RU2655528C1 - Method of treating hepatic failure - Google Patents
Method of treating hepatic failure Download PDFInfo
- Publication number
- RU2655528C1 RU2655528C1 RU2017128293A RU2017128293A RU2655528C1 RU 2655528 C1 RU2655528 C1 RU 2655528C1 RU 2017128293 A RU2017128293 A RU 2017128293A RU 2017128293 A RU2017128293 A RU 2017128293A RU 2655528 C1 RU2655528 C1 RU 2655528C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mmsc
- rna
- liver
- cells
- days
- Prior art date
Links
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 238000012937 correction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 83
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 15
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 14
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- -1 AsAT Proteins 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 108010033918 Alanine-glyoxylate transaminase Proteins 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 208000008964 Chemical and Drug Induced Liver Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 208000007348 Experimental Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 206010016454 Femur fracture Diseases 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000037037 animal physiology Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002615 fibrolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008756 pathogenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009719 regenerative response Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/407—Liver; Hepatocytes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к клинической медицине, а именно к гепатологии, трансплантологии и может быть использовано для лечения печеночной недостаточности.The invention relates to clinical medicine, namely to hepatology, transplantation and can be used to treat liver failure.
В экономически развитых странах хронические заболевания печени (хронический гепатит, цирроз печени) входят в число шести основных причин смерти пациентов от 35 до 60 лет, составляя 14-30 случаев на 100 тысяч населения. Ежегодно в мире умирают 40 миллионов человек от цирроза печени. Возрастание медицинской и социальной значимости хронических заболеваний печени требует разработки новых более эффективных технологий лечения и профилактики этих заболеваний на основе достижений современной биологической и медицинской науки.In economically developed countries, chronic liver diseases (chronic hepatitis, cirrhosis) are among the six main causes of death for patients from 35 to 60 years old, accounting for 14-30 cases per 100 thousand of the population. Annually, 40 million people die of cirrhosis in the world. The increasing medical and social significance of chronic liver diseases requires the development of new, more effective technologies for the treatment and prevention of these diseases based on the achievements of modern biological and medical science.
Известны технологии получения суммарных рибонуклеиновых кислот (РНК) из лейкоцитов, дрожжей, микробных и растительных клеток, которые используются для неспецифической стимуляции иммунитета и лечения вирусных инфекций, а также воспалительных процессов, в том числе в печени [SV Total RNA isolation system. Technical Manual. 08.2016. Phomega Corporation].Known technologies for producing total ribonucleic acids (RNA) from leukocytes, yeast, microbial and plant cells, which are used for nonspecific stimulation of the immune system and treatment of viral infections, as well as inflammatory processes, including in the liver [SV Total RNA isolation system. Technical Manual. 08.2016. Phomega Corporation].
К настоящему времени в арсенале лечебных средств имеется две разновидности препаратов, в состав которых входит ксеногенная РНК. Действующим веществом в препаратах первой группы (НКАД, Нуклеинат натрия, Ридостин, Полирибонат, Виталанг 2) является одна или двуспиральная высоко или низкомолекулярная РНК, выделенная из дрожжей Sacharomyces cerevisiae.To date, the arsenal of therapeutic agents has two types of drugs, which include xenogenic RNA. The active substance in the preparations of the first group (NKAD, Sodium Nucleinate, Ridostin, Polyribonate, Vitalang 2) is one or double-stranded high or low molecular weight RNA isolated from Sacharomyces cerevisiae yeast.
Препараты дрожжевой РНК обладают неспецифическим иммунотропным действием: регулируют миграцию Т лимфоцитов, активируют гуморальный иммунитет и функциональную активность макрофагов [Кактурский Л.В., Шабанова М.Е., Большакова Г.Б. Изменение состава грануляционной ткани при заживлении экспериментального инфаркта миокарда под влиянием препарата НКАД // Тез. 7 Всесоюзной конф. по регенерации и клеточному делению, М., 1985, с. 17; Земсков В.М., Земсков A.M., Караулов А.В. Низкомолекулярная РНК - естественный модулятор иммунологического гомеостаза // Практический врач, 1995, №1, с. 6-9; Ямковая Т.В., Ямковой В.И., Панин Л.Е. Выделение и анализ биологической активности высокополимерной РНК из пекарских дрожжей // Бюлл. СО РАМН, 2012, №6, с. 60-68; Ридостин - инструкция к препарату ООО «Вектор Фарм. Россия»].Yeast RNA preparations have a non-specific immunotropic effect: they regulate the migration of T lymphocytes, activate humoral immunity and the functional activity of macrophages [Kaktursky L.V., Shabanova M.E., Bolshakova GB Change in the composition of granulation tissue during the healing of an experimental myocardial infarction under the influence of the drug NKAD // Proc. 7 All-Union Conf. for regeneration and cell division, M., 1985, p. 17; Zemskov V.M., Zemskov A.M., Karaulov A.V. Low molecular weight RNA is a natural modulator of immunological homeostasis // Practical Physician, 1995, No. 1, p. 6-9; Yamkova T.V., Yamkova V.I., Panin L.E. Isolation and analysis of the biological activity of high polymer RNA from baker's yeast // Bull. SB RAMS, 2012, No. 6, p. 60-68; Ridostin - instructions for the preparation of LLC Vector Pharm. Russia"].
К препаратам второй группы относят высоко или низкомолекулярные РНК, выделенные из различных органов крупного рогатого скота [Витвицкий В.М., Ушаков И.В., Сидляров Д.П., Апросин Ю.Д. Средство, стимулирующее репарирование повреждений, обладающее ткане-, органо- и стадиеспецифичностью и противовирусной активностью. // Патент РФ, №2238756 С1, 2003].The drugs of the second group include high or low molecular weight RNA isolated from various organs of cattle [Vitvitsky VM, Ushakov IV, Sidlyarov DP, Aprosin Yu.D. An agent that stimulates the repair of damage, with tissue, organo- and stage-specificity and antiviral activity. // RF patent, No. 2238756 C1, 2003].
В отличие от дрожжевых препаратов эти РНК оказывают исключительно органоспецифическое стимулирующее действие только на гомологичные органы реципиента, независимо от их видовой принадлежности.Unlike yeast preparations, these RNAs have an exclusively organ-specific stimulating effect only on the homologous organs of the recipient, regardless of their species.
Известен способ коррекции хронической печеночной недостаточности при моделировании токсического цирроза печени (затравка CCl4) у мышей путем внутрибрюшинного введения им цитоплазматической рибонуклеиновой кислоты (РНК), выделенной из печени здоровых крыс [Чернух A.M., Вышепан Е.Д., Разумова И.Л. и др. Особенности течения экспериментального цирроза печени под влиянием печеночной РНК Бюлл. экспер. биологии и медицины 1970, №10, с. 12-15]. В этом исследовании, выполненном на мышах, авторы использовали экзогенную РНК из печени здоровых крыс, исходя из представлений о видовой неспецифичности РНК.Known is a method of correction of chronic liver failure in the simulation toxic cirrhosis (primer CCl 4) in mice by intraperitoneal treatment with cytoplasmic ribonucleic acid (RNA) is isolated from the liver of healthy rats [Chernukh AM, Vyshepan ED, IL Razumova et al. Peculiarities of the course of experimental liver cirrhosis under the influence of hepatic RNA Bull. an expert. Biology and Medicine 1970, No. 10, p. 12-15]. In this study, performed on mice, the authors used exogenous RNA from the liver of healthy rats based on the notion of species-specific RNA.
