RU2654669C1 - Diagnostic nutrient medium for differentiation of the bacillus anthracis by capsule and toxin formation - Google Patents
Diagnostic nutrient medium for differentiation of the bacillus anthracis by capsule and toxin formation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2654669C1 RU2654669C1 RU2016126462A RU2016126462A RU2654669C1 RU 2654669 C1 RU2654669 C1 RU 2654669C1 RU 2016126462 A RU2016126462 A RU 2016126462A RU 2016126462 A RU2016126462 A RU 2016126462A RU 2654669 C1 RU2654669 C1 RU 2654669C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- capsule
- agar
- nutrient medium
- solution
- differentiation
- Prior art date
Links
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 title claims abstract description 34
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 title claims abstract description 25
- 239000002775 capsule Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 9
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 title abstract description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims abstract description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims abstract description 7
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 6
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 claims abstract description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims abstract description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 8
- 244000005706 microflora Species 0.000 claims description 3
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 5
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 101100311260 Caenorhabditis elegans sti-1 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- WMDDNKROYKCDJC-UHFFFAOYSA-N [4-[3-oxo-1-(4-phosphonooxyphenyl)-2-benzofuran-1-yl]phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC(OP(O)(=O)O)=CC=C1C1(C=2C=CC(OP(O)(O)=O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 WMDDNKROYKCDJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940036121 anthrax immunoglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится, в частности, к микробиологии, может быть использовано в медицине и ветеринарии для выявления возбудителя сибирской язвы и его дифференциации при исследованиях объектов внешней среды и инфицированных материалов. Изобретение может найти практическое применение в учреждениях Минздрава, Минобороны, МЧС России, занимающихся вопросами лабораторной диагностики сибирской язвы.The invention relates, in particular, to microbiology, can be used in medicine and veterinary medicine to identify the causative agent of anthrax and its differentiation in studies of environmental objects and infected materials. The invention can find practical application in institutions of the Ministry of Health, the Ministry of Defense, the Ministry of Emergencies of Russia, dealing with laboratory diagnostics of anthrax.
Наличие природных очагов сибирской язвы, ведущее к возникновению спорадических и массовых вспышек сибирской язвы среди сельскохозяйственных животных, приводящих к заболеваниям людей, обуславливает необходимость разработки методов выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы. Для выделения сибиреязвенного микроба из объектов внешней среды существуют различные питательные среды, но лишь немногие из них позволяют проводить его дифференциацию от близкородственных сапрофитов и практически отсутствуют среды для одновременного выделения и разделения капсульных и бескапсульных штаммов В. anthracis.The presence of natural foci of anthrax, leading to the occurrence of sporadic and mass outbreaks of anthrax among farm animals, leading to human diseases, necessitates the development of methods for the isolation and identification of the causative agent of anthrax. To isolate the anthrax microbe from environmental objects, various nutrient media exist, but only a few of them allow its differentiation from closely related saprophytes and there are practically no media for the simultaneous isolation and separation of capsule and capsule-free B. anthracis strains.
Известна диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая, авторы Дармов И.В., Лазыкин А.Г., Строчков Ю.И. и др. - патент на изобретение №2289622. - 2004.Known diagnostic nutrient medium for identification of the causative agent of anthrax is dry, authors Darmov IV, Lazykin AG, Strochkov Yu.I. and others. - patent for the invention No. 2289622. - 2004.
Для дифференциации капсулообразующих и бескапсульных штаммов В. anthracis авторы предложили агаризованную питательную среду на основе ферментативного гидролизата казеина с добавками фенолфталеинфосфата натрия и натрия двууглекислого. Среда позволяет проводить как межвидовую дифференциацию бактерий, так и внутривидовую капсулообразующих и бескапсульных штаммов сибиреязвенного микроба. Однако среда не дает возможности идентификации токсинпродуцирующих штаммов В. anthracis.To differentiate capsule-forming and capsule-free B. anthracis strains, the authors proposed an agarized nutrient medium based on enzymatic casein hydrolyzate with the addition of sodium phenolphthalein phosphate and sodium bicarbonate. The medium allows both interspecific differentiation of bacteria and intraspecific capsule-forming and capsule-free strains of anthrax microbe. However, the medium does not allow the identification of toxin-producing strains of B. anthracis.
