RU2648161C2 - Method of obtaining the antibody, which specifically binds the domain of the her2/neu excellular part of the her2/neu oncoprotein, in the plant, the antibody, which is obtained by means of this method and its application - Google Patents
Method of obtaining the antibody, which specifically binds the domain of the her2/neu excellular part of the her2/neu oncoprotein, in the plant, the antibody, which is obtained by means of this method and its application Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648161C2 RU2648161C2 RU2016112466A RU2016112466A RU2648161C2 RU 2648161 C2 RU2648161 C2 RU 2648161C2 RU 2016112466 A RU2016112466 A RU 2016112466A RU 2016112466 A RU2016112466 A RU 2016112466A RU 2648161 C2 RU2648161 C2 RU 2648161C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- promoter
- mosaic virus
- terminator
- rna
- vector
- Prior art date
Links
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 title 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 92
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 84
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 63
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 35
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 claims abstract description 29
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims abstract description 22
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 94
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 65
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 63
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 52
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 52
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 41
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 41
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 35
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 claims description 23
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 20
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 16
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 16
- 101000773403 Arabidopsis thaliana Actin-2 Proteins 0.000 claims description 15
- 101000799418 Arabidopsis thaliana Actin-7 Proteins 0.000 claims description 15
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 14
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 13
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 13
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 2
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 claims description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N lapatinib Chemical compound O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims 1
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 21
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- VPRLICVDSGMIKO-UHFFFAOYSA-N Mannopine Natural products NC(=O)CCC(C(O)=O)NCC(O)C(O)C(O)C(O)CO VPRLICVDSGMIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 11
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 4
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000415246 Callisia navicularis Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000009607 mammography Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 102100031102 C-C motif chemokine 4 Human genes 0.000 description 1
- 101100054773 Caenorhabditis elegans act-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 229920004011 Macrolon® Polymers 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101100102871 Mus musculus Was gene Proteins 0.000 description 1
- 241000862464 Nicotiana excelsior Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229940100514 Syk tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 1
- 241000710155 Turnip yellow mosaic virus Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/13—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для создания растений - суперпродуцентов антител, в частности против HER2/neu-позитивных раковых клеток. Настоящее изобретение может быть использовано для диагностики и лечения рака молочной железы.The invention relates to biotechnology, genetic engineering and medicine and can be used to create plants - superproducers of antibodies, in particular against HER2 / neu-positive cancer cells. The present invention can be used for the diagnosis and treatment of breast cancer.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Каждый год рак молочной железы (РМЖ) убивает больше чем 500000 женщин во всем мире (WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014). Примерно у 30% больных РМЖ, так называемых HER2-позитивных и наиболее опасных форм рака, наблюдается суперпродукция онкобелка HER2 (от Human Epidermal growth factor Receptor 2), представляющего собой трансмембранную тирозиновую протеинкиназу ErbB2 с мол. массой 185 кДа. Аномальная активность HER2 вызывает ускоренное метастазирование и устойчивость к терапевтическому воздействию (Ahmed et al., 2015). Успех в лечении РМЖ связан с тем, что несколько лет назад в медицинскую практику был введен трастузумаб, созданный фирмой Дженентек (Genentech, США) и производимый фирмой Хоффман-Ля Рош (Hoffman La Roche, Швейцария). Это лекарство создано на основе гуманизированных моноклональных антител (MA) (huMab4D5-8 или rhuMabHer2), производимых мышиной гибридомой АТСС CRL-10463 из коллекции штаммов микроорганизмов и клеточных культур США (Hudziak et al., 1989) (Harries and Smith, 2002). Антитело, введенное в кровоток пациента, взаимодействует с внеклеточный частью HER2/neu и угнетает деление раковых клеток, редко сопровождающееся разрушением раковых клеток. В комбинации с химиотерапией антитела huMab4D5-8 оказывают выраженный лечебный эффект (Hudis, 2007). Показано, что использование трастузумаба снижает риск развития отдаленных метастазов и увеличивает продолжительность жизни пациентов (Hudis, 2007). Однако способ лечения трастузумабом имеет ряд недостатков. Обычно MA получают в культуре животных клеток, а это чаще всего опухолевые клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, СНО). Вообще, продукция белка в животных клетках сопряжена с риском контаминации продуктами и патогенами животного происхождения, такие как ретровирусы и прионы. Другим существенным недостатком является высокая стоимость MA, которая включает инновационные издержки, а также затраты на оборудование, систему поддержания стерильности, а также системы сертификации и контроля сред, использующих продукты животного происхождения и увеличивающих риск загрязнения препарата MA прионами и вирусами. Этим объясняется высокая стоимость лечения HER2/neu-позитивного РМЖ с использованием MA. Она составляет не менее 70000 долларов США для лечения РМЖ с применением трастузумаба (Fleck, 2006)(Macedo et al., 2010).Every year, breast cancer (BC) kills more than 500,000 women worldwide (WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014). In about 30% of breast cancer patients, the so-called HER2-positive and most dangerous forms of cancer, superproduction of HER2 oncoprotein (from Human Epidermal growth factor Receptor 2) is observed, which is an ErbB2 transmembrane tyrosine protein kinase with mol. mass of 185 kDa. Abnormal activity of HER2 causes accelerated metastasis and resistance to therapeutic effects (Ahmed et al., 2015). Success in the treatment of breast cancer is due to the fact that several years ago, trastuzumab, created by Genentech (Genentech, USA) and manufactured by Hoffman La Roche (Switzerland), was introduced into medical practice. This medicine is based on humanized monoclonal antibodies (MA) (huMab4D5-8 or rhuMabHer2) produced by the ATCC CRL-10463 mouse hybridoma from the U.S. collection of microorganism strains and cell cultures (Hudziak et al., 1989) (Harries and Smith, 2002). An antibody introduced into the patient’s bloodstream interacts with the extracellular part of HER2 / neu and inhibits the division of cancer cells, rarely accompanied by the destruction of cancer cells. In combination with chemotherapy, huMab4D5-8 antibodies have a pronounced therapeutic effect (Hudis, 2007). The use of trastuzumab has been shown to reduce the risk of developing distant metastases and increase the life expectancy of patients (Hudis, 2007). However, the method of treatment with trastuzumab has several disadvantages. Typically, MA is obtained in an animal cell culture, and this is most often the tumor cells of a Chinese hamster ovary (Chinese hamster ovary, CHO). In general, protein production in animal cells carries a risk of contamination with products and pathogens of animal origin, such as retroviruses and prions. Another significant drawback is the high cost of MA, which includes innovative costs, as well as equipment costs, a sterility maintenance system, and certification and control systems for environments that use animal products and increase the risk of MA contamination with prions and viruses. This explains the high cost of treating HER2 / neu-positive breast cancer using MA. It is at least US $ 70,000 for the treatment of breast cancer with trastuzumab (Fleck, 2006) (Macedo et al., 2010).
Растение - это источник дешевого белка, имеющий ряд преимуществ по сравнению с клетками млекопитающих при использовании для продукции фармацевтических белков. Растения как «фабрики» (а) не содержат патогенных для человека вирусов и прионов, и (б) не требуют применения дорогостоящей аппаратуры (например, ферментеров), культуральных сред и поддержания стерильности. Стоимость выращивания исходных опытных растений несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей или животных. Технология «временной» продукции (transient expression) белков в растении позволяет наработать чужеродный белок в количестве, достигающем 10%-30% от общего растворимого белка растения в короткое время (5-10 дней) (Komarova et al., 2010). Эта система успешно используется для продукции антираковых антител (Giritch et al., 2006). При использовании способа, когда целевой ген включается в бинарный вектор с последующей доставкой его в клетки инфицируемого растения методом агроинокуляции или агроинфильтрации, удалось получить в растении MA против онкогена HER2/neu, получившее название фитотрастузумаб (Komarova et al., 2011). У трастузумаба помимо высокой цены есть еще один недостаток, это появление при лечении РМЖ устойчивых к нему клеточных форм (Peake and Nahta, 2014). Одним из способов преодоления этой проблемы является создание антитела, способного узнавать другой, отличный от сайта узнавания трастузумабом, участок экзоклеточной части HER2 (Hu et al., 2014, p. 2) (Rimawi et al., 2015). Если трастузумаб взаимодействует с IV субдоменом (аминокислоты с 480 по 620), то поступивший недавно в клиническую практику пертузумаб, взаимодействуя со II субдоменом димеризации (аминокислоты с 165 по 310), блокирует димеризацию HER2 и HER3 (Barthélémy et al., 2014). Поскольку пертузумаб и трастузумаб блокируют HER2 в разных участках, то совместное использование этих антител приводит к синергидному эффекту (Kawajiri et al., 2015). Кроме того, использование пертузумаба дает возможность лечения форм рака, резистентных к трастузумабу (Chung and Lam, 2013) (Rimawi et al., 2015).A plant is a cheap protein source that has several advantages over mammalian cells when used for the production of pharmaceutical proteins. Plants as “factories” (a) do not contain pathogenic viruses for humans and prions, and (b) do not require the use of expensive equipment (for example, fermenters), culture media and maintaining sterility. The cost of growing the original experimental plants is incomparably lower than the cost of culturing bacterial, yeast, or animal cells. The technology of “temporary” production (transient expression) of proteins in a plant allows producing a foreign protein in an amount reaching 10% -30% of the total soluble protein of a plant in a short time (5-10 days) (Komarova et al., 2010). This system has been successfully used to produce anti-cancer antibodies (Giritch et al., 2006). Using the method, when the target gene is included in a binary vector with its subsequent delivery to the cells of the infected plant by agroinoculation or agroinfiltration, it was possible to obtain MA against the HER2 / neu oncogene, called phytotrastuzumab (Komarova et al., 2011). In addition to the high price, trastuzumab has another drawback, the appearance of cell forms resistant to it during the treatment of breast cancer (Peake and Nahta, 2014). One way to overcome this problem is to create an antibody capable of recognizing another, different from the recognition site of trastuzumab, site of the exocellular portion of HER2 (Hu et al., 2014, p. 2) (Rimawi et al., 2015). If trastuzumab interacts with the IV subdomain (amino acids 480 to 620), then recently introduced into clinical practice, pertuzumab interacting with the II subdomain of dimerization (
Однако продукция пертузумаба имеет все те отмеченные выше недостатки, что и продукция трастузумаба.However, the production of Pertuzumab has all the disadvantages noted above, as well as the products of Trastuzumab.
Настоящее изобретения направлено на преодоление недостатков, присущих трастузумабу, фитотрастузумабу и пертузумабу, известным из уровня техники, путем продукции в клетке растения антитела, специфически, связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.The present invention aims to overcome the disadvantages inherent in trastuzumab, phytotrustuzumab and pertuzumab known in the art by producing an antibody in a plant cell that specifically binds the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein.