Было констатировано, что введение мышам органоспецифичной цитоплазматической РНК из печени крыс достоверно уменьшило гибель животных и число очагов некроза в ткани печени, а также достоверно увеличило не только митотическую активность гепатоцитов, но и количество междольковых соединительнотканных волокон. Отсутствие полного восстановительного (регенерационного) эффекта от применения тканеспецифичной (печеночной) РНК для лечения фиброзирующего типа печеночной недостаточности предопределило тот факт, что в клинике препараты РНК, полученные из ткани печени, стали для повышения лечебного эффекта сочетать с органоспецифическими препаратами РНК, выделенными из других органов - желудка, селезенки, надпочечников, поджелудочной железы и др. Однако ввиду малой клинической эффективности этот метод, основанный на применении комплекса органных РНК, в настоящее время не находит широкого применения.It was found that the administration to mice of organ-specific cytoplasmic RNA from rat liver significantly reduced the death of animals and the number of foci of necrosis in the liver tissue, and also significantly increased not only the mitotic activity of hepatocytes, but also the number of interlobular connective tissue fibers. The lack of a full recovery (regenerative) effect from the use of tissue-specific (liver) RNA for the treatment of the fibrosing type of liver failure predetermined the fact that in the clinic RNA preparations obtained from liver tissue began to be combined with organ-specific RNA preparations isolated from other organs to increase the therapeutic effect - the stomach, spleen, adrenal glands, pancreas, etc. However, due to the low clinical effectiveness, this method is based on the use of a complex of organ pH K, is currently not widely used.
Основной недостаток применения органоспецифических РНК от здоровых доноров, прежде всего печеночных РНК, состоит в том, что в тканях органов здоровых животных из-за стабильного равновесного состояния и отсутствия необходимости выработки в них факторов, индуцирующих процессы быстрого роста и развития, имеет место низкий уровень пролиферативной (митотической) активности клеток и поэтому выделенная из них РНК имеет низкий регенерационный потенциал. Кроме того РНК, выделенная из печени, обладает только органоспецифической активностью и не способна участвовать в компенсаторной поддержке других систем организма (почки, легкие), активно участвующих в процессе восстановительной регенерации печени.The main disadvantage of using organ-specific RNAs from healthy donors, especially hepatic RNAs, is that in the tissues of organs of healthy animals, due to a stable equilibrium state and the absence of the need to develop factors inducing processes of rapid growth and development, a low level of proliferative (mitotic) activity of cells and therefore RNA isolated from them has a low regenerative potential. In addition, RNA isolated from the liver has only organ-specific activity and is not able to participate in the compensatory support of other body systems (kidneys, lungs) that are actively involved in the process of regenerative regeneration of the liver.
Костный мозг, будучи центральным органом иммуногенеза и системы крови в организме, обладает универсальными регуляторными свойствами и его клетки относятся к быстро реагирующим и быстро развивающимся клеткам, содержат постоянно самообновляющийся пул стволовых/прогениторных клеток, постоянно продуцируют цитокины и факторы роста, оказывая регуляторное воздействие на клетки различных паренхиматозных органов, и поэтому именно их предпочитают использовать для индукции процессов регенерации.The bone marrow, being the central organ of immunogenesis and the blood system in the body, has universal regulatory properties and its cells are fast-responding and rapidly developing cells, contain a constantly self-renewing pool of stem / progenitor cells, constantly produce cytokines and growth factors, exerting a regulatory effect on cells various parenchymal organs, and therefore they are preferred to be used for the induction of regeneration processes.
Известен способ лечения печеночной недостаточности путем применения универсальных регуляторов восстановительных процессов в органах - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) от здорового донора [Люндуп А.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Применение аллогенных мезенхимальных клеток костного мозга в лечении хронических заболеваний печени, Сборник материалов Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине», Тула 2009, с. 6-8], который выбран нами в качестве прототипа.There is a method of treating liver failure by using universal regulators of restoration processes in organs - multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells (MMSC KM) from a healthy donor [Lyundup A.V., Krasheninnikov M.E., Onishchenko N.A. The use of allogeneic mesenchymal bone marrow cells in the treatment of chronic liver diseases, Proceedings of the All-Russian Conference "Cell Research and Technology in Modern Biomedicine", Tula 2009, p. 6-8], which we have selected as a prototype.
Способ-прототип основан на выделении из костного мозга донора - ММСК КМ, культивировании их для увеличения клеточной массы в течение 3-4 недель и внутривенном введении реципиенту с поврежденной печенью. ММСК КМ после введения реципиенту корригируют клинические и морфологические проявления печеночной недостаточности путем индукции митотической активности клеток печени, а также путем активации дефиброзирующих процессов в печени (фибролитический эффект) [Люндуп А.В. «Применение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для коррекции фиброзирующего повреждения печени» (экспериментальное исследование), автореферат диссертации канд. мед. наук, Москва 2011, 26 с.]. Эффективность применения ММСК КМ, для коррекции и лечения печеночной недостаточности обусловлена тем, что эти клетки обладают высоким регенерационным потенциалом, так как являются стволовыми/прогениторными (малодифференцированными) активно пролиферирующими клетками и в процессе своей жизнедеятельности выделяют комплекс высокоактивных регуляторных рост стимулирующих и паракринных факторов.The prototype method is based on the allocation of bone marrow donor - MMSC KM, culturing them to increase cell mass for 3-4 weeks and intravenous administration to a recipient with a damaged liver. MMSC CM after administration to the recipient corrects the clinical and morphological manifestations of liver failure by inducing mitotic activity of liver cells, as well as by activating defibrosing processes in the liver (fibrolytic effect) [Lundup A.V. "The use of mesenchymal stromal bone marrow cells for the correction of fibrosing damage to the liver" (experimental study), Ph.D. thesis. honey. Sciences, Moscow 2011, 26 pp.]. The effectiveness of the use of MMSC KM for the correction and treatment of liver failure is due to the fact that these cells have a high regenerative potential, since they are stem / progenitor (poorly differentiated) actively proliferating cells and, in the course of their life, they secrete a complex of highly active regulatory growth of stimulating and paracrine factors.
Эти факторы, корригируют взаимодействия в системе мезенхимальных клеток организма, в том числе системе мезенхимальных клеток поврежденной печени (купферовских клеток, звездчатых клеток, фибробластов, лейкоцитов), восстанавливают их нарушенное взаимодействие между собой и с паренхиматозными клетками печени (гепатоцитами), обеспечивая, таким образом, регуляцию процессов восстановительной регенерации печени.These factors correct the interactions in the system of mesenchymal cells of the body, including the system of mesenchymal cells of the damaged liver (Kupffer cells, stellate cells, fibroblasts, leukocytes), restore their disturbed interaction between themselves and with parenchymal liver cells (hepatocytes), thus ensuring , regulation of the processes of regenerative regeneration of the liver.
Однако внедрение в клиническую практику клеточных технологий для лечения заболеваний печени продолжает оставаться на стадии пилотных исследований. Даже применение аутологичных стволовых/прогениторных клеток не получает единодушной поддержки и не находит широкого клинического применения из-за опасности малигнизации и генетических мутаций стволовых/прогениторных клеток после трансплантации в организме реципиента, а также из-за быстрой гибели этих клеток при получении их от аллогенного или ксеногенного донора.However, the introduction into clinical practice of cellular technologies for the treatment of liver diseases continues to remain at the stage of pilot studies. Even the use of autologous stem / progenitor cells does not receive unanimous support and does not find wide clinical use because of the danger of malignancy and genetic mutations of stem / progenitor cells after transplantation in the recipient's body, as well as because of the rapid death of these cells when they are received from allogeneic or xenogenic donor.
