий «p» в популяции. Один или несколько из этих клинических/биохимических факторов риска можно выбирать для оценки риска.
CRFP	βCRFp
Возраст (10 лет)	0,086 (0,008;0,860)	15-85
Пол (мужской)	0,668 (0,067; 1,500)	0,1
Общий холестерин (мг/дл)	0(-0,100;0-100)	80-600
LDL-холестерин	0(-0,100;0-100)	45-500
HDL-холестерин (мг/дл)	-0,223 (-0,600;-0,020)	20-120
Триглицериды (мг/дл)	0 (-0,100;0-100)	40-500
Дислипидемия в анамнезе (0=Нет, l=Да)	0,378 (0,030; 1,200	0, 1
Систолическое кровяное давление (мм рт.ст.)	0 (-0,100;0-200)	60-250
Диастолическое кровяное давление (мм рт.ст.)	0 (-0,100;0-200)	40-150
Гипертензия в анамнезе (0=Нет, l=Да)	0(-0,100;0-300)	0, 1
Гликемия (мг/дл)	0(-0,100;0-300)	30-350
Гликозилированный гемоглобин (%)	0(-0,100;0-300)	3-20
Диабет в анамнезе (0=Нет, l=Да)	0(-0,100;0-300)	0, 1
Почечная недостаточность (0=Нет, l=Да)	0	0, 1
Стадия хронического заболевания почек:
- Перед диализом	-0,494 (-2,800; -0,050)	0, 1
- Диализ	-0,654 (-2,000; -0,060)	0, 1
- Трансплантация	-0,416 (-2,000;-0,040)	0, 1
- Отторжение Трансплантата	-0,654 (-2,000;-0,060)	0, 1
Клубочковая фильтрация (мл/мин/м²)	0 (-0,800; 0,100)	1-200
Креатинин /мг/дл)	0 (-0,200; 0,900)	0-20
Кальций (мг/дл)	0 (-0,400; 1,500)	3-50
Фосфор (мг/дл)	0 (-0,400; 1,500)	0,5-15
Паратгормон (пг/дл)	0(-0,400; 1,500)	0-4000
Альбумин (г/л)	-0,598(4,500;-0,060)	1-7
24-часовая протеинурия (мг/24 час)	0(-0,400; 1,500)	0-70
GRS (стандартное отклонение GRS)
Перед диализом	0,815 (0,080;2,000)	-6 - +6
Диализ	-0,248 (-0,400; 1,000)	-6 - +6
Трансплантация	0,554 (0,050;2,000)	-6 - +6
Отторжение трансплантата	0,020 (-0,200; 1,000)	-6 - +6

Таблица B Варианты, в настоящее время включенные в логарифм отношения рисков настоящей инновационной модели (диапазон возможных значений), ^βSNP_j и среднее количество копий аллеля риска (диапазон возможных значений), для каждого генетического варианта.
SNPj		^βSNP_j
rs17465637		0,1310 (0,0100-0,5000)	1,48 (0,3-2,8)
rs6725887	0,1310 (0,0100-0,5000)		0,3 (0,15-1,4)
rs9818870	0,1133 (0,0100-0,5000)		0,36 (0,15-1-4)
rs12526453	0,0953 (0,100-0,5000)		1,34 (0,3-2,8)
rs1333049	0,2546 (0,0100-1,0000)		0,92 (0,3-2,8)
rs9982601	0,1655 (0,0100-0,5000)		0,3 (0,15-1,4)
rsl0455872	0,2852 (0,0100-1,0000)		0,14 (0,1-1,4)
rsl0507391*	0,1310 (0,0100-0,5000)		0,08 (0,005-0,5)
rs9315051*	0,0000 (0,00100-0,5000)		1 (0,3-2,8)
rs17222842*	0,1310(0,0100-0,5000)		0,08 (0,05-0,5)
rs501120	0,090 (0,010; 0,400)		0,08 (0,05;0,5).
*Все эти SNP определяют гаплотип В ALOX5AP, который обладает уровнем эффекта, определяемым значением β 0,1310

Таблица С

Возраст

Пол

Общий холестерин (мг/дл)

LDL-холестерин (мг/дл)

HDL-холестерин (мг/дл)

Триглицериды (мг/дл)

Диагноз дислипидемии (Нет/Да)

Систолическое артериальное давление (мм рт.ст.)

