RU2650668C1 - Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b - Google Patents
Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2650668C1 RU2650668C1 RU2016148913A RU2016148913A RU2650668C1 RU 2650668 C1 RU2650668 C1 RU 2650668C1 RU 2016148913 A RU2016148913 A RU 2016148913A RU 2016148913 A RU2016148913 A RU 2016148913A RU 2650668 C1 RU2650668 C1 RU 2650668C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- calb
- carrier
- activity
- incubation
- enzyme
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 title claims abstract description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 134
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract description 96
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 14
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 28
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 10
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 62
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 14
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract 1
- 102100021851 Calbindin Human genes 0.000 description 82
- 101000898082 Homo sapiens Calbindin Proteins 0.000 description 82
- 101001021643 Pseudozyma antarctica Lipase B Proteins 0.000 description 82
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 32
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 23
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 23
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 17
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 14
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 10
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012051 hydrophobic carrier Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 5
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010031797 Candida antarctica lipase B Proteins 0.000 description 4
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- WAPNOHKVXSQRPX-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethanol Chemical compound CC(O)C1=CC=CC=C1 WAPNOHKVXSQRPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010084311 Novozyme 435 Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPNGNIFUDRPBFJ-UHFFFAOYSA-N alpha-methylbenzylalcohol Natural products CC1=CC=CC=C1CO XPNGNIFUDRPBFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- FWIVDMJALNEADT-SFTDATJTSA-N (2s)-n-(1-cyanocyclopropyl)-4-fluoro-4-methyl-2-[[(1s)-2,2,2-trifluoro-1-[4-(4-methylsulfonylphenyl)phenyl]ethyl]amino]pentanamide Chemical compound C1=CC([C@H](N[C@@H](CC(C)(F)C)C(=O)NC2(CC2)C#N)C(F)(F)F)=CC=C1C1=CC=C(S(C)(=O)=O)C=C1 FWIVDMJALNEADT-SFTDATJTSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVIBNURMYIXLCU-UHFFFAOYSA-N 2-[[2,3-bis(ethenyl)phenyl]methyl]prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)CC1=CC=CC(C=C)=C1C=C XVIBNURMYIXLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 241000038463 Adesmia candida Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100273064 Brassica oleracea var. botrytis CAL-B gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 101710098556 Lipase A Proteins 0.000 description 1
- 101710098554 Lipase B Proteins 0.000 description 1
- 108010048733 Lipozyme Proteins 0.000 description 1
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 description 1
- QOSMNYMQXIVWKY-UHFFFAOYSA-N Propyl levulinate Chemical compound CCCOC(=O)CCC(C)=O QOSMNYMQXIVWKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl ether Chemical compound CC(C)(C)OC(C)(C)C AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N lipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC1CCSS1 FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229950009755 odanacatib Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ULSIYEODSMZIPX-UHFFFAOYSA-N phenylethanolamine Chemical class NCC(O)C1=CC=CC=C1 ULSIYEODSMZIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к получению гетерогенных биокатализаторов (БК) для процессов биокаталитической трансформации органических соединений, в том числе протекающих в неводных средах, а именно биокатализатора на основе липазы Candida antarctica фракции В (CALB).The invention relates to the production of heterogeneous biocatalysts (BC) for the processes of biocatalytic transformation of organic compounds, including those occurring in non-aqueous media, namely a biocatalyst based on Candida antarctica fraction B lipase (CALB).
Липаза дрожжей Candida antarctica фракции В является ферментом, имеющим большое прикладное значение. Высокая стерео- и позиционная селективность CALB позволяет использовать ее для направленных трансформаций органических соединений, являющихся полупродуктами синтеза лекарственных препаратов, где особо важна чистота получаемых веществ. Способность данного фермента работать в гетерогенных системах (на границе раздела фаз) и в фазе органических растворителей делает его незаменимым при трансформации и получении соединений, обладающих высокой растворимостью в неводных системах.Candida antarctica fraction B yeast lipase is an enzyme of great practical importance. The high stereo- and positional selectivity of CALB allows its use for directed transformations of organic compounds, which are intermediates in the synthesis of drugs, where the purity of the resulting substances is especially important. The ability of this enzyme to work in heterogeneous systems (at the interface) and in the phase of organic solvents makes it indispensable in the transformation and preparation of compounds with high solubility in non-aqueous systems.
Обязательным условием практического применения CALB в технологических процессах является иммобилизация фермента с целью создания гетерогенного биокатализатора, пригодного для многократного использования и обладающего высокой эффективностью в целевых процессах и хорошей операционной стабильностью. При этом источником фермента должен служить высокопродуктивный рекомбинантный штамм.An indispensable condition for the practical application of CALB in technological processes is the immobilization of the enzyme in order to create a heterogeneous biocatalyst that is suitable for repeated use and has high efficiency in the target processes and good operational stability. In this case, a highly productive recombinant strain should serve as the source of the enzyme.
Известно использование для иммобилизации CALB носителей, обладающих высокой гидрофобностью за счет гидрофобной природы матрицы [1-6], либо за счет гидрофобизации поверхности гидрофильного или слабо гидрофобного носителя [7-10]. Гидрофобная адсорбция CALB на таких носителях из водных растворов, содержащих фермент, является широко используемым способом иммобилизации CALB. К достоинствам способа следует отнести его простоту и, как правило, высокую стабильность получаемых биокатализаторов в органических растворителях. Коммерческий биокатализатор Novozym 435®, представляющий собой рекомбинантную CALB, гидрофобно адсорбированную на полиметакрилатном носителе Lewatit® VP ОС 1600, сохраняет 60% активности после инкубации в толуоле при 95°C в течение 24 часов. CALB, иммобилизованная путем адсорбции на полиметакритном носителе, поверхность которого гидрофобизована прививкой октадецильных групп, полностью сохраняет активность после инкубации в 50% водном растворе диоксана при комнатной температуре в течение 200 часов [8].It is known to use carriers for immobilization of CALB with high hydrophobicity due to the hydrophobic nature of the matrix [1-6], or due to hydrophobization of the surface of a hydrophilic or weakly hydrophobic carrier [7-10]. The hydrophobic adsorption of CALB on such carriers from aqueous solutions containing the enzyme is a widely used method for immobilizing CALB. The advantages of the method include its simplicity and, as a rule, the high stability of the resulting biocatalysts in organic solvents. The Novozym 435® commercial biocatalyst, which is a recombinant CALB hydrophobically adsorbed on a Lewatit® VP OS 1600 polymethacrylate carrier, retains 60% activity after incubation in toluene at 95 ° C for 24 hours. CALB immobilized by adsorption on a polymethacryt support, the surface of which is hydrophobized by grafting of octadecyl groups, remains fully active after incubation in a 50% aqueous solution of dioxane at room temperature for 200 hours [8].
Синтетазная (по синтезу пропиллаурата) активность биокатализатора Novozym 435® составляет 10000 ПЛЕ/г сух. БК [6]. Более высокая синтетазная активность достигнута путем адсорбционной иммобилизации CALB на носителе Lifetech™ ECR 1030М, представляющем собой сополимер дивинилбензола с метакрилатом - 12000 ПЛЕ/г сух. БК [3]. Другие известные способы иммобилизации CALB путем адсорбции на гидрофобных носителях обеспечивают получение биокатализаторов с худшим уровнем активности: на макропористом полистирольном носителе - 3450 ПЛЕ/г сух. БК [4]; на макропористом полипропиленовом носителе Accurel® ЕР 100 - 4900 ПЛЕ/г сух. БК [1] или 6200 ПЛЕ/г сух. БК [2].The synthetic (according to the synthesis of propylaurate) activity of the Novozym 435® biocatalyst is 10,000 PLE / g dry. BC [6]. Higher synthetase activity was achieved by adsorption immobilization of CALB on a Lifetech ™ ECR 1030M carrier, which is a copolymer of divinylbenzene with methacrylate - 12000 PLE / g dry. BC [3]. Other known methods of immobilization of CALB by adsorption on hydrophobic carriers provide biocatalysts with the worst level of activity: on a macroporous polystyrene carrier - 3450 PLE / g dry. BC [4]; on a macroporous polypropylene carrier Accurel® EP 100 - 4900 PLE / g dry. BK [1] or 6200 PLE / g dry. BC [2].