В настоящее время из ММСК КМ выделено несколько микро РНК (микро РНК-188, микро РНК-21) для ускорения процессов остеогенной дифференцировки ММСК КМ и заживления костных переломов [Li C.J., Cheng P., Liang M.K., Chen Y.S., Lu Q., Wang J.Y. et al., MicroRNA-188 regulates age-related switch between osteoblast and adipocyte differentiation. J Clin. Invest. 2015 Apr, 125 (4): 1509-22. doi: 10.1172/JCI177716. Epub 2015, Mar 9; / Sun Y., Xu L., Huang S., Hou Y., Liu Y. et al., Mir-21 overexpressing mesenchymal stem cells accelerate fracture healing in a rat closed femur fracture model. Biomed Res. Int. 2015; 2015: 412327. doi: 10.1155/2015/412327. Epub 2015 Mar 23].Currently, several micro RNAs (micro RNA-188, micro RNA-21) have been isolated from MMSC CM to accelerate the processes of osteogenic differentiation of MMSC CM and healing of bone fractures [Li CJ, Cheng P., Liang MK, Chen YS, Lu Q., Wang jy et al., MicroRNA-188 regulates age-related switch between osteoblast and adipocyte differentiation. J Clin. Invest. 2015 Apr, 125 (4): 1509-22. doi: 10.1172 / JCI177716. Epub 2015, Mar 9; / Sun Y., Xu L., Huang S., Hou Y., Liu Y. et al., Mir-21 overexpressing mesenchymal stem cells accelerate fracture healing in a rat closed femur fracture model. Biomed Res. Int. 2015; 2015: 412327. doi: 10.1155 / 2015/412327. Epub 2015 Mar 23].
Описания исследований по выделению и применению микро РНК из ММСК КМ для лечения печеночной недостаточности в литературе отсутствуют.There are no descriptions of studies on the isolation and use of micro RNA from MMSC KM for the treatment of liver failure in the literature.
Кроме того, следует иметь ввиду, что регулирование процесса восстановительной регенерации в печени не может осуществляться какой либо одной микро РНК (их в настоящее время идентифицировано в организме свыше 1800 типов), т.к. печень представляет собой гистологически сложный орган, состоящий из 5 типов клеток различного происхождения (гепатоциты, купферовские клетки, клетки Ито - звездчатые клетки, эндотелиальные клетки, лейкоциты) и выполняет комплекс важнейших гомеостатических функций (синтетическая, детоксикационная, пищеварительная, выделительная, иммунорегуляторная и др.), взаимодействуя с другими системами организма.In addition, it should be borne in mind that the regulation of the process of regenerative regeneration in the liver cannot be carried out by any one micro RNA (they are currently identified in the body over 1800 types), because the liver is a histologically complex organ, consisting of 5 types of cells of various origins (hepatocytes, Kupffer cells, Ito cells - stellate cells, endothelial cells, white blood cells) and performs a complex of important homeostatic functions (synthetic, detoxification, digestive, excretory, immunoregulatory, etc. ), interacting with other body systems.
Техническая проблема заключается в повышении качества, надежности и безопасности применения клеточной терапии с использованием стволовых/прогениторных ММСК КМ при лечении (коррекции) печеночной недостаточности.The technical problem is to improve the quality, reliability and safety of the use of cell therapy using stem / progenitor MMSC KM in the treatment (correction) of liver failure.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого способа, заключается в повышении эффективности лечения печеночной недостаточности за счет возможности многократного применения препарата, выделенного из ММСК КМ (аллогенного или ксеногенного) донора, а также в предупреждении осложнений, связанных с применением биотехнологических методов коррекции и профилактики печеночной недостаточности стволовыми/прогениторными клетками - (малигнизация и генетические мутации при имплантации ММСК КМ, быстрая гибель аллогенных и ксеногенных клеток костного мозга) путем использования биологически активного комплекса, содержащего в себе все типы РНК, в том числе все типы регуляторных белок - некодирующихмикро РНК, способного осуществить перенос «регенерационной информации» клеткам поврежденного органа - печени, индуцируя в ней процесс ускоренной и эффективной восстановительной регенерации.The technical result achieved by the implementation of the proposed method is to increase the effectiveness of the treatment of liver failure due to the possibility of multiple use of the drug isolated from MMSC KM (allogeneic or xenogenic) donor, as well as to prevent complications associated with the use of biotechnological methods for the correction and prevention of liver failure stem / progenitor cells - (malignancy and genetic mutations during implantation of MMSC KM, rapid death of allogeneic and senogenic bone marrow cells) by using a biologically active complex that contains all types of RNA, including all types of regulatory proteins - non-coding micro RNAs, capable of transferring “regenerative information” to cells of a damaged organ - the liver, inducing an accelerated and effective recovery process in it regeneration.
Нами во избежание негативных последствий применения терапии ММСК КМ для повышения качества и безопасности применения биотехнологических методов регенерационной терапии предложено использовать не ММСК КМ, а выделенный из них комплекс биологически активных компонентов, включающий в себя все типы РНК, в том числе все типы регуляторных микро РНК, способных осуществить перенос содержащейся в них «регенерационной информации» клеткам поврежденного органа (печени) и тем самым активизировать в них восстановительные процессы.To avoid the negative consequences of the use of MMSC KM therapy, to improve the quality and safety of using biotechnological methods of regenerative therapy, it was proposed to use not MMSC KM, but a complex of biologically active components isolated from them, including all types of RNA, including all types of regulatory micro RNA, able to carry out the transfer of “regeneration information” contained in them to the cells of the damaged organ (liver) and thereby activate the recovery processes in them.
Достоинством предлагаемого способа лечения печеночной недостаточности, позволяющим по существу достигнуть более выраженного и надежного лечебного эффекта является:The advantage of the proposed method for the treatment of liver failure, which allows to essentially achieve a more pronounced and reliable therapeutic effect is:
- отказ от необходимости поиска антиген совместимого донора для получения и использования ММСК КМ, так как суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ здорового донора, обладает иммуно-неспецифичными (видо-неспецифичными) свойствами и может быть получена из ММСК КМ как аутологичного, так и аллогенного и ксеногенного донора;- the rejection of the need to search for a compatible donor antigen for the production and use of MMSC KM, since the total RNA isolated from MMSC KM of a healthy donor has immuno-specific (species-specific) properties and can be obtained from MMSC KM of both autologous and allogeneic and xenogenic donor;
- возможность проводить (курсовую терапию) путем парентерального многократного применения препарата суммарной РНК до полного выздоровления или ремиссии;- the ability to conduct (course therapy) by parenteral repeated use of the total RNA preparation until complete recovery or remission;
- возможность обеспечить компенсаторную поддержку регенерации печени, стимулируя адаптационную и регенерационную поддержку другим органам (почки, легкие), относящимся к единой системе детоксикации организма;- the ability to provide compensatory support for liver regeneration by stimulating adaptive and regenerative support to other organs (kidneys, lungs) related to a single body detoxification system;
- возможность обеспечения безопасности проведения регенерационной терапии препаратом суммарной РНК из ММСК КМ, так как введенная РНК, являясь химическим веществом, не может стать объектом малигнизации, генетических мутации, а также утратить свою регуляторную активность.- the ability to ensure the safety of regenerative therapy with the preparation of total RNA from MMSC KM, since the introduced RNA, being a chemical substance, cannot become an object of malignancy, genetic mutations, and also lose its regulatory activity.
- возможность проводить эффективную регенерационную терапию различных органов и систем в организме, т.к. суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ, сохраняет универсальность регуляторных свойств этих клеток- the ability to conduct effective regenerative therapy of various organs and systems in the body, because total RNA isolated from MMSC KM retains the universality of the regulatory properties of these cells
Сущность изобретения заключается в следующем.The invention consists in the following.
Для коррекции печеночной недостаточности выделяют из костного мозга донора (человека или животного) мононуклеарную фракцию клеток. Затем после их культивирования выделяют из них фракцию ММСК КМ. Далее из полученной фракции выделяют суммарную РНК ММСК КМ и вводят ее в эффективном количестве пациенту.To correct liver failure, a mononuclear fraction of cells is isolated from the bone marrow of the donor (human or animal). Then, after their cultivation, the MMSC KM fraction is isolated from them. Then, total MMSC KM RNA is isolated from the obtained fraction and it is administered in an effective amount to the patient.