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Первый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела, и терминатор транскрипции.The first aspect of the present invention provides a recombinant expression non-amplifying vector for producing an antibody light chain in a plant cell that specifically binds a dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein containing sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, consisting of a signal peptide that secures the secretion of antibodies, and the light chain of the antibody la, and transcription terminator.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the promoter is a
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the transcription terminator is a
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the promoter is a 35S
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the transcription terminator is a
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In a most preferred embodiment, the promoter is a
Второй аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы Х-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепь антитела, 3'-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.The second aspect of the present invention provides a recombinant expression of a viral amplifying vector to obtain an antibody in a plant light chain that specifically binds a dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein containing sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, a 5'-untranslated portion of the X- genome potato virus, potato X virus polymerase gene, second promoter of subgenomic potato X virus RNA, nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, consisting of a signal peptide that secures antibody secretion and an antibody light chain, a 3'-untranslated portion of the potato X virus genome and a transcription terminator.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the promoter is a
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the transcription terminator is a
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the promoter is a 35S
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the transcription terminator is a
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In a most preferred embodiment, the promoter is a
Третий аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела, 3'-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.A third aspect of the present invention provides a recombinant viral expression amplifying vector for producing an antibody light chain in a plant’s cells that specifically binds a dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein containing sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, a 5 ′ untranslated region of the tobacco virus genome cruciferous mosaic, polymerase gene of the cruciferous tobacco mosaic virus, including the first promoter of the subgenomic RNA of virus t cruciferous abdominal mosaic, transport protein gene, including the second promoter of cruciferous tobacco mosaic virus subgenomic RNA, nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the coding amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, consisting of a signal peptide that secures the secretion of the antibody, and the light chain of the antibody, 3 '-non-translated part of the genome of the virus of the tobacco mosaic cruciferous and transcription terminator.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the promoter is a
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the transcription terminator is a
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In more preferred embodiments, the promoter is an Arabidopsis thaliana
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the transcription terminator is a
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In a most preferred embodiment, the promoter is an Arabidopsis thaliana
Четвертый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, и терминатор транскрипции.A fourth aspect of the present invention provides a recombinant expression non-amplifying vector for producing an antibody heavy chain plant cell that specifically binds a dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein containing sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, consisting of a signal peptide that secures the secretion of antibodies, and the heavy chain of ant body, and a transcription terminator.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the promoter is a
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the transcription terminator is a
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the promoter is a 35S
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the transcription terminator is a
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In a most preferred embodiment, the promoter is a
Пятый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы Х-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3'-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.A fifth aspect of the present invention provides a recombinant expression viral amplifying vector for producing an antibody heavy chain plant cell that specifically binds a dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein containing sequentially arranged elements: a promoter that is functionally active in plant cells, a 5 ′ untranslated region of the X- genome potato virus, potato X virus polymerase gene, second promoter of subgenomic potato X virus RNA, nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, consisting of a signal peptide that secures the secretion of the antibody and the antibody heavy chain, a 3'-untranslated portion of the potato X virus genome and a transcription terminator.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the promoter is a
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the transcription terminator is a
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the promoter is a 35S
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the transcription terminator is a
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In a most preferred embodiment, the promoter is a
Шестой аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3'-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.A sixth aspect of the present invention provides a recombinant viral amplifying vector for producing an antibody heavy chain plant cell that specifically binds a dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein containing sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, a 5'-untranslated region of the tobacco mosaic virus genome cruciferous, cruciferous tobacco mosaic virus polymerase gene, including the first promoter of subgenomic RNA tobacco mosaic virus and cruciferous, transport protein gene, including the second promoter of the subgenomic RNA of the cruciferous tobacco mosaic virus, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, the coding amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, consisting of a signal peptide that secures the secretion of the antibody and the antibody heavy chain, 3 ' - untranslated part of the genome of the virus of the mosaic of the cruciferous virus and the terminator of transcription.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the promoter is a
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In preferred embodiments, the transcription terminator is a
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.In more preferred embodiments, the promoter is an Arabidopsis thaliana
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In more preferred embodiments, the transcription terminator is a
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.In a most preferred embodiment, the promoter is an Arabidopsis thaliana
Седьмой аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, включающий стадии:A seventh aspect of the present invention provides a method for producing an antibody that specifically binds a dimerization domain of the excellular portion of the HER2 / neu oncoprotein in a plant, comprising the steps of:
- обеспечение первого экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 и терминатор транскрипции;- providing a first expression vector containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, consisting of a signal peptide for secretion of the antibody and the light chain of the antibody; where the specified expression vector contains the following sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a transcription terminator;
- обеспечение второго экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 и терминатор транскрипции;- providing a second expression vector containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, consisting of a signal peptide for secretion of the antibody and the antibody heavy chain; where the specified expression vector contains the following sequentially arranged elements: a promoter functionally active in plant cells, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a transcription terminator;
- получение штамма Agrobacterium tumefaciens. трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens. трансформированного вторым экспрессионным вектором;- obtaining a strain of Agrobacterium tumefaciens. transformed with the first expression vector, and a strain of Agrobacterium tumefaciens. transformed with a second expression vector;
- совместное введение штамма Agrobacterium tumefaciens. трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного вторым экспрессионным вектором, в клетки растения рода Nicotiana:- co-administration of a strain of Agrobacterium tumefaciens. transformed with the first expression vector, and a strain of Agrobacterium tumefaciens transformed with the second expression vector into cells of a plant of the genus Nicotiana:
- культивирование полученного растения и сбор листьев;- cultivating the resulting plant and collecting leaves;
- выделение и очистка антител из собранных листьев.- isolation and purification of antibodies from the collected leaves.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно первому аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно четвертому аспекту настоящего изобретения.In a preferred embodiment, the first expression vector is a recombinant expression non-amplifying vector according to the first aspect of the present invention and the second expression vector is a recombinant expression non-amplifying vector according to the fourth aspect of the present invention.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе Х-вируса картофеля согласно второму аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно шестому аспекту настоящего изобретения.In a preferred embodiment, the first expression vector is a potato X virus-based recombinant viral amplifying vector according to a second aspect of the present invention and the second expression vector is a cruciferous tobacco mosaic virus recombinant viral amplifying vector according to the sixth aspect of the present invention.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно третьему аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе Х-вируса картофеля согласно пятому аспекту настоящего изобретения.In a preferred embodiment, the first expression vector is a cruciferous tobacco mosaic virus recombinant viral amplifying vector according to the third aspect of the present invention and the second expression vector is a potato X virus recombinant viral amplifying vector based on the fifth aspect of the present invention.
В предпочтительных вариантах воплощения растение выбирают из Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Nicotiana excelsior.In preferred embodiments, the plant is selected from Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Nicotiana excelsior.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения растение представляет собой Nicotiana benthamiana.In a most preferred embodiment, the plant is Nicotiana benthamiana.
В предпочтительных вариантах воплощения растения культивируют в почве в условиях теплицы или климатической камеры со световым режимом: день 16 часов, ночь 8 часов.In preferred embodiments, the plants are cultivated in soil under the conditions of a greenhouse or climatic chamber with a light regime: day 16 hours,
Восьмой аспект настоящего изобретения предусматривает антитело, специфически связывающее домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, полученное заявленным способом.The eighth aspect of the present invention provides an antibody that specifically binds the dimerization domain of the excellular portion of the HER2 / neu oncoprotein obtained by the claimed method.
Девятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в качестве терапевтического агента для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.A ninth aspect of the present invention provides for the use of an antibody of the invention specifically binding the dimerization domain of the excellular portion of the HER2 / neu oncoprotein as a therapeutic agent for the treatment of HER2 / neu-positive breast cancer.
В предпочтительных вариантах воплощения применение дополнительно включает введение второго терапевтического агента, ингибирующего активность HER2/neu.In preferred embodiments, the use further comprises administering a second therapeutic agent that inhibits HER2 / neu activity.
В более предпочтительных вариантах воплощения вторым терапевтическим агентом является ингибитор тирозинкиназы.In more preferred embodiments, the second therapeutic agent is a tyrosine kinase inhibitor.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения ингибитор тирозинкиназы представляет собой лапатиниб.In a most preferred embodiment, the tyrosine kinase inhibitor is lapatinib.
В более предпочтительных вариантах воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело, взаимодействующее с экзоклеточной частью онкобелка HER2/neu.In more preferred embodiments, the second therapeutic agent is an antibody that interacts with the extracellular portion of the HER2 / neu oncoprotein.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело трастузумаб.In a most preferred embodiment, the second therapeutic agent is a trastuzumab antibody.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело фитотрастузумаб.In a most preferred embodiment, the second therapeutic agent is a phytotrustuzumab antibody.
Десятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, при изготовлении лекарственного средства для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.A tenth aspect of the present invention provides for the use of a claimed antibody that specifically binds a dimerization domain of the excellular portion of the HER2 / neu oncoprotein in the manufacture of a medicament for the treatment of HER2 / neu-positive breast cancer.
Перечень фигурList of figures
На Фиг. 1 представлена схему строения бинарного вектора рА16571, кодирующего легкую (L) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где RB и LB - соответственно, правая и левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; 35S - транскрипционный промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК); Poly А/Т - полиаденилирующий сигнал ВМЦК/терминатор транскрипции геномной РНК ВМЦК. S1-лидер - 5'-нетранслируемая область геномной РНК ВМЦК.In FIG. 1 is a diagram of the structure of the binary vector pA16571 encoding the light (L) chain of an antibody that specifically binds the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein, where RB and LB are the right and left parts of the site of insertion of the binary vector into the plant genome; 35S — transcriptional promoter of cauliflower mosaic virus (VMCC); Poly A / T - VCCA polyadenylation signal / terminator for transcription of VCCA genomic RNA. S1 leader - 5'-untranslated region of the genomic RNA of WCC.
На Фиг. 2 представлена схему строения бинарного вектора рА16671, кодирующего тяжелую (Н) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu. Условные обозначения те же, что и на Фиг. 1.In FIG. Figure 2 shows the structure of the binary vector pA16671 encoding the heavy (H) chain of an antibody that specifically binds the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein. The legend is the same as in FIG. one.
На Фиг. 3 приведены результаты электрофореза растительных экстрактов в невосстанавливающих условиях (в отсутствие β-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси. Показано накопление собранных полноразмерных антител в листьях N.benthamiana после совместной инфильтрации вектором, содержащем ген легкой цепи, и вектором, содержащем ген тяжелой цепи. Использованы последовательности, кодирующие разные сигнальные пептиды (указаны названия конструкций), дорожки:In FIG. Figure 3 shows the results of electrophoresis of plant extracts under non-reducing conditions (in the absence of β-mercaptoethanol) in a 7.5% polyacrylamide gel followed by Coomassie staining. The accumulation of the collected full-length antibodies in the leaves of N. benthamiana after co-infiltration with a vector containing the light chain gene and a vector containing the heavy chain gene is shown. Used sequences encoding different signal peptides (names of constructs are indicated), tracks:
Инфильтрированные листья были собраны 5, 7 или 9 день (dpi). Дорожка U, неинфицированный лист; дорожка S, 1 μg hIgG; дорожка M, маркеры мол. веса. Область полноразмерных антител выделена стрелкой.Infiltrated leaves were collected on
На Фиг. 4 представлена схема строения бинарного вектора рА16921, основанного на кДНК ХВК и кодирующего легкую (L) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где (слева направо) LB - левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; Τ - нопалинсинтазный терминатор; ΝΡΤ - ген неомицинфосфотрансферазы; Ρ - нопалинсинтазный транскрипционный промотор; 35S - транскрипционный промотор ВМЦК; ген репликазы ХВК, L-цепь - легкая цепь; НТО - 3'нетранслируемая область геномной РНК ХВК; Τ - 35S терминатор ВМЦК; RB - правая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора. Стрелки показывают направление транскрипции.In FIG. Figure 4 shows the structural structure of the binary vector pA16921, based on PVA cDNA and encoding the light (L) chain of an antibody that specifically binds the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein, where (from left to right) LB is the left part of the site of the integration of the binary vector into the plant genome; Τ - nopaline synthase terminator; ΝΡΤ - neomycin phosphotransferase gene; Ρ - nopalinsynthase transcriptional promoter; 35S - transcriptional promoter of WCC; PVK replicase gene, L-chain - light chain; NTO - 3 'untranslated region of genomic RNA of PVX; Τ - 35S terminator VVCC; RB is the right part of the site of embedding a binary vector in the plant genome. Arrows indicate the direction of transcription.
На Фиг. 5 представлена схема строения бинарного вектора pA16722, основанного на кДНК крВТМ и кодирующего тяжелую (Н) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где (слева направо) LB - левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; Τ - нопалинсинтазный терминатор; ΝΡΤ - ген неомицинфосфотрансферазы; Ρ - нопалинсинтазный транскрипционный промотор; Act2 - актиновый транскрипционный промотор 2 из арабидопсиса; ген репликазы крВТМ; ТБ - транспортный белок крВТМ, Н-цепь - тяжелая цепь; НТО - 3'нетранслируемая область геномной РНК крВТМ; Τ - нопалинсинтазный терминатор; RB - правая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора. Стрелки показывают направление транскрипции.In FIG. Figure 5 shows the structure of the binary vector pA16722, based on the crvTM cDNA and encoding the heavy (H) chain of an antibody that specifically binds the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein, where (from left to right) LB is the left part of the site of integration of the binary vector into the plant genome; Τ - nopaline synthase terminator; ΝΡΤ - neomycin phosphotransferase gene; Ρ - nopalinsynthase transcriptional promoter; Act2 -
На Фиг. 6 приведены результаты анализа тотального растворимого белка листьев N. benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 7,5% ПААГ в невосстанавливающих условиях с последующей окраской Кумасси. Дорожки: 1 - интактный лист (отрицательный контроль); 2, 4, 6 - листья, инъецированные бинарными векторами, кодирующими легкую (рА11866) и тяжелую (рА11903) цепь антитела трастузумаб; 3, 5, 7 - листья, инъецированные бинарными векторами рА16571 и рА16671 (зона, соответствующая полноразмерному антителу, отмечена *); +K - 3 мкг трастузумаба (положительный контроль); MR -маркеры молекулярного веса.In FIG. 6 shows the results of the analysis of the total soluble protein of leaves of N. benthamiana, agroinjected with binary vectors pA16571 and pA16671. Separation of 7.5% SDS page under non-reducing conditions followed by Coomassie staining. Lanes: 1 - intact sheet (negative control); 2, 4, 6 - leaves injected with binary vectors encoding the light (pA11866) and heavy (pA11903) chains of the trastuzumab antibody; 3, 5, 7 — leaves injected with the binary vectors pA16571 and pA16671 (the zone corresponding to the full-sized antibody is marked *); + K - 3 μg of trastuzumab (positive control); MR markers of molecular weight.