Известна плотная питательная среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы (СОПЭК), разработанная в СтавНИПЧИ, которая позволяет выявлять культуры, обладающие капсулообразующей способностью и продуцирующие экзотоксин. Еременко Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus anthracis: Дисс. … док. мед. наук. - Саратов (Ставрополь), 1997. - 275 с. Через 48 ч культивирования в атмосфере CO2 продуцирующие капсулу культуры формируют на питательной среде колонии в SM-форме - округлые, гладкие, блестящие, со слизистым капсульным веществом на поверхности. В мазках из колоний обнаруживаются цепочки капсульных палочек. Не продуцирующие капсулу культуры растут в R-форме в виде шероховатых с волокнистым краем матовых сухих колоний.A dense nutrient medium for the combined determination of exotoxin and capsule production (SOPEC) is developed at StavNIPCHI, which allows the identification of cultures with capsule-forming ability and producing exotoxin. Eremenko E.I. Biological and population aspects of the pathogenicity of Bacillus anthracis: Diss. ... doc. honey. sciences. - Saratov (Stavropol), 1997 .-- 275 p. After 48 hours of cultivation in a CO 2 atmosphere, capsule-producing cultures are formed on a nutrient medium colonies in SM-form - round, smooth, shiny, with a mucous capsule substance on the surface. In smears from colonies, chains of capsule sticks are found. Non-capsule-producing cultures grow in the R-form in the form of dry, frosted, rough, with a fibrous edge, colonies.
Токсинообразование определяют по образованию вокруг колоний концентрических ореолов иммунопреципитации в виде мутно-белых тонких колец. Не продуцирующие токсин колонии лишены таких ореолов.Toxin formation is determined by the formation around the colonies of concentric halos of immunoprecipitation in the form of cloudy-white thin rings. Non-toxin producing colonies lack such halos.
Недостатком указанной среды является сложный состав, включающий 18 аминокислот, соли, агарозу, бикарбонат натрия и иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий (коммерческий). Кроме того, длительность получения результатов затягивается до 5 суток культивирования.The disadvantage of this environment is the complex composition, including 18 amino acids, salts, agarose, sodium bicarbonate and immunoglobulin antisybrilene horse liquid (commercial). In addition, the duration of obtaining the results is delayed up to 5 days of cultivation.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для выделения и дифференциации возбудителя сибирской язвы по способности утилизировать D-сорбит. Патент на изобретение №2125610 Говорунова В.А., Мацаренко Г.В., Маринин Л.И., Степанов А.В. Плотная питательная среда для выявления возбудителя сибирской язвы.Closest to the proposed invention is a nutrient medium for the isolation and differentiation of the causative agent of anthrax by the ability to utilize D-sorbitol. Patent for invention No. 2125610 Govorunova V.A., Matsarenko G.V., Marinin L.I., Stepanov A.V. Dense nutrient medium for identifying the causative agent of anthrax.
По характеру роста и изменению окраски среды вокруг колоний можно дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы возбудителя сибирской язвы от близкородственных споровых сапрофитов.Virulent and avirulent strains of the anthrax pathogen can be differentiated from closely related spore saprophytes by the nature of growth and color change of the medium around the colonies.
Однако капсуло- и токсинообразование на данной среде не выявляются и срок культивирования составляет 36 ч.However, capsule and toxin formation on this medium are not detected and the cultivation period is 36 hours.
