RU2647420C1 - Combined method of hystochemical detection of dezoxyribonucleoprotenins, polysaccharides and hydrocarbon components of bio polymers in semitinous sections of tissues and organs - Google Patents
Combined method of hystochemical detection of dezoxyribonucleoprotenins, polysaccharides and hydrocarbon components of bio polymers in semitinous sections of tissues and organs Download PDFInfo
- Publication number
- RU2647420C1 RU2647420C1 RU2016147502A RU2016147502A RU2647420C1 RU 2647420 C1 RU2647420 C1 RU 2647420C1 RU 2016147502 A RU2016147502 A RU 2016147502A RU 2016147502 A RU2016147502 A RU 2016147502A RU 2647420 C1 RU2647420 C1 RU 2647420C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sections
- minutes
- reaction
- distilled water
- semitinous
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 13
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 13
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 title claims description 8
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 title 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 title 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 title 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 14
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- MLIWQXBKMZNZNF-KUHOPJCQSA-N (2e)-2,6-bis[(4-azidophenyl)methylidene]-4-methylcyclohexan-1-one Chemical compound O=C1\C(=C\C=2C=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])CC(C)CC1=CC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 MLIWQXBKMZNZNF-KUHOPJCQSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108091023046 Deoxyribonucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229920003319 Araldite® Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 51
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 7
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 7
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 5
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 3
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108010022894 Euchromatin Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 2
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 2
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N dibutyl phthalate Chemical compound CCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCC DOIRQSBPFJWKBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 210000000632 euchromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 229910000487 osmium oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- JIWAALDUIFCBLV-UHFFFAOYSA-N oxoosmium Chemical compound [Os]=O JIWAALDUIFCBLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 2
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YAXXOCZAXKLLCV-UHFFFAOYSA-N 3-dodecyloxolane-2,5-dione Chemical compound CCCCCCCCCCCCC1CC(=O)OC1=O YAXXOCZAXKLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical group O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- -1 for example Polymers 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M periodate Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001230 potassium iodate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 229940043672 thyroid preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
- G01N2001/364—Embedding or analogous mounting of samples using resins, epoxy
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, а именно к гистологическим исследованиям. Наиболее часто используемыми гистохимическими реакциями для световой микроскопии являются реакция Фельгена и ШИК-реакция (реактив Шиффа-йодная кислота) [3]. ШИК-реакция выявляет в срезах полисахариды и углеводные компоненты гликопротеинов и заключается в окислении перйодатом калия или натрия полисахаридов с образованием из гидроксильных групп альдегидных, дающих реакцию с фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа) с образованием продуктов малинового цвета [4]. Реакция Фельгена выявляет пентозы в составе дезоксирибонуклеопротеинов и также основана на применении реактива Шиффа. Ее особенностью является предварительный кислотный гидролиз нуклеопротеинов при температуре 60°С вместо использования перйодата [4]. При кислотном гидролизе в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) разрываются гликозидные связи, соединяющие пентозу с азотистым основанием, вследствие чего в пентозах освобождаются реакционно-способные альдегидные группы у первого атома углерода, которые затем реагируют с реактивом Шиффа. Многие полимеры, содержащие углеводы, при этом гидролизуются, деполимеризуются и экстрагируются, вследствие чего реакция положительная Фельгена и ШИК-реакция одновременно не могут проявляться, и их совместное проведение нецелесообразно из-за высокой вероятности ложноотрицательных результатов.The invention relates to experimental medicine and biology, namely to histological studies. The most commonly used histochemical reactions for light microscopy are the Felgen reaction and the SIR reaction (Schiff-iodic acid reagent) [3]. The SIC reaction reveals polysaccharides and carbohydrate components of glycoproteins in the slices and consists in the oxidation of polysaccharides with potassium or sodium periodate to form aldehyde groups from the hydroxyl groups, which give a reaction with fuchsulfuric acid (Schiff's reagent) with the formation of raspberry colored products [4]. The Felgen reaction reveals pentoses in the composition of deoxyribonucleoproteins and is also based on the use of Schiff's reagent. Its peculiarity is preliminary acid hydrolysis of nucleoproteins at a temperature of 60 ° C instead of using periodate [4]. During acid hydrolysis in deoxyribonucleic acid (DNA), glycosidic bonds are broken that connect the pentose to the nitrogenous base, as a result of which reactive aldehyde groups at the first carbon atom are released in pentoses, which then react with the Schiff reagent. Many polymers containing carbohydrates are hydrolyzed, depolymerized and extracted, as a result of which the positive Felgen reaction and the SIR reaction cannot occur simultaneously, and their joint implementation is impractical due to the high probability of false negative results.