Диастолическое артериальное давление (мм рт.ст.)

Диагноз гипертензии (Нет/Да)

Гликемия (мг/дл)

Гликозилированный гемоглобин (%)

Диагноз сахарного диабета (Нет/Да)

Почечная недостаточность (Нет/Да)

Стадия хронического заболевания почек:

Перед диализом

Диализ

Трансплантация

Отторжение трансплантата

Клубочковая фильтрация (мл/мин/м²)

Креатинин/мг/дл)

Кальций (мг/дл)

Фосфор (мг/дл)

Паратгормон (пг/дл)

Таблица D
	CHD	Не-CHD CVD
Текущий статус курения, β_{курение}	0,71	0,63
Холестерин (нмоль/л), β_{холестерин}	0,24	0,02
Систолическое артериальное давление (мм рт.ст.), β_SBP	0,018	0,022
CHD = коронарное заболевание сердца
CVD = сердечно-сосудистое заболевание

Таблица E
		CHD		Не-CHD CVD
Страна		A	p	A	p
Низкий риск	Мужчины	-22,1	4,71	-26,7	5,64
	Женщины	-29,8	6,36	-31,0	6,62
Высокий риск	Мужчины	-21,0	4,62	-25,7	5,47
	Женщины	-28,7	6,23	-30,0	6,42
CHD: коронарное заболевание сердца CVD: сердечно-сосудистое заболевание

Неожиданно доказали, что комбинация маркеров SNP, включенных в настоящее изобретение и указанных в таблице 1 (фигура 1), и комбинаций, включенных в различные варианты осуществления, и использования функций, описанных в функциях 1a-1b выше, у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек, является способной оценивать риск пострадать от сердечно-сосудистого заболевания и/или сердечно-сосудистых событий, и/или сердечно-сосудистых осложнений с более высокой точностью, чем полученная с использованием классических факторов риска отдельно или с использованием шкал/функций, используемых в настоящее время. Неожиданно доказали, что при помощи комбинаций маркеров SNP, включенных в настоящее изобретение и указанных в таблице 1 (фигура 1), и комбинаций, включенных в различные варианты осуществления, и с использованием функций, описанных в функциях 1a-1b выше, у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек, получают более высокую достоверность и превосходную валидацию при прогнозировании сердечно-сосудистого заболевания и/или сердечно-сосудистых событий, и/или осложнений сердечно-сосудистого заболевания, чем полученные с использованием только классических факторов риска и/или с использованием функций, используемых в настоящее время, или опубликованных функций, включающих генетическую информацию. Кроме того, реклассификация также улучшалась.

С использованием описанных функций, для пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек, получен персонифицированный риск развития ишемической болезни сердца и/или сердечно-сосудистых событий, и/или сердечно-сосудистого заболевания, в частности, смертельного и несмертельного инфаркта миокарда, стенокардии, инсульта, транзиторной ишемической атаки, периферической артериопатии или их сочетания. Представленным способом улучшают категорию (реклассифицируют) субъектов, неправильно классифицированных с помощью способов, используемых в настоящее время для расчета риска сердечно-сосудистых событий, до более точной группы риска. Поскольку лечение (профилактическое и/или терапевтическое) адаптируют для уровня риска, реклассификация подразумевает более эффективные способы для профилактических и/или терапевтических мер, которые могут уменьшать частоту возникновения и/или рецидивов сердечно-сосудистых заболеваний и осложнений сердечно-сосудистого заболевания, таких как - но без ограничения - смертельный и несмертельный инфаркт миокарда, стенокардия, инсульт, транзиторная ишемическая атака, периферическая артериопатия или их сочетание.

Пример 1

Хроническое заболевание почек (CKD) представляет собой привлекающую все большее внимание проблему мирового здравоохранения, ассоциированную с увеличенной заболеваемостью и смертностью, и сердечно-сосудистое заболевание является ее главной причиной даже у пациентов с пре-ESRD CKD (NEng J Med 2004; 351:1296).