Техническим результатом предлагаемой среды является повышение ее дифференцирующих свойств и способность сибиреязвенного микроорганизма продуцировать капсулу и экзотоксин на данной среде.The technical result of the proposed environment is to increase its differentiating properties and the ability of the anthrax microorganism to produce a capsule and exotoxin on this medium.
Технический результат достигается тем, что плотная питательная среда для одновременного капсуло- и токсинообразования содержит питательную основу, агар-агар, ускорители роста - L-аланин и инозин, натрий двууглекислый, натрия хлорид, сыворотку крупного рогатого скота, D-сорбит, бромтимоловый синий. Для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры в среду вводится полимиксина сульфат.The technical result is achieved by the fact that a dense nutrient medium for simultaneous capsule and toxin formation contains a nutrient base, agar-agar, growth accelerators - L-alanine and inosine, sodium bicarbonate, sodium chloride, cattle serum, D-sorbitol, bromothymol blue. To inhibit the growth of concomitant microflora, polymyxin sulfate is introduced into the medium.
Высев исследуемых штаммов (вирулентных, аттенуированных штаммов В. anthracis и близкородственных бактерий) проводят на предлагаемой питательной среде и культивируют при температуре 36±1°С в атмосфере CO2 с последующим учетом образования капсулы через 24-30 ч роста культур.Sowing the studied strains (virulent, attenuated strains of B. anthracis and closely related bacteria) is carried out on the proposed nutrient medium and cultivated at a temperature of 36 ± 1 ° C in a CO 2 atmosphere, followed by capsule formation after 24-30 hours of crop growth.
Для определения образования токсина рядом с колонией выросшей культуры возбудителя сибирской язвы или близкородственных бактерий делают лунки, которые заполняют преципитирующей сибиреязвенной сывороткой или противосибиреязвенным иммуноглобулином. Токсинопродуцирующие культуры образуют линии преципитации. Учет образования токсина проводят через 24 ч.To determine the formation of toxin near the colony of the grown culture of the causative agent of anthrax or closely related bacteria, holes are made that are filled with precipitating anthrax serum or an antisyrera immunoglobulin. Toxin-producing cultures form precipitation lines. Accounting for the formation of toxin is carried out after 24 hours.
Таким образом, время для учета капсуло- и токсинообразования на предлагаемой среде составляет 2-2,5 суток.Thus, the time for accounting for capsule and toxin formation on the proposed medium is 2-2.5 days.
Возможность осуществления заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.The possibility of carrying out the claimed invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Приготовление питательной среды.Example 1. Preparation of a nutrient medium.
В качестве основы берут агаровую питательную среду по Луриа-Бертани. Для приготовления агаровой среды в 1 л дистиллированной воды размешивают 10,0 г пептона (сухого питательного бульона), 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г натрия хлорида, 8,9 г L-аланина, 5,36 г инозина и 15,0 г агар-агара. Подогревают до полного растворения частиц. Среду разливают во флаконы (колбы) по 200 мл и стерилизуют автоклавированием при 1,0 атм (120°С) в течение 20 минут. Готовую среду хранят при температуре +2…8°С.The agar culture medium according to Luria-Bertani is taken as the basis. To prepare the agar medium, 10.0 g of peptone (dry nutrient broth), 5.0 g of yeast extract, 10.0 g of sodium chloride, 8.9 g of L-alanine, 5.36 g of inosine and 15 are stirred in 1 liter of distilled water 0 g agar agar. Heated until the particles are completely dissolved. The medium is poured into 200 ml bottles (flasks) and sterilized by autoclaving at 1.0 atm (120 ° C) for 20 minutes. The finished medium is stored at a temperature of + 2 ... 8 ° C.
Готовят дополнительные ингредиенты:Prepare additional ingredients:
- 20 г D-сорбита вносят в 80 мл стерильной дистиллированной воды, размешивают и кипятят 1-2 минуты.- 20 g of D-sorbitol are added to 80 ml of sterile distilled water, stirred and boiled for 1-2 minutes.