Особую сложность представляет гистохимическое выявление дезоксирибонуклеопротеинов и углеводных структур в полутонких срезах тканей и органов, залитых в смолы для электронно-микроскопического исследования. Изготовление полутонких срезов толщиной 1-2 мкм предшествует электронно-микроскопическому исследованию биологических препаратов и необходимо для выявления клеток и неклеточных структур, интересующих исследователя, для последующего изготовления ультратонких срезов. Гистохимические методики, широко применяемые при исследовании гистологических препаратов, изготовленных из обезвоженных в спиртах и залитых в парафин кусочков ткани, не всегда воспроизводятся на полутонких срезах, так как при подготовке ткани для электронно-микроскопического исследования образцы контрастируются оксидом осмия, уранилацетатом, что существенно влияет на течение гистохимических реакций, а затем заливаются в эпоксидные смолы, которые, полимеризуясь, изменяют свойства биополимеров [1]. Проведение гистохимических реакций, направленных на выявление основных биополимеров в клетках, таких как нуклеиновые кислоты, полисахариды и гликопротеины позволило бы существенно повысить точность выявления органелл и включений, а также дифференцировки сходных по строению структур, таких как фрагментированные ядра, секреторные гранулы, лизосомы, что значительно повысило бы точность отбора участков тканей и органов для электронной микроскопии, избавило от необходимости заливки и исследования большего количества объектов, а соответственно, снизило стоимость исследования. Помимо этого данные методики позволили бы существенно расширить использование полутонких срезов в гистологических и цитологических исследованиях с использованием световой микроскопии, так как полутонкие срезы позволяют визуализировать структуры, недоступные для исследования классических гистологических препаратов. Использование гистохимических реакций, выявление и дифференцировка внутриклеточных образований могли бы в ряде случаев проводиться и без использования электронной микроскопии, что также существенно позволяет снизить стоимость исследования.Of particular difficulty is the histochemical detection of deoxyribonucleoproteins and carbohydrate structures in semi-thin sections of tissues and organs embedded in resins for electron microscopy. The manufacture of semi-thin sections with a thickness of 1-2 μm precedes the electron microscopic examination of biological preparations and is necessary to identify cells and non-cellular structures of interest to the researcher, for the subsequent manufacture of ultra-thin sections. Histochemical methods that are widely used in the study of histological preparations made from pieces of tissue dehydrated in alcohols and embedded in paraffin do not always reproduce on semi-thin sections, since when preparing the tissue for electron microscopy, the samples are contrasted with osmium oxide, uranyl acetate, which significantly affects the course of histochemical reactions, and then poured into epoxy resins, which, when polymerized, change the properties of biopolymers [1]. Conducting histochemical reactions aimed at identifying the main biopolymers in cells, such as nucleic acids, polysaccharides and glycoproteins, would significantly increase the accuracy of detection of organelles and inclusions, as well as the differentiation of structures similar in structure, such as fragmented nuclei, secretory granules, lysosomes, which is significantly would increase the accuracy of the selection of tissue and organ sections for electron microscopy, eliminate the need to fill and study more objects, and accordingly Twain, reduced the cost of the study. In addition, these techniques would significantly expand the use of semi-thin sections in histological and cytological studies using light microscopy, since semi-thin sections allow visualization of structures inaccessible to the study of classical histological preparations. The use of histochemical reactions, the identification and differentiation of intracellular formations could in some cases be carried out without the use of electron microscopy, which also significantly reduces the cost of the study.
Реакция Фельгена на полутонких срезах затруднена, так как смолы и контрастирующие вещества ингибируют проявление окраски [2]. Наиболее близким аналогом реакции Фельгена в полутонких срезах является методика, разработанная для неконтрастированных препаратов [9]. Образцы для исследований фиксируют в глутаровом альдегиде без постфиксации оксидом осмия и заливают в Эпон. Изготавливают полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм. Кислотный гидролиз проводят в течение 1 ч при комнатной температуре в 5 н. растворе соляной кислоты. Затем на срезы наносят реактив Шиффа и инкубируют в темноте в течение 1-2 ч. Ядра окрашиваются в ярко-розовый цвет.The Felgen reaction on semi-thin sections is difficult, since resins and contrast agents inhibit the manifestation of color [2]. The closest analogue of the Felgen reaction in semi-thin sections is the technique developed for non-contrasted preparations [9]. Samples for research are fixed in glutaraldehyde without postfixation with osmium oxide and poured into Epon. Semi-thin sections of 1-2 microns thick are made. Acid hydrolysis is carried out for 1 h at room temperature in 5 N. hydrochloric acid solution. Then Schiff's reagent is applied to the sections and incubated in the dark for 1-2 hours. The nuclei are painted in bright pink.
Недостатком метода является получение аналогичного окрашивания и без кислотного гидролиза, который является определяющим фактором в развитии реакции Фельгена, только за счет реакции реактива Шиффа с глутаровым альдегидом, присутствующим в образце, то есть окрашивание является неспецифической реакцией, что было установлено самим разработчиком метода [9]. Помимо этого подготовка образцов не позволяет использовать их в дальнейшем для электронно-микроскопических исследований.The disadvantage of this method is to obtain a similar stain without acid hydrolysis, which is a determining factor in the development of the Felgen reaction, only due to the reaction of the Schiff reagent with glutaraldehyde present in the sample, that is, staining is a nonspecific reaction, which was established by the developer of the method [9] . In addition, sample preparation does not allow their further use for electron microscopic studies.
Известно несколько способов проведения ШИК-реакции на полутонких срезах [5, 6]. Их общими недостатками являются сильное повреждающее воздействие на ткань дополнительных окислителей, например перекиси водорода, а также способность давать специфическое окрашивание препаратов только при использовании определенного типа заливочной смолы (метакрилат, Эпон, Аралдит). В настоящее время, как правило, для изготовления препаратов применяется комбинированная смесь смол Эпон и Аралдит, а метакрилат практически не применяется в электронной микроскопии.Several methods are known for conducting a SEC reaction on semi-thin sections [5, 6]. Their common disadvantages are the strong damaging effect on the fabric of additional oxidizing agents, such as hydrogen peroxide, as well as the ability to give specific staining of drugs only when using a certain type of filling resin (methacrylate, Epon, Araldit). Currently, as a rule, a combined mixture of Epon and Araldit resins is used for the manufacture of drugs, and methacrylate is practically not used in electron microscopy.