Введение может быть осуществлено внутрибрюшинно, в паренхиму печени, внутрипортально, подкожно, внутримышечно или внутривенно в дозе в дозе 1-3 мг вещества в сутки, по меньшей мере, три раза с интервалом между первым и вторым введениями 1-3 суток, а затем с интервалом 2-5 суток.The introduction can be carried out intraperitoneally, into the liver parenchyma, intraportally, subcutaneously, intramuscularly or intravenously in a dose of 1-3 mg of the substance per day, at least three times with an interval between the first and second administrations of 1-3 days, and then with an interval of 2-5 days.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Для лечения печеночной недостаточности используют не ММСК КМ донора, а биологически активный комплекс, выделенный из этих клеток. Комплекс содержит суммарную (общую) РНК, в состав которой входят все типы РНК, в том числе все типы регуляторных РНК (прежде всего микро РНК), обеспечивающие перенос «регенерационной информации», содержащейся в ММСК КМ, клеткам поврежденной печени.For the treatment of hepatic insufficiency, not MMSC KM donor is used, but a biologically active complex isolated from these cells. The complex contains total (total) RNA, which includes all types of RNA, including all types of regulatory RNA (primarily micro RNA), providing the transfer of "regeneration information" contained in MMSC CM to damaged liver cells.
Приводим способ получения суммарной РНК из ММСК КМ на примере экспериментального животного - крысы, который аналогичен таковому у человека.We present a method for producing total RNA from MMSC KM by the example of an experimental animal, a rat, which is similar to that in humans.
Выполнение способа начинают с получения мононуклеарной фракции клеток из аспирата костного мозга. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых и бедренных костей крысы получали клетки костного мозга путем аспирации их шприцем с иглой 18G, содержащим среду для забора (0,5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина).The implementation of the method begins with obtaining a mononuclear fraction of cells from a bone marrow aspirate. To do this, under ether anesthesia, rats received bone marrow cells from the bone marrow canal of the tibia and femur by aspirating them with a syringe with an 18G needle containing a collection medium (0.5 ml of phosphate-buffered solution with 50 IU / ml of heparin and 0.25 mg / l gentamicin).
Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NH4Cl, 7,5 мМ КНСОз, 100 мкМ EDTA) в течение 3 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClonegold», USA), инсулин 0,4 мкМ и 0,25 мг/л гентамицина.The KM cell suspension was centrifuged at 1500 rpm (350g) for 5 minutes, the cell pellet was resuspended in erythrocyte lysis solution (114 mM NH 4 Cl, 7.5 mM KHCO3, 100 μM EDTA) for 3 min and centrifuged again. The hemolyzed supernatant was removed by suction, and the cell pellet was resuspended in DMEM medium (PanEco, Russia) containing 10% calf fetal serum (HyClonegold, USA), insulin 0.4 μM and 0.25 mg / l gentamicin.
Выделенные клетки, представляли собой фракцию, преимущественно мононуклеарных клеток костного мозга (первичная культура), которые затем высевали в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл в культуральные флаконы.The isolated cells were a fraction, mainly of bone marrow mononuclear cells (primary culture), which were then plated in the amount of 2.0-2.5 million cells / ml in culture bottles.
Затем культуральные флаконы помещали в СО2-инкубатор с 5% концентрацией CO2 и 95% содержанием атмосферного воздуха с повышенной влажностью. Через 2 суток после выделения первичной культуры не прикрепившуюся клеточную взвесь удаляли, а оставшиеся клетки с фибробластоподобной морфологией продолжали культивировать. Замену культуральной среды на свежую, осуществляли каждые 3-4 суток. После образования субконфлюэнтного монослоя клетки однократно отмывали раствором Версена, затем снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, ресуспендировали в ростовой среде и разливали в новую культуральную посуду. Для работы использовали клетки после 2-го пассажа, в концентрации 2,5-3,0×106 клеток/мл.Then the culture bottles were placed in a CO 2 incubator with a 5% concentration of CO 2 and 95% atmospheric air with high humidity. 2 days after isolation of the primary culture, the non-adherent cell suspension was removed, and the remaining cells with fibroblast-like morphology continued to be cultured. The replacement of the culture medium with a fresh one was carried out every 3-4 days. After the formation of a subconfluent monolayer, the cells were washed once with Versen solution, then removed with Versen solution with 0.25% trypsin, resuspended in growth medium and poured into a new culture dish. For work, cells were used after the 2nd passage, at a concentration of 2.5-3.0 × 10 6 cells / ml.
Клеточный материал, представляющий собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки - ММСК КМ считался пригодным как для применения при лечении печеночной недостаточности по способу прототипу, так и для получения суммарной РНК при лечении печеночной недостаточности по предлагаемому способу, так как выделенная фракция ММСК КМ сохраняла популяционную активность и не содержала погибшие клетки. Гомогенность культуры ММСК КМ была подтверждена иммуногистохимическим исследованием путем выявления в них коллагена I типа с помощью кроличьих моноклональных антител («Имтэк»).Cellular material, which is flattened fibroblast-like cells attached to plastic, MMSC KM was considered suitable both for use in the treatment of liver failure by the prototype method and for obtaining total RNA in the treatment of liver failure according to the proposed method, since the isolated MMSC CM fraction retained population activity and did not contain dead cells. The homogeneity of the MMSC KM culture was confirmed by immunohistochemical studies by detecting type I collagen in them using rabbit monoclonal antibodies ("Imtek").
Затем приступали к выделению суммарной РНК из полученной культуры ММСК КМ (суммарный выход ММСК обычно составлял 8-10×106 клеток) по методике ExtractRNA, разработанной фирмой «Евроген» (Россия). Культуру ММСК КМ после 2-го пассажа снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, дважды отмывали средой ДМЕМ без добавок, каждый раз центрифугируя при комнатной температуре при скорости 1500 об/мин в течение 5 минут и удаляли надосадочную жидкость.Then, we started to isolate the total RNA from the obtained MMSC KM culture (the total MMSC output was usually 8-10 × 10 6 cells) according to the ExtractRNA method developed by Eurogen (Russia). The MMSC KM culture after
Далее к выделенной культуре ММСК (в камере Горяева предварительно подсчитывали количество клеток) добавляли реагент ExtractRNA из расчета 1 мл реагента на 1×106 клеток, инкубировали смесь 15 минут (периодически пипетируя) и центрифугировали при 13400 об/мин 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переносили в новую пробирку и приступали к разделению фаз. Для этого добавляли 0,2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента ExtractRNA, инкубировали смесь в течение 5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая образец; затем образец центрифугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре.Further, an isolated culture MMSC (a Goryaev chamber previously counted number of cells) was added ExtractRNA reagent rate of 1
В ходе центрифугирования происходило разделение смеси на три фазы: нижнюю - органическую фенол хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК находится в верхней водной фазе, которую аккуратно собирали и переносили в чистую пробирку.During centrifugation, the mixture was divided into three phases: the lower — the yellow phenol organic phenol, the chloroform phase, the white interphase, and the upper colorless aqueous phase. RNA is in the upper aqueous phase, which was carefully collected and transferred to a clean tube.