- 1,6 г бромтимолового синего растворяют в 98,4 мл этилового спирта.- 1.6 g of bromothymol blue is dissolved in 98.4 ml of ethyl alcohol.
- инактивируют сыворотку крупного рогатого скота прогреванием при 56°С в течение 30 минут.- inactivate the serum of cattle by heating at 56 ° C for 30 minutes.
- 10% раствор натрия двууглекислого.- 10% sodium bicarbonate solution.
Перед применением агаризованную питательную среду расплавляют на водяной бане, охлаждают до температуры 45-50°С и на 200 мл добавляют 20 мл раствора D-сорбита (конечная концентрация 2%), 0,36 мл бромтимолового синего (0,003%), 20 мл инактивированной сыворотки крупного рогатого скота (20%), 10 мл 10% раствора натрия двууглекислого (1%) и 20000 Ед. полимиксина сульфат. Готовая питательная среда имеет синий с зеленоватым оттенком цвет (рН 7,2-7,4).Before use, the agarized nutrient medium is melted in a water bath, cooled to a temperature of 45-50 ° C and 20 ml of a solution of D-sorbitol (final concentration of 2%), 0.36 ml of bromothymol blue (0.003%), 20 ml of inactivated are added to 200 ml cattle serum (20%), 10 ml of 10% sodium bicarbonate solution (1%) and 20,000 units. polymyxin sulfate. Ready medium is blue with a greenish tint (pH 7.2-7.4).
Пример 2. Использование питательной среды для дифференциации капсулообразующих штаммов В. anthracis и близкородственных сапрофитов (В. cereus).Example 2. The use of a nutrient medium for the differentiation of capsule-forming strains of B. anthracis and closely related saprophytes (B. cereus).
На питательную среду в чашках Петри высевают исследуемую пробу или культуру (В. anthracis штаммы - И-363, 81-1, 47, СТИ-1, 34F2, 52/33, 71/12 и В. cereus штаммы - 95, 160, 127, 1408, в концентрации 1×103/см3) и распределяют по поверхности среды шпателем с целью получения отдельных изолированных колоний. Чашки помещают в эксикатор вместимостью 5 дм3, в котором создают атмосферу CO2. Можно использовать CO2 инкубатор с содержанием углекислоты 10-25%. Через 24 ч культивирования при температуре 36±1°С визуально учитывают результаты по характеру роста микроорганизмов. Колонии капсулообразующих штаммов В. anthracis выпуклые, блестящие, гладкие, округлой формы, слизистой консистенции (SM-форма). В окрашенных по Ребигеру мазках из слизистых колоний палочки, окруженные слоем капсульного вещества. Колонии не образующих капсулу штаммов В. anthracis и штаммов В. cereus белесоватые, плоские, шероховатые, матовые (R-формы). В мазках, окрашенных по Ребигеру - цепочки бескапсульных палочек.The test sample or culture is seeded on a nutrient medium in Petri dishes (B. anthracis strains - I-363, 81-1, 47, STI-1, 34F2, 52/33, 71/12 and B. cereus strains - 95, 160, 127, 1408, at a concentration of 1 × 10 3 / cm 3 ) and distributed over the surface of the medium with a spatula in order to obtain separate isolated colonies. The cups are placed in a desiccator with a capacity of 5 dm 3 in which a CO 2 atmosphere is created. You can use a CO 2 incubator with a carbon dioxide content of 10-25%. After 24 hours of cultivation at a temperature of 36 ± 1 ° C, the results on the pattern of growth of microorganisms are visually taken into account. Colonies of capsule-forming strains of B. anthracis are convex, shiny, smooth, rounded, mucous consistency (SM-form). In Rebiger-stained smears from mucous colonies, rods are surrounded by a layer of capsular substance. Colonies of non-capsule strains of B. anthracis and strains of B. cereus are whitish, flat, rough, dull (R-forms). In smears stained according to Rebiger - chains of capsuleless rods.