Этот избыточный риск сердечно-сосудистых событий можно отнести как к высокой распространенности традиционных факторов риска среди пациентов с CKD, так и к присутствию других нетрадиционных факторов риска (Kidney Int 2006; 70:26). Показано, что классические оценки риска коронарного заболевания сердца (CHD), такие как Фремингемская шкала риска, обладают ограниченной клинической применимостью для пациентов с CKD (J Am Coll Cardiol 2007; 50:217).

Может ли добавление показателя генетического риска (GRS), включая генетические варианты, ассоциированные с CHD, но не с классическими факторами риска сердечно-сосудистых событий, улучшать прогноз риска CHD у пациентов с CKD, остается неясным. Задачами этого исследования являются:

1. Разработка и оценка прогностической мощности функции риска CHD на основании клинических переменных

2. Оценка того, улучшает ли включение генетических вариантов оценку риска CHD у пациентов с CKD, включая реципиентов трансплантата почки

Методы

Когортное исследование авторов настоящего изобретения включало в себя 632 пациента с KD (200 реципиентов трансплантата почки) с медианой наблюдения 9,13 лет. Средний возраст составлял 53,4 (±10,6), и 32,4% пациентов составляли мужчины.

Семьдесят три коронарных события (смертельного или несмертельного острого инфаркта миокарда или острой стенокардии) идентифицировано при наблюдении.

Клинический показатель риска CHD включал в себя:

- Статус KD (CKD стадий 1-4, ESRD при заместительной почечной терапии или трансплантации почки)

- Возраст

- Пол

- HDL

- Диабетическое состояние

- Состояние гипертензии

- Гемоглобин A1с.

Во вторую модель авторы настоящего изобретения включили также взвешенный показатель генетического риска (GRS) с вариантами, ранее идентифицированными как ассоциированные с CHD, и не связанные с классическими факторами риска сердечно-сосудистых событий (rs10455872, rs12526453, rs1333049, rs17465637, rs501120, rs6725887, rs9818870, rs9982601, rs10507391, rs17222842 и rs9315051).

GRS рассчитывали для каждого индивидуума как сумму количества аллелей риска среди 11 вариантов, после взвешивания каждого из них по расчетной величине эффекта в исследовании CARDIoGRAM (Nat Genet. 2011; 43:333)

Авторы настоящего изобретения тестировали ассоциацию между распространенностью коронарных событий и клиническими данными, и индивидуальными генетическими вариантами и GRS с использованием моделей пропорциональных рисков Кокса.

Статистические инструменты, используемые для оценки потенциального значения включения GRS в прогнозирование риска в соответствии с критериями AHA, представляли собой:

a. Относительный риск, отношение рисков для GRS

b. Дискриминирующую способность модели оценивали с использованием индекса конкордантности (c-статистики)

c. Точность модели:

- Степень соответствия моделей оценивали посредством теста Хосмера-Лемешева.

Улучшение при реклассификации рассчитывали с использованием улучшения остаточного индекса реклассификации (NRI).

Результаты

На фигуре 2 показано, как популяция с CKD обладает более высоким риском сердечно-сосудистых и коронарных событий, чем общая испанская популяция без CKD (Rev Esp Cardiol 2003; 56(3):253).

Как показано в следующей таблице, среди других факторов риска, GRS являлся независимо связанным с коронарными событиями:

Таблица 2
Факторы риска для коронарных событий
	Без коронарных событий (n=547)	Коронарные события (n=73)	P
Возраст (лет)	53±10	55±10	0,074
Пол (женский)	34,7%	17,8%	0,006
Холестерин (мг/дл)	209±49	206±60	0,690
HDL (мг/дл)	53±17	46 ±16	0,001
Систолическое BP (мм рт.ст.)	141±20	140±20	0,955
Диастолическое BP (мм рт.ст.)	82±12	82±10	0,808
Диабет	19,7%	24,7%	0,409
Гипертензия	84,6%	83,6%	0,946
HbA1c (%)	5,6±0,5	5,8±0,6	0,149
MDRD (мл/мин/ 1,73 м z)	19,2 (8,7; 43,6)	20,5(10,5; 32,9)	0,911
Кальций (мг/дл)	9,3 (8,7; 9,8)	9,0 (8,3; 9,7)	0,127
Фосфор (мг/дл)	4,2 (3,4; 5,6)	4,3 (3,4; 5,4)	0,927
PTH (нг/л)	156 (72; 307)	226(94; 392)	0,019
Альбумин (г/дл)	4,1 (3,8; 4,4)	4,1 (3,7; 4,4)	0,791
Стандартизованный GRS	-0,08 (-0,72; 0,68)	0,30 (-0,21; 0,86)	0,024
a. Относительный риск, отношение рисков для GRS. Отношение рисков для GRS составляет 1,29 [1,02; 1,64, 95%CI], p=0,035. b. Дискриминирующую способность модели оценивали с использованием индекса конкордантности (c-статистики). Как показано в следующей таблице 3, дискриминация модели риска CHD улучшалась с помощью GRS c. Точность модели: - Степень соответствия моделей оценивали посредством теста Хосмера-Лемешева. Как показано в таблице 3, точность была очень хорошей с отсутствием статистических различий между прогнозированными и наблюдаемыми событиями. - Реклассификация была улучшена, как рассчитано с использованием улучшения остаточного индекса реклассификации (NRI), показанного в таблице 3.

Таблица 3
Прогностическая мощность для коронарных событий
	КЛИНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ	КЛИНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ+GRS
C-индекс (%), значение p	67,8 (59,9; 75,6)	71,7(64,3; 79,0) 0,015
Тест Хосмера-Лемешева, значение p	9,5 (0,092)	9,6 (0,088)
Улучшение остаточного индекса реклассификации (%)	Эталон	22,0 (5,5; 38,6)

Заключения:

- Показатель генетического риска, включая варианты генов, ассоциированные с CHD, но не с классическими факторами риска сердечно-сосудистых событий, независимо связан с коронарным заболеванием сердца в популяции пациентов с хроническим заболеванием почек.

Включение GRS улучшает прогнозирование риска CHD у пациентов с CKD, особенно с KT. Генетический скрининг может помогать предотвращать события CHD в этой группе пациентов.

Claims

1. Способ оценки риска сердечно-сосудистых событий у субъекта, включающий стадии определения в образце, выделенном от указанного субъекта, страдающего хроническим заболеванием почек, присутствия полиморфизмов в положении 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:1-8, или в последовательности, находящейся в сильном неравновесном сцеплении с последовательностью из любой из SEQ ID NO:1-8, где присутствие в положении 27 С в SEQ ID NO:1, С в SEQ ID NO:2, T в SEQ ID NO:3, С в SEQ ID NO:4, С в SEQ ID NO:5, A в SEQ ID N0:6, T в SEQ ID NO:7 и G в SEQ ID NO:8, что соответствует номеру доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, соответственно, или присутствие полиморфизма в последовательности любого другого rs, который находится в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs, является показателем риска наличия сердечно-сосудистого события.

2. Способ по п. 1, где, кроме того, определяют присутствие в положении 27 A в SEQ ID NO: 9, A в SEQ ID NO:10 и/или G в SEQ ID NO:11 с no. доступа в db SNP rs10507391, rs9315051, и/или rs17222842, соответственно, или любого другого rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

3. Способ по п. 2, где последние три SEQ (SEQ ID NO 9-11) и rs формируют гаплотип В ALOX5AP, и их рассматривают как один из генетических компонентов риска в дополнение к другим 8 последовательностям.

4. Способ, как определено по любому из пп. 1-3, где сердечно-сосудистое событие выбрано из группы из смертельного или несмертельного инфаркта миокарда, инсульта, стенокардии, транзиторных ишемических атак, болезни периферических артерий или их сочетания.