На Фиг. 7 приведены результаты анализа фракций очищенного на колонке с протеин-A сефарозой моноклонального антитела, выделенного из листьев N.benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумасси. Дорожки: MR - маркеры молекулярного веса; +K - 3 мкг трастузумаба (положительный контроль); 1 - 2 мкг из фракции №3; 2 - 2 мкг из фракции №4. Отмечены зоны, соответствующие тяжелой (Н) и легкой (L) цепи антитела.In FIG. 7 shows the results of the analysis of fractions of a monoclonal antibody purified on a protein-A sepharose column isolated from leaves of N. benthamiana agro-injected with binary vectors pA16571 and pA16671. Separation in 12% SDS page under reducing conditions followed by Coomassie staining. Lanes: MR — molecular weight markers; + K - 3 μg of trastuzumab (positive control); 1 - 2 μg from fraction No. 3; 2 - 2 μg from fraction No. 4. Zones corresponding to the heavy (H) and light (L) chains of the antibody are marked.
На Фиг. 8 приведены результаты вестерн-блот анализа растительных экстрактов из листьев N.benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 12% ПААГ. Дорожки: 1 - интактный лист (отрицательный контроль); 2 - листья, инъецированные бинарными векторами, кодирующими легкую (рА11866) и тяжелую цепь (рА11903) антитела трастузумаб под контролем 35S-промотора; 3 - листья, инъецированные бинарными векторами рА16571 и рА16671; +K - 120 нг трастузумаба в случае L цепи, 60 нг трастузумаба в случае H цепи (положительный контроль). Зоны, соответствующие легкой и тяжелой цепи, отмечены * Слева: вестерн-блот с антителами против легкой каппа-цепи иммуноглобулина G человека. Справа: вестерн-блот с антителами против тяжелой гамма-цепи иммуноглобулина G человека.In FIG. Figure 8 shows the results of a Western blot analysis of plant extracts from N. benthamiana leaves agro-injected with the binary vectors pA16571 and pA16671. Separation in 12% PAAG. Lanes: 1 - intact sheet (negative control); 2 - leaves injected with binary vectors encoding the light (pA11866) and heavy chain (pA11903) antibodies of trastuzumab under the control of the 35S promoter; 3 - leaves injected with binary vectors pA16571 and pA16671; + K - 120 ng of trastuzumab in the case of the L chain, 60 ng of trastuzumab in the case of the H chain (positive control). Zones corresponding to light and heavy chains are marked * Left: Western blot with antibodies against the human immunoglobulin G light Kappa chain. Right: Western blot with antibodies against the heavy gamma chain of human immunoglobulin G.
На Фиг. 9 приведены результаты анализа аффинности рекомбинантных моноклональных антител против домена димеризации HER2/neu, продуцированных в растении, к антигену HER2/neu на поверхности клеток SKBR-3 по данным проточной цитометрии. Клетки инкубировались с антителами в указанных по оси абсцисс концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл. По оси ординат - процент связавшихся с антителами клеток.In FIG. Figure 9 shows the results of the affinity analysis of recombinant monoclonal antibodies against the HER2 / neu dimerization domain produced in a plant to the HER2 / neu antigen on the surface of SKBR-3 cells according to flow cytometry. Cells were incubated with antibodies in concentrations indicated on the abscissa axis from 0.01 to 100 μg / ml. The ordinate is the percentage of cells bound to antibodies.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение представляет собой способ продукции в клетках растения функционально активного моноклонального антитела против домена димеризации HER2/neu. Гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи MA против домена димеризации онкогена HER2/neu, могут быть экспрессированы в клетке растения с получением полностью функционального антитела, специфически связывающегося с HER2/neu как in vitro, так и in vivo.The present invention is a method for producing a functionally active monoclonal antibody against the HER2 / neu dimerization domain in plant cells. Genes encoding the heavy and light chains of MA against the HER2 / neu oncogene dimerization domain can be expressed in a plant cell to produce a fully functional antibody that specifically binds to HER2 / neu both in vitro and in vivo.
Описанный в изобретении способ предполагает создание экспрессионных векторов, направляющих в клетке растения синтез тяжелой (Н) и легкой (L) цепи антитела, введение указанных векторов в клетки растения с последующим культивированием в условиях, обеспечивающих совместную экспрессию в растительной клетке генов тяжелой и легкой цепи MA с последующей сборкой полноразмерного MA.The method described in the invention involves the creation of expression vectors directing the synthesis of the heavy (H) and light (L) chains of an antibody in a plant cell, the introduction of these vectors into plant cells, followed by cultivation under conditions that co-express the heavy and light chain MA genes in the plant cell followed by assembly of the full-sized MA.
Для продукции MA в растительной клетке могут быть созданы как неамплифицирующиеся (см. Пример 2) экспрессионные векторы, так и амплифицирующиеся, на основе геномов вирусов растений (см. Пример 4). Экспрессионные векторы содержат транскрипционную кассету (промотор и терминатор транскрипции), узнаваемую ДНК-зависимой РНК полимеразой растительной клетки. В качестве промотора и терминатора могут быть использованы как последовательности из генома растений, так и из генома бактерий (например, агробактерий) или вирусов (например, ВМЦК) растений (см. Фиг. 1, 2 Примера 2, Фиг. 4, 5 Примера 4). При создании экспрессионных амплифицирующихся векторов - векторов на основе геномов вирусов растений - необходимо учитывать тот факт, что продукция легкой и тяжелой цепи MA в одной и той же клетке возможна при условии отсутствия конкуренции между вирусами, геномы которых использованы. Наши эксперименты показывают, что ВТМ и ХВК не только не конкурируют между собой, но ХВК даже стимулирует репродукцию ВТМ. Анализ механизмов репродукции синдбис-подобных фитовирусов показывает, что конкуренция между ними происходит на стадии формирования так называемых вирусных «фабрик», когда вирусная репликаза локализуется на мембранах эндоплазматического ретикулума. ВТМ и ХВК не конкурируют между собой на стадии формирования репликативного комплекса и вирусной «фабрики». Вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ), формирующий вирусную «фабрику» на мембранах хлоропластов, также не конкурирует с ВТМ и ХВК и поэтому может быть использован в комбинации с ВТМ или ХВК для синтеза антитела.For the production of MA in a plant cell, both non-amplifying (see Example 2) expression vectors and amplifying vectors based on plant virus genomes can be created (see Example 4). Expression vectors contain a transcription cassette (promoter and transcription terminator) recognized by DNA-dependent RNA polymerase of a plant cell. As a promoter and terminator, both sequences from the plant genome and from the genome of bacteria (e.g., agrobacteria) or viruses (e.g., MCC) of plants (see Fig. 1, 2 of Example 2, Fig. 4, 5 of Example 4 can be used). ) When creating expression amplifying vectors - vectors based on the genomes of plant viruses - it is necessary to take into account the fact that the production of MA light and heavy chains in the same cell is possible provided there is no competition between the viruses whose genomes are used. Our experiments show that TMV and CVC not only do not compete with each other, but CVC even stimulates the reproduction of TMV. An analysis of the mechanisms of reproduction of syndbis-like phytoviruses shows that competition between them occurs at the stage of formation of the so-called viral “factories”, when viral replicase is localized on the membranes of the endoplasmic reticulum. TMV and CVC do not compete with each other at the stage of formation of the replicative complex and the viral “factory”. The turnip yellow mosaic virus (HMT), which forms the viral “factory” on the chloroplast membranes, also does not compete with TMV and PVX and therefore can be used in combination with TMV or PVX for antibody synthesis.
Согласно изобретению, нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи MA, могут быть получены на основе аминокислотной последовательности с помощью инструмента «обратной трансляции» параллельно с проведением оптимизации кодонового состава с учетом частоты встречаемости тех или иных кодонов в тех растениях, которые в дальнейшем будут использованы для продукции MA.According to the invention, nucleotide sequences encoding MA light and heavy chains can be obtained on the basis of the amino acid sequence using the "reverse translation" tool in parallel with optimization of the codon composition taking into account the frequency of occurrence of certain codons in those plants that will be used later for MA products.
Для осуществления эффективного процессинга и сборки MA аминокислотная последовательность каждой из цепей антитела должна содержать сигнальный пептид, направляющий белки через эндоплазматический ретикулум в апопласт. В отсутствие сигнальных пептидов MA в растительной клетке собираться не будет. Можно использовать как одинаковые, так и разные сигнальные пептиды для легкой и тяжелой цепи с целью определения наиболее оптимального сочетания (см. Пример 3).For efficient processing and assembly of MA, the amino acid sequence of each of the antibody chains must contain a signal peptide that directs proteins through the endoplasmic reticulum to the apoplast. In the absence of signal peptides, MA will not be assembled in the plant cell. You can use the same or different signal peptides for light and heavy chains in order to determine the most optimal combination (see Example 3).
В контексте настоящего изобретения экспрессионные векторы, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела против домена димеризации онкогена HER2/neu, могут быть созданы на основе бинарного вектора pCambia1300 или pBIN19 (см. Пример 2 и 4). Эти плазмиды обеспечивают возможность использования Agrobacterium tumefaciens для доставки генетического материала в клетки растения.In the context of the present invention, expression vectors encoding the light and heavy chains of an antibody against the HER2 / neu oncogene dimerization domain can be created based on the binary vector pCambia1300 or pBIN19 (see Examples 2 and 4). These plasmids allow the use of Agrobacterium tumefaciens to deliver genetic material to plant cells.
Для экспрессии чужеродного гена в листовой ткани можно использовать метод агроинфильтрации и агроинокуляции. Трансформация растительных клеток может быть стабильной, сопровождающейся интеграцией вводимой ДНК в клеточный геном, или же временной, когда ДНК, содержащая целевой ген, находится в виде эписомы, т.е. интеграции ДНК в хозяйский геном не происходит. Временная, или транзиентная, экспрессия чужеродных генов в растительной клетке позволяет получить более высокий выход целевого белка в короткие сроки (3-14 дней). Более того, экспрессия целевых генов наблюдается через 3 часа после отправки ДНК, а уже между 18 и 48 часами достигает максимума и сохраняется на протяжении 10 дней. Очевидными преимуществами использования такой растительной «фабрики» являются простота в обращении, скорость, низкая себестоимость конечного продукта, высокий уровень продуцируемого белка, масштабируемость и возможность контроля процесса синтеза белка (Makhzoum et al., 2014).For expression of a foreign gene in leaf tissue, the method of agroinfiltration and agroinoculation can be used. The transformation of plant cells can be stable, accompanied by the integration of the introduced DNA into the cellular genome, or temporary, when the DNA containing the target gene is in the form of an episoma, i.e. DNA integration into the host genome does not occur. Temporary, or transient, expression of foreign genes in a plant cell allows a higher yield of the target protein in a short time (3-14 days). Moreover, the expression of target genes is observed 3 hours after DNA sending, and already between 18 and 48 hours reaches its maximum and persists for 10 days. The obvious advantages of using such a plant “plant” are ease of handling, speed, low cost of the final product, high level of protein production, scalability and the ability to control the process of protein synthesis (Makhzoum et al., 2014).
Настоящее изобретение подразумевает предпочтительное использование транзиентной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей MA и осуществление доставки экспрессионных векторов с помощью агроинокуляции или вакуумной агроинфильтрации.The present invention implies the preferred use of transient expression of MA light and heavy chain genes and delivery of expression vectors by agroinoculation or vacuum agroinfiltration.
Важным и решающим преимуществом настоящего изобретения, является то, что описываемая система синтеза антитела против онкогена HER2/neu в растении может обеспечивать высокий уровень продукции целевого белка при небольших затратах и в короткие сроки: уже на 3 день после агроинъекции нереплицирующимися векторами, содержащими ген легкой и тяжелой цепи MA, в листьях N.benthamiana накапливается до 50-80 мг/кг антител (см. Фиг. 6 Примера 6). Наши эксперименты показывают, что по результатам ИФА выход антител при использовании амплифицирующихся векторов в несколько раз больше - 250-500 мг/кг листовой массы (2.5-5% от суммарного растворимого белка клетки). С помощью аффинной хроматографии на колонке с протеином G или А можно получить чистый препарат MA против домена димеризации HER2/neu (Фиг. 7).An important and decisive advantage of the present invention is that the described system for the synthesis of antibodies against the HER2 / neu oncogen in a plant can provide a high level of production of the target protein at low cost and in a short time: already 3 days after agroinjection by non-replicating vectors containing the light and heavy chain MA, in the leaves of N. benthamiana accumulates up to 50-80 mg / kg of antibodies (see Fig. 6 of Example 6). Our experiments show that according to the ELISA results, the yield of antibodies when using amplifying vectors is several times greater - 250-500 mg / kg of leaf mass (2.5-5% of the total soluble protein of the cell). Using affinity chromatography on a protein G or A column, a pure MA preparation can be obtained against the HER2 / neu dimerization domain (Fig. 7).