Наиболее близким аналогом к заявляемому способу является способ, предложенный R. DiBella и K. Hashimoto [7], по проведению ШИК-реакции на полутонких срезах. На препараты биологических образцов, залитых в Аралдит, наносят несколько капель 0,5%-ного перйодата калия на 10 мин и нагревают стекла на нагревательном столике до 65°C. Чтобы избежать испарения по мере надобности перйодат добавляют на срезы. Затем погружают стекла в дистиллированную воду, а затем снова прогревают до испарения воды. На прогретый до 65°C препарат наносят капельно реактив Шиффа на 5 мин, периодически добавляя для предупреждения испарения. Реактив изменяет цвет на пурпурный, после чего срезы отмываются в дистиллированной воде.The closest analogue to the claimed method is the method proposed by R. DiBella and K. Hashimoto [7], to conduct the SEC reaction in semi-thin sections. A few drops of 0.5% potassium periodate are applied to the preparations of biological samples poured into Araldit for 10 minutes and the glasses are heated on a heating table to 65 ° C. To avoid evaporation, periodate is added to the slices as needed. Then the glass is immersed in distilled water, and then heated again until the water evaporates. Schiff's reagent is applied dropwise to a preparation warmed up to 65 ° C for 5 minutes, periodically adding to prevent evaporation. The reagent changes color to purple, after which the sections are washed in distilled water.
Недостатком данного метода является необходимость неоднократного инкубирования срезов при повышенной температуре, которая вызывает пересушивание препарата, а в дальнейшем при отмывании в дистиллированной воде отклеивание и потерю срезов. Метод не окрашивает биологические образцы, залитые в другие заливочные смолы. Не комбинируется с другими гистохимическими методиками.The disadvantage of this method is the need for repeated incubation of sections at elevated temperature, which causes the drug to dry out, and then, when washing in distilled water, peeling and loss of sections. The method does not stain biological samples embedded in other casting resins. It is not combined with other histochemical methods.
Задача изобретения - разработать методику, позволяющую одновременно проводить гистохимическое выявление ДНК, полисахаридов и углеводных компонентов различных классов биополимеров (гликопротеинов) в полутонких срезах образцов, залитых в комбинированные смолы, дающую специфическое окрашивание различных тканей и органов, с минимальным повреждающим воздействием на срезы.The objective of the invention is to develop a technique that allows simultaneous histochemical detection of DNA, polysaccharides and carbohydrate components of various classes of biopolymers (glycoproteins) in semi-thin sections of samples poured into combined resins, giving specific staining of various tissues and organs, with minimal damaging effects on the sections.
Заявленный способ одновременного гистохимического выявления ДНК, полисахаридов и углеводных компонентов биополимеров в полутонких срезах биологических образцов, залитых в смесь смол эпона и аралдита, заключается в погружение срезов в 0,5 М раствор гидроксида калия в абсолютном метаноле на 10 мин при комнатной температуре, переносе срезов в первый абсолютный этиловый спирт на 3 мин, затем - во второй и третий абсолютный этанол также с инкубацией 3 мин. Затем срезы промываются в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин. После третьей промывки избыток воды осторожно удаляется со стекол вокруг срезов фильтровальной бумагой, и предметные стекла со срезами оставляют для подсушивания при комнатной температуре на 3-4 мин. Затем на срезы капельно наносят 1%-ный водный раствор перйодата калия и инкубируют при комнатной температуре 8 мин. Погружают стекла в дистиллированную воду на несколько секунд для удаления перийодата. Затем избыток воды удаляют со стекол вокруг срезов фильтровальной бумагой. Срезы подсушивают при комнатной температуре в течение 3-4 мин. На срезы капельно наносят реактив Шиффа и помещают срезы в темноту на 30 мин. После окончания инкубации срезы погружают на 2-3 мин в проточную холодную воду. В это время приготовляют сернистую воду добавлением к 100 мл дистиллированной воды 0,5 г метабисульфита натрия и 5-6 капель 1 н. соляной кислоты. Затем переносят на 1 мин в сернистую воду, после чего промывают в дистиллированной воде в течение 1 мин. Удаляют избыток воды со стекол фильтровальной бумагой, оставляют срезы при комнатной температуре на 5 мин для высыхания, затем наносят среду для заключения препаратов и покрывают покровным стеклом.The claimed method for simultaneous histochemical detection of DNA, polysaccharides and carbohydrate components of biopolymers in semi-thin sections of biological samples embedded in a mixture of epon and araldite resins consists in immersing the sections in a 0.5 M solution of potassium hydroxide in absolute methanol for 10 min at room temperature, transferring the sections in the first absolute ethanol for 3 minutes, then in the second and third absolute ethanol also with an incubation of 3 minutes. Then the sections are washed in three shifts of distilled water for 3 minutes. After the third washing, excess water is carefully removed from the glasses around the sections with filter paper, and the slides with sections are left to dry at room temperature for 3-4 minutes. Then, a 1% aqueous solution of potassium periodate is added dropwise to the sections and incubated at room temperature for 8 minutes. Immerse the glass in distilled water for a few seconds to remove the periodate. Then, excess water is removed from the glasses around the sections with filter paper. Slices are dried at room temperature for 3-4 minutes. Schiff's reagent is applied dropwise to the sections and the sections are placed in the dark for 30 minutes. After incubation, the sections are immersed for 2-3 minutes in running cold water. At this time, sulphurous water is prepared by adding 0.5 g of sodium metabisulfite and 5-6 drops of 1N to 100 ml of distilled water. of hydrochloric acid. Then it is transferred for 1 min into sulphurous water, after which it is washed in distilled water for 1 min. Remove excess water from the glasses with filter paper, leave the slices at room temperature for 5 minutes to dry, then apply the medium for the conclusion of the preparations and cover with a coverslip.