Затем приступали к непосредственному выделению РНК. Для этого в водную фазу добавляли 0,5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента (ExtractRNA). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно отбирали супернатант, оставляя осадок РНК на дне пробирки. Далее аккуратно, по стенке пробирки, добавляли 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного ранее. Полученный образец центрифугировали на максимальной скорости (13400 об/мин) в течение 5 минут. Удаляли этанол пипеткой, осадок выделенной РНК растворяли в 1 мл воды и определяли концентрацию РНК в 100 мкл образца на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Из каждых 8-10 млн исходно использованных ММСК в 1 мл определялось 750-950 мкг РНК. Далее из этого концентрированного раствора РНК готовили рабочие растворы РНК требуемой концентрации для введения в организм крысы с целью коррекции печеночной недостаточности. Суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ, представляет собой биотехнологический продукт высокой степени очистки, который может быть введен внутрибрюшинно, в паренхиму печени, через воротную вену в печень, а также подкожно, внутримышечно или внутривенноThen proceeded to direct RNA isolation. For this, 0.5 ml of 100% isopropanol for each 1 ml of reagent used (ExtractRNA) was added to the aqueous phase. The resulting mixture was incubated at room temperature for 10 minutes and centrifuged at 13,400 rpm for 10 minutes at room temperature. Then the supernatant was carefully selected, leaving the RNA pellet at the bottom of the tube. Then, gently, 2 ml of 75% ethanol for each 1 ml of isopropanol used previously was added along the wall of the tube. The resulting sample was centrifuged at maximum speed (13,400 rpm) for 5 minutes. Ethanol was removed with a pipette, the precipitate of the isolated RNA was dissolved in 1 ml of water, and the concentration of RNA in 100 μl of the sample was determined on a spectrophotometer at a wavelength of 260 nm. Of every 8–10 million MMSCs initially used, 750–950 μg of RNA was determined in 1 ml. Further, from this concentrated RNA solution, RNA working solutions of the required concentration were prepared for administration to a rat in order to correct liver failure. Total RNA isolated from MMSC KM is a highly purified biotechnological product that can be introduced intraperitoneally, into the liver parenchyma, through the portal vein into the liver, and also subcutaneously, intramuscularly or intravenously
Для экспериментального животного - (крысы) рабочий раствор РНК содержал 75-95 мкг РНК/мл (к 0,5 мл концентрированного раствора РНК добавляли 9,5 мл дистиллированной воды). Введение РНК осуществляют в дозе 15-45 мкг на 100 г веса животного (или 150-450 мкг/кг веса животного) трехкратно с интервалами в 1-3 суток между первым и вторым введениями и 2-5 суток между вторым и последующими введениями внутрибрюшинно или в паренхиму печени. Т.е. крысе массой 400 г вводят 0,2-0,6 мл рабочего раствора РНК в сутки трехкратно по выше указанной схемеFor the experimental animal (rat), the working RNA solution contained 75-95 μg RNA / ml (9.5 ml of distilled water was added to 0.5 ml of concentrated RNA solution). The introduction of RNA is carried out at a dose of 15-45 μg per 100 g of animal weight (or 150-450 μg / kg of animal weight) three times at intervals of 1-3 days between the first and second administrations and 2-5 days between the second and subsequent administrations intraperitoneally or into the liver parenchyma. Those. a rat weighing 400 g is injected with 0.2-0.6 ml of a working solution of RNA per day three times according to the above scheme
Использование для человека эффективного количества суммарной РНК, выделенной из ММСК КМ, будет зависеть от массы тела пациента, степени тяжести (обратимости) печеночной недостаточности, особенностей ответной реакции организма на вводимый биологически активный комплекс. Для человека суточная доза суммарной РНК будет находиться в диапазоне 1,0-3,0 мг РНК в сутки (или 1000-3000 мкг РНК в сутки, или 16-48 мкг/кг), т.е. эффективная доза РНК для человека будет приблизительно в 10 раз меньше на единицу массы тела, чем у крысы, т.к. известно, что интенсивность метаболизма в организме крысы, которая характеризуется отношением поверхности тела к его массе, приблизительно в 10 раз выше, чем у человека (Л. Проссер, Ф. Браун «Сравнительная физиология животных», 1967, Изд. Мир, 768 с.; В.И. Шумаков, Е.Ш. Штенгольд, Н.А. Онищенко «Консервация органов», Москва, Медицина, 1975, 250 с.).The use for humans of an effective amount of total RNA isolated from MMSC KM will depend on the patient’s body weight, severity (reversibility) of liver failure, and the characteristics of the body's response to the introduced biologically active complex. For humans, the daily dose of total RNA will be in the range of 1.0-3.0 mg RNA per day (or 1000-3000 μg RNA per day, or 16-48 μg / kg), i.e. the effective dose of RNA for humans will be approximately 10 times less per unit body weight than in rats, as it is known that the metabolic rate in the rat organism, which is characterized by the ratio of the body surface to its mass, is approximately 10 times higher than in humans (L. Prosser, F. Brown, “Comparative Animal Physiology”, 1967, Izd. Mir, 768 pp. ; V.I. Shumakov, E.Sh. Shtengold, N.A. Onishchenko "Conservation of organs", Moscow, Medicine, 1975, 250 p.).
Для усиления биорегуляторного воздействия и закрепления лечебного эффекта у человека суммарную РНК, выделенную из ММСК КМ, целесообразно вводить в указанной дозе, по меньшей мере, трехкратно с интервалом в 1-3 суток между первым и вторым введениями и 2-5 суток между последующими введениями, количество которых может достигать 10 и более, что необходимо для создания условий эффективной индукции (активации) перепрограммирования процессов регенерации печени в организме больного с патологического (фиброзирующего) типа на восстановительный.To enhance the bioregulatory effect and consolidate the therapeutic effect in humans, the total RNA isolated from MMSC KM, it is advisable to enter at a specified dose at least three times with an interval of 1-3 days between the first and second administrations and 2-5 days between subsequent administrations, the number of which can reach 10 or more, which is necessary to create conditions for effective induction (activation) of reprogramming the processes of liver regeneration in the patient’s body from a pathological (fibrosing) type to a regenerative one.
Приготовление рабочего раствора РНК и получение эффективного количества суммарной РНК для человека требует выделения не 8-10 млн ММСК из костного мозга (как для крысы), а 80-100 млн ММСК из костного мозга здорового человека или животного (особи крупного рогатого скота), из которых по выше описанной методике выделения суммарной РНК, удается получить в 1 мл водного раствора 8-10 мг (или 8000-10000 мкг/мл) суммарной РНК из ММСК. Рабочий раствор РНК для человека (10 мл) содержал 800-1000 мкг РНК/мл и его готовили добавляя к 0,5 мл полученного (концентрированного) раствора РНК 9,5 мл дистиллированной воды. Для доставки в организм человека необходимой (терапевтической) дозы РНК достаточно ввести 1,2-3,6 мл рабочего раствора РНК, т.е. 1-3 мг РНК.Preparation of a working RNA solution and obtaining an effective amount of total RNA for humans requires the isolation of not 8-10 million MMSCs from the bone marrow (as for rats), but 80-100 million MMSCs from the bone marrow of a healthy person or animal (cattle), from which, according to the above procedure for isolating total RNA, can be obtained in 1 ml of an aqueous solution of 8-10 mg (or 8000-10000 μg / ml) of total RNA from MMSC. A human RNA working solution (10 ml) contained 800-1000 μg RNA / ml and it was prepared by adding 9.5 ml of distilled water to 0.5 ml of the obtained (concentrated) RNA solution. To deliver the necessary (therapeutic) dose of RNA to the human body, it is enough to introduce 1.2-3.6 ml of a working RNA solution, i.e. 1-3 mg of RNA.
Многократностью введения удается достигнуть, поддержать и сохранить начавшееся перепрограммирование процессов регенерации с патологического типа на восстановительный.By repeated administration it is possible to achieve, maintain and maintain the begun reprogramming of the regeneration processes from the pathological type to the recovery type.
Таким образом, доза вводимого вещества определяется следующим образом: 16-48 мкг РНК/кг веса реципиента (или 1000-3000 мкг РНК на реципиента), которая вводится, по меньшей мере, трехкратно с интервалом 1-3 суток между первым и вторым введением и 2-5 суток между последующими введениями, количество которых может достигать 10 и более.Thus, the dose of the administered substance is determined as follows: 16-48 μg RNA / kg of the recipient's weight (or 1000-3000 μg RNA per recipient), which is introduced at least three times with an interval of 1-3 days between the first and second administration and 2-5 days between subsequent administrations, the amount of which can reach 10 or more.