Пример 3. Выявление продукции экзотоксина.Example 3. Detection of exotoxin production.
Рядом с колониями выросшей культуры микроорганизмов (В. anthracis штаммы - И-363, 81-1, 47, СТИ-1, 34F2, 52/33, 71/12 и В. cereus штаммы - 95, 160, 127, 1408) на расстоянии 5-7 мм делают луночки, которые заполняют преципитирующей сибиреязвенной сывороткой (ФГУП Орловская биофабрика) или противосибиреязвенным иммуноглобулином. Чашки оставляют при комнатной температуре на 24 ч. При просмотре выявляют сформированные контурированные 1-3 линии преципитации со стороны роста токсинопродуцирующих культур В. anthracis. Линии преципитации отсутствуют со стороны роста не продуцирующих токсин культур В. anthracis, а также культур В. cereus.Near the colonies of the grown culture of microorganisms (B. anthracis strains - I-363, 81-1, 47, STI-1, 34F2, 52/33, 71/12 and B. cereus strains - 95, 160, 127, 1408) on 5-7 mm holes are made in the holes, which are filled with precipitating anthrax serum (FSUE Oryol Biofactory) or anti-anthrax immunoglobulin. The cups are left at room temperature for 24 hours. When viewed, formed formed contour lines 1-3 of precipitation from the growth of toxin-producing cultures of B. anthracis are revealed. Precipitation lines are absent from the growth side of non-toxin-producing B. anthracis cultures, as well as B. cereus cultures.
Таким образом, предлагаемая питательная среда позволяет выявлять типичные сибиреязвенные штаммы и дифференцировать их от близкородственных микроорганизмов по продукции капсулы и экзотоксина. Кроме того, на питательной среде можно проводить внутривидовую дифференциацию сибиреязвенных штаммов по капсуло- и токсинообразованию. Предлагаемую питательную среду испытали при выделении микроорганизмов из инфицированной почвы и трупов животных. Эксперименты показывают не только возможность выделения сибиреязвенного микроба из контаминированных посторонней микрофлорой проб, но и одновременную межштаммовую и межвидовую дифференциацию возбудителя сибирской язвы.Thus, the proposed nutrient medium allows you to identify typical anthrax strains and differentiate them from closely related microorganisms according to the production of capsules and exotoxin. In addition, on a nutrient medium, intraspecific differentiation of anthrax strains by capsule and toxin formation can be carried out. The proposed nutrient medium was tested during the isolation of microorganisms from infected soil and animal corpses. The experiments show not only the possibility of isolating the anthrax microbe from samples contaminated by extraneous microflora, but also the simultaneous inter-strain and interspecific differentiation of the causative agent of anthrax.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016126462A RU2654669C1 (en) | 2016-07-01 | 2016-07-01 | Diagnostic nutrient medium for differentiation of the bacillus anthracis by capsule and toxin formation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016126462A RU2654669C1 (en) | 2016-07-01 | 2016-07-01 | Diagnostic nutrient medium for differentiation of the bacillus anthracis by capsule and toxin formation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2654669C1 true RU2654669C1 (en) | 2018-05-21 |
Family
ID=62202569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016126462A RU2654669C1 (en) | 2016-07-01 | 2016-07-01 | Diagnostic nutrient medium for differentiation of the bacillus anthracis by capsule and toxin formation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2654669C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125610C1 (en) * | 1989-06-21 | 1999-01-27 | Государственный научный центр прикладной микробиологии | Solid nutrient medium for anthrax pathogen detection |
| RU2204607C2 (en) * | 2001-06-08 | 2003-05-20 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Method of identification of bacillus anthracis |