Технический результат заключается в появлении стабильного специфического окрашивания структур, содержащих ДНК и углеводы, в оттенки от розово-сиреневого до малиново-фиолетового в различных органах и тканях, залитых в смесь Эпона и Аралдита, без потери и термического повреждения полутонких срезов.The technical result consists in the appearance of stable specific staining of structures containing DNA and carbohydrates in shades from pink-lilac to raspberry-violet in various organs and tissues embedded in a mixture of Epon and Araldite, without loss and thermal damage to semi-thin sections.
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе кислотный гидролиз ДНК при повышенной температуре заменен на обработку спиртовым раствором щелочи. Для выявления ДНК в полутонких срезах образцов необходимо было сделать пентозы ДНК доступными для проведения ШИК-реакции, как с другими полисахаридами и гликопротеинами, то есть освободить их гидроксильные группы для реакции с перйодатом, что позволит избежать разрыва гликозидных связей и окисления пентоз кислотой. Для образования в пентозах реакционно-способных альдегидных групп провели щелочной гидролиз в 0,5 М растворе гидроокиси калия в метаноле. Воздействие щелочи вызывает отщепление от нуклеотидов остатков фосфорной кислоты с образованием нуклеозидов. Разрыва гликозидных связей при этом не происходит, но освобождается гидроксильная группа у третьего атома углерода пентозы. Это дает возможность окислить ее перйодатом, а затем провести реакцию с реактивом Шиффа. Выбор в качестве растворителя абсолютного метанола обусловлен следующим: спирты облегчают проникновение реактива в срезы, но при приготовлении водно-спиртового раствора может произойти реакция Каниццаро с образованием из углеводов спиртов и кислот [4], что может помешать выявлению ДНК. Поэтому был выбран абсолютный спирт. Выбор метанола обусловлен тем, что он не способен вступать в реакцию с щелочами, но понижает рН раствора, что важно для сохранности биополимеров. Одновременно это позволяет также увеличить реакционную способность углеводов в ДНК и в других сложных соединениях за счет растворения смол, а также облегчить взаимодействие перйодата калия с гидроксилами углеводов. Известно, что некоторые полисахариды, например гликозаминогликаны, плохо реагируют с перийодатом, так как их карбоксильные и сульфатные группировки вызывают отталкивание перйодат-иона, вследствие чего ШИК-реакция может их не выявлять [8]. Обработка срезов щелочью должна была минимизировать эти явления. Для повышения специфичности после щелочного гидролиза использовали многократную отмывку препарата сначала в полярных (абсолютном этаноле), затем в неполярных растворителях (дистиллированной воде) для удаления органических и неорганических гидрофобных и гидрофильных соединений, в том числе фиксатора, так как ШИК-реакция может давать ложноположительные результаты на биологических образцах, фиксированных глутаровым альдегидом (наиболее распространенным фиксатором для электронно-микроскопических исследований), поскольку считается, что свободные альдегидные группы могут вступать в реакцию с реактивом Шиффа. Концентрацию перийодата калия повысили с 0,5 до 1% для повышения эффективности окисления при комнатной температуре. Усиление реакции с реактивом Шиффа за счет повышения температуры реакционной среды заменили увеличением длительности инкубации с реактивом Шиффа при комнатной температуре.The specified technical result is achieved by the fact that in the proposed method, acid hydrolysis of DNA at an elevated temperature is replaced by treatment with an alcohol solution of alkali. To identify DNA in semi-thin sections of the samples, it was necessary to make DNA pentoses available for the SHIC reaction, as with other polysaccharides and glycoproteins, that is, to free their hydroxyl groups for reaction with periodate, which will avoid breaking glycosidic bonds and oxidation of pentoses with acid. To form reactive aldehyde groups in pentoses, alkaline hydrolysis was carried out in a 0.5 M solution of potassium hydroxide in methanol. The action of alkali causes the removal of phosphoric acid residues from nucleotides to form nucleosides. There is no rupture of glycosidic bonds, but the hydroxyl group at the third carbon atom of pentose is released. This makes it possible to oxidize it with periodate, and then carry out the reaction with Schiff's reagent. The choice of absolute methanol as a solvent is due to the following: alcohols facilitate the penetration of the reagent into sections, but during the preparation of a water – alcohol solution, the Canizzaro reaction can occur with the formation of alcohols and acids from carbohydrates [4], which may interfere with DNA detection. Therefore, absolute alcohol was chosen. The choice of methanol is due to the fact that it is not able to react with alkalis, but lowers the pH of the solution, which is important for the preservation of biopolymers. At the same time, it also makes it possible to increase the reactivity of carbohydrates in DNA and in other complex compounds by dissolving resins, as well as to facilitate the interaction of potassium periodate with carbohydrate hydroxyls. It is known that some polysaccharides, for example, glycosaminoglycans, react poorly with periodate, since their carboxyl and sulfate groups cause repulsion of the periodate ion, as a result of which the SIR reaction may not reveal them [8]. The treatment of slices with alkali was to minimize these phenomena. To increase the specificity after alkaline hydrolysis, multiple washing of the drug was used, first in polar (absolute ethanol), then in non-polar solvents (distilled water) to remove organic and inorganic hydrophobic and hydrophilic compounds, including the fixative, since the SIR reaction can give false positive results on biological samples fixed with glutaraldehyde (the most common fixative for electron microscopic studies), since it is believed that of free aldehyde groups may react with Schiff's reagent. The potassium periodate concentration was increased from 0.5 to 1% to increase the oxidation efficiency at room temperature. The enhancement of the reaction with the Schiff reagent due to an increase in the temperature of the reaction medium was replaced by an increase in the duration of incubation with the Schiff reagent at room temperature.