В РНК-содержащие препараты могут быть включены стабилизирующие агенты.Stabilizing agents may be included in RNA-containing preparations.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.To prove the possibility of realizing the claimed purpose and achieving the specified technical result, we provide the following data.
Сравнительное изучение эффективности коррекции печеночной недостаточности по способу прототипу (внутривенное введение ММСК КМ) и по предлагаемому способу (внутрибрюшинное или внутрипортальное введение в печень суммарной РНК) выполняли на модели хронической печеночной недостаточности (ХПН).A comparative study of the effectiveness of the correction of liver failure by the prototype method (intravenous administration of MMSC KM) and the proposed method (intraperitoneal or intraportal administration of total RNA to the liver) was performed on a model of chronic liver failure (CRF).
Для этого создавали модель хронического фиброзирующего повреждения печени у крыс путем длительной (в течение 42 дней) затравки четыреххлористым углеродом (CCL4) по описанной ниже методике. Длительным введением раствора CCL4 достигалось развитие хронического токсического гепатита и стимуляция заместительного типа регенерационного ответа печени (развитие склероза и фиброза печени). Метод поддается высокой степени стандартизации и является «классической» моделью для изучения регенерации печени при хроническом токсическом повреждении.For this, a model of chronic fibrosing liver damage in rats was created by means of a prolonged (for 42 days) seeding with carbon tetrachloride (CCL 4 ) according to the procedure described below. Long-term administration of CCL 4 solution resulted in the development of chronic toxic hepatitis and stimulation of the replacement type of the regenerative response of the liver (the development of sclerosis and liver fibrosis). The method lends itself to a high degree of standardization and is a "classic" model for studying liver regeneration in chronic toxic damage.
Моделирование хронического токсического фиброзирующего повреждения печени проводили на белых крысах самцах породы Вистар (вес к началу затравки 250-300 г, n=85), содержащихся в виварии на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде.Chronic toxic fibrosing liver damage was simulated on white rats of Wistar male males (weight at the beginning of the seed 250-300 g, n = 85) contained in the vivarium on a mixed diet with free access to water.
Затравку крыс CCL4 проводили под кратковременным эфирным наркозом в интервале между 9-ю и 12-ю часами дня, что исключало суточные колебания митотической активности клеток печени. Подкожные инъекции 60% раствора CCL4 на персиковом масле проводили 2 раза в неделю (понедельник, четверг) в течение 6 недель (42 суток) в дозе 0,3 мл раствора на 100 г веса животного. Первая инъекция проводилась в дозе 0,5 мл 60% раствора CCL4 на 100 г веса животного. Суммарная курсовая доза чистого CCL4 составляла 3,5 мл на 100 г веса животного.Seeding of CCL 4 rats was carried out under short-term ether anesthesia in the interval between the 9th and 12th hours of the day, which excluded diurnal fluctuations in the mitotic activity of liver cells. Subcutaneous injections of a 60% CCL 4 solution in peach oil were performed 2 times a week (Monday, Thursday) for 6 weeks (42 days) at a dose of 0.3 ml of solution per 100 g of animal weight. The first injection was carried out in a dose of 0.5 ml of 60% CCL 4 solution per 100 g of animal weight. The total course dose of pure CCL 4 was 3.5 ml per 100 g of animal weight.
Через трое суток после завершения моделирования ХПН (на 46 сутки от начала моделирования ХПН) всех животных разделили на 3 группы: 1 группа - контроль (ХПН без применения терапии, n=35); 2 группа - ХПН и внутривенное введение ММСК КМ в хвостовую вену в дозе 2,5×106 кл/мл на крысу двукратно с интервалом в 7 суток, т.е. на 4 и 11 сутки после завершения моделирования ХПН (группа сравнения, n=20). 3 группа состояла из двух подгрупп: подгруппы 3.1 (n=15), в которой проводилось внутрибрюшинное введение РНК в дозе 15 мкг на 100 г веса животного (крысы), и подгруппы 3.2 (n=15), в которой проводилось введение РНК в паренхиму печени в дозе 45 мкг на 100 г веса животного (крысы). Инъекции осуществляли трехкратно с интервалом в 1-3 суток после первого введения и 2-5 суток после второго введения на фоне завершения моделирования ХПН (основная группа, n=30).Three days after the completion of the modeling of CRF (on the 46th day from the beginning of the modeling of CRF) all animals were divided into 3 groups: 1 group - control (CRF without the use of therapy, n = 35); Group 2 - CRF and intravenous administration of MMSC KM into the tail vein at a dose of 2.5 × 10 6 cells / ml per rat twice with an interval of 7 days, i.e. on the 4th and 11th day after the completion of the modeling of CRF (comparison group, n = 20).
Результаты оценивали в трех группах опытов на 1, 30, 90, 180 и 270 сутки после проведения терапии с помощью биохимических, гистологических и морфометрических методов.The results were evaluated in three groups of experiments on
Биохимическими методами исследовали кровь на содержание аланин-аминотрансферазы (АлАТ), аспарагин-аминотрансферазы (АсАТ) и щелочную фосфатазу (ЩФ). Для этого у крысы под эфирным наркозом надсекали кончик хвоста, пипеткой забирали 28-32 мкл крови, капали на специальные тест-полоски Reflotron™, которые сразу же устанавливали в биохимический анализатор Reflotron™ («Roche», Швейцария) (Принцип измерения - рефлексионная фотометрия, точность измерения - ±0.5%, воспроизводимость - <=0.2%, линейность: ±0.05%).Biochemical methods examined the blood for the content of alanine aminotransferase (AlAT), asparagine aminotransferase (AcAT) and alkaline phosphatase (ALP). To do this, a tail tip was cut in a rat under ether anesthesia, 28-32 μl of blood was taken with a pipette, dropped onto special Reflotron ™ test strips, which were immediately installed in a Reflotron ™ biochemical analyzer (Roche, Switzerland) (Measurement principle - reflection photometry , measurement accuracy ± 0.5%, reproducibility <= 0.2%, linearity: ± 0.05%).
Для гистологического исследования печени животных забивали под эфирным наркозом декапитацией, извлекали фрагмент средней доли печени, разрезали его на кусочки размерами 3×4×5 мм и помещали в раствор Буэна (через 24 часа раствор Буэна меняли на 70% этанол) для фиксации. После завершения фиксации кусочки промывали в проточной воде в течение 2-3 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм наклеивали влажным способом на стекла с поли-L-лизиновым покрытием («Thermo», США). Затем препараты высушивали в течение 48 ч в термостате при 37°C, депарафинировали, регидратировали и окрашивали срезы гематоксилин-эозином и по Маллори (на соединительную ткань).For histological examination of the liver, animals were sacrificed under ether anesthesia by decapitation, a fragment of the middle lobe of the liver was extracted, cut into 3 × 4 × 5 mm pieces and placed in a Buen solution (after 24 hours, the Buen solution was changed to 70% ethanol) for fixation. After the fixation was completed, the pieces were washed in running water for 2-3 hours, dehydrated in alcohols of an ascending concentration, and embedded in paraffin. 4-5 μm thick paraffin sections were wet glued onto poly-L-lysine coated glass (Thermo, USA). Then, the preparations were dried for 48 h in a thermostat at 37 ° C, dewaxed, rehydrated and stained with hematoxylin-eosin and Mallory sections (on connective tissue).