5. Способ, как определено по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий в себя определение одного или нескольких фактора(факторов) риска сердечно-сосудистого заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из возраста, расы, пола, индекса массы тела, систолического артериального давления, диастолического артериального давления, статуса и анамнеза курения, уровня общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL) или липопротеинов высокой плотности (HDL), триглицеридов, дислипидемии в анамнезе, сердечной недостаточности в анамнезе, предшествующего коронарного заболевания сердца, сахарного диабета, гликемии, гликозилированного гемоглобина, гемоглобина A1c, клубочковой фильтрации, статуса заболевания почек (CKD статуса 1-4, заболевание почек на терминальной стадии (ESRD) при заместительной почечной терапии или трансплантации почки), гипертензии, почечной недостаточности и ее статуса (1-5), хронического заболевания почек и его статуса (перед диализом, диализ, трансплантация, отторжение трансплантата), общего времени заместительной почечной терапии, количества трансплантатов, гипертрофии левого желудочка, употребления алкоголя, проявления физической активности, диеты и семейного анамнеза сердечно-сосудистых или коронарных заболеваний, уровней креатинина, кальция, фосфора, паратгормона, альбумина и 24-часовой протеинурии.

6. Способ по п. 4, дополнительно включающий в себя определение одного или нескольких фактора(факторов) риска сердечно-сосудистого заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из возраста, расы, пола, индекса массы тела, систолического артериального давления, диастолического артериального давления, статуса и анамнеза курения, уровня общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL) или липопротеинов высокой плотности (HDL), триглицеридов, дислипидемии в анамнезе, сердечной недостаточности в анамнезе, предшествующего коронарного заболевания сердца, сахарного диабета, гликемии, гликозилированного гемоглобина, гемоглобина A1c, клубочковой фильтрации, статуса заболевания почек (CKD статуса 1-4, заболевание почек на терминальной стадии (ESRD) при заместительной почечной терапии или трансплантации почки), гипертензии, почечной недостаточности и ее статуса (1-5), хронического заболевания почек и его статуса (перед диализом, диализ, трансплантация, отторжение трансплантата), общего времени заместительной почечной терапии, количества трансплантатов, гипертрофии левого желудочка, употребления алкоголя, проявления физической активности, диеты и семейного анамнеза сердечно-сосудистых или коронарных заболеваний, уровней креатинина, кальция, фосфора, паратгормона, альбумина и 24-часовой протеинурии.

7. Способ, как определено по пп. 1-3, где применяют множество классических факторов риска «p», где указанное множество выбрано из группы из:

- статуса заболевания почек (CKD стадий 1-4, ESDR при заместительной почечной терапии или трансплантации почки), возраста, пола, HDL-холестерина, диабетического состояния, состояния гипертензии, гемоглобина A1c,

- возраста, предшествующего коронарного заболевания сердца, курения, креатинина в сыворотке, сахарного диабета, LDL-холестерина, общего времени заместительной почечной терапии, количества трансплантатов,

- HDL-холестерина, сахарного диабета, гипертензии, дислипидемии, гемоглобина A1c, клубочковой фильтрации, кальция, фосфора, паратгормона, альбумина.

8. Способ по п. 5, где применяют множество классических факторов риска «p», где указанное множество выбрано из группы из:

9. Способ по п. 6, где применяют множество классических факторов риска «p», где указанное множество выбрано из группы из:

10. Способ, как определено по любому из пп. 1-3, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

11. Способ по п. 5, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

12. Способ по п. 6, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

13. Способ по п. 8, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

14. Набор для осуществления способа по пп. 1-13, содержащий одну или несколько пар праймеров для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательностях нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1-8.

15. Набор по п. 14, дополнительно содержащий одну или несколько пар праймеров для детекции идентичности нуклеотида в положении 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9-11.

16. Набор по п. 14 или 15, содержащий одну или несколько пар праймеров, специфических для амплификации области, содержащей положение 27 в последовательностях нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1-8 или SEQ ID NO: 9-11.

17. Набор, как определено по пп. 14-16, где выбранные последовательности представляют собой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601, rs10455872, rs10507391, rs9315051 и rs17222842, соответственно, или любой другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

18. Набор, как определено по пп. 14-17, где выбранные последовательности представляют собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, с номером доступа в db SNP rs17465637, rs6725887, rs9818870, rs12526453, rs1333049, rs501120, rs9982601 и rs10455872, соответственно или любой другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs.