Выделенные из растительного материала MA обладают способностью связывать HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3, что показано с помощью проточной цитометрии (Фиг. 9).Isolated from plant material MA have the ability to bind HER2 / neu on the surface of SK-BR-3 cells, as shown by flow cytometry (Fig. 9).
Продуцированные и выделенные из растений MA против домена димеризации HER2/neu являются полностью функционально активными. На мышах с перевитой опухолью РМЖ человека - клетки SK-BR-3 - была подтверждена эффективность полученных в растениях антител. Продемонстрировано подавление роста опухоли при использовании комбинации двух моноклональных антител, продуцированных в растении - фитотрастузумаб и MA против домена димеризации HER2/neu, причем эффективность этой комбинации, по крайней мере, в два раза выше, чем одного фитотрастузумаба. Сравнение с группой фитотрастузумаба показало достоверный почти двукратный терапевтический выигрыш. Таким образом, антираковое антитело против домена димеризации HER2/neu, полученное в растительной клетке, является функционально активным, что продемонстрировано как в системе in vitro, так и in vivo, при этом по нашим оценкам себестоимость препарата MA, полученного в клетке растения, может быть в 10-20 раз ниже стоимости аналогичного препарата, полученного из животных клеток.MA produced and isolated from plants against the HER2 / neu dimerization domain are fully functionally active. In mice with an inoculated human breast tumor, SK-BR-3 cells, the efficacy of the antibodies obtained in plants was confirmed. Inhibition of tumor growth was demonstrated using a combination of two monoclonal antibodies produced in a plant - phytotrustuzumab and MA against the HER2 / neu dimerization domain, and the effectiveness of this combination is at least two times higher than that of phytotrustuzumab alone. Comparison with the phytotrustuzumab group showed a significant almost twofold therapeutic gain. Thus, the anti-cancer antibody against the HER2 / neu dimerization domain obtained in a plant cell is functionally active, which has been demonstrated both in the in vitro and in vivo systems, and according to our estimates, the prime cost of the MA preparation obtained in the plant cell can be 10-20 times lower than the cost of a similar drug obtained from animal cells.
Не менее существенным преимуществом данного изобретения является то, что на протяжении всего цикла получения MA из растительной клетки не используются какие-либо материалы животного происхождения, что гарантирует отсутствие вирусов или их генетического материала, прионов и прочих инфекционных агентов в получаемом продукте.An equally significant advantage of this invention is that during the entire cycle of obtaining MA from a plant cell no materials of animal origin are used, which guarantees the absence of viruses or their genetic material, prions and other infectious agents in the resulting product.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.Information confirming the possibility of carrying out the invention.
Данное изобретение подробно проиллюстрировано ниже со ссылками на конкретные примеры, представляющие собой его наиболее предпочтительные воплощения.The invention is illustrated in detail below with reference to specific examples representing its most preferred embodiments.
Пример 1. Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей легкую и тяжелую антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенной для экспрессии в клетках растения рода Nicotiana.Example 1. Obtaining a nucleotide sequence encoding a light and heavy antibody directed against the dimerization domain of the exocellular portion of the HER2 / neu oncoprotein, intended for expression in cells of a plant of the genus Nicotiana.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую и тяжелую антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенной для экспрессии в клетках растения рода Nicotiana получали на основе опубликованной в драгбанке (DrugBank accession number DB06366) аминокислотной последовательности антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/ с помощью инструмента «обратной трансляции» с одновременной оптимизацией кодонового состава для экспрессии в растениях рода Nicotiana (http://www.entelechon.de/2008/10/backtranslation-tool/). К каждой последовательности с N-конца была добавлена аминокислотная последовательность сигнального пептида тяжелой цепи антител Р01749 (HVM05_MOUSE) Mus musculus. Аминокислотная последовательность тяжелой или легкой цепи вводилась в соответствующее поле сервиса «обратная трансляция», затем устанавливались следующие параметры: стандартный генетический код; таблица частоты использования кодонов для рода Nicotiana с включенным условием использования наиболее часто встречающихся кодонов; в качестве нежелательных мотивов были указаны сайты узнавания рестриктазами NcoI, XhoI, которые в дальнейшем использовались для получения генноинженерных конструкций. Выведенные нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенные для экспресии в клетках растения рода Nicotiana представлены в (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) соответственно. По заказу авторов эти последовательности были синтезированы ЗАО «Евроген», каждая из них была вставлена в вектор pAL-TA (Евроген, Россия), причем на 5'-конце каждой из последовательностей был добавлен сайт узнавания рестриктазой NcoI, а на 3'-конце - XhoI. В результате были получены конструкции pAL-L и pAL-H, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, соответственно.The nucleotide sequence encoding the light and heavy antibodies directed against the dimerization domain of the exocellular part of the HER2 / neu oncoprotein intended for expression in Nicotiana plant cells was obtained based on the amino acid sequence of the antibody directed against the dimerization domain of the exoccellular part published in dragbank (DrugBank accession number DB06366) HER2 oncoprotein / using the “reverse translation” tool with simultaneous optimization of the codon composition for expression in plants of the genus Nicotiana (http: //www.entelechon. de / 2008/10 / backtranslation-tool /). The amino acid sequence of the P01749 antibody heavy chain signal peptide (HVM05_MOUSE) Mus musculus was added to each sequence from the N-terminus. The amino acid sequence of the heavy or light chain was entered into the corresponding field of the “reverse translation” service, then the following parameters were set: standard genetic code; a table of codon usage for the genus Nicotiana with the condition for using the most common codons included; recognition sites by restriction enzymes NcoI, XhoI, which were subsequently used to obtain genetic engineering constructs, were indicated as undesirable motifs. The deduced nucleotide sequences encoding the light and heavy chains of an antibody directed against the dimerization domain of the exocellular part of the HER2 / neu oncoprotein, intended for expression in cells of plants of the genus Nicotiana, are presented in (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2), respectively. By order of the authors, these sequences were synthesized by CJSC Evrogen, each of them was inserted into the pAL-TA vector (Evrogen, Russia), and the recognition site with the restriction enzyme NcoI was added at the 5'-end of each of the sequences, and at the 3'-end - XhoI. As a result, pAL-L and pAL-H constructs containing the nucleotide sequence encoding the light and heavy chain of an antibody against the dimerization domain of the extracellular part of the HER2 / neu oncoprotein, respectively, were obtained.
Пример 2. Создание экспрессионных неамплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana.Example 2. The creation of expression non-amplifying vectors for the production of antibodies against the dimerization domain of the exocellular part of the oncoprotein HER2 / neu in the Nicotiana plant.
Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana использовали имеющиеся в распоряжении авторов настоящего изобретения бинарный вектор на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия) содержащий в качестве транскрипционного промотора конститутивный (Arce et al., 2008) транскрипционный промотор. В одном из вариантов рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению использовали конститутивный транскрипционный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. В другом варианте рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению использовали конститутивный транскрипционный промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana В качестве терминатора транскрипции использовали 35S-терминатор вируса мозаики цветной капусты или nos-терминатор Agrobacterium tumefaciens. Между последовательностью промотора и терминатора была помещена последовательность, кодирующая легкую (SEQ ID NO: 1) или тяжелую (SEQ ID NO: 2) цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.To obtain expression non-amplifying vectors for the production of antibodies against the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein in the Nicotiana plant, a binary vector based on pCambia 1300 (Cambia, Australia) containing a constitutive constituent (Arce et al., 2008) transcriptional promoter. In one embodiment of the recombinant expression vector according to the invention, the constitutive transcriptional promoter of the 35S cauliflower mosaic virus was used. In another embodiment of the recombinant expression vector according to the invention, the constitutive transcriptional promoter of the
Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов в плазмиды на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия), содержащие 358-промотор и 358-терминатор транскрипции, по сайтам рестрикции NcoI-SalI из плазмид pAL-L и pAL-H были перенесены фланкированные сайтами NcoI-XhoI последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, соответственно.To obtain expression nonamplifying vectors, pCambia 1300 plasmids (Cambia, Australia) containing 358 promoter and 358 transcription terminator were transferred to the NcoI-SalI restriction sites from the pAL-L and pAL-H plasmids and the sequences flanked by the NcoI-XhoI sites were transferred encoding the light and heavy chains of antibodies against the dimerization domain of the excellular part of the oncoprotein HER2 / neu, respectively.
В результате были получены экспрессионные неамплифицирующиеся векторы: рА16571, содержащий ген легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) (Фиг. 1), и рА16671, содержащий ген тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 2) (Фиг. 2), продуцирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana. соответственно.As a result, expression nonamplifying vectors were obtained: pA16571 containing the antibody light chain gene (SEQ ID NO: 1) (Fig. 1), and pA16671 containing the antibody heavy chain gene (SEQ ID NO: 2) (Fig. 2), producing light and heavy chain antibodies against the dimerization domain of the exoccellular part of the HER2 / neu oncoprotein in the Nicotiana plant. respectively.
Пример 3. Определение оптимальной сигнальной последовательности для доставки цепей антител в апопластExample 3. Determination of the optimal signal sequence for the delivery of antibody chains to the apoplast
Для определения наиболее эффективной сигнальной последовательности для доставки цепей антител в апопласт проводили сравнение нескольких сигнальных последовательностей (Табл. 1).To determine the most effective signal sequence for the delivery of antibody chains into the apoplast, several signal sequences were compared (Table 1).
Для этого ЗАО «Евроген» по заказу авторов были синтезированы последовательности, кодирующие легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащие с 5'-конца последовательности, кодирующие приведенные в таблице 1 сигналы апопластной локализации. Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов в плазмиду на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия), содержащую 35S-промотор и 358-терминатор транскрипции, обработанную рестриктазами NcoI/SalI из плазмид, содержащих последовательности, кодирующие сигнальный пептид и легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, были перенесены фланкированные сайтами NcoI-XhoI последовательности, кодирующие сигнальный пептид и легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.To this end, Evrogen CJSC, by order of the authors, synthesized sequences encoding the light or heavy chain of the antibody against the dimerization domain of the exocellular part of the HER2 / neu oncoprotein, containing sequences from the 5'-end that encoded apoplastic localization signals in Table 1. To obtain expression nonamplifying vectors in a pCambia 1300-based plasmid (Cambia, Australia) containing a 35S promoter and a 358 transcription terminator, processed with NcoI / SalI restriction enzymes from plasmids containing sequences encoding the signal peptide and light or heavy chain of the antibody against the dimerization domain of the extracellular part of the HER2 / neu oncoprotein, the sequences coding for the signal peptide and light or heavy chain of the antibody against the dimerization domain of the oncoprotein part of the onc were transferred flanked by NcoI-XhoI sites protein HER2 / neu.
В результате были получены экспрессионные неамплифицирующиеся векторы, перечисленные в таблице 1.As a result, expression nonamplifying vectors are listed in Table 1.