Главным недостатком биокатализаторов, получаемых адсорбционной иммобилизацией CALB является обратимость связывания целевого фермента и других белков, приводящая в определенных условиях к падению активности БК и загрязнению продуктов биокаталитической трансформации, что ограничивает возможности применения адсорбционно-иммобилизованной CALB. Такие БК абсолютно непригодны для использования в присутствии поверхностно-активных веществ и в водных средах с высокой ионной силой. В определенных условиях наблюдается также смывание CALB с носителя и загрязнение реакционной смеси органическими соединениями в ионных жидкостях и органических растворителях, являющихся средой для биокаталитических трансформаций, катализируемых данных ферментом [7, 11, 12]. Проблема достижения необратимой фиксации, адсорбционно-иммобилизованной CALB, может быть решена путем ковалентной сшивки адсорбированного фермента с помощью бифункционального реагента.The main disadvantage of biocatalysts obtained by adsorption immobilization of CALB is the reversibility of the binding of the target enzyme and other proteins, leading under certain conditions to a decrease in BK activity and contamination of biocatalytic transformation products, which limits the possibility of using adsorption-immobilized CALB. Such BCs are absolutely unsuitable for use in the presence of surfactants and in aqueous media with high ionic strength. Under certain conditions, CALB is also washed off from the carrier and the reaction mixture is contaminated with organic compounds in ionic liquids and organic solvents, which are the medium for biocatalytic transformations catalyzed by these enzymes [7, 11, 12]. The problem of achieving irreversible fixation, adsorption-immobilized CALB, can be solved by covalent crosslinking of the adsorbed enzyme using a bifunctional reagent.
Известен способ получения биокатализатора, обладающего активностью в денатурирующих ионных жидкостях, путем адсорбции CALB на макропористом полипропиленовом носителе Accurel ЕР100, дополнительного осаждения фермента в виде агрегатов 2-пропанолом и последующей ковалентной сшивки агрегированной CALB глутаровым альдегидом (ГА) в водно-органической среде с содержанием 2-пропанола 75% (об/об) [13].A known method of producing a biocatalyst having activity in denaturing ionic liquids by adsorption of CALB on a macroporous polypropylene carrier Accurel EP100, additional precipitation of the enzyme in the form of aggregates with 2-propanol and subsequent covalent crosslinking of aggregated CALB with glutaraldehyde (HA) in an aqueous-2 content -propanol 75% (v / v) [13].
Известен также способ получения биокатализатора для процессов кинетического разделения рацематов 1-фенилэтанола или 1-фенилэтаноламина при их энантиоселективном ацилировании трет-бутанолом [7]. Для адсорбции CALB используют гидрофильный мезопористый силикагель, поверхность которого модифицируют путем прививки фенильных и аминоалкильных групп под действием соответствующих производных силана. Исходя их водного раствора CALB, фермент осаждают ацетоном в виде ферментных агрегатов с одновременной адсорбцией на гидрофобизованной поверхности носителя и ковалентной сшивкой белковых молекул друг с другом и с носителем через первичные аминогруппы в водно-органической среде с содержанием ацетона 75% (об/об). Уровень активности получаемого таким образом БК в форме адсорбционно-ковалентно иммобилизованной CALB, измеренный в отношении энантиоселективной этерефикации 1-фенилэтанола трет-бутиловым эфиром, составляет 50-70% от активности CALB, гидрофобно-адсорбированной на соответствующем носителе. При этом адсорбционно-ковалентно иммобилизованная CALB сохраняет 80% своей исходной активности после инкубации в 2% растворе детергента Тритон Х-100, в то время как гидрофобно-адсорбированная CALB практически полностью инактивируется. К недостаткам данного способа получения БК в форме адсорбционно-ковалентно иммобилизованной CALB [7] следует отнести его сложность, а также значительные потери активности при процедуре ковалентной сшивки фермента, возможно, за счет ее осуществления в водно-органической среде и/или из-за диффузионных ограничений для доступа субстратов к крупным ферментным агрегатам, адсорбированным в порах носителя.There is also known a method for producing a biocatalyst for the kinetic separation of 1-phenylethanol or 1-phenylethanolamine racemates during their enantioselective acylation with tert-butanol [7]. Hydrophilic mesoporous silica gel is used to adsorb CALB, the surface of which is modified by grafting phenyl and aminoalkyl groups under the action of the corresponding silane derivatives. Starting from their aqueous solution of CALB, the enzyme is precipitated with acetone in the form of enzyme aggregates with simultaneous adsorption on the hydrophobized surface of the support and covalent crosslinking of the protein molecules with each other and with the support through primary amino groups in an aqueous-organic medium with an acetone content of 75% (v / v). The activity level of the thus obtained BC in the form of adsorption-covalently immobilized CALB, measured in relation to the enantioselective esterification of 1-phenylethanol with tert-butyl ether, is 50-70% of the activity of CALB hydrophobically adsorbed on an appropriate carrier. At the same time, adsorption-covalently immobilized CALB retains 80% of its initial activity after incubation in a 2% solution of Triton X-100 detergent, while hydrophobic-adsorbed CALB is almost completely inactivated. The disadvantages of this method of obtaining BC in the form of adsorption-covalently immobilized CALB [7] include its complexity, as well as significant loss of activity during the procedure of covalent crosslinking of the enzyme, possibly due to its implementation in an aqueous-organic medium and / or due to diffusion restrictions on access of substrates to large enzyme aggregates adsorbed in the pores of the carrier.
Наиболее близким к заявляемому способу получения гетерогенного биокатализатора является способ иммобилизации CALB путем адсорбции на гидрофобном носителе - сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite® Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [3]. Согласно ближайшему аналогу процедура иммобилизации состоит в следующем.The closest to the claimed method of producing a heterogeneous biocatalyst is a method CALB immobilization by adsorption to a hydrophobic carrier - divinylbenzene copolymer, and methacrylate manufactured by Purolite ® Life Sciences under the designation 1030M Lifetech ™ ECR [3]. According to the closest analogue, the immobilization procedure is as follows.
Для иммобилизации используют CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme® CALB L, компания Novozymes) с удельной гидролазной (липазной) активностью (по гидролизу трибутирина)1 (1 За международную единицу ферментативной (гидролазной, липазной) активности образца CALB в реакции гидролиза трибутирина (1 ЛЕ) принимают такое количество препарата, которое катализирует образование 1 мкмоля масляной кислоты в минуту в стандартных условиях, а именно в 0,1 М водной эмульсии трибутирина при рН 7,0 и температуре (30±1)°C.) 330 ЛЕ/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.For immobilization, CALB is used in the form of an aqueous solution (commercial preparation Lipozyme ® CALB L, Novozymes company) with specific hydrolase (lipase) activity (for the hydrolysis of tributyrin) 1 ( 1 per international unit of enzymatic (hydrolase, lipase) activity of the CALB sample in the hydrolysis of tributyrin (1 LU) take an amount of the drug that catalyzes the formation of 1 μmol of butyric acid per minute under standard conditions, namely in 0.1 M aqueous emulsion of tributyrin at pH 7.0 and a temperature of (30 ± 1) ° C.) 330 LU / mg protein. Before use, a pH of 7.5 is adjusted in the CALB solution and the solution with the carrier is incubated with stirring overnight. Then the external solution was separated by vacuum filtration, the carrier with adsorbed CALB was washed once with 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, and dried in a stream of nitrogen.
Получаемые образцы биокатализатора характеризуют по синтетазной активности в отношении синтеза пропиллаурата2 (2 За международную единицу ферментативной (синтетазной) активности образца CALB в реакции синтеза пропиллаурата (1 ПЛЕ) принимают такое количество препарата, которое катализирует образование 1 мкмоля продукта в минуту в стандартных условиях, а именно в расплаве, содержащем 40 ммолей лауриловой кислоты и 40 ммолей н-пропилового спирта, при температуре (60±1)°C.).The resulting biocatalyst samples are characterized by synthetase activity in relation to the synthesis of propillaurate 2 ( 2 For the international unit of enzymatic (synthetase) activity of the CALB sample in the reaction of the synthesis of propylaurate (1 PLE), take such an amount of the drug that catalyzes the formation of 1 μmol of product per minute under standard conditions, and it is in a melt containing 40 mmol of lauryl acid and 40 mmol of n-propyl alcohol at a temperature of (60 ± 1) ° C.).
Лучший результат по активности получаемого таким образом БК достигнут при использовании нагрузки по белку - Qprot=160 мг белка/г сух. носителя. Полученный в этих условиях биокатализатор в форме гидрофобно-адсорбированной CALB обладает синтетазной активностью АБК=12000 ПЛЕ/г сух. БК.The best result in the activity of BC obtained in this way was achieved when using a protein load - Q prot = 160 mg protein / g dry. carrier. The biocatalyst obtained under these conditions in the form of a hydrophobically adsorbed CALB has synthetase activity A BK = 12000 PLE / g dry. BC.
При снижении нагрузки на носитель вдвое (Qprot=80 мг белка/г сух. носителя) получен БК с синтетазной активностью АБК=10250 ПЛЕ/г сух. БК.With a decrease in the load on the carrier by half (Q prot = 80 mg protein / g dry. Carrier), BK with synthetase activity was obtained A BK = 10250 PLE / g dry. BC.