Для оценки эффективности заявленного способа провели следующие исследования.To evaluate the effectiveness of the claimed method conducted the following studies.
Пример 1. Определение специфичности развивающейся окраскиExample 1. Determination of the specificity of developing color
Для установления специфичности одновременного определения углеводных компонентов и ДНК провели гистохимические реакции заявленным способом в образцах органов, имеющих биологические структуры, которые должны давать положительную реакцию на углеводные компоненты и ДНК, а также отрицательную реакцию на ДНК и углеводы. Объектом исследования были полутонкие срезы щитовидной железы и сосудов. Препараты щитовидной железы являются положительной пробой на ШИК-реакцию из-за содержания в полостях фолликулах большого количества коллоида - высокогликозилированного белка тироглобулина. Также положительную ШИК-реакцию дают базальные мембраны фолликулярных тироцитов и капилляров. Одновременно ядра клеток щитовидной железы дают положительную реакцию Фельгена. Плазма крови в просветах сосудов содержит большое количество гликопротеинов, дающих ШИК-положительную реакцию. Эритроциты не имеют ядер и не содержат большого количества углеводов в цитоплазме, вследствие чего не дают ни ШИК-реакции, ни реакции Фельгена, то есть являются отрицательным контролем.To establish the specificity of the simultaneous determination of carbohydrate components and DNA, histochemical reactions were performed by the claimed method in samples of organs having biological structures that should give a positive reaction to carbohydrate components and DNA, as well as a negative reaction to DNA and carbohydrates. The object of the study was the semi-thin sections of the thyroid gland and blood vessels. Thyroid preparations are a positive test for the CHIC reaction due to the content in the follicle cavities of a large amount of colloid - a highly glycosylated thyroglobulin protein. Also, a positive CHIC reaction is provided by the basement membranes of follicular thyrocytes and capillaries. At the same time, the nuclei of thyroid cells give a positive Felgen reaction. Blood plasma in the lumen of blood vessels contains a large number of glycoproteins, giving a SIC-positive reaction. The erythrocytes do not have nuclei and do not contain a large amount of carbohydrates in the cytoplasm, as a result of which they do not give either the SIR reaction or the Felgen reaction, i.e. they are a negative control.
Материал фиксировали 1%-ным глутаровым альдегидом с постфиксацией 1%-ным раствором тетраокиси осмия в какодилатном буфере и 5%-ным водным раствором уранилацетата и заливали в смесь Эпона и Аралдита с добавлением дибутилфталата в качестве пластификатора и додецил-янтарнокислого ангидрида в качестве уплотнителя и DMP30 в качестве катализатора. Провели окрашивание изготовленных полутонких срезов по заявленной методике. На фиг. 1 представлены результаты гистохимических реакций в щитовидной железе. Коллоид в просвете фолликулов окрашен в малиново-фиолетовый цвет, ядра тироцитов - в сиренево-розовый цвет с более интенсивной окраской ядрышек, цитоплазма клеток не окрашена, в цитоплазме видны ШИК-положительные включения тироглобулина (указаны стрелками), в просветах сосудов неокрашенные эритроциты. На фиг. 2 представлены результаты окрашивания срезов сосуда, в виде окрашенной в розово-малиновый цвет плазмы в просвете сосуда и неокрашенных эритроцитов (указаны стрелками). Сохранность срезов была стопроцентной.The material was fixed with 1% glutaraldehyde with postfixation with a 1% solution of osmium tetrooxide in cacodilate buffer and a 5% aqueous solution of uranyl acetate and poured into a mixture of Epon and Araldit with the addition of dibutyl phthalate as a plasticizer and dodecyl succinic anhydride DMP30 as a catalyst. We stained the manufactured semi-thin sections according to the claimed methodology. In FIG. 1 shows the results of histochemical reactions in the thyroid gland. The colloid in the lumen of the follicles is colored raspberry-violet, the nuclei of thyrocytes are lilac-pink with a more intense color of the nucleoli, the cytoplasm of the cells is not stained, in the cytoplasm you can see the SHIK-positive inclusions of thyroglobulin (indicated by arrows), in the lumen of blood vessels unpainted erythrocytes. In FIG. 2 presents the results of staining sections of the vessel, in the form of a plasma painted in pink and crimson in the lumen of the vessel and unpainted red blood cells (indicated by arrows). The safety of the slices was one hundred percent.
Таким образом, заявленный способ характеризуется эффективностью при постановке реакции на образцах, залитых в комбинированные эпоксидные смолы, не дает ложноположительных и ложноотрицательных реакций и, следовательно, является специфичным методом выявления углеводных компонентов и ДНК.Thus, the claimed method is characterized by efficiency in the formulation of the reaction on samples embedded in combined epoxy resins, does not give false positive and false negative reactions and, therefore, is a specific method for identifying carbohydrate components and DNA.