Растения Nicotiana benthamiana совместно инфильтрировали полученными векторами в следующих комбинациях: 1. pA-L-cyt + pA-H-cyt; 2. pA-L-pec + рА-Н-рес; 3. pA-L-cal + pA-H-cal; 4. pA-L-iaa + pA-H-iaa; 5. pA-L-ea2 + pA-H-ea2; 6. pA-L-aa + pA-H-aa; 7. pA-L-abp + pA-H-abp; 8,9. pA16571 + pA16671. Затем через 5, 7 и 9 дней после инфильтрации собирали растительный материал, получали экстракт суммарного растворимого белка и аликвоту наносили на 7.5% полиакриламидный геле (ПААГ) в отсутствие бета-меркаптоэтанола. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем ПААГ проводили в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970) по следующей схеме. К препарату, содержащему анализируемый белок, добавляли 2-3 объема буфера для нанесения на ПААГ, содержащего 60% глицерин, 10% ДСН, 1% бромфеноловый синий и 0,25 M Трис-HCl, рН 6,8, после чего пробу прогревали 3-10 мин при 95°С. Электрофорез проводили в ПААГ в приборе фирмы "Bio-Rad". Верхний (концентрирующий) гель с рН 6,8 содержал 3% акриламид, 0,08% Ν,Ν'-метиленбисакриламид, 0,125 M Трис-HCl и 0,1% ДСН. Нижний (разделяющий) гель с рН 8,8 содержал 7,5% или 12% акриламид и 0,075 или 0,12% Ν,Ν'-метиленбисакриламида соответственно, 0,4 M Трис-HCl и 0,1% ДСН. Пробы вносили в лунки верхнего геля. В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы маркерных белков фирм ThermoScientific (10-250 кДа). Электрофорез проводили в приборе фирмы "Bio-Rad" в трис-глициновом буфере, рН 8,4 (25 мМ Трис, 0,192 M глицин, 0,1% ДСН) при постоянном токе 10 мА на гель в приборе фирмы "Bio-Rad". Гель окрашивали Кумасси G-250 в течение 20 мин, затем отмывали. На Фигуре 3 приведены результаты электрофореза растительных экстрактов в невосстанавливающих условиях (в отсутствие β-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси.Nicotiana benthamiana plants were jointly infiltrated with the resulting vectors in the following combinations: 1. pA-L-cyt + pA-H-cyt; 2. pA-L-pec + pA-H-res; 3. pA-L-cal + pA-H-cal; 4. pA-L-iaa + pA-H-iaa; 5. pA-L-ea2 + pA-H-ea2; 6. pA-L-aa + pA-H-aa; 7. pA-L-abp + pA-H-abp; 8.9. pA16571 + pA16671. Then, 5, 7, and 9 days after the infiltration, plant material was collected, the total soluble protein extract was obtained, and an aliquot was applied on a 7.5% polyacrylamide gel (PAGE) in the absence of beta-mercaptoethanol. Electrophoretic analysis of proteins in denaturing PAAG was carried out in accordance with the Laemmli method (Laemmli, 1970) according to the following scheme. To the preparation containing the analyzed protein, 2–3 volumes of PAG application buffer was added containing 60% glycerol, 10% SDS, 1% bromphenol blue and 0.25 M Tris-HCl, pH 6.8, after which the sample was heated 3 -10 min at 95 ° C. Electrophoresis was performed on a PAGE using a Bio-Rad instrument. The upper (concentrating) gel with a pH of 6.8 contained 3% acrylamide, 0.08% Ν, Ν'-methylenebisacrylamide, 0.125 M Tris-HCl and 0.1% SDS. The lower (separating) gel with a pH of 8.8 contained 7.5% or 12% acrylamide and 0.075 or 0.12% of Ν, Ν'-methylenebisacrylamide, respectively, 0.4 M Tris-HCl and 0.1% SDS. Samples were added to the wells of the upper gel. ThermoScientific marker protein kits (10-250 kDa) were used as molecular weight standards. Electrophoresis was carried out in a Bio-Rad instrument in Tris-glycine buffer, pH 8.4 (25 mM Tris, 0.192 M glycine, 0.1% SDS) at a direct current of 10 mA per gel in a Bio-Rad instrument . The gel was stained with Coomassie G-250 for 20 minutes, then washed. The Figure 3 shows the results of electrophoresis of plant extracts in non-reducing conditions (in the absence of β-mercaptoethanol) in a 7.5% polyacrylamide gel followed by Coomassie staining.
Для оценки эффективности работы разных сигнальных последовательностей сравнивали уровень накопления антител в растительном экстракте с помощью иммуноферментного анализа, измеряя количество тотального иммуноглобулина человека. Для этого использовали набор для определения концентрации иммуноглобулинов «IgG общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Как следует из результатов, приведенных на Фиг. 3, наиболее оптимальным оказался вариант последовательности, содержащей сигнальный пептид тяжелой цепи антител мыши, т.к. уровень накопления антитела в растительной клетке мы оценили как 65-75 мкг/мл растительного экстракта, для других же сигнальных пептидов этот уровень колеблется от 20 до 50 мкг/мл.To evaluate the performance of different signal sequences, the level of accumulation of antibodies in the plant extract was compared using enzyme-linked immunosorbent assay, measuring the amount of total human immunoglobulin. For this, a kit for determining the concentration of immunoglobulins “IgG total-IFA-BEST” (Vector-Best, Russia) according to the manufacturer's instructions was used. As follows from the results shown in FIG. 3, the most optimal variant was the sequence containing the signal peptide of the heavy chain of mouse antibodies, because we estimated the level of antibody accumulation in the plant cell as 65-75 μg / ml of plant extract; for other signal peptides, this level ranges from 20 to 50 μg / ml.
Пример 4. Создание экспрессионных вирусных амплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении.Example 4. The creation of expression of viral amplifying vectors for the production of antibodies against the dimerization domain of the excellular part of the oncoprotein HER2 / neu in a plant.
Для получения экспрессионных амплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana использовали векторы на основе генома X вируса картофеля (ХВК) и на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ). Вектор на основе ХВК содержал 35S транскрипционный промотор вируса мозаики цветной капусты, 5'-НТО ХВК, ген репликазы, первый субгеномный промотор, ген легкой цепи (SEQ ID NO: 1) и 3'-НТО ХВК. Вектор на основе ВТМ содержал эукариотический транскрипционный промотор актина 2 A.thaliana (EMBL AF308778 (An et al., 1996), обеспечивающий синтез репликазы; ген репликазы крВТМ, содержащий 8 интронов и часть последовательности гена транспортного белка крВТМ, ген тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) и 3'-нетранслируемую область (НТО) крВТМ.To obtain expression amplifying vectors for the production of antibodies against the dimerization domain of the excellular part of the HER2 / neu oncoprotein in the Nicotiana plant, vectors based on the potato virus genome X (CVC) and on the basis of the tobacco mosaic virus (TMV) genome were used. The PVX vector contained the 35S transcriptional promoter of cauliflower mosaic virus, 5'-HTV PVK, the replicase gene, the first subgenomic promoter, the light chain gene (SEQ ID NO: 1), and 3'-HTV PVK. The TMV-based vector contained the A. thaliana eukaryotic transcriptional promoter actin 2 (EMBL AF308778 (An et al., 1996), providing replicase synthesis; the krVTM replicase gene containing 8 introns and part of the krVTM transport protein gene sequence, heavy chain gene (SEQ ID NO: 2) and the 3'-untranslated region (UTR) of krVTM.
Для получения экспрессионного амплифицирующегося вектора на основе ХВК была создана промежуточная конструкция (ПК) 1. В плазмиду pGEM3Z (Promega), обработанную рестриктазами HindIII и SacI, были вставлены следующие фрагменты: фрагмент 1 (с 3452 нт по 4485 нт геном ХВК), фланкированный сайтами узнавания рестриктаз HindIII и XbaI, содержал часть гена полимеразы ХВК и участок субгеномного промотора, фрагмент 2 представлял собой ген легкой цепи с внесенными сайтами XbaI, BamHI и NcoI на 5'-конце и XhoI на 3'- конце, фрагментом 3 (с 6380 по 6552 нт генома ХВК), имеющим XhoI и SacI сайты на 5'- и 3'-конце, являлся 3'-концевой участок гена белка оболочки с частью 3'-нетранслируемой области. В результате была получена ПК1. Затем плазмиду PVXdt-GFP (Komarova et al., 2006) обработали рестриктазами AvrII-XhoI и перенесли в нее фрагмент из ПК1 по тем же сайтам. В результате получена плазмида pA16921 (Фиг. 4), несущая последовательность гена легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) в составе вектора на основе генома ХВК.To obtain an expression amplifying vector based on PVI, an intermediate construct (PC) 1 was created. The following fragments were inserted into the plasmid pGEM3Z (Promega), processed with HindIII and SacI restriction enzymes: fragment 1 (from 3452 nt to 4485 nt PVK gene), flanked by sites recognition of HindIII and XbaI restriction enzymes, contained a portion of the PVX polymerase gene and a portion of the subgenomic promoter,
Для создания вектора на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ) (Фиг. 5) была использована кДНК ВТМ крестоцветных (Dorokhov YuL et al., 1994), в которой ген репликазы был привнесен из близкородственного вирусного штамма - вируса просветления жилок турнепса (Lartey et al., 1994). Вирусный вектор, содержащий ген тяжелой цепи антитела против Her2/neu на основе генома крВТМ был создан через ряд промежуточных конструкций. Получение ПК2. Фрагмент, фланкированный сайтами EcoRI-BamHI, из плазмиды BTM(и):GFP (Комарова и др., 2012) был перенесен в pGEM3Z (Promega), в результате была создана ПК2. Для получения ПК3 в ПК2 ген GFP был заменен на ген тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) по сайтам NcoI-XhoI. Затем из ПК3 фрагмент, содержащий часть гена транспортного белка крВТМ, ген тяжелой цепи и 3'-нетранслируемую область из генома крВТМ, был перенесен в плазмиду BTM(h):GFP (Комарова и др., 2012) по сайтам EcoRI-BamHI. В результате была получена конструкция рА16722 (Фиг. 5).Cruciferous VTM cDNA (Dorokhov YuL et al., 1994) was used to create a vector based on the tobacco mosaic virus genome (VTM) (Fig. 5), in which the replicase gene was introduced from a closely related viral strain, turnip vein enlightenment virus (Lartey et al., 1994). The viral vector containing the anti-Her2 / neu antibody heavy chain gene based on the krVTM genome was created through a series of intermediate constructs. Getting PC2. A fragment flanked by EcoRI-BamHI sites from plasmid BTM (s): GFP (Komarova et al., 2012) was transferred to pGEM3Z (Promega), and PC2 was created as a result. To obtain PC3 in PC2, the GFP gene was replaced with the heavy chain gene (SEQ ID NO: 2) at the NcoI-XhoI sites. Then, a fragment from PC3 containing a part of the krBTM transport protein gene, the heavy chain gene, and a 3'-untranslated region from the krVTM genome was transferred to the BTM (h): GFP plasmid (Komarova et al., 2012) at EcoRI-BamHI sites. As a result, the construction of pA16722 was obtained (Fig. 5).
В результате были получены экспрессионные амплифицирующиеся векторы: рА16921, содержащий ген легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) (Фиг. 4), и рА16722, содержащий ген тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 2) (Фиг. 5), продуцирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana соответственно.As a result, expression amplifying vectors were obtained: pA16921, containing the antibody light chain gene (SEQ ID NO: 1) (Fig. 4), and pA16722, containing the antibody heavy chain gene (SEQ ID NO: 2) (Fig. 5), producing light and heavy chain antibodies against the dimerization domain of the exoccellular part of the oncoprotein HER2 / neu in the Nicotiana plant, respectively.
Пример 5. Продуцирование антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana.Example 5. The production of antibodies directed against the dimerization domain of the exocular part of the oncoprotein HER2 / neu in the Nicotiana plant.
Для получения растения Nicotiana, продуцирующего антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu полученными плазмидами рА16571 и рА16671 или рА16921 и рА16722 трансформировали клетки Agrobacterium tumefaciens. после чего осуществляли агроинфильтрацию листьев суспензией трансформированных клеток.In order to obtain a Nicotiana plant producing an antibody directed against the dimerization domain of the extracellular part of the HER2 / neu oncoprotein, the obtained plasmids pA16571 and pA16671 or pA16921 and pA16722 transformed Agrobacterium tumefaciens cells. after which the leaves were agroinfiltrated with a suspension of transformed cells.
Для этого выращивали полученные штаммы A.tumefaciens в ночной культуре в жидкой среде LB. Ночную культуру выращивали в течение 18 часов при 28°С, затем разводили в 10-100 раз буфером для агроинфильтрации, содержащем 10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES рН 5,0. В лист вводили суспензию смеси A.tumefaciens, содержащей плазмиды, соответствующие нереплицирующимся векторам, pA16571 (Фиг. 1) и рА16671 (Фиг. 2), или реплицирующимся векторам, pA16921 (Фиг. 3) и pA16722 (Фиг. 4). Агроинфильтрацию осуществляли с помощью шприца без иглы или путем погружения растения в суспензию агробактерий с последующим созданием вакуума. При одновременной ко-инъекции векторами, кодирующими легкую и тяжелую цепь антитела, в листьях N.benthamiana синтезируются легкая (SEQ ID NO: 3) и тяжелая цепи антитела (SEQ ID NO: 4), содержащие сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию и сборку антитела.For this, the obtained A.tumefaciens strains were grown in an overnight culture in LB liquid medium. The overnight culture was grown for 18 hours at 28 ° C, then diluted 10-100 times with agroinfiltration buffer containing 10 mM MgCl 2 and 10 mM MES pH 5.0. A suspension of a mixture of A.tumefaciens containing plasmids corresponding to non-replicating vectors pA16571 (Fig. 1) and pA16671 (Fig. 2), or replicating vectors, pA16921 (Fig. 3) and pA16722 (Fig. 4) was introduced into the leaf. Agroinfiltration was carried out using a syringe without a needle or by immersing the plant in a suspension of agrobacteria with the subsequent creation of a vacuum. With simultaneous co-injection with vectors encoding the light and heavy chain of the antibody, the light (SEQ ID NO: 3) and heavy chain of the antibody (SEQ ID NO: 4) containing the signal peptide providing secretion and assembly of the antibody are synthesized in the leaves of N. benthamiana.