Основными недостатками способа ближайшего аналога являются:The main disadvantages of the closest analogue method are:
- отсутствие необратимого связывания CALB, которое в определенных условиях может повлечь за собой падение активности БК и загрязнение продуктов биокаталитической трансформации, а также- the absence of irreversible binding of CALB, which under certain conditions can lead to a decrease in the activity of CD and contamination of biocatalytic transformation products, as well as
- недостаточно высокая ферментативная активность.- insufficiently high enzymatic activity.
Воспроизведение способа иммобилизации CALB согласно ближайшему аналогу с использованием концентрата культуральной жидкости, продуцируемой рекомбинантным штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4298, обладающего удельной гидролазной (липазной) активностью 350 ЛЕ/мг белка (Пример 5), позволило получить биокатализатор с активностью по синтезу пропиллаурата АБК=11100 ПЛЕ/г сухого БК. Инкубация этого БК в растворе детергента приводит к практически полной потере синтетазной активности (Пример 7, №4 в Таблице 2), что свидетельствует об обратимости связывания CALB с дивинил-бензол-метакрилатным полимерным носителем Lifetech™ ECR 1030М при использовании способа иммобилизации CALB согласно ближайшему аналогу.Playback immobilization method CALB according to the closest analogue with concentrate the culture fluid, produced by a recombinant strain of Pichia pastoris VKPM Y-4298 having a specific hydrolase (lipase) activity of 350 LU / mg protein (Example 5) allowed to obtain a biocatalyst with activity on the synthesis propillaurata A BC = 11100 PLE / g dry BC. Incubation of this BC in the detergent solution leads to an almost complete loss of synthetase activity (Example 7, No. 4 in Table 2), which indicates the reversibility of the binding of CALB to the divinyl-benzene-methacrylate polymer carrier Lifetech ™ ECR 1030M using the CALB immobilization method according to the closest analogue .
Задача заявляемого изобретения - создание способа получения биокатализатора, обладающего высокой активностью и высокой термической стабильностью в среде органических растворителей, а также характеризующегося необратимым связыванием CALB в биокатализаторе.The objective of the invention is the creation of a method for producing a biocatalyst having high activity and high thermal stability in an environment of organic solvents, as well as characterized by irreversible binding of CALB in the biocatalyst.
Поставленную задачу решают путем совокупного использования в процессе получения биокатализатора приемов адсорбционной и ковалентной иммобилизации CALB, а именно путем избирательной адсорбции CALB на гидрофобном макропористом носителе, осуществляемой при инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка, и последующей ковалентной сшивке (модификации) адсорбированного фермента глутаровым альдегидом (ГА), добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%, осуществляя модификацию в течение 30-120 мин.The problem is solved by the combined use of adsorption and covalent immobilization of CALB in the process of obtaining the biocatalyst, namely, by selective adsorption of CALB on a hydrophobic macroporous carrier, carried out by incubation of carrier particles in an aqueous concentrate of the culture fluid of the Pichia pastoris yeast strain VKPM Y-4298 with specific enzyme activity not less than 350 LE / mg of protein, and subsequent covalent cross-linking (modification) of the adsorbed enzyme with glutaraldehyde (HA), added directly primarily in the incubation suspension to a final concentration of 1.0-2.5%, carrying out modification within 30-120 minutes.
Согласно заявляемому способу исходным материалом для процедуры адсорбционно-ковалентной иммобилизации CALB служит водный концентрат культуральной жидкости (КЖ), продуцируемой рекомбинантным штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4298, несущим ген липазы из Candida antarctica фракции В, который может быть получен, например, методом мембранной фильтрации культуральной жидкости. В качестве носителей для иммобилизации CALB используют полимерные материалы, обладающие развитой (за счет макропористой структуры) гидрофобной поверхностью. При этом гидрофобность поверхности носителя обеспечена или за счет гидрофобной природы полимерной матрицы (например, макропористый полистирол или сополимеры дивинилбензола и метакрилата), или за счет модификации поверхности полимера привитыми гидрофобными остатками (например, октадецил-полиметакрилат).According to the claimed method, the starting material for the adsorption-covalent immobilization procedure of CALB is an aqueous concentrate of culture fluid (CL) produced by the recombinant strain Pichia pastoris VKPM Y-4298 carrying the lipase gene from Candida antarctica fraction B, which can be obtained, for example, by the method of membrane filtration culture fluid. As carriers for immobilization of CALB, polymeric materials are used that have a developed (due to macroporous structure) hydrophobic surface. The hydrophobicity of the surface of the carrier is ensured either due to the hydrophobic nature of the polymer matrix (for example, macroporous polystyrene or copolymers of divinylbenzene and methacrylate), or due to the modification of the polymer surface with grafted hydrophobic residues (for example, octadecyl-polymethacrylate).
В качестве сшивающего агента для ковалентной фиксации гидрофобно-адсорбированной CALB используют бифункциональный реагент глутаровый альдегид, способный взаимодействовать с аминогруппами на поверхности белка, в первую очередь с первичными аминогруппами лизина, с образованием внутри- и межмолекулярных сшивок [14]. Модификация аминогрупп лизина не оказывает негативного действия на активность получаемого биокатализатора, так как большая часть доступных остатков лизина локализована в гидрофильных зонах поверхности белковой глобулы CALB вдали от активного центра фермента [15, 16], что позволяет вовлекать их в процессы модификации и ковалентной сшивки без существенных потерь ферментативной активности в том случае, если процесс протекает в мягких условиях.As a crosslinking agent for covalent fixation of hydrophobically adsorbed CALB, a bifunctional reagent glutaraldehyde is used, which is able to interact with amino groups on the surface of a protein, primarily with primary amino groups of lysine, with the formation of intra- and intermolecular cross-links [14]. Modification of the amino groups of lysine does not adversely affect the activity of the obtained biocatalyst, since most of the available lysine residues are located in the hydrophilic zones of the surface of the protein globule CALB far from the active center of the enzyme [15, 16], which allows them to be involved in the processes of modification and covalent crosslinking without significant loss of enzymatic activity in the event that the process proceeds under mild conditions.
Применение для иммобилизации CALB гидрофобных носителей обеспечивает избирательность адсорбции целевого белка, обладающего, как все липазы, природным сродством к гидрофобным поверхностям [17]: в растворе после адсорбции фермента, согласно заявляемому способу, отсутствует активность CALB, при этом остаточное содержание в нем белка составляет 15-20% от концентрации в исходном концентрате КЖ. Кроме того, молекула CALB, связанная силами гидрофобного взаимодействия, принимает открытую конформацию, открывающую доступ субстратов к активному центру фермента [18, 19]. Фиксация активной формы белка ковалентными связями за счет сшивки адсорбированной CALB глутаровым альдегидом обеспечивает необратимое связывание фермента в биокатализаторе, высокую активность и стабильность получаемого БК.The use of hydrophobic carriers for immobilization of CALB ensures selectivity of adsorption of the target protein, which, like all lipases, has a natural affinity for hydrophobic surfaces [17]: in the solution after adsorption of the enzyme, according to the claimed method, there is no CALB activity, while the residual protein content in it is 15 -20% of the concentration in the initial concentrate QOL. In addition, the CALB molecule, bound by hydrophobic interaction forces, takes an open conformation, which allows access of substrates to the active center of the enzyme [18, 19]. Fixation of the active form of the protein by covalent bonds due to crosslinking of the adsorbed CALB with glutaraldehyde ensures irreversible binding of the enzyme in the biocatalyst, high activity and stability of the resulting BK.
Способ в общем видеThe method in General
Адсорбцию CALB на гидрофобном носителе осуществляют путем инкубации аликвоты носителя в концентрате культуральной жидкости, продуцируемой рекомбинантным штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4298, несущим ген липазы из Candida antarctica фракции В. Процедуру проводят при рН 6,0÷8,0; температуре (20÷30)°C и умеренной скорости перемешивания, обеспечивающей отсутствие пенообразования. Соотношение между массой носителя и объемом КЖ задают, исходя из нагрузки по белку на носитель Qprot=150÷250 мг белка/г сух. носителя. Время инкубации при адсорбции CALB на носителе τинк=6÷24 часа.The adsorption of CALB on a hydrophobic carrier is carried out by incubating an aliquot of the carrier in a culture fluid concentrate produced by the recombinant strain Pichia pastoris VKPM Y-4298 carrying the lipase gene from Candida antarctica fraction B. The procedure is carried out at pH 6.0 ÷ 8.0; temperature (20 ÷ 30) ° C and moderate mixing speed, ensuring the absence of foaming. The ratio between the mass of the carrier and the volume of QOL is set based on the load on the protein on the carrier Q prot = 150 ÷ 250 mg of protein / g dry. carrier. The incubation time during adsorption of CALB on the carrier τ Inc. = 6 ÷ 24 hours.