Пример 2. Определение чувствительности выявления ДНК и углеводного компонентаExample 2. Determining the sensitivity of detection of DNA and carbohydrate component
Яркость развивающейся окраски ядер зависит от количества гетерохроматина, имеющего высокую компактизацию нуклеопротеинов, и более рыхлого эухроматина, соответственно, дающего более слабую окраску дезоксирибонуклеопротеинов. Аналогично насыщенность окраски углеводных компонентов зависит от их количества в исследуемом объекте, что дает возможность при необходимости для спектрофотометрического определения количества данных соединений. Для определения чувствительности заявленного способа провели гистохимическое выявление гликопротеинов и ДНК в щитовидной железе в фолликулах с различным функциональным состоянием клеток. Фиксация и заливка материала проводилась аналогичным способом, как и в примере 1.The brightness of the developing color of the nuclei depends on the amount of heterochromatin, which has a high compaction of nucleoproteins, and more loose euchromatin, respectively, giving a weaker color of deoxyribonucleoproteins. Similarly, the color saturation of carbohydrate components depends on their quantity in the studied object, which makes it possible, if necessary, for spectrophotometric determination of the amount of these compounds. To determine the sensitivity of the claimed method, histochemical detection of glycoproteins and DNA in the thyroid gland in follicles with different functional state of the cells was performed. Fixation and filling of the material was carried out in a similar manner as in example 1.
На фиг. 3 представлены результаты выявления тироглобулина в группе фолликулов щитовидной железы с различным содержанием этого гликопротеина с соответствующей окраской содержимого полостей фолликулов от светлого розово-сиренево до насыщенного малинового цвета. Эухроматин ядер дает слабую положительную реакцию, гетерохроматин вдоль ядерной оболочки и ядрышки окрашиваются более интенсивно. Цитоплазма клеток не окрашивается. Положительная ШИК-реакция наблюдается в базальных мембранах фолликулярных тироцитов.In FIG. Figure 3 presents the results of the detection of thyroglobulin in the group of thyroid follicles with different contents of this glycoprotein with a corresponding coloration of the contents of the follicle cavities from light pink-lilac to saturated raspberry color. Euchromatin of nuclei gives a weak positive reaction, heterochromatin along the nuclear membrane and nucleoli stain more intensely. Cell cytoplasm does not stain. A positive SIC reaction is observed in the basement membranes of follicular thyrocytes.
На фиг. 4 представлены результаты гистохимической реакции в клетках щитовидной железы с различным состоянием ядер. Пикнотизированные ядра погибающих, десквамированных в полость фолликулов, клеток (указаны стрелками) дают более интенсивную окраску за счет более высокой концентрации нуклеопротеинов.In FIG. 4 presents the results of a histochemical reaction in thyroid cells with different nuclear states. The pycnotized nuclei of dying cells desquamated into the cavity of the follicles (indicated by arrows) give a more intense color due to a higher concentration of nucleoproteins.
Таким образом, заявленный способ гистохимического выявления обладает чувствительностью.Thus, the claimed method of histochemical detection is sensitive.
Пример 3. Выявление полисахаридов, затрудняющих протекание ШИК-реакцииExample 3. The identification of polysaccharides that impede the course of the SIC reaction
К углеводам, в структуре которых имеются группировки, препятствующие образованию альдегидных групп в углеводах, относятся гликозаминогликаны. Для определения эффективности заявленного метода провели гистохимическое выявление гепарина тучных клеток - протеогликана, состоящего из белка и гликозаминогликанов. Для избежания неправильной трактовки отрицательных результатов провели реакцию вышеописанным способом на полутонких срезах дающей положительную ШИК-реакцию щитовидной железы, в соединительнотканных перегородках которой часто встречаются тучные клетки.Carbohydrates, in the structure of which there are groups that prevent the formation of aldehyde groups in carbohydrates, include glycosaminoglycans. To determine the effectiveness of the claimed method, histochemical detection of mast cell heparin, proteoglycan, consisting of protein and glycosaminoglycans, was performed. To avoid misinterpretation of negative results, the reaction was carried out as described above on semi-thin sections giving a positive SHIK reaction of the thyroid gland, in which connective tissue septa there are often mast cells.
На фиг. 5 показаны результаты в виде резко положительной реакции с развитием насыщенной малиново-фиолетовой окраски гранул в цитоплазме тучных клеток, ярким розово-сиреневым окрашиванием коллоида в фолликулах и малиново-фиолетовым окрашиванием гетерохроматина и ядрышек ядер фолликулярных тироцитов.In FIG. Figure 5 shows the results in the form of a sharply positive reaction with the development of a saturated raspberry-violet color of the granules in the cytoplasm of mast cells, bright pink-purple staining of the colloid in the follicles, and raspberry-violet staining of heterochromatin and nucleoli of follicular thyrocyte nuclei.
Таким образом, заявленный способ позволяет выявлять гликозаминогликаны, что повышает применимость ШИК-реакции.Thus, the claimed method allows the detection of glycosaminoglycans, which increases the applicability of the SIK reaction.