Морфометрический анализ срезов фрагмента средней доли печени был произведен с помощью морфометрической программы Image Scope М (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия). Исследуемые изображения получены с использованием микроскопа Leica DM 1000 и камеры Leica LTDCH9435 DFC 295 (Leica Camera AG, Германия).Morphometric analysis of slices of a fragment of the middle lobe of the liver was performed using the Image Scope M morphometric program (Systems for Microscopy and Analysis LLC, Russia). The studied images were obtained using a
Данным методом определяли:This method was determined:
1. наличие цирроза (подсчет количества ложных долек);1. the presence of cirrhosis (counting the number of false lobules);
2. долю соединительной ткани (в процентном соотношении к общей площади среза печени), кровеносных сосудов и желчных протоков в %;2. the proportion of connective tissue (as a percentage of the total area of the cut of the liver), blood vessels and bile ducts in%;
3. выраженность жировой дистрофии (оценивали 10 полей зрения среза каждого образца);3. the severity of fatty degeneration (evaluated 10 fields of view of the slice of each sample);
4. количество двуядерных гепатоцитов (на 10 полей зрения среза при увеличении ×400);4. the number of binuclear hepatocytes (per 10 fields of view of the slice with an increase of × 400);
5. количество гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями.5. the number of hepatocytes with intranuclear lipid inclusions.
Приводим результаты сравнительного исследования эффективности применения ММСК КМ и суммарной РНК из ММСК КМ для восстановительной регенерации поврежденной печени. Так как результаты исследования в подгруппах 3.1 и 3.2 достоверно не различались между собой они были объединены в группу 3.We present the results of a comparative study of the effectiveness of using MMSC KM and total RNA from MMSC KM for the regenerative regeneration of damaged liver. Since the results of the study in subgroups 3.1 and 3.2 did not significantly differ, they were combined into
На фиг. 1 представлена динамика АлАТ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).In FIG. Figure 1 shows the dynamics of AlAT in rats with liver failure without treatment (group 1) and using MMSC KM (group 2) or total RNA from MMSC KM (group 3).
На фиг. 2. представлена динамика AcAT у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).In FIG. 2. The dynamics of AcAT in rats with liver failure without treatment (group 1) and using MMSC KM (group 2) or total RNA from MMSC KM (group 3) is presented.
На фиг. 3 представлена динамика ЩФ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).In FIG. Figure 3 shows the dynamics of alkaline phosphatase in rats with liver failure without treatment (group 1) and using MMSC KM (group 2) or total RNA from MMSC KM (group 3).
На фиг. 4 представлена динамика формирования ложных долек у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).In FIG. Figure 4 shows the dynamics of the formation of false lobules in rats with liver failure without treatment (group 1) and using MMSC KM (group 2) or total RNA from MMSC KM (group 3).
Результаты гистологического и морфометрического исследования представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.The results of histological and morphometric studies are presented in tables 1 and 2, respectively.
Обозначения:Designations:
* - р<0,05 по сравнению с нормой;* - p <0.05 compared with the norm;
# - р<0,05 по сравнению с 30 сутками в контрольной группе. # - p <0.05 compared with 30 days in the control group.
Обозначения:Designations:
** - р<0,05 по сравнению с 30 сутками в контрольной группе;** - p <0.05 compared with 30 days in the control group;
# - р<0,05 по сравнению с аналогичным сроком в контрольной группе.# - p <0.05 compared with the same period in the control group.
Исследование динамики восстановительных процессов в печени в трех группах опытов показали, что сразу после затравки CCL4 во всех трех группах имело место достоверное повышение ферментов цитолитического повреждения - печени - АлАТ, АсАТ и ЩФ - (фиг. 1, 2, 3). Однако в отличие от 1 контрольной группы во 2 и 3 группах уже на седьмые сутки после окончания затравки происходило достоверное снижение в крови ферментов цитолиза, как после первого внутривенного введения ММСК КМ (2 группа), так и после первого внутрибрюшинного введения или введения в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).A study of the dynamics of restoration processes in the liver in three groups of experiments showed that immediately after the inoculation of CCL 4 in all three groups there was a significant increase in the enzymes of cytolytic damage — liver — AlAT, AsAT, and alkaline phosphatase — (Fig. 1, 2, 3). However, unlike the control group in
К 14 суткам (уже после второго введения ММСК КМ) во 2 группе и после третьего введения суммарной РНК из ММСК КМ в 3 группе, а также к 21 суткам во 2 группе и в 3 группе происходило дальнейшее достоверное снижение уровня цитолитических ферментов печени по сравнению с 1 контрольной группой к этим срокам.By 14 days (after the second administration of MMSC KM) in
К 28 суткам наблюдения значения АлАТ, АсАТ и ЩФ во 2 и 3 группах продолжали снижаться, приближаясь к исходному уровню, тогда как в 1 группе показатели оставались достоверно на более высоком уровне по сравнению с исходными значениями. На протяжении всего этого срока наблюдения достоверных различий в уровне печеночных ферментов между 2 и 3 группой выявлено не было.By 28 days of observation, the values of AlAT, AsAT, and alkaline phosphatase in
Продолжая динамическое наблюдение за содержанием ферментов цитолиза в крови в течение 180 суток, было установлено (фиг. 1, 2, 3), что во 2 и 3 группах значения АлАТ, АсАТ и ЩФ снижались до исходных значений уже к 28-30 дню, тогда как в 1 контрольной группе значения этих показателей нормализовались только через 6 месяцев (к 180 суткам наблюдения).Continuing dynamic monitoring of the content of cytolysis enzymes in the blood for 180 days, it was found (Figs. 1, 2, 3) that in
При гистологической оценке динамики репаративных процессов в печени у животных этих 3-х групп было установлено, что восстановление морфологических показателей печени во всех исследуемых группах происходит в более замедленном темпе, чем восстановление биохимических показателей (ферменты) (таблицы 1, 2).A histological assessment of the dynamics of reparative processes in the liver in animals of these 3 groups showed that the restoration of the morphological parameters of the liver in all studied groups occurs at a slower rate than the restoration of biochemical parameters (enzymes) (tables 1, 2).
Так из таблицы 1 следует, что количество гепатоцитов с признаками жировой дистрофии и с дегенерирующими ядрами, а также количество двуядерных гепатоцитов и гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями в 1 контрольной группе не нормализуется ни к 180, ни к 270 дню наблюдения.So from table 1 it follows that the number of hepatocytes with signs of fatty degeneration and with degenerating nuclei, as well as the number of binuclear hepatocytes and hepatocytes with intranuclear lipid inclusions in the 1st control group, does not normalize either to 180 or to the 270th day of observation.
Во 2 группе (с двукратным введением ММСК КМ) и в 3 группе (с 3-кратным введением суммарной РНК из ММСК КМ) восстановление морфологических показателей происходит более активно: к 180 суткам не все исследуемые показатели возвратились к исходным значениям, но уже на 270 сутки все исследуемые показатели в этих группах не отличались от значений в интактной печени (норма).In group 2 (with a double administration of MMSC KM) and in group 3 (with a 3-fold administration of total RNA from MMSC KM), the morphological parameters are restored more actively: by 180 days not all studied parameters returned to their initial values, but already by 270 days all the studied parameters in these groups did not differ from the values in the intact liver (normal).