Сшивку (модификацию) адсорбированной CALB глутаровым альдегидом осуществляют в водной среде, а именно непосредственно в реакционной смеси, полученной в результате процедуры адсорбции, без отделения носителя, несущего адсорбированный фермент, от внешнего раствора. В реакционную смесь через 6-24 часа добавляют водный раствор глутарового альдегида в объеме, необходимом для создания концентрации сшивающего агента СГА=1,0÷2,5%, и продолжают инкубацию реакционной смеси в тех же условиях, в которых осуществлялась адсорбция CALB на носителе. Время сшивки (модификации) адсорбированной CALB глутаровым альдегидом τмод=30÷120 мин.The crosslinking (modification) of the adsorbed CALB with glutaraldehyde is carried out in an aqueous medium, namely, directly in the reaction mixture obtained as a result of the adsorption procedure, without separating the carrier carrying the adsorbed enzyme from the external solution. After 6-24 hours, an aqueous solution of glutaraldehyde is added to the reaction mixture in an amount necessary to create a concentration of a crosslinking agent C HA = 1.0–2.5%, and incubation of the reaction mixture is continued under the same conditions under which CALB was adsorbed on carrier. The crosslinking time (modification) of the adsorbed CALB with glutaraldehyde is τ mod = 30 ÷ 120 min.
Биокатализатор в форме адсорбционно-ковалентно иммобилизованной CALB отделяют от внешнего раствора вакуумной фильтрацией и отмывают водой от не связанных с носителем веществ. Полученный влажный биокатализатор обезвоживают ацетоном и удаляют летучие вещества под вакуумом.A biocatalyst in the form of adsorption-covalently immobilized CALB is separated from the external solution by vacuum filtration and washed with water from non-carrier substances. The resulting wet biocatalyst is dehydrated with acetone and the volatiles are removed under vacuum.
Биокатализатор на основе CALB, полученный согласно заявляемому способу, обладает синтетазной активностью (в отношении синтеза пропиллаурата) 18000÷25000 ПЛЕ/г сух. БК, что превосходит активность БК, полученного согласно ближайшему аналогу, в 1,5-2,5 раза (10250÷12000 ПЛЕ/г сух. БК). При этом он толерантен к воздействию органических растворителей при высоких температурах (см. таблицу 1 в Примере 6).The biocatalyst based on CALB, obtained according to the claimed method, has synthetase activity (in relation to the synthesis of propillaurate) 18000 ÷ 25000 PLE / g dry. BC, which exceeds the activity of BC obtained according to the closest analogue, by 1.5-2.5 times (10250 ÷ 12000 PLE / g dry. BC). Moreover, it is tolerant to the effects of organic solvents at high temperatures (see table 1 in Example 6).
Кроме того, фермент в биокатализаторе, получаемом согласно заявляемому способу, связан необратимо, что продемонстрировано в Примере 7, где показано, что БК в форме адсорбционно-ковалентно иммобилизованной CALB, полностью сохраняет синтетазную активность после инкубации в растворе детергента, в то время как БК, полученный при воспроизведении способа согласно ближайшему аналогу (Пример 5), практически полностью ее теряет (см. таблицу 2 в Примере 7).In addition, the enzyme in the biocatalyst obtained according to the claimed method is irreversibly bound, as shown in Example 7, where it is shown that BK in the form of adsorption-covalently immobilized CALB fully retains synthetase activity after incubation in a detergent solution, while BK, obtained when reproducing the method according to the closest analogue (Example 5), almost completely loses it (see table 2 in Example 7).
Сопоставление активности биокатализаторов в форме гидрофобно-адсорбированной CALB (Пример 4) и полученного способом адсорбционно-ковалентной иммобилизации (Пример 3) позволяет заключить, что процедура сшивки глутаровым альдегидом согласно заявляемому способу осуществляется без потери активности БК. Сохранение активности является следствием мягких условий проведения процесса (водная среда, комнатная температура), а также того, что предварительно адсорбированный фермент равномерно распределен по развитой поверхности носителя (в отличие от одновременной адсорбции и сшивки ферментных агрегатов CALB в водно-органической среде, согласно способу, описанному в [7], когда возможны диффузионные ограничения для доступа субстратов к крупным ферментным агрегатам, адсорбированным в порах носителя).A comparison of the activity of biocatalysts in the form of hydrophobic-adsorbed CALB (Example 4) and obtained by the adsorption-covalent immobilization method (Example 3) allows us to conclude that the crosslinking procedure with glutaraldehyde according to the claimed method is carried out without loss of activity of BC. The preservation of activity is a consequence of the mild conditions of the process (aqueous medium, room temperature), as well as the fact that the pre-adsorbed enzyme is evenly distributed over the developed surface of the carrier (in contrast to the simultaneous adsorption and crosslinking of CALB enzyme aggregates in an aqueous-organic medium, according to the method described in [7], when diffusion restrictions are possible for access of substrates to large enzyme aggregates adsorbed in the pores of the support).
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами осуществления способа.The invention is illustrated by the following examples of the method.
Исходные образцы ферментного препарата CALB в форме жидкого концентрата культуральной жидкости характеризуют по гидролазной (липазной активности) в отношении гидролиза трибутирина (1,2,3-масляного эфира глицерина), эмульгированного в водной среде, в стандартных условиях, а именно 0,01 М фосфатно-натриевый буфер, рН 7,0; 0,1 М трибутирина, (30±1)°C. Процесс гидролиза осуществляют в водной эмульсии трибутирина, фиксируя количество образующейся масляной кислоты титриметрическим методом при постоянном рН с использованием в качестве титранта 0,1 М раствора гидроокиси натрия.The initial samples of the enzyme preparation CALB in the form of a liquid concentrate of the culture fluid are characterized by hydrolase (lipase activity) in relation to the hydrolysis of tributyrin (1,2,3-oil glycerol ester), emulsified in an aqueous medium, under standard conditions, namely 0.01 M phosphate Sodium buffer, pH 7.0; 0.1 M tributyrin, (30 ± 1) ° C. The hydrolysis process is carried out in an aqueous emulsion of tributyrin, fixing the amount of butyric acid formed by the titrimetric method at a constant pH using a 0.1 M sodium hydroxide solution as a titrant.
Получаемые гетерогенные биокатализаторы характеризуют по синтетазной активности в отношении синтеза пропилового эфира лауриловой кислоты (пропиллаурата, ПЛ) путем этерификации лауриловой кислоты (ЛК) 1-пропанолом (н-пропиловым спиртом, ПС) в стандартных условиях, а именно в расплаве, содержащем 40 ммолей лауриловой кислоты и 40 ммолей н-пропилового спирта, при температуре (60±1)°C. Активность определяют по начальной скорости реакции синтеза при глубине трансформации ЛК в ПС не более 15%. Количество образовавшегося продукта ПЛ и остаточное содержание ЛК в реакционной смеси определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).The resulting heterogeneous biocatalysts are characterized by their synthetase activity with respect to the synthesis of lauryl acid propyl ester (propillaurate, PL) by esterification of lauryl acid (LA) with 1-propanol (n-propyl alcohol, PS) under standard conditions, namely in a melt containing 40 mmol of lauryl acid acid and 40 mmoles of n-propyl alcohol, at a temperature of (60 ± 1) ° C. The activity is determined by the initial rate of the synthesis reaction at a depth of transformation of LA in PS no more than 15%. The amount of the resulting PL product and the residual LC content in the reaction mixture are determined by high performance liquid chromatography (HPLC).
Содержания сухих веществ в образцах носителя и гетерогенного биокатализатора определяли весовым методом после высушивания образцов до постоянной массы при температуре (105±1)°C.The solids content in the samples of the carrier and heterogeneous biocatalyst was determined by the gravimetric method after drying the samples to constant mass at a temperature of (105 ± 1) ° C.
Определение содержания белка в ферментных препаратах проводят спектрофотометрическим методом по реакции с реактивом Бредфорд по стандартной методике (Инструкции фирмы "SIGMA" - производителя реактива Bradford) с использованием калибровочной кривой, построенной по отношению к стандартному белку - бычьему сывороточному альбумину.Determination of protein content in enzyme preparations is carried out spectrophotometrically by reaction with the Bradford reagent according to the standard method (Instructions from SIGMA, the manufacturer of the Bradford reagent) using a calibration curve plotted against a standard protein, bovine serum albumin.
Стабильность биокатализатора в органических растворителях при заданной температуре характеризуют по относительной остаточной активности образца БК после его инкубации в соответствующих условиях.The stability of the biocatalyst in organic solvents at a given temperature is characterized by the relative residual activity of the BC sample after its incubation under appropriate conditions.