Пример 4. Отсутствие органоспецифичности заявленного способаExample 4. The lack of organ specificity of the claimed method
Для установления эффективности заявленного метода провели выявление ДНК и углеводов в различных органах. Препараты коркового вещества надпочечников и семенников крыс были изготовлены вышеописанным в примере 1 способом. Корковое вещество надпочечников представлено клетками, в цитоплазме которых содержится большое количество крупных митохондрий овальной формы и единичные липидные капли, не дающие положительной реакции с реактивом Шиффа. Клетки окружены капиллярами, чья базальная мембрана ШИК-положительна. В семенниках сперматогенный эпителий содержит крупные ядра с деконденсированным хроматином низкой плотности, дающим слабую реакцию Фельгена. Сперматозоиды содержат в головке сильно конденсированный хроматин, а в хвостике - большое количество гликопротеинов на плазмолемме, вследствие чего дают резко положительную ШИК-реакцию и реакцию Фельгена.To establish the effectiveness of the claimed method, DNA and carbohydrates were detected in various organs. Preparations of the cortical substance of the adrenal glands and testes of rats were made as described above in example 1. The cortical substance of the adrenal glands is represented by cells whose cytoplasm contains a large number of large oval-shaped mitochondria and single lipid droplets that do not give a positive reaction with Schiff's reagent. Cells are surrounded by capillaries, whose basement membrane is CHIC-positive. In the testes, the spermatogenous epithelium contains large nuclei with decondensed chromatin of low density, giving a weak Felgen reaction. Sperm cells contain highly condensed chromatin in the head, and a large amount of glycoproteins on the plasmolemma in the tail, resulting in a sharply positive SIR reaction and the Felgen reaction.
На фиг. 6 показаны результаты реакции на корковом веществе надпочечников. Ядра клеток имеют сиренево-розовую окраску, в цитоплазме видны крупные неокрашенные капли липидов (указаны стрелками) и более мелкие неокрашенные митохондрии. Яркую окраску дают базальные мембраны капилляров.In FIG. Figure 6 shows the results of the reaction on the adrenal cortex. The cell nuclei have a lilac-pink color, large unpainted lipid drops (indicated by arrows) and smaller unpainted mitochondria are visible in the cytoplasm. The basement membranes of the capillaries give a bright color.
На фиг. 7 представлены результаты гистохимических реакций заявленным способом в препаратах семенников. В сперматогенном эпителии розово-сиреневую окраску дают хромосомы, яркую малиново-фиолетовую окраску - головки, и малиново-сиреневую - хвостики сперматозоидов (указаны стрелками).In FIG. 7 presents the results of histochemical reactions of the claimed method in the preparations of the testes. In spermatogenous epithelium, pink-lilac color gives chromosomes, bright raspberry-violet color - heads, and raspberry-lilac color - tails of sperm (indicated by arrows).
Следовательно, заявленный способ характеризуется отсутствием органоспецифичности положительных реакций, то есть является универсальным для выявления ДНК и углеводных компонентов в органах и тканях.Therefore, the claimed method is characterized by the absence of organ-specificity of positive reactions, that is, it is universal for detecting DNA and carbohydrate components in organs and tissues.
Таким образом, заявленный способ является эффективным методом выявления ДНК, полисахаридов и углеводных компонентов биополимеров в полутонких срезах образцов разнообразных тканей и органов, залитых в смесь различных эпоксидных смол. Данный метод отличается также высокой сохранностью материала и простотой исполнения, так как не требует использования термостатов и нагревательных столиков.Thus, the claimed method is an effective method for detecting DNA, polysaccharides and carbohydrate components of biopolymers in semi-thin sections of samples of various tissues and organs embedded in a mixture of various epoxy resins. This method is also characterized by high material safety and ease of execution, since it does not require the use of thermostats and heating tables.
ЛитератураLiterature
1. Гайер Г. Электронная гистохимия. - М.: Мир, 1974. - 488 с.1. Gayer G. Electronic histochemistry. - M .: Mir, 1974. - 488 p.
2. Конарев В.Г., Тютерев С.Л. Методы биохимии и цитохимии нуклеиновых кислот растений. - Л.: Колос, 1970. - 204 с.2. Konarev V.G., Tyuterev S.L. Methods of biochemistry and cytochemistry of plant nucleic acids. - L .: Kolos, 1970 .-- 204 p.
3. Петрова А.С., Полонская Н.Ю. Глава 17. Основные методы окрашивания цитологических препаратов // Микроскопическая техника: руководство / Под ред. Д.С. Саркисова, Л.Ю. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.3. Petrova A.S., Polonskaya N.Yu. Chapter 17. The main methods of staining of cytological preparations // Microscopic technique: manual / Ed. D.S. Sarkisova, L.Yu. Perova. - M.: Medicine, 1996 .-- 544 p.
4. Пирс Э. Гистохимия. Пер. с англ. - М.: Издательство иностранной литературы, 1962. - 962 с.4. Pierce E. Histochemistry. Per. from English - M .: Publishing house of foreign literature, 1962. - 962 p.
5. Carson F., Hladik С. Histotechnology: A Self-Instructional Text (3 ed.). - Hong Kong: American Society for Clinical Pathology Press, 2009. - P. 137-139.5. Carson F., Hladik C. Histotechnology: A Self-Instructional Text (3 ed.). - Hong Kong: American Society for Clinical Pathology Press, 2009 .-- P. 137-139.
6. Cerri PS, Sasso-Cerri E. Staining methods applied to glycol methacrylate embedded tissue sections // Micron - 2003. - Vol. 34. - No 8. - P. 365-372.6. Cerri PS, Sasso-Cerri E. Staining methods applied to glycol methacrylate embedded tissue sections // Micron - 2003. - Vol. 34. - No. 8. - P. 365-372.
7. DiBella R., Hashimoto K. A new method for PAS stain of osmium-fixed Araldite-embedded thick tissue section // J. Invest. Dermatol. - 1966. - Vol. 47. - P. 503-505.7. DiBella R., Hashimoto K. A new method for PAS stain of osmium-fixed Araldite-embedded thick tissue section // J. Invest. Dermatol. - 1966. - Vol. 47. - P. 503-505.