В таблице 2 представлены результаты морфометрического определения удельной площади соединительной ткани, пощади кровеносных сосудов и желчных протоков в срезах ткани печени в трех группах опытов при динамическом наблюдении в течение 270 суток. Из таблицы видно, что в 1 контрольной группе на 270 сутки исследуемые показатели были достоверно выше не только по сравнению с интактными животными, но и по сравнению с 30 сутками у животных этой же группы, свидетельствуя об усилении процессов склерозирования ткани печени. Во 2 и 3 группах имеет место постепенная нормализация исследуемых показателей и к 270 суткам они в плотную приближаются к значениям у интактных животных, причем часть из этих показателей имеет достоверно более низкие значения, чем аналогичные показатели в 1-контрольной группе к 270 суткам наблюдения.Table 2 presents the results of morphometric determination of the specific area of the connective tissue, spare blood vessels and bile ducts in sections of liver tissue in three groups of experiments under dynamic observation for 270 days. The table shows that in the 1st control group on 270 days the studied parameters were significantly higher not only compared to intact animals, but also compared to 30 days in animals of the same group, indicating an increase in liver tissue sclerosis processes. In
Достоверных различий в динамике исследуемых показателей во 2 и 3 группах обнаружено не было, хотя в 3 группе имела место тенденция к более выраженному снижению площади соединительной ткани и площади кровеносных сосудов, что может быть связано с 3-кратным введением суммарной РНК из ММСК КМ в течение первого месяца после моделирования печеночной недостаточности. Подсчет ложных долек в течение 180 суток (в баллах) также подтвердил (фиг. 4), что во 2 и 3 группах имеет место процесс дефиброзирования ткани печени, тогда как в 1-группе он практически отсутствует. Достоверные различия в содержании ложных долек в печени животных 2 и 3 групп не выявлены.There were no significant differences in the dynamics of the studied parameters in
Таким образом, с помощью биохимических, морфологических и морфометрических исследований ткани печени в динамике после моделирования ХПН нами установлено, что двукратное внутривенное введение ММСК КМ (2 группа) и 3-кратное внутрибрюшинное введение или введение в ткань печени суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа) на всех исследуемых сроках обеспечивают постепенную коррекцию нарушенных показателей печени и индуцируют в ней восстановительные процессы по сравнению с 1 контрольной группой.Thus, using biochemical, morphological and morphometric studies of liver tissue in dynamics after modeling chronic renal failure, we found that double intravenous administration of MMSC KM (group 2) and 3-fold intraperitoneal injection or introduction into the liver tissue of total RNA from MMSC CM (group 3 ) on all the studied periods provide a gradual correction of impaired liver parameters and induce restoration processes in it compared to the 1st control group.
Мы констатировали также, что достоверные различия в динамике восстановления биохимических и морфологических показателей печени во 2 и 3 группах отсутствовали. Этот факт свидетельствует о том, что двукратное внутривенное введение ММСК КМ (суммарная доза 5,0×106 кл. на животное) и 3-кратное внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (суммарная доза 45 мкг на 100 г животного в подгруппе 3.1 и суммарная доза 135 мкг на 100 г животного в подгруппе 3.2) идентичны по своему биологическому регенераторному воздействию на ткань печени.We also noted that there were no significant differences in the dynamics of restoration of biochemical and morphological parameters of the liver in
Анализ результатов проведенных экспериментов показал также, что предлагаемый биологически активный комплекс суммарной РНК не только оказывает лечебное воздействие при моделировании печеночной недостаточности, но и позволяет достигнуть указанного технического результата как при использовании «крайних значений» заявленного диапазона доз суммарной РНК из ММСК КМ так и «крайних значений» заявленного диапазона временного интервала между введениями суммарной РНК из ММСК КМ.The analysis of the results of the experiments also showed that the proposed biologically active complex of total RNA not only has a therapeutic effect in modeling liver failure, but also allows you to achieve the specified technical result both when using the "extreme values" of the claimed dose range of total RNA from MMSC KM and "extreme values "of the declared range of the time interval between the introduction of total RNA from MMSC KM.
Учитывая сходство патогенетических механизмов развития печеночной недостаточности в клинике и при создании адекватной модели ее развития в эксперименте (как показано выше), результаты представленного эксперимента могут быть правомерно экстраполированы на человека.Given the similarity of the pathogenetic mechanisms of the development of liver failure in the clinic and when creating an adequate model of its development in the experiment (as shown above), the results of the presented experiment can be rightfully extrapolated to humans.
Таким образом, применение суммарной РНК из ММСК КМ в соответствии с предлагаемым способом будет способствовать безопасной восстановительной регенерации печени, т.к. препарат суммарной РНК не несет в своей структуре малигнизирующих и мутационных свойств, не обладает иммуноспецифичностью и пригоден для многократного (курсового) применения.Thus, the use of total RNA from MMSC KM in accordance with the proposed method will contribute to the safe regenerative regeneration of the liver, because the total RNA preparation does not have malignant and mutational properties in its structure, does not have immunospecificity and is suitable for multiple (course) use.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128293A RU2655528C1 (en) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Method of treating hepatic failure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128293A RU2655528C1 (en) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Method of treating hepatic failure |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2655528C1 true RU2655528C1 (en) | 2018-05-28 |
Family
ID=62560053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128293A RU2655528C1 (en) | 2017-08-08 | 2017-08-08 | Method of treating hepatic failure |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2655528C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2425645C1 (en) * | 2010-03-18 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method and transplant for treatment of liver failure |
| US20160074437A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Batu Biologics, Inc. | Immunological treatment of liver failure |
| RU2586952C1 (en) * | 2015-07-20 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of treating hepatic failure |
-
2017
- 2017-08-08 RU RU2017128293A patent/RU2655528C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2425645C1 (en) * | 2010-03-18 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method and transplant for treatment of liver failure |
| US20160074437A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Batu Biologics, Inc. | Immunological treatment of liver failure |
| RU2586952C1 (en) * | 2015-07-20 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of treating hepatic failure |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SZKOLNICKA D et al., Reducing hepatocyte injury and necrosis in response to paracetamol using noncoding RNAs, Stem Cells Transl Med. 2016 Jun;5(6):764-72-. * |
| SZKOLNICKA D et al., Reducing hepatocyte injury and necrosis in response to paracetamol using noncoding RNAs, Stem Cells Transl Med. 2016 Jun;5(6):764-72-реферат. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106109496B (en) | Human umbilical cord mesenchymal stem cells extract freeze-drying powder and preparation method | |
| US20170182100A1 (en) | Conditioned medium of liver progenitor cells | |
| CN105477016A (en) | Application of exosome derived from human mesenchymal stem cells to resistance to tissue fibrosis and scar forming | |
| EP3013943B1 (en) | Cell populations having immunoregulatory activity, methods for the preparation and uses thereof | |
| CN105535022A (en) | Application of exosome to preparing of acute-hepatic-failure treating medicine and medicine composition | |
| KR101507174B1 (en) | Immune privileged and modulatory progenitor cells | |
| JP2020505442A (en) | Injectable composition for preventing hair loss or promoting hair growth | |
| NZ727950A (en) | Mesenchymal stromal cells for treating sepsis | |
| CN1820069A (en) | Selection and propagation of progenitor cells | |
| CN116077448B (en) | Human mesenchymal stem cell injection and application thereof | |
| RU2650209C1 (en) | Method of correction of hepatic insufficiency in the experiment | |
| CN104845933A (en) | Method for enhancing immunological performance and migration capacity of adipose mesenchymal stem cell | |
| KR860000899B1 (en) | Producing method of human pollicle-stimulating hormone | |
| CN113307845B (en) | Polypeptide for promoting hepatocyte proliferation and/or inhibiting hepatocyte apoptosis and application thereof | |
| WO2020103651A1 (en) | Use of mesenchymal stem cells in preparation of product for treating rheumatoid arthritis | |
| KR860000898B1 (en) | Producing method of human chorionic gonadotpopin | |
| RU2655761C1 (en) | Use of total ribonucleic acid (rna) from multipotent mesenchymal stromal cells of the mammal's bone marrow as method for correcting liver failure | |
| He et al. | Full-thickness tissue engineered skin constructed with autogenic bone marrow mesenchymal stem cells | |
| CN116650530A (en) | ACLF pharmaceutical application of CD146+ mesenchymal stem cell subgroup | |
| US20170095593A1 (en) | Adipose-derived stem cell product | |
| Li et al. | An improved two-step method for extraction and purification of primary cardiomyocytes from neonatal mice | |
| RU2655528C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| Saxén et al. | Host factors in cell culture: further studies on the growth-controlling action of fresh human serum | |
| KR102096886B1 (en) | A composition for preventing or treating of graft versus host disease comprising conditioned medium of tonsil-derived mesenchymal stem cell | |
| CN114762697B (en) | Medicine and method for treating diabetes |