Устойчивость биокатализатора к вымыванию целевого фермента характеризуют по относительной остаточной активности образца БК после его инкубации в растворе детергента Тритон Х-100.The biocatalyst resistance to leaching of the target enzyme is characterized by the relative residual activity of the BC sample after its incubation in the solution of the Triton X-100 detergent.
Пример 1. Осуществление заявляемого способа с использованием в качестве носителя макропористого сополимера дивинилбензола и метакрилатаExample 1. The implementation of the proposed method using as a carrier a macroporous copolymer of divinylbenzene and methacrylate
Иммобилизацию осуществляют в четырех колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл (реакционные колбы), помещенных на круговую термостатируемую качалку при перемешивании 100 об/мин.Immobilization is carried out in four Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml (reaction flasks), placed on a circular thermostatically controlled rocking chair with stirring at 100 rpm.
Для иммобилизации используют концентрат культуральной жидкости, продуцируемой рекомбинантным штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4298, полученный методом мембранной фильтрации, со следующими характеристиками:For immobilization using a concentrate of culture fluid produced by the recombinant strain Pichia pastoris VKPM Y-4298, obtained by membrane filtration, with the following characteristics:
- гидролазная активность (по гидролизу трибутирина) - 2220 ЛЕ/мл;- hydrolase activity (by the hydrolysis of tributyrin) - 2220 LE / ml;
- содержание белка - 4,0 мг белка/мл;- protein content - 4.0 mg protein / ml;
- удельная гидролазная активность - 555 ЛЕ/мг белка.- specific hydrolase activity - 555 LU / mg protein.
Перед использованием в концентрате КЖ устанавливают рН 7,0±0,1.Before use in the concentrate, QL is adjusted to pH 7.0 ± 0.1.
Шарики макропористого сополимера дивинилбензола и метакрилата (Lifetech™ ECR1030M, компания Purolite® Life Sciences) промывают 0,05 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,0, отделяя промывные воды вакуумной фильтрацией.Divinylbenzene macroporous copolymer beads methacrylate (Lifetech ™ ECR1030M, the company Purolite ® Life Sciences) were washed with 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, separating the washings by vacuum filtration.
- Содержание сухих веществ в носителе: 41,9%.- Solids content in the carrier: 41.9%.
Адсорбцию CALB на носителе осуществляют при рН 7,0±0,1, температуре (20±1)°C в течение времени инкубации τинк=6 часов с использованием нагрузки на носитель по белку Qprot=160 мг белка/г сух. носителя.The adsorption of CALB on the carrier is carried out at pH 7.0 ± 0.1, temperature (20 ± 1) ° C during the incubation time τ Inc. = 6 hours using the carrier load on the protein Q prot = 160 mg protein / g dry. carrier.
В каждую из четырех реакционных колб помещают по 6,6 г влажного промытого носителя и добавляют по 110 мл концентрата КЖ с рН 7,0±0,1. Колбы помещают на качалку и инкубируют при (20±1)°C в течение 6 часов.In each of the four reaction flasks, 6.6 g of wet washed carrier are added and 110 ml of QOL concentrate with a pH of 7.0 ± 0.1 are added. The flasks are placed on a rocking chair and incubated at (20 ± 1) ° C for 6 hours.
Модификацию (сшивку) адсорбированной CALB глутаровым альдегидом осуществляют при концентрации сшивающего агента в реакционной смеси СГА=1,5%, время модификации составляет 30 мин.Modification (crosslinking) of the adsorbed CALB with glutaraldehyde is carried out at a concentration of a crosslinking agent in the reaction mixture With GA = 1.5%, the modification time is 30 minutes.
В каждую из четырех реакционных колб, где проводят адсорбцию CALB, добавляют по 7,0 мл 25% водного раствора ГА и продолжают инкубацию реакционной смеси на качалке в течение еще 30 минут в тех же условиях, в которых осуществлялась адсорбция CALB на носителе.To each of the four reaction flasks where CALB adsorption is carried out, 7.0 ml of a 25% aqueous HA solution is added and the reaction mixture is further incubated on a rocking chair for another 30 minutes under the same conditions under which the CALB adsorption on the support was carried out.
Биокатализатор в форме адсорбционно-ковалентно иммобилизованной CALB отделяют от внешнего раствора вакуумной фильтрацией на пористом стеклянном фильтре и прямо на фильтре промывают дистиллированной водой до бесцветных и прозрачных промывных вод. Влажный БК, находящийся на фильтре, обезвоживают путем трехкратной промывки ацетоном с отделением отработанного растворителя вакуумной фильтрацией. Летучие вещества из биокатализатора удаляют под вакуумом при комнатной температуре до содержания сухих веществ в БК βБК=(95±2)%.A biocatalyst in the form of adsorption-covalently immobilized CALB is separated from the external solution by vacuum filtration on a porous glass filter and washed directly on the filter with distilled water to colorless and transparent washings. Wet BC, located on the filter, is dehydrated by triple washing with acetone with separation of the spent solvent by vacuum filtration. Volatiles from the biocatalyst are removed under vacuum at room temperature to a solids content in BC β BK = (95 ± 2)%.
Получено 15,4 г обезвоженного биокатализатора со следующими характеристиками:Received 15.4 g of dehydrated biocatalyst with the following characteristics:
- содержание сухих веществ: βБК=96,1%;- solids content: β BC = 96.1%;
- синтетазная (по синтезу пропиллаурата) активность: АБК=17840 ПЛЕ/г сух. БК.- synthetase (according to the synthesis of propillaurate) activity: A BC = 17840 PLE / g dry. BC.
Пример 2. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием в качестве носителя макропористого полистиролаExample 2. The implementation of the proposed method for producing a biocatalyst using macroporous polystyrene as a carrier
Иммобилизацию CALB осуществляют, как описано в Примере 1, с той разницей, что в качестве носителя используют макропористый полистирол (Lifetech™ ECR1090F, компания Purolite® Life Sciences).Immobilization of CALB was performed as described in Example 1, except that used as a carrier macroporous polystyrene (Lifetech ™ ECR1090F, the company Purolite ® Life Sciences).
- Содержание сухих веществ в носителе: 28,0%.- Solids content in the carrier: 28.0%.
Адсорбцию CALB на носителе проводят в условиях Примера 1, но в течение времени инкубации τинк=24 часа внося в каждую реакционную колбу, содержащую 110 мл концентрата КЖ, по 6,3 г влажного носителя, то есть с использованием нагрузки на носитель по белку Qprot=250 мг белка/г сух. носителя.The adsorption of CALB on the carrier was carried out under the conditions of Example 1, but during the incubation time τ inc = 24 hours, 6.3 g of a wet carrier were added to each reaction flask containing 110 ml of QOL concentrate, i.e. using the Q load on the carrier prot = 250 mg protein / g dry carrier.
Сшивку (модификацию) адсорбированной CALB глутаровым альдегидом осуществляют в условиях Примера 1, но с использованием концентрации сшивающего агента в реакционной смеси СГА=2,5% (по 12 мл 25% водного раствора ГА в каждую реакционную колбу) в течение времени модификации τмод=120 мин.The crosslinking (modification) of the adsorbed CALB with glutaraldehyde is carried out under the conditions of Example 1, but using the concentration of the crosslinking agent in the reaction mixture With HA = 2.5% (12 ml of a 25% aqueous solution of HA in each reaction flask) during the modification time τ mod = 120 minutes
Получено 10,1 г обезвоженного биокатализатора со следующими характеристиками:Received 10.1 g of dehydrated biocatalyst with the following characteristics:
- содержание сухих веществ: βБК=96,8%;- solids content: β BC = 96.8%;
- синтетазная (по синтезу пропиллаурата) активность: АБК=19320 ПЛЕ/г сух. БК.- synthetase (according to the synthesis of propillaurate) activity: A BC = 19320 PLE / g dry. BC.
Пример 3. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием в качестве носителя макропористого октадецил-полиметакрилатаExample 3. The implementation of the proposed method for producing a biocatalyst using a macroporous octadecyl polymethacrylate as a carrier
Иммобилизацию CALB осуществляют, как описано в Примере 1, с той разницей, что в качестве носителя используют макропористый октадецил-полиметакрилат (Lifetech™ ECR8806F, компания Purolite® Life Sciences).CALB immobilization was performed as described in Example 1, except that used as a carrier octadecyl macroporous polymethacrylate (Lifetech ™ ECR8806F, the company Purolite ® Life Sciences).
- Содержание сухих веществ в носителе: 34,2%.- Solids content in the carrier: 34.2%.