Пример 6. Получение и очистка антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.Example 6. Obtaining and purification of antibodies directed against the dimerization domain of the exocular part of the oncoprotein HER2 / neu.
Антитела, направленные против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, выделяли из растительного экстракта листьев, инфильтрированных агробактерией, несущей пары плазмид рА16571 и рА16671 или рА16921 и рА16722. Для этого растительный материал, замороженный в жидком азоте, растирали до состояния пудры. К нему добавляли 4-6 объемов буфера для экстракции (200 мМ цитрат натрия, 0.1% Tween 20, 5 мМ ЭДТА, рН 6.0). Суспензию инкубировали на льду при покачивании в течение 20-30 мин, после чего центрифугировали 5000 g × 15 мин. К осадку добавляли 2 объема буфера для экстракции и проводили повторную инкубацию на льду при покачивании в течение 20-30 мин, центрифугировали при 5000 g × 15 мин. Объединенный супернатант фильтровали через Miracloth, затем центрифугировали при 15000 g × 25 мин.Antibodies directed against the dimerization domain of the extracellular part of the HER2 / neu oncoprotein were isolated from plant extract of leaves infiltrated with agrobacterium carrying pairs of plasmids pA16571 and pA16671 or pA16921 and pA16722. For this, plant material frozen in liquid nitrogen was ground to a powder state. To it was added 4-6 volumes of extraction buffer (200 mM sodium citrate, 0.1
Растительные экстракты анализировали с помощью электрофореза в невосстанавливающих условиях (в отсутствие β-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси.Plant extracts were analyzed by electrophoresis under non-reducing conditions (in the absence of β-mercaptoethanol) in a 7.5% polyacrylamide gel followed by Coomassie staining.
Как следует из результатов, приведенных на Фигуре 6, в листьях N.benthamiana через 3 дня после агроинъекции нереплицирующимися векторами, рА16571 и рА16671 накапливаются полноразмерные антитела против онкогена Her2/neu. Подобный профиль мы наблюдаем и в экстрактах растений, агроинъецированных амплифицирующимися вирусными векторами, рА16722 и pA16921. Для оценки выхода антител использовали набор для определения концентрации иммуноглобулинов «IgG общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. По результатам ИФА выход антител с амплифицирующихся векторов возрастает в несколько раз по сравнению с неамплифицирующимися векторами и составляет от 250 до 500 мг с кг листовой массы.As follows from the results shown in Figure 6, in the leaves of N. benthamiana 3 days after agroinjection by non-replicating vectors, pA16571 and pA16671, full-length antibodies against Her2 / neu oncogen accumulate. We observe a similar profile in plant extracts agroinjected with amplifying viral vectors, pA16722 and pA16921. To assess the yield of antibodies, the IgG total-IFA-BEST immunoglobulin concentration kit (Vector-Best, Russia) was used according to the manufacturer's instructions. According to the results of ELISA, the yield of antibodies from amplifying vectors increases several times in comparison with non-amplifying vectors and ranges from 250 to 500 mg per kg of leaf mass.
На следующем этапе растительный экстракт последовательно фильтровали через фильтры Millipore с диаметрами пор, начиная с 0,8 мкм, заканчивая 0,25 мкм и наносили на колонку с протеин А сефарозой, уравновешенной буфером, содержащем 10 мМ Na2HPO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ NaH2PO4, рН 8,5. Оптимальная скорость - 1 мл/мин. Экстракт наносили на колонку 2-4 раза для улучшения связывания. После нанесения, колонка промывается однократным натрий-фосфатным буфер (PBS), а затем 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6.0. Элюцию осуществляли 10 мМ NaH2PO4, рН 3, с немедленной нейтрализацией 0,4 M Na2HPO4. Для дальнейшей очистки и для удаления вирусов, ДНК и эндотоксинов была использована фильтрация «Sartobind Q нано» мембрана (Sartorius Stedim Biotech).In the next step, the plant extract was sequentially filtered through Millipore filters with pore diameters ranging from 0.8 μm to 0.25 μm and applied to a protein A Sepharose column equilibrated with 10 mM Na 2 HPO 4 , 137 mM NaCl buffer, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH 2 PO 4 , pH 8.5. The optimal speed is 1 ml / min. The extract was applied to the column 2-4 times to improve binding. After application, the column is washed with a single sodium phosphate buffer (PBS) and then with 10 mM Na phosphate buffer, pH 6.0. Elution was carried out with 10 mM NaH 2 PO 4 ,
На Фигуре 7 представлены результаты электрофореза белков, элюированных с колонки с протеин-A сефарозой.The Figure 7 presents the results of electrophoresis of proteins eluted from a protein-A Sepharose column.
Для вестерн-блот анализа белков проводили их перенос на мембрану Hybond-Р (GE Healthcare) в буфере для переноса (47,9 мМ Трис, 38,6 мМ глицин) под действием электрического тока 150 мА в течение 2 часов. Мембраны затем инкубировали с блокирующим раствором (5% обезжиренное молоко) на 1x TBS-t (1x TBS, 0,1% Tween-20), после чего проводили инкубацию с антителами к гамма (тяжелой)-цепи или каппа (легкой)-цепи. Проявка осуществлялась системой ECL (GE Healthcare). Время экспозиции мембран с рентгеновской пленкой составляло 10-60 мин.For Western blot analysis of proteins, they were transferred to a Hybond-P membrane (GE Healthcare) in a transfer buffer (47.9 mM Tris, 38.6 mM glycine) under an electric current of 150 mA for 2 hours. The membranes were then incubated with a blocking solution (5% skim milk) on 1x TBS-t (1x TBS, 0.1% Tween-20), after which they were incubated with antibodies to the gamma (heavy) chain or kappa (light) chain . The development was carried out by the ECL system (GE Healthcare). The exposure time of membranes with x-ray film was 10-60 minutes
На Фигуре 7 представлены результаты вестерн-блот анализа растительных экстрактов листьев, инфильтрированных агробактерией, несущей плазмиды рА16571 и рА16671, с использованием антител, специфических к легкой (каппа) или тяжелой (гамма) цепи человеческих иммуноглобулинов G. Электрофоретическое разделение белков проведено в восстанавливающих условиях (в присутствии β-меркаптоэтанола). Результаты экспериментов показывают, что из 1 кг листьев N.benthamiana, агроинъецированных вирусными векторами, рА16722 (Фиг. 4) и рА16921 (Фиг. 5) можно выделить до 300-500 мг очищенных антител. В результате определения биосинтетической активностью листьев различного возраста и яруса растений N.benthamiana было выявлено, что максимального выхода 500 мг антител на 1 кг листьев удается достичь при 7-дневной инфекции и, прежде всего, в листьях 3-4 яруса растений.The Figure 7 presents the results of a Western blot analysis of plant extracts of leaves infiltrated with agrobacterium bearing plasmids pA16571 and pA16671 using antibodies specific for the light (kappa) or heavy (gamma) chain of human immunoglobulins G. Electrophoretic separation of proteins was carried out under reducing conditions ( in the presence of β-mercaptoethanol). The experimental results show that from 1 kg of leaves of N. benthamiana, agroinjected with viral vectors, pA16722 (Fig. 4) and pA16921 (Fig. 5), up to 300-500 mg of purified antibodies can be isolated. As a result of determining the biosynthetic activity of leaves of different ages and levels of N.benthamiana plants, it was found that the maximum yield of 500 mg of antibodies per 1 kg of leaves can be achieved with a 7-day infection and, above all, in leaves of 3-4 tiers of plants.
Результаты препаративной очистки на колонке с протеин G сефарозой (Фиг. 6) и последующего анализа методом иммуноблота со специфическими антителами против иммуноглобулина G человека (Фиг. 7) показывают существенное накопление в трансформированном растении N.benthamiana легкой и тяжелой цепей антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.The results of preparative purification on a protein G Sepharose column (Fig. 6) and subsequent immunoblot analysis with specific antibodies against human immunoglobulin G (Fig. 7) show a significant accumulation in the transformed N. benthamiana plant of light and heavy chains of the antibody against the dimerization domain of the extracellular part Oncoprotein HER2 / neu.
Для биологических экспериментов препарат антител в концентрации 1 мг/мл в растворе 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,0 хранили в стерильных условиях в холодильнике при температуре 4°С.For biological experiments, the antibody preparation at a concentration of 1 mg / ml in a solution of 10 mm phosphate buffer, pH 7.0 was stored under sterile conditions in a refrigerator at a temperature of 4 ° C.
Пример 7. Взаимодействие антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, продуцированного в растении N.benthamiana с раковыми клетками SK-BR-3.Example 7. Interaction of antibodies against the dimerization domain of the exocellular part of the HER2 / neu oncoprotein produced in the N. benthamiana plant with SK-BR-3 cancer cells.
Аффинность рекомбинантных моноклональных антител против домена димеризации HER2/neu, продуцированных в растении, к антигену HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3, проводили с помощью проточной цитометрии. Для этого из каждой лунки 96-ячеечной платы было собрано 5×105 клеток SKBR-3. Клетки промывал дважды 1xPBS и далее инкубировали в течение 30 мин при 4°С с рекомбинантными моноклональными антителами против домена димеризации HER2/neu, продуцированными в растении. Клетки затем три раза промывали 1xPBS, после чего инкубировали в PBS с добавлением 0,1% БСА, содержащем конъюгированные с FITC иммуноглобулины, специфичные к человеческому IgG. Клетки инкубировали с антителами в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл с последующей оценкой доли связавшихся с антителами клеток. Каждое разведение антител было протестировано в трех повторностях. Результаты приведены на Фиг. 9. Как следует из приведенных результатов, антитело, полученное в N.benthamiana, является полностью функциональным и способно специфически узнавать онкобелок HER2/neu на поверхности опухолевых клеток SK-BR-3, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии онкогена HER2/neu.The affinity of the recombinant monoclonal antibodies against the HER2 / neu dimerization domain produced in the plant to the HER2 / neu antigen on the surface of SK-BR-3 cells was performed by flow cytometry. For this, 5 × 10 5 SKBR-3 cells were harvested from each well of a 96-cell plate. The cells were washed twice with 1xPBS and then incubated for 30 min at 4 ° C with recombinant monoclonal antibodies against the HER2 / neu dimerization domain produced in the plant. The cells were then washed three times with 1xPBS, after which they were incubated in PBS supplemented with 0.1% BSA containing FITC conjugated immunoglobulins specific for human IgG. Cells were incubated with antibodies at concentrations from 0.01 to 100 μg / ml, followed by an estimate of the proportion of cells bound to the antibodies. Each antibody dilution was tested in triplicate. The results are shown in FIG. 9. As follows from the above results, the antibody obtained in N. benthamiana is fully functional and is capable of specifically recognizing HER2 / neu oncoproteins on the surface of SK-BR-3 tumor cells, characterized by an increased level of HER2 / neu oncogen expression.
Пример 8. Подавление роста HER2/neu позитивных опухолей у мышей с подкожными ксенографтами рака молочной железы человека SK-BR-3 при использовании комбинации двух антител против HER2/neu, продуцированных в растении.Example 8. Inhibition of growth of HER2 / neu positive tumors in mice with subcutaneous xenografts of human breast cancer SK-BR-3 using a combination of two anti-HER2 / neu antibodies produced in a plant.
Для этой работы было проведено разведение и содержание в бестимусном отсеке половозрелых мышей-самок Balb/c nude для трансплантации опухолевого материала. Мышей содержали в специализированном бестимусном отсеке (зона SPF) в макролоновых клетках с твердым основанием, аксессуарами и аэросистемой (бумажный фильтр, бутылка внутри, Cage Type II - Hood of open design) фирмы EHRET GNBA (Германия) со свободным доступом к воде. Для разведения и содержания мышей использованы:For this work, dilution and maintenance in the athymic compartment of sexually mature Balb / c nude female mice for transplantation of tumor material was performed. The mice were kept in a specialized athymic compartment (SPF zone) in macrolon cages with a solid base, accessories and an aerosystem (paper filter, bottle inside, Cage Type II - Hood of open design) from EHRET GNBA (Germany) with free access to water. For breeding and keeping mice used:
- подстилка из бумаги ГОСТ 8273-75 (пищевая), нарезанной с помощью бумагорезательной машины BLS-272 и шреддера Kobra 240 S4 (Германия) и стерилизованная в стерилизаторе для бумаги ВК75-01;- litter of paper GOST 8273-75 (food), cut using a paper cutting machine BLS-272 and
- экструзированный гранулированного корма («МЭСТ», РФ) соответствующей пищевой ценности для разведения и содержания мышей, стерилизованный в сухожаровом шкафу;- extruded granular feed (MEST, RF) of appropriate nutritional value for breeding and keeping mice, sterilized in a dry oven;
- питьевая вода, стерилизованная в сухожаровом шкафу.- drinking water sterilized in a dry oven.