19. Набор по п.17 или 18, где указанный другой rs в сильном неравновесном сцеплении с любым из этих упомянутых rs представляет собой (i) rs1746048, который представлен SEQ ID NO:49 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs501120, или (ii) rs2133189, который представлен SEQ ID NO:48 и находится в сильном неравновесном сцеплении с rs17465637.

20. Набор зондов для осуществления способа по пп. 1-13, где зонды представляют собой:

SEQ ID NO:12 и 13 (rs1333049), и

SEQ ID NO:14 и 15 (rs1333049);

SEQ ID NO:16 и 17 (rs10455872) и

SEQ ID NO:18 и 19 (rs10455872);

SEQ ID NO:20 и 21 (rs6725887) и

SEQ ID NO:22 и 23 (rs6725887);

SEQ ID NO:24 и 25 (rs9818870) и

SEQ ID NO:26 и 27 (rs9818870);

SEQ ID NO:28 и 29 (rs10507391) и

SEQ ID NO:30 и 31 (rs10507391);

SEQ ID NO:32 и 33 (rs9982601) и

SEQ ID NO:34 и 35 (rs9982601);

SEQ ID NO:36 и 37 (rs9315051) и

SEQ ID NO:38 и 39 (rs9315051);

SEQ ID NO:40 и 41 (rs12526453) и

SEQ ID NO:42 и 43 (rs12526453);

SEQ ID NO:44 и 45 (rs17222842) и

SEQ ID NO:46 и 47 (rs17222842);

SEQ ID NO: 50 и 51 (rs17465637) и

SEQ ID NO: 52 и 53 (rs17465637);

SEQ ID NO: 54 и 55 (rs501120) и

SEQ ID NO: 56 и 57 (rs501120);

SEQ ID NO: 58 и 59 (rs2133189) и

SEQ ID NO: 60 и 61 (rs2133189);

SEQ ID NO: 62 и 63 (rs1746048) и

SEQ ID NO: 64 и 65 (rs1746048);

SEQ ID NO: 66 и 67 (rs2133189) и

SEQ ID NO: 68 и 69 (rs2133189).

21. Набор праймеров для осуществления способа по пп. 1-13, где праймеры представляют собой:

SEQ ID NO:12 и 13 (rs1333049), и

SEQ ID NO:14 и 15 (rs1333049);

SEQ ID NO:16 и 17 (rs10455872) и

SEQ ID NO:18 и 19 (rs10455872);

SEQ ID NO:20 и 21 (rs6725887) и

SEQ ID NO:22 и 23 (rs6725887);

SEQ ID NO:24 и 25 (rs9818870) и

SEQ ID NO:26 и 27 (rs9818870);

SEQ ID NO:28 и 29 (rs10507391) и

SEQ ID NO:30 и 31 (rs10507391);

SEQ ID NO:32 и 33 (rs9982601) и

SEQ ID NO:34 и 35 (rs9982601);

SEQ ID NO:36 и 37 (rs9315051) и

SEQ ID NO:38 и 39 (rs9315051);

SEQ ID NO:40 и 41 (rs12526453) и

SEQ ID NO:42 и 43 (rs12526453);

SEQ ID NO:44 и 45 (rs17222842) и

SEQ ID NO:46 и 47 (rs17222842);

SEQ ID NO: 50 и 51 (rs17465637) и

SEQ ID NO: 52 и 53 (rs17465637);

SEQ ID NO: 54 и 55 (rs501120) и

SEQ ID NO: 56 и 57 (rs501120);

SEQ ID NO: 58 и 59 (rs2133189) и

SEQ ID NO: 60 и 61 (rs2133189);

SEQ ID NO: 62 и 63 (rs1746048) и

SEQ ID NO: 64 и 65 (rs1746048);

SEQ ID NO: 66 и 67 (rs2133189) и

SEQ ID NO: 68 и 69 (rs2133189).