Адсорбцию CALB на носителе проводят в условиях Примера 1, но в течение времени инкубации τинк=23 часа, внося в каждую реакционную колбу, содержащую 110 мл концентрата КЖ, по 6,5 г влажного носителя, то есть с использованием нагрузки на носитель по белку Qprot=200 мг белка/г сух. носителя.The adsorption of CALB on the carrier is carried out under the conditions of Example 1, but during the incubation time τ Inc. = 23 hours, introducing 6.5 g of a wet carrier into each reaction flask containing 110 ml of QOL concentrate, i.e. using a protein load on the carrier Q prot = 200 mg protein / g dry carrier.
Модификацию адсорбированной CALB глутаровым альдегидом осуществляют в условиях Примера 1, но с использованием концентрации сшивающего агента в реакционной смеси СГА=1,0% (по 4,7 мл 25% водного раствора ГА в каждую реакционную колбу) в течение времени модификации τмод=60 мин.Modification of the adsorbed CALB with glutaraldehyde is carried out under the conditions of Example 1, but using the concentration of a crosslinking agent in the reaction mixture With HA = 1.0% (4.7 ml of a 25% aqueous solution of HA in each reaction flask) during the modification time τ mod = 60 min
Получено 12,4 г обезвоженного биокатализатора со следующими характеристиками:Received 12.4 g of dehydrated biocatalyst with the following characteristics:
- содержание сухих веществ: βБК=95,9%;- solids content: β BC = 95.9%;
- синтетазная (по синтезу пропиллаурата) активность: АБК=24840 ПЛЕ/г сух. БК.- synthetase (according to the synthesis of propillaurate) activity: A BC = 24840 PLE / g dry. BC.
Пример 4. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора в форме CALB, гидрофобно-адсорбированной на макропористом октадецил-полиметакрилатеExample 4. The implementation of the proposed method for producing a biocatalyst in the form of CALB hydrophobically adsorbed on macroporous octadecyl polymethacrylate
Адсорбцию CALB на носителе Lifetech™ ECR8806F проводят, как это описано в соответствующей части Примера 3. Стадию ковалентной сшивки не осуществляют.The adsorption of CALB on a Lifetech ™ ECR8806F carrier is carried out as described in the corresponding part of Example 3. The covalent crosslinking step is not carried out.
Биокатализатор в форме гидрофобно-адсорбированной CALB отделяют от внешнего раствора вакуумной фильтрацией, однократно промывают дистиллированной водой, а затем обезвоживают ацетоном и высушивают, как это описано в соответствующей части Примера 1.The hydrophobic adsorbed CALB biocatalyst is separated from the external solution by vacuum filtration, washed once with distilled water, and then dried with acetone and dried, as described in the corresponding part of Example 1.
Получено 11,0 г обезвоженного биокатализатора со следующими характеристиками:Received 11.0 g of dehydrated biocatalyst with the following characteristics:
- содержание сухих веществ: βБК=94,8%;- solids content: β BC = 94.8%;
- синтетазная (по синтезу пропиллаурата) активность: АБК=23960 ПЛЕ/г сух. БК.- synthetase (according to the synthesis of propillaurate) activity: A BC = 23960 PLE / g dry. BC.
Пример 5. Контроль. Осуществление способа получения биокатализатора на основе CALB согласно ближайшему аналогу с использованием концентрата культуральной жидкости, продуцируемой рекомбинантным штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4298.Example 5. Control. The implementation of the method of producing a biocatalyst based on CALB according to the closest analogue using a concentrate of culture fluid produced by the recombinant strain Pichia pastoris VKPM Y-4298.
Для иммобилизации используют концентрат культуральной жидкости, продуцируемой рекомбинантным штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4298, полученный методом мембранной фильтрации, со следующими характеристиками:For immobilization using a concentrate of culture fluid produced by the recombinant strain Pichia pastoris VKPM Y-4298, obtained by membrane filtration, with the following characteristics:
- гидролазная активность (по гидролизу трибутирина) - 1620 ЛЕ/мл;- hydrolase activity (by the hydrolysis of tributyrin) - 1620 LU / ml;
- содержание белка - 4,6 мг белка/мл;- protein content - 4.6 mg protein / ml;
- удельная гидролазная активность - 350 ЛЕ/мг белка.- specific hydrolase activity - 350 LU / mg protein.
Перед использованием в концентрате культуральной жидкости устанавливают рН 7,5±0,1.Before use, the pH of the culture fluid is adjusted to pH 7.5 ± 0.1.
В качестве носителя используют макропористый сополимер дивинилбензола и метакрилата (Lifetech™ ECR1030M, компания Purolite® Life Sciences). Носитель промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, отделяя промывные воды вакуумной фильтрацией.The support used is a macroporous copolymer of methacrylate and divinylbenzene (Lifetech ™ ECR1030M, the company Purolite ® Life Sciences). The carrier is washed with 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, and the washings are separated by vacuum filtration.
- Содержание сухих веществ в носителе: 40,2%.- Solids content in the carrier: 40.2%.
Адсорбцию CALB осуществляют в четырех колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл (реакционные колбы), помещенных на круговую термостатируемую качалку при перемешивании 100 об/мин в следующих операционных условиях: рН 7,5±0,1; температура (20±1)°C; нагрузка на носитель по белку Qprot=160 мг белка/г сух. носителя; время инкубации τинк=16 часов. В каждую из четырех реакционных колб помещают по 7,9 г влажного промытого носителя и добавляют по 110 мл концентрата КЖ с рН 7,5±0,1 и инкубируют колбы на качалке.The adsorption of CALB is carried out in four Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml (reaction flasks) placed on a circular thermostatically controlled rocking chair with stirring at 100 rpm under the following operating conditions: pH 7.5 ± 0.1; temperature (20 ± 1) ° C; protein carrier load Q prot = 160 mg protein / g dry. carrier; incubation time τ Inc. = 16 hours. In each of the four reaction flasks, 7.9 g of wet washed carrier are added and 110 ml of QOL concentrate with a pH of 7.5 ± 0.1 are added and the flasks are incubated on a rocking chair.
По окончании процедуры адсорбции внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, а носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.At the end of the adsorption procedure, the external solution is separated by vacuum filtration, and the carrier with adsorbed CALB is washed once with 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, and dried in a stream of nitrogen.
Способ получения биокатализатора гидрофобно-адсорбированной CALB согласно ближайшему аналогу не предусматривает ковалентную сшивку адсорбированного фермента.The method for producing a biocatalyst of hydrophobically adsorbed CALB according to the closest analogue does not provide for covalent crosslinking of the adsorbed enzyme.
Получено 19,1 г обезвоженного биокатализатора со следующими характеристиками:Received 19.1 g of dehydrated biocatalyst with the following characteristics:
- содержание сухих веществ: βБК=94,1%;- solids content: β BC = 94.1%;
- синтетазная (по синтезу пропиллаурата) активность: АБК=11910 ПЛЕ/г сух. БК.- synthetase (according to the synthesis of propillaurate) activity: A BC = 11910 PLE / g dry. BC.
Пример 6. Стабильность полученных заявляемым способом биокатализаторов в органических растворителяхExample 6. The stability obtained by the claimed method of biocatalysts in organic solvents
Стабильность образцов биокатализаторов на основе CALB в органических растворителях при заданной температуре характеризуют по относительной остаточной активности образца БК после его инкубации в заданных условиях.The stability of CALB-based biocatalyst samples in organic solvents at a given temperature is characterized by the relative residual activity of the BC sample after incubation under specified conditions.
Аликвоту обезвоженного образца БК (300 мг) с известной синтетазной активностью заливают органическим растворителем (5 мл) и инкубируют на качалке при заданной температуре (60°C или 95°C) в течение необходимого времени. Органический растворитель отделяют вакуумной фильтрацией, а образец БК промывают ацетоном и высушивают под вакуумом. В образце БК после инкубации определяют синтетазную активность. Относительную остаточную активность образца БК после его инкубации в заданных условиях (Аотн, %) рассчитывают как отношение синтетазной активности БК после инкубации (в пересчете на сухой вес) к исходной синтетазной активности образца (в пересчете на сухой вес).An aliquot of the dehydrated BK sample (300 mg) with known synthetase activity was poured with an organic solvent (5 ml) and incubated on a shaker at a given temperature (60 ° C or 95 ° C) for the required time. The organic solvent was separated by vacuum filtration, and the BC sample was washed with acetone and dried under vacuum. After incubation, the synthetase activity is determined in the CD sample. The relative residual activity of the BK sample after its incubation under specified conditions (A rel ,%) is calculated as the ratio of the synthetase activity of the BK after incubation (in terms of dry weight) to the initial synthetase activity of the sample (in terms of dry weight).