| RU2289622C2 (en) * | 2004-11-09 | 2006-12-20 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Dry diagnostic broth for identification of malignant anthrax exitor |
| RU2376385C1 (en) * | 2008-07-07 | 2009-12-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | METHOD FOR IDENTIFICATION OF Bacillus anthracis WITH DIFFERENTIATION OF STRAINS BY PRODUCTION OF CAPSULE, PROTECTIVE ANTIGEN AND ANTIGENS OF S-LAYER |
-
2016
- 2016-07-01 RU RU2016126462A patent/RU2654669C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125610C1 (en) * | 1989-06-21 | 1999-01-27 | Государственный научный центр прикладной микробиологии | Solid nutrient medium for anthrax pathogen detection |
| RU2204607C2 (en) * | 2001-06-08 | 2003-05-20 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Method of identification of bacillus anthracis |
| RU2289622C2 (en) * | 2004-11-09 | 2006-12-20 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Dry diagnostic broth for identification of malignant anthrax exitor |
| RU2376385C1 (en) * | 2008-07-07 | 2009-12-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | METHOD FOR IDENTIFICATION OF Bacillus anthracis WITH DIFFERENTIATION OF STRAINS BY PRODUCTION OF CAPSULE, PROTECTIVE ANTIGEN AND ANTIGENS OF S-LAYER |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Islam et al. | Isolation and identification of Escherichia coli and Salmonella from poultry litter and feed | |
| Ananthanarayan | Ananthanarayan and Paniker's textbook of microbiology | |
| Cook et al. | Selective medium for culture of Mycoplasma hyopneumoniae | |
| EA021339B1 (en) | Rapid sterility microassay | |
| Salimov et al. | Specific prevention of emphysematous carbuncle of cattle and sheep | |
| Parveen et al. | Characterization of bacterial pathogens from egg shell, egg yolk, feed and air samples of poultry houses | |
| Buncic et al. | Relationship between variations in pathogenicity and lag phase at 37 C of Listeria monocytogenes previously stored at 4 C | |
| CN107743519A (en) | For separate include can not cultivating in conventional medium as mycoplasma species clinical sample culture medium | |
| RU2654669C1 (en) | Diagnostic nutrient medium for differentiation of the bacillus anthracis by capsule and toxin formation | |
| RU2376385C1 (en) | METHOD FOR IDENTIFICATION OF Bacillus anthracis WITH DIFFERENTIATION OF STRAINS BY PRODUCTION OF CAPSULE, PROTECTIVE ANTIGEN AND ANTIGENS OF S-LAYER | |
| RU2388489C1 (en) | Method for preparing vaccine associated against pseudomonosis and enterococcus infection of nutrias | |
| Kaushik | Quick Review Series for B. Sc. Nursing: 2nd Year-E-Book | |
| RU2538158C1 (en) | Method of production of vaccine associated against colibacillosis, streptococcosis and staphylococcosis of cattle | |
| RU2289622C2 (en) | Dry diagnostic broth for identification of malignant anthrax exitor | |
| Sapkota et al. | Prevelance and associated risk factor of escherichia coli from the cases of Poultry at Regional Veterinary Laboratory (RVL) Surkhet, Nepal | |
| RU2580227C1 (en) | Medium for isolation of legionella pneumophila | |
| RU2738858C1 (en) | Method of extracting uncultivated forms of staphylococci | |
| CN108018228B (en) | An Attenuated Escherichia coli O157:H7 Strain and Its Application | |
| RU2841541C1 (en) | Universal culture medium for culturing bacteria based on hydrolyzate of mink carcasses | |
| RU2648160C2 (en) | Nutrient medium for the isolation of bacteria yersinia enterocolitica | |
| RU2788607C1 (en) | Method for obtaining a nutrient medium for the selective detection of candida auris | |
| RU2843376C1 (en) | Aeromonas salmonicida bacteria strain for the biological preparations production for the salmon fishes furunculosis specific prevention | |
| RU2510416C1 (en) | Nutritive medium for extraction of lactobacteria | |
| Rakovskaya et al. | Anti mycoplasmal activity of the concentrate from Trichoderma | |
| RU2123532C1 (en) | Method of selection of anthrax vaccine strain cultures and vaccines prepared of thereof |