В день начала опыта всех мышей взвешивали на электронных весах MW-T series, User's Manual (фирма CAS, США), цена деления 0,01 г под контролем стандартной динамики прироста массы тела. Для введения в эксперимент мышей перед началом лечения делили на группы по 10 особей. После завершения экспериментов мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза в соответствии с методами гуманного обращения в лабораторными животными, принятыми в РФ и за рубежом.On the day of the start of the experiment, all mice were weighed on an MW-T series, User's Manual (CAS, USA) electronic balance; the division price was 0.01 g under the control of standard dynamics of body weight gain. Before introducing treatment, mice were divided into groups of 10 animals for introduction into the experiment. After the completion of the experiments, the mice were killed by an overdose of ether anesthesia in accordance with the methods of humane treatment in laboratory animals adopted in the Russian Federation and abroad.
Получение донорского прививочного материала включало выполнение двух пассажей клеток SK-BR-3 на бестимусных мышах. Использовали штамм перевиваемого рака молочной железы человека SK-BR-3 из Коллекции штаммов опухолей человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Перевиваемый рак молочной железы человека SK-BR-3 представляет собой аденокарциному, содержащую на своей поверхности до 8×105 рецепторов HER2/neu на клетку. Использованная в данном исследовании культура клеток также была проверена на наличие экспрессии поверхностного антигена Her2/neu методом цитофлюорометрии. Эта линия клеток формирует подкожные ксенографты у nude мышей и отличается отсутствием рецепторов эстрогенных и прогестероновых гормонов. В связи с этим, для ее трансплантации и роста не требуется создания гормонального фона, резко сниженного у мышей nudeObtaining donor vaccine material included performing two passages of SK-BR-3 cells on nude mice. Used the strain of transplantable human breast cancer SK-BR-3 from the Collection of strains of human tumors RONTS them. N.N. Flea. Transplantable human breast cancer SK-BR-3 is an adenocarcinoma containing up to 8 × 10 5 HER2 / neu receptors per cell on its surface. The cell culture used in this study was also tested for the expression of Her2 / neu surface antigen by cytofluorometry. This cell line forms subcutaneous xenografts in nude mice and is characterized by the absence of estrogen and progesterone hormone receptors. In this regard, for its transplantation and growth does not require the creation of a hormonal background, sharply reduced in nude mice
Для получения мышей-ксенографтов взвесь опухоли размораживали после хранения стандартным методом, затем содержимое каждой ампулы имплантировать мышам подкожно по 0,5 мл (3 млн клеток на мышь в 0,1 мл питательной среды) на мышь. Полученные опухолевые узлы (1-й пассаж, n=5) были использованы в качестве донорского материала для трансплантации. Инокулят для опыта готовили по стандартной методике и трансплантировали по 60 мг взвеси на мышь (2-й пассаж, n=20). На 6-е сутки после трансплантации, когда опухолевые узлы появляются у всех мышей (100% прививаемость), измеряли объемы опухолей, после чего животных ранжировали на 2 группы (контроль и опыт) по 10 мышей так, чтобы средний объем опухолей в каждой из групп составил 41±15,5 мм3. Группа контроля не получала специфического лечения, животным проводили внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора в режиме, аналогичном исследуемому агенту.To obtain xenograft mice, the suspension of the tumor was thawed after storage by the standard method, then the contents of each ampule were implanted into the mice subcutaneously with 0.5 ml (3 million cells per mouse in 0.1 ml of culture medium) per mouse. The resulting tumor nodes (1st passage, n = 5) were used as donor material for transplantation. The inoculum for the experiment was prepared according to the standard method and transplanted with 60 mg of suspension per mouse (2nd passage, n = 20). On the 6th day after transplantation, when the tumor nodes appear in all mice (100% vaccination), the tumor volumes were measured, after which the animals were ranked into 2 groups (control and experiment) of 10 mice so that the average tumor volume in each group amounted to 41 ± 15.5 mm 3 . The control group did not receive specific treatment; the animals received intraperitoneal injections of saline in a regimen similar to the test agent.
Другая контрольная группа получала лечение Фитотрастузумабом. Опытная группа получала лечение при совместном введении фитотрастузумаба и антитела против домена димеризации (АПДД) HER2/neu, которое начинали вводить на 5 сутки после трансплантации внутрибрюшинно курсом по аналогичной фитотрастузумабу схеме: 1-я инъекция в дозе 20 мг/кг, остальные 8 инъекций через 48 часов в разовой дозе 10 мг/кг. Длительность курса лечения - 16 дней, курсовая доза - 100 мг/кг. Таким образом, введение АПДД HER2/neu совместно с Фитотрастузумабом осуществляли внутрибрюшинно одновременно всем мышам последовательно на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21 сутки после трансплантации опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по общепринятому показателю торможению роста опухоли (ТРО). Для вычисления показателя ТРО с помощью электронного измерителя многократно в процессе и после лечения измеряли опухолевые узлы и рассчитывали средние объемы (Vcp) в каждой группе. Для контроля стандартности опухолевой модели в процессе роста определяли скорость роста опухолевых узлов по соотношению средних объемов к исходному (Vt/Vo). Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин, рассчитанных по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считаются различия при р≤0,05. Наблюдение проводили в течение 30-ти дней после трансплантации опухолей, после чего животных умертвляли передозировкой эфирного наркоза в рамках правил гуманного обращения с лабораторными животными. Результаты одновременного использования двух антител против онкобелка HER2/neu, продуцированных в растении, представлены в таблице 2.Another control group received treatment with Fitotrastuzumab. The experimental group received treatment with the joint administration of phytotrustuzumab and an antibody against the HER2 / neu dimerization domain (APDD), which was started to be administered intraperitoneally on the 5th day after the transplantation according to a similar phytotrustuzumab regimen: 1st injection at a dose of 20 mg / kg, the remaining 8 injections through 48 hours in a single dose of 10 mg / kg. The duration of the course of treatment is 16 days, the course dose is 100 mg / kg. Thus, the administration of HER2 / neu APDD together with Fitotrastuzumab was administered intraperitoneally simultaneously to all mice sequentially on
Видно, что без лечения на 22, 28 и 31 дни после имплантации опухоль достигает средних объемов Vcp=704±137 мм3, 1083±218 мм3 и 1410±384 мм3. На эти сроки (10 дней) кратность увеличения опухолей составила, соответственно Vt1-3/V0=20,7-31,9-41,5. За весь период роста в группе КРО опухолевые узлы увеличились боле чем в 40 раз.It can be seen that without treatment, on the 22nd, 28th and 31st days after implantation, the tumor reaches average volumes Vcp = 704 ± 137 mm 3 , 1083 ± 218 mm 3 and 1410 ± 384 mm 3 . For these periods (10 days), the multiplicity of tumor growth was, respectively, V t1-3 / V 0 = 20.7-31.9-41.5. Over the entire growth period in the CRO group, the tumor nodes increased by more than 40 times.
В основной группе, получившей сочетание Фитотрастузумаб и АПДД Her2/neu, средний объем и кратность увеличения опухоли на все сроки после окончания лечения были достоверно меньше контрольных.In the main group receiving the combination of Fitotrastuzumab and Her2 / neu APDD, the average volume and the multiplicity of tumor growth for all periods after the end of treatment were significantly less than the control ones.
Из таблицы 2 видно, что наиболее эффективное достоверное (р<0,05) подавление роста опухоли наблюдается при использовании комбинации двух моноклональных антител, продуцированных в растении - фитотрастузумаб и АПДД HER2/neu, причем эффективность этой комбинации по крайней мере в два раза выше, чем одного фитотрастузумаба. Сравнение с группой Фитотрастузумаба показало достоверный почти двукратный терапевтический выигрыш. Соответственно, показатели эффективности по срокам измерения составили в группе с сочетанием Фитотрастузумаба + АПДД Her2/neu против группы Фитотрастузумаба (Таблица 3):Table 2 shows that the most effective reliable (p <0.05) inhibition of tumor growth is observed when using a combination of two monoclonal antibodies produced in the plant - phytotrastuzumab and HER2 / neu APDD, and this combination is at least twice as effective. than one phytotrustuzumab. Comparison with the Fitotrastuzumab group showed a significant almost double therapeutic gain. Accordingly, the performance indicators for the measurement time were in the group with the combination of Fitotrastuzumab + APDD Her2 / neu against the group of Fitotrastuzumab (Table 3):
Т/С=21, 35 и 41% (р<0,05) против Т/С=45 и 59 (р<0,05);T / C = 21, 35 and 41% (p <0.05) versus T / C = 45 and 59 (p <0.05);
Vt1-3/V0=4,2-11,2-16,9 против Vt1-3/V0=9,3-18,9-27,7.V t1-3 / V 0 = 4.2-11.2-16.9 vs V t1-3 / V 0 = 9.3-18.9-27.7.
Переносимость лечения во всех группах мышей была удовлетворительной. Состояние и поведение мышей было в пределах физиологической нормы, гибели от токсичности не отмечали.Treatment tolerance was satisfactory in all groups of mice. The condition and behavior of mice was within the physiological norm; death from toxicity was not noted.
Таким образом, вышеописанные примеры иллюстрируют разработанный авторами способ продукции в растительной клетке MA против домена димеризации HER2/neu, позволяющий получать функционально активный препарат MA против РМЖ для использования в комплексной терапии.Thus, the above examples illustrate the method developed by the authors for the production of MA against a HER2 / neu dimerization domain in a plant cell, which makes it possible to obtain a functionally active MA preparation against breast cancer for use in complex therapy.
Конкретные гены, векторы, виды растений, применения, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.Specific genes, vectors, plant species, uses, materials and methods described herein are preferred embodiments, are exemplary, and are not intended to limit the scope of the invention. When studying this description, other objects, aspects, and embodiments will come to mind to those skilled in the art, and they are encompassed by the scope of this invention. Specialists in this field will be clear that various replacements and modifications can be made in relation to the invention described here without deviating from its scope and scope, which are determined by the attached claims.
Цитированная литератураCited literature
Комарова Т.В., Шеваль Е.В., Поздышев Д.В., Колесникова B.C., Дорохов Ю.Л. (2012).Komarova T.V., Sheval E.V., Pozdyshev D.V., Kolesnikova B.C., Dorokhov Yu.L. (2012).
Интенсивный синтез зеленого флуоресцирующего белка ведет к формированиюIntensive synthesis of green fluorescent protein leads to the formation of
Y-тел включения в растительной клетке. Биохимия, 77, №6, 742-749. Ahmed, S., Sami, Α., Xiang, J., 2015. HER2-directed therapy: current treatment options forY-inclusion bodies in a plant cell. Biochemistry, 77, No. 6, 742-749. Ahmed, S., Sami, Α., Xiang, J., 2015. HER2-directed therapy: current treatment options for
HER2-positive breast cancer. Breast Cancer Tokyo Jpn. doi: 10.1007/s12282-015-0587-xHER2-positive breast cancer. Breast Cancer Tokyo Jpn. doi: 10.1007 / s12282-015-0587-x
An, Y.Q., McDowell, J.M., Huang, S., McKinney, E.C., Chambliss, S., Meagher, R.B., 1996.An, Y.Q., McDowell, J.M., Huang, S., McKinney, E.C., Chambliss, S., Meagher, R.B., 1996.
Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Cell Mol. Biol. 10, 107-121.Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2 / ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Cell Mol. Biol. 10, 107-121.
Arce, A.L., Cabello, J.V., Chan, R.L., 2008. Patents on plant transcription factors. Recent Pat. Biotechnol. 2, 209-217.Arce, A. L., Cabello, J. V., Chan, R. L., 2008. Patents on plant transcription factors. Recent Pat. Biotechnol. 2, 209-217.