Пример 7. Устойчивость полученных биокатализаторов на основе CALB к вымыванию целевого ферментаExample 7. The resistance of the obtained biocatalysts based on CALB to leaching of the target enzyme
Устойчивость биокатализатора к вымыванию целевого фермента характеризуют по относительной остаточной активности образца БК после его инкубации в растворе детергента.The biocatalyst resistance to leaching of the target enzyme is characterized by the relative residual activity of the BC sample after its incubation in the detergent solution.
Аликвоту обезвоженного образца БК (300 мг) с известной синтетазной активностью заливают 2,5% раствором детергента Тритон Х-100 в 0,05 М фосфатно-натриевом буфере, рН 7,0 (5 мл) и инкубируют на качалке при заданной температуре 20°C в течение 3 часов. Внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, а образец БК промывают водой, затем ацетоном и высушивают под вакуумом. В образце БК после инкубации определяют синтетазную активность. Относительную остаточную активность образца БК после его инкубации в заданных условиях (Аотн, %) рассчитывают как отношение синтетазной активности БК после инкубации (в пересчете на сухой вес) к исходной синтетазной активности образца (в пересчете на сухой вес).An aliquot of the dehydrated BK sample (300 mg) with known synthetase activity is poured with a 2.5% solution of Triton X-100 detergent in 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.0 (5 ml) and incubated on a shaker at a given temperature of 20 ° C for 3 hours. The external solution was separated by vacuum filtration, and the BC sample was washed with water, then with acetone, and dried under vacuum. After incubation, the synthetase activity is determined in the CD sample. The relative residual activity of the BK sample after its incubation under specified conditions (A rel ,%) is calculated as the ratio of the synthetase activity of the BK after incubation (in terms of dry weight) to the initial synthetase activity of the sample (in terms of dry weight).
Таким образом, разработан способ получения биокатализатора путем адсорбционно-ковалентной иммобилизации CALB, состоящий в физической адсорбции фермента из водного раствора на гидрофобном носителе и последующей ковалентной сшивки адсорбированной CALB. Биокатализатор в форме адсорбционно-ковалентно иммобилизованной CALB обезвоживают и высушивают до содержания сухих веществ (95±2)%, что делает его пригодным для использования в биокаталитических процессах, протекающих в среде органических растворителей.Thus, a method for producing a biocatalyst by adsorption-covalent immobilization of CALB has been developed, consisting in the physical adsorption of the enzyme from an aqueous solution on a hydrophobic carrier and subsequent covalent crosslinking of the adsorbed CALB. The biocatalyst in the form of adsorption-covalently immobilized CALB is dehydrated and dried to a dry matter content of (95 ± 2)%, which makes it suitable for use in biocatalytic processes occurring in an environment of organic solvents.
Способ позволяет получать биокатализатор с синтетазной активностью (в отношении синтеза пропиллаурата) 18000÷25000 ПЛЕ/г сух. БК, обладающий высокой термической стабильностью в среде органических растворителей и толерантный к обработке раствором детергента в водной среде, что свидетельствует о необратимости связывания CALB в биокатализаторе.The method allows to obtain a biocatalyst with synthetase activity (in relation to the synthesis of propillaurate) 18000 ÷ 25000 PLE / g dry. BC, which has high thermal stability in an environment of organic solvents and is tolerant to treatment with a solution of detergent in an aqueous medium, which indicates the irreversibility of the binding of CALB in the biocatalyst.
Преимущества заявляемого способа получения БК:The advantages of the proposed method for obtaining BC:
- ферментативная активность в 1,5-2,5 раза выше, чем у ближайшего аналога;- enzymatic activity is 1.5-2.5 times higher than that of the closest analogue;
- высокая термическая стабильность в органических растворителях;- high thermal stability in organic solvents;
- необратимость связывания целевого фермента (устойчивость к вымыванию) многократно выше, чем у ближайшего аналога (98-99% остаточной активности по сравнению с 0,8-1,4%).- the irreversibility of binding of the target enzyme (resistance to leaching) is many times higher than that of the closest analogue (98-99% of residual activity compared to 0.8-1.4%).
Источники информацииInformation sources
1. US 5773266 (1998) Immobilized lipases on a dry, porous particulate hydrophobic support and containing a non-ionic surfactant.1. US 5773266 (1998) Immobilized lipases on a dry, porous particulate hydrophobic support and containing a non-ionic surfactant.
2. WO 9015868 (1990) IMMOBILIZED LIPASE PREPARATION AND USE THEREOF FOR ESTER SYNTHESIS.2. WO 9015868 (1990) IMMOBILIZED LIPASE PREPARATION AND USE THEREOF FOR ESTER SYNTHESIS.
3. Basso A., Froment L., Hesseler M., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115 - P. 468-472.3. Basso A., Froment L., Hesseler M., Serban S. New highly robust divinyl benzene / acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013 .-- V. 115 - P. 468-472.
4. Ferrario, V. Lipases Immobilization for Effective Synthesis of Biodiesel Starting from Coffee Waste Oils / V. Ferrario, H. Veny, E. De Angelis, L. Navarini, C. Ebert, L. Gardossi // Biomolecules. - 2013. - V. 3. - P. 514-534.4. Ferrario, V. Lipases Immobilization for Effective Synthesis of Biodiesel Starting from Coffee Waste Oils / V. Ferrario, H. Veny, E. De Angelis, L. Navarini, C. Ebert, L. Gardossi // Biomolecules. - 2013. - V. 3. - P. 514-534.
5. Wang W., Zhou W., Li J., Hao D., Su Z., Ma G. Comparison of covalent and physical immobilization of lipase in gigaporous polymeric microspheres // Bioproc. Biosyst. Eng. - 2015. - V. 38 - P. 2107-2115.5. Wang W., Zhou W., Li J., Hao D., Su Z., Ma G. Comparison of covalent and physical immobilization of lipase in gigaporous polymeric microspheres // Bioproc. Biosyst. Eng. - 2015.- V. 38 - P. 2107-2115.
6. Poojairi Y., Clarson S.J. Thermal stability of Candida Antarctica lipase В immobilized on macroporous acrylic resin in organic media // Biocatal. Agricul. Biotech. - 2013. - V. 2. - P. 7-113.6. Poojairi Y., Clarson S.J. Thermal stability of Candida Antarctica lipase B immobilized on macroporous acrylic resin in organic media // Biocatal. Agricul. Biotech - 2013. - V. 2. - P. 7-113.
7. Boros Z., Weiser D., Markus M., Abahaziova E., Magyar A., Tomin A., Koczka В., Kovacs P., Poppe L. Hydrophobic adsorption and covalent immobilization of Candida antarctica lipase В on mixed-function-grafted silica gel supports for continuous-flow biotransformations // Proc. Biochem. - 2013. - V. 48. - P. 1039-1047.7. Boros Z., Weiser D., Markus M., Abahaziova E., Magyar A., Tomin A., Koczka B., Kovacs P., Poppe L. Hydrophobic adsorption and covalent immobilization of Candida antarctica lipase B on mixed- function-grafted silica gel supports for continuous-flow biotransformations // Proc. Biochem. - 2013. - V. 48. - P. 1039-1047.
8. Palomo J.M., Munoz G., Fernández-Lorente G., Mateo C., Fernández-Lafuente R., Guisán J.M. Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-Sepabeads): immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases // J. Mol. Catal. B: Enz. - 2002. - V. 19-20. - P. 279-286.8. Palomo J.M., Munoz G., Fernández-Lorente G., Mateo C., Fernández-Lafuente R., Guisán J.M. Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-Sepabeads): immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases // J. Mol. Catal. B: Enz. - 2002. - V. 19-20. - P. 279-286.
9. Truppo M.D., Hughes G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. // Org. Process Res. Dev. - 2011. - V. 15. - P. 1033-1035.9. Truppo M.D., Hughes G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. // Org. Process res. Dev. - 2011. - V. 15. - P. 1033-1035.
10. Hernandez К., Fernandez-Lafuente R. Lipase В from Candida antarctica immobilized on octadecyl Sepabeads: A very stable biocatalyst in the presence of hydrogen peroxide. // Process Biochem. - 2011. - V. 46. - P. 873-878.10. Hernandez K., Fernandez-Lafuente R. Lipase B from Candida antarctica immobilized on octadecyl Sepabeads: A very stable biocatalyst in the presence of hydrogen peroxide. // Process Biochem. - 2011. - V. 46. - P. 873-878.
11. Chen В., Hu J., Miller E.M., Xie W., Cai M., Gross R.A. Candida antarctica lipase В chemically immobilized on epoxy-activated micro- and nanobeads: catalysts for polyester synthesis // Biomacromolecules. - 2008. - V. 9. - P. 463-471.11. Chen B., Hu J., Miller E.M., Xie W., Cai M., Gross R.A. Candida antarctica lipase B chemically immobilized on epoxy-activated micro- and nanobeads: catalysts for polyester synthesis // Biomacromolecules. - 2008. - V. 9. - P. 463-471.