Barthélémy, P., Leblanc, J., Wendling, F., Wissler, M.-P., Bergerat, J.-P., 2014. Pertuzumab and solid tumors: perspectives. Bull. Cancer (Paris) 101, 1114-1121. doi:10.1684/bdc.2014.2026Barthélémy, P., Leblanc, J., Wendling, F., Wissler, M.-P., Bergerat, J.-P., 2014. Pertuzumab and solid tumors: perspectives. Bull. Cancer (Paris) 101, 1114-1121. doi: 10.1684 / bdc.2014.2026
Chung, C., Lam, M.S.H., 2013. Pertuzumab for the treatment of human epidermal growth factor receptor type 2-positive metastatic breast cancer. Am. J. Health-Syst. Pharm. AJHP Off. J. Am. Soc. Health-Syst. Pharm. 70, 1579-1587. doi:10.2146/ajhpl20735Chung, C., Lam, M.S.H., 2013. Pertuzumab for the treatment of human epidermal growth factor receptor type 2-positive metastatic breast cancer. Am. J. Health-Syst. Pharm. AJHP Off. J. Am. Soc. Health Syst. Pharm. 70, 1579-1587. doi: 10.2146 / ajhpl20735
Dorokhov YuL, null, Ivanov, P.A., Novikov, V.K., Agranovsky, A.A., Morozov SYu, null, Efimov, V.A., Casper, R., Atabekov, J.G., 1994. Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants. FEBS Lett. 350, 5-8.Dorokhov YuL, null, Ivanov, P.A., Novikov, V.K., Agranovsky, A.A., Morozov SYu, null, Efimov, V.A., Casper, R., Atabekov, J.G., 1994. Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants. FEBS Lett. 350, 5-8.
Fleck, L.M., 2006. The costs of caring: Who pays? Who profits? Who panders? Hastings Cent. Rep. 36, 13-17.Fleck, L.M., 2006. The costs of caring: Who pays? Who profits? Who panders? Hastings Cent. Rep. 36, 13-17.
Giritch, Α., Marillonnet, S., Engler, C, van Eldik, G., Botterman, J., Klimyuk, V., Gleba, Y., 2006. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706. doi: 10.1073/pnas.0606631103Giritch, Α., Marillonnet, S., Engler, C, van Eldik, G., Botterman, J., Klimyuk, V., Gleba, Y., 2006. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706. doi: 10.1073 / pnas.0606631103
Harries, M, Smith, I., 2002. The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin). Endocr. Relat. Cancer 9, 75-85.Harries, M, Smith, I., 2002. The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin). Endocr. Relat.
Hudis, C.A., 2007. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice. N. Engl. J. Med. 357, 39-51. doi:10.1056/NEJMra043186Hudis, C. A., 2007. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice. N. Engl. J. Med. 357, 39-51. doi: 10.1056 / NEJMra043186
Hudziak, R.M., Lewis, G.D., Winget, M., Fendly, B.M., Shepard, H.M., Ullrich, Α., 1989. p185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172.Hudziak, R. M., Lewis, G. D., Winget, M., Fendly, B. M., Shepard, H. M., Ullrich, Α., 1989. p185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172.
Hu, S., Sun, Y., Meng, Y., Wang, X., Yang, W., Fu, W., Guo, H., Qian, W., Hou, S., Li, В., Rao, Z., Lou, Z., Guo, Y., 2014. Molecular architecture of the ErbB2 extracellular domain homodimer. Oncotarget.Hu, S., Sun, Y., Meng, Y., Wang, X., Yang, W., Fu, W., Guo, H., Qian, W., Hou, S., Li, B., Rao, Z., Lou, Z., Guo, Y., 2014. Molecular architecture of the ErbB2 extracellular domain homodimer. Oncotarget.
Kawajiri, H., Takashima, T., Kashiwagi, S., Noda, S., Onoda, N., Hirakawa, K., 2015. Pertuzumab in combination with trastuzumab and docetaxel for HER2-positive metastatic breast cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 15, 17-26. doi:10.1586/14737140.2015.992418Kawajiri, H., Takashima, T., Kashiwagi, S., Noda, S., Onoda, N., Hirakawa, K., 2015. Pertuzumab in combination with trastuzumab and docetaxel for HER2-positive metastatic breast cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 15, 17-26. doi: 10.1586 / 14737140.2015.992418
Komarova, T.V., Baschieri, S., Donini, M., Marusic, C., Benvenuto, E., Dorokhov, Y.L., 2010. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. Expert Rev. Vaccines 9, 859-876. doi:10.1586/erv.10.85Komarova, T.V., Baschieri, S., Donini, M., Marusic, C., Benvenuto, E., Dorokhov, Y. L., 2010. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals.
Komarova, T.V., Kosorukov, V.S., Frolova, O.Y., Petrunia, I.V., Skrypnik, K.A., Gleba, Y.Y., Dorokhov, Y.L., 2011. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits HER2/Neu+ cell proliferation and retards tumor growth. PloS One 6, e17541. doi:10.1371/journal.pone.0017541Komarova, T.V., Kosorukov, V.S., Frolova, O.Y., Petrunia, I.V., Skrypnik, K.A., Gleba, Y.Y., Dorokhov, Y.L., 2011. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits HER2 / Neu + cell proliferation and retards growth. PloS One 6, e17541. doi: 10.1371 / journal.pone.0017541
Komarova, T.V., Skulachev, M.V., Zvereva, A.S., Schwartz, A.M., Dorokhov, Y.L., Atabekov, J.G., 2006. New viral vector for efficient production of target proteins in plants. Biochem. Biokhimii€a 71, 846-850.Komarova, T.V., Skulachev, M.V., Zvereva, A.S., Schwartz, A.M., Dorokhov, Y. L., Atabekov, J.G., 2006. New viral vector for efficient production of target proteins in plants. Biochem. Biokhimii € a 71, 846-850.
Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lartey, R.T., Lane, L.C., Melcher, U., 1994. Electron microscopic and molecular characterization of turnip vein-clearing virus. Arch. Virol. 138, 287-298.Lartey, R.T., Lane, L.C., Melcher, U., 1994. Electron microscopic and molecular characterization of turnip vein-clearing virus. Arch. Virol. 138, 287-298.
Macedo, Α., Monteiro, I., Andrade, S., Cirrincione, Α., Ray, J., 2010. [Cost-effectiveness of trastuzumab in the treatment of early stages breast cancer patients, in Portugal]. Acta Médica Port. 23, 475-482.Macedo, Α., Monteiro, I., Andrade, S., Cirrincione, Α., Ray, J., 2010. [Cost-effectiveness of trastuzumab in the treatment of early stages breast cancer patients, in Portugal]. Acta Médica Port. 23, 475-482.
Makhzoum, Α., Benyammi, R., Moustafa, K., Trémouillaux-Guiller, J., 2014. Recent advances on host plants and expression cassettes' structure and function in plant molecular pharming. BioDrugs Clin. Immunother. Biopharm. Gene Ther. 28, 145-159. doi:10.1007/s40259-013-0062-1Makhzoum, Α., Benyammi, R., Moustafa, K., Trémouillaux-Guiller, J., 2014. Recent advances on host plants and expression cassettes' structure and function in plant molecular pharming. BioDrugs Clin. Immunother. Biopharm. Gene Ther. 28, 145-159. doi: 10.1007 / s40259-013-0062-1
Peake, B.F., Nahta, R., 2014. Resistance to HER2-targeted therapies: a potential role for FOXM1. Breast Cancer Manag. 3, 423-431. doi:10.2217/bmt.14.33Peake, B.F., Nahta, R., 2014. Resistance to HER2-targeted therapies: a potential role for FOXM1. Breast Cancer Manag. 3, 423-431. doi: 10.2217 / bmt.14.33
Rimawi, M.F., Schiff, R., Osborne, C.K., 2015. Targeting HER2 for the Treatment of Breast Cancer. Annu. Rev. Med. 66, 111-128. dor.10.1146/annurev-med-042513-015127Rimawi, M.F., Schiff, R., Osborne, C.K., 2015. Targeting HER2 for the Treatment of Breast Cancer. Annu. Rev. Med. 66, 111-128. dor.10.1146 / annurev-med-042513-015127
WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014., WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization, Geneva. WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014., WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization, Geneva.
Claims (41)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016112466A RU2648161C2 (en) | 2016-04-01 | 2016-04-01 | Method of obtaining the antibody, which specifically binds the domain of the her2/neu excellular part of the her2/neu oncoprotein, in the plant, the antibody, which is obtained by means of this method and its application |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016112466A RU2648161C2 (en) | 2016-04-01 | 2016-04-01 | Method of obtaining the antibody, which specifically binds the domain of the her2/neu excellular part of the her2/neu oncoprotein, in the plant, the antibody, which is obtained by means of this method and its application |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016112466A RU2016112466A (en) | 2017-10-04 |
| RU2648161C2 true RU2648161C2 (en) | 2018-03-22 |
Family
ID=60047484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016112466A RU2648161C2 (en) | 2016-04-01 | 2016-04-01 | Method of obtaining the antibody, which specifically binds the domain of the her2/neu excellular part of the her2/neu oncoprotein, in the plant, the antibody, which is obtained by means of this method and its application |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2648161C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7560111B2 (en) * | 2004-07-22 | 2009-07-14 | Genentech, Inc. | HER2 antibody composition |
| RU2370280C2 (en) * | 2007-10-08 | 2009-10-20 | Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского | METHOD OF HER2/neu ONCOGENE ANTIBODY SUPERPRODUCTION IN PLANT |
| RU2402607C2 (en) * | 2008-10-21 | 2010-10-27 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Virus vector for production of recombinant proteins in plants |
-
2016
- 2016-04-01 RU RU2016112466A patent/RU2648161C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7560111B2 (en) * | 2004-07-22 | 2009-07-14 | Genentech, Inc. | HER2 antibody composition |
| RU2370280C2 (en) * | 2007-10-08 | 2009-10-20 | Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского | METHOD OF HER2/neu ONCOGENE ANTIBODY SUPERPRODUCTION IN PLANT |
| RU2402607C2 (en) * | 2008-10-21 | 2010-10-27 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Virus vector for production of recombinant proteins in plants |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016112466A (en) | 2017-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2486791A2 (en) | Highly pathogenic avian influenza virus protein vaccine derived from transgenic plants, and method for preparing same | |
| Kumar et al. | Production of hepatitis B surface antigen in recombinant plant systems: an update | |
| JP7291973B2 (en) | Porcine epidemic diarrhea virus vaccine composition and method for producing the same | |
| CA2388955A1 (en) | Recombinant fusion molecules | |
| US8557246B2 (en) | Fusion protein that directs vaccine antigens to antigen-presenting cells, and applications thereof | |
| KR102317403B1 (en) | Vaccine composition for preventing tuberculosis containing a glycosylated Ag85A protein and method for producing the vaccine composition | |
| CN105154408B (en) | A kind of monoclonal antibody and application thereof of detection antiweed glyphosate albumen | |
| KR102444019B1 (en) | Recombinant vectors for the preparation of antigens for prevention of African swine fever and uses thereof | |
| RU2648161C2 (en) | Method of obtaining the antibody, which specifically binds the domain of the her2/neu excellular part of the her2/neu oncoprotein, in the plant, the antibody, which is obtained by means of this method and its application | |
| Noris et al. | A human papillomavirus 8 E7 protein produced in plants is able to trigger the mouse immune system and delay the development of skin lesions | |
| KR102200773B1 (en) | A antigen fused with porcine Fc fragment and vaccine composition comprising the same | |
| RU2370280C2 (en) | METHOD OF HER2/neu ONCOGENE ANTIBODY SUPERPRODUCTION IN PLANT | |
| Barzigar et al. | Transient recombinant expression of highly immunogenic CagA, VacA and NapA in Nicotiana benthamiana | |
| CN103981191A (en) | Plant seed expression system for single-chain antibody against CD20 | |
| Shafique et al. | Expression of mastitis causing fibrinogen binding protein of gram positive bacteria in genetically engineered switchgrass and antibodies production in mice | |
| CN103068837A (en) | Chimeric momp antigen, method and use | |
| KR20100015187A (en) | Edible swine cholera vaccine using plant transformant and method for preparing the same | |
| US20040161432A1 (en) | Subunit vaccines and processes for the production thereof | |
| Naseri et al. | Expression of novel lhmlt fusion protein using plant viral vector and study of its anticancer effect | |
| Razna | Progress of edible vaccine development | |
| KR20240173301A (en) | A recombinant vector for transformation of Tomato and methods for preparing target protein using the same | |
| CN105002195B (en) | A kind of pig blue-ear disease recombinant vaccine | |
| KR102712874B1 (en) | High frequency specific expression promoter | |
| JP5105272B2 (en) | Rice containing a gene encoding amyloid β peptide | |
| KR20240120818A (en) | Vaccine compositions comprising recombinant Zika virus envelope proteins expressed from plants and preparation methods thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200402 |