12. Zhao H., Song Z. Migration of reactive trace compounds from Novozym® 435 into organic solvents and ionic liquids // Biochem. Eng. J. - 2010. - V. 49. - P. 113-118.12. Zhao H., Song Z. Migration of reactive trace compounds from Novozym® 435 into organic solvents and ionic liquids // Biochem. Eng. J. - 2010. - V. 49. - P. 113-118.
13. Ruiz Toral A., de los
14. Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M. J., Waldron K.C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking (Review). // BioTechniques - 2004. - V. 37, №5 - P. 790-802.14. Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M. J., Waldron K.C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking (Review). // BioTechniques - 2004. - V. 37, No. 5 - P. 790-802.
15. Uppenberg J., Hansen M.T., Patkar S., Jones T.A. The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase В from Candida Antarctica // Structure. - 1994. - V. 2. - P. 293-308.15. Uppenberg J., Hansen M.T., Patkar S., Jones T.A. The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida Antarctica // Structure. - 1994. - V. 2. - P. 293-308.
16. Basso A., Braiuca P., Cantone S., Ebert C., Paolo Linda P., Spizzo P., Caimi P., Hanefeld U., Giuliano Degrassi G., Gardossi L. In Silico Analysis of Enzyme Surface and Glycosylation Effect as a Tool for Efficient Covalent Immobilisation of CalB and PGA on Sepabeads® // Adv. Synth. Catal. - 2007. - V. 349 - P. 877-886.16. Basso A., Braiuca P., Cantone S., Ebert C., Paolo Linda P., Spizzo P., Caimi P., Hanefeld U., Giuliano Degrassi G., Gardossi L. In Silico Analysis of Enzyme Surface and Glycosylation Effect as a Tool for Efficient Covalent Immobilization of CalB and PGA on Sepabeads® // Adv. Synth. Catal. - 2007. - V. 349 - P. 877-886.
17. Miled N., Beisson F., de Caro J., de Caro A., Arondel V., Verger R. Interfacial catalysis by lipases // J. Mol. Catal. B. Enzym. - 2001. - V. 11. - P. 65-171.17. Miled N., Beisson F., de Caro J., de Caro A., Arondel V., Verger R. Interfacial catalysis by lipases // J. Mol. Catal. B. Enzym. - 2001. - V. 11. - P. 65-171.
18. Ericsson D.J., Kasrayan A., Johansson P., Bergfors Т., Sandstrom A.G., Backvall J.E., Mowbray S.L. X-ray structure of Candida Antarctica lipase A shows a novel lid structure and a likely mode of interfacial activation // J. Mol. Biol. - 2008. - V. 376. - P. 109-119.18. Ericsson D.J., Kasrayan A., Johansson P., Bergfors T., Sandstrom A.G., Backvall J.E., Mowbray S.L. X-ray structure of Candida Antarctica lipase A shows a novel lid structure and a likely mode of interfacial activation // J. Mol. Biol. - 2008. - V. 376. - P. 109-119.
19. Skjot M., de Maria L., Chatterjee R., Svendsen A., Patkar S.A., Ostergraad P.R., Brask J. Understanding the plasticity of the alpha/beta hydrolase fold: Lid swapping on the Candida antarctica lipase В results in chimeras with interesting biocatalytic properties // ChemBioChem - 2009 - V. 10 - P. 520-527.19. Skjot M., de Maria L., Chatterjee R., Svendsen A., Patkar SA, Ostergraad PR, Brask J. Understanding the plasticity of the alpha / beta hydrolase fold: Lid swapping on the Candida antarctica lipase B results in chimeras with interesting biocatalytic properties // ChemBioChem - 2009 - V. 10 - P. 520-527.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148913A RU2650668C1 (en) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148913A RU2650668C1 (en) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2650668C1 true RU2650668C1 (en) | 2018-04-16 |
Family
ID=61976764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016148913A RU2650668C1 (en) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2650668C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818272C1 (en) * | 2023-07-26 | 2024-04-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on cation-exchange fibres “вион кн-1” in h-form |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2381273C2 (en) * | 2008-03-04 | 2010-02-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Method for production of heterogeneous biocatalyst, biocatalyst based on hydrolase of alpha-aminoacid ethers and method for synthesis of aminobeta-lactam antibiotic under action of this biocatalyst |
| RU2535893C1 (en) * | 2013-08-20 | 2014-12-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Method for obtaining heterogenic biocatalyst based on hydrolase of esters of alpha aminoacids, heterogenic biocatalyst obtained by such method, and synthesis method of aminobeta-lactam antibiotic under action of this heterogenic biocatalyst |
-
2016
- 2016-12-13 RU RU2016148913A patent/RU2650668C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2381273C2 (en) * | 2008-03-04 | 2010-02-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Method for production of heterogeneous biocatalyst, biocatalyst based on hydrolase of alpha-aminoacid ethers and method for synthesis of aminobeta-lactam antibiotic under action of this biocatalyst |
| RU2535893C1 (en) * | 2013-08-20 | 2014-12-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Method for obtaining heterogenic biocatalyst based on hydrolase of esters of alpha aminoacids, heterogenic biocatalyst obtained by such method, and synthesis method of aminobeta-lactam antibiotic under action of this heterogenic biocatalyst |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BASSO A., FROMENT L., HESSELER M., SERBAN S., New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB, Eur. J. Lipid Sci Technol, 2013, v.115, N. 4, p. 468-472. * |
| SHIM S.E., YANG S., JUNG H., CHOE S., Thermally robust crosslinked poly(methyl methacrylate-co-divinylbenzene) microspheres by precipitation polymerization, Macromolecular research, 2004, v.12, N.2, p.233-239. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818272C1 (en) * | 2023-07-26 | 2024-04-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on cation-exchange fibres “вион кн-1” in h-form |
| RU2823329C1 (en) * | 2023-07-26 | 2024-07-22 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on anion-exchange resins av-16-gs and an-12p in oh-form |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brena et al. | Immobilization of enzymes: a literature survey | |
| Brena et al. | Immobilization of enzymes: a literature survey | |
| Hanefeld et al. | Understanding enzyme immobilisation | |
| Cunha et al. | Preparation of core–shell polymer supports to immobilize lipase B from Candida antarctica: effect of the support nature on catalytic properties | |
| Cao | Carrier-bound immobilized enzymes: principles, application and design | |
| Bai et al. | Covalent immobilization of triacylglycerol lipase onto functionalized nanoscale SiO2 spheres | |
| Kallenberg et al. | Immobilization of penicillin G acylase: the key to optimum performance | |
| Miletić et al. | Immobilization of biocatalysts for enzymatic polymerizations: possibilities, advantages, applications | |
| Cui et al. | Hybrid cross-linked lipase aggregates with magnetic nanoparticles: a robust and recyclable biocatalysis for the epoxidation of oleic acid | |
| JP6908653B2 (en) | Immobilized protein and its use | |
| Guisan et al. | Preparation of new lipases derivatives with high activity–stability in anhydrous media: adsorption on hydrophobic supports plus hydrophilization with polyethylenimine | |
| Rekuć et al. | Very stable silica-gel-bound laccase biocatalysts for the selective oxidation in continuous systems | |
| Panzavolta et al. | Acetylenic polymers as new immobilization matrices for lipolytic enzymes | |
| Chaubey et al. | Arthrobacter sp. lipase immobilization on magnetic sol–gel composite supports for enantioselectivity improvement | |
| Nagy et al. | Bisepoxide-activated hollow silica microspheres for covalent immobilization of lipase from Burkholderia cepacia | |
| RU2650668C1 (en) | Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b | |
| Kurjatschij et al. | Production and properties of threonine aldolase immobilisates | |
| Tambe et al. | Macroporous poly (vinyl acetate-co-divinyl benzene) copolymer beads as adsorptive support for the direct immobilization of candida antarctica lipase B | |
| Peper et al. | Immobilization and characterization of benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida on spherical silica carrier | |
| Bhushan et al. | Macroporous beads for lipase immobilization: kinetic resolution of a racemic drug intermediate | |
| Vlakh et al. | The preparation and study of the properties of macroporous monolith-based continuous flow bioreactors | |
| HK40026961A (en) | Immobilized proteins and use thereof | |
| Kukreja et al. | Underlining some important aspects behind the role of enzyme immobilization in pharmaceutical technology | |
| NABI et al. | Enzymatic transesterification between sugar alcohol and oils | |
| da Costa Teodoro et al. | Immobilization of Biotechnologically Important Candida rugosa Lipase onto Commercial Matrices |