8. Scott J., Harbinson R. Periodate oxidation of acid polysaccharides. II. Rates of oxidation of uronic acids in hyalyuronides and acid mucopolysaccharides // Histochemie. - 1969. - Vol. 19. - P. 155-161.8. Scott J., Harbinson R. Periodate oxidation of acid polysaccharides. II. Rates of oxidation of uronic acids in hyalyuronides and acid mucopolysaccharides // Histochemie. - 1969. - Vol. 19. - P. 155-161.
9. Stockert J. Feulgen positive nucleoli in Epon semithin sections: Fact or artifact? // Experientia. 1978. - Vol. 33. - No 12. - P. 1669-1670.9. Stockert J. Feulgen positive nucleoli in Epon semithin sections: Fact or artifact? // Experientia. 1978. - Vol. 33. - No. 12 .-- P. 1669-1670.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147502A RU2647420C1 (en) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | Combined method of hystochemical detection of dezoxyribonucleoprotenins, polysaccharides and hydrocarbon components of bio polymers in semitinous sections of tissues and organs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147502A RU2647420C1 (en) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | Combined method of hystochemical detection of dezoxyribonucleoprotenins, polysaccharides and hydrocarbon components of bio polymers in semitinous sections of tissues and organs |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2647420C1 true RU2647420C1 (en) | 2018-03-15 |
Family
ID=61629567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147502A RU2647420C1 (en) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | Combined method of hystochemical detection of dezoxyribonucleoprotenins, polysaccharides and hydrocarbon components of bio polymers in semitinous sections of tissues and organs |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2647420C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2485209A (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-09 | Inst Medical Informatics | Curve fitting to histogram data for identification of chromatin types in nuclei |
-
2016
- 2016-12-05 RU RU2016147502A patent/RU2647420C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2485209A (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-09 | Inst Medical Informatics | Curve fitting to histogram data for identification of chromatin types in nuclei |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Pacific Medical Journal, 2004, 2, p. 18-23, найдено 09.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте http://tmj-vgmu.ru/files/old/PMJ_2004_2/PMJ_2004_2_18.pdf. * |
| МАЛЬКОВ П.Г. и др. Гиалинизирующая трабекулярная опухоль щитовидной железы. Российский онкологический журнал, 2010, 1 стр. 46-48, найдено 09.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте https://istina.msu.ru/media/publications/article/b72/369/999470/166.pdf. Разработка фундаментальных основ определения масс биополимеров, недоступных современным методам масс-спектрометрического анализа. * |
| Отчет о НИР. Новосибирск, 2009, стр. 32-35, найдено 05.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте http://ssrc.inp.nsk.su/CKP/biblio/INP_Report_1_Stage_02_552_11_7081.pdf. ХРУЛЕВ С.В. Солокализация серотонина и нитроксидсинтазы в нейронах подкоркового белого вещества мозга человека. * |
| ТИТОВ Л.П. Медицинская геномика. Oбзор. Известия национальной академии наук Беларуси, 2015, 4, стр. 97-114, найдено 09.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте http://csl.bas-net.by/xfile/v_med/2015/4/7sr5n.pdf. * |
| ТИТОВ Л.П. Медицинская геномика. Oбзор. Известия национальной академии наук Беларуси, 2015, 4, стр. 97-114, найдено 09.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте http://csl.bas-net.by/xfile/v_med/2015/4/7sr5n.pdf. МАЛЬКОВ П.Г. и др. Гиалинизирующая трабекулярная опухоль щитовидной железы. Российский онкологический журнал, 2010, 1 стр. 46-48, найдено 09.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте https://istina.msu.ru/media/publications/article/b72/369/999470/166.pdf. Разработка фундаментальных основ определения масс биополимеров, недоступных современным методам масс-спектрометрического анализа. Отчет о НИР. Новосибирск, 2009, стр. 32-35, найдено 05.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте http://ssrc.inp.nsk.su/CKP/biblio/INP_Report_1_Stage_02_552_11_7081.pdf. ХРУЛЕВ С.В. Солокализация серотонина и нитроксидсинтазы в нейронах подкоркового белого вещества мозга человека. Pacific Medical Journal, 2004, 2, p. 18-23, найдено 09.10.2017 в Интернете [on-line] на сайте http://tmj-vgmu.ru/files/old/PMJ_2 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Munger | Staining methods applicable to sections of osmium-fixed tissue for light microscopy | |
| Stowell | Feulgen reaction for thymonucleic acid | |
| Mitra et al. | Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements | |
| Layton et al. | Fixation of tissues | |
| Baker | The structure and chemical composition of the Golgi element | |
| Baker | The Histochemical Recognition, of Lipine | |
| Sjöstrand et al. | Fixation by freezing-drying for electron microscopy of tissue cells | |
| Freeman | A study of the jelly envelopes surrounding the egg of the amphibian, Xenopus laevis | |
| US8158381B2 (en) | Methods for integrated tissue processing and staining | |
| Horobin | Biological staining: mechanisms and theory | |
| Horobin | Staining plastic sections: a review of problems, explanations and possible solutions | |
| Fullmer et al. | A selective stain for elastic tissue (orcinol-new fuchsin) | |
| Kiernan | Dyes and other colorants in microtechnique and biomedical research | |
| Ajileye et al. | Fixation and fixatives in histopathology: a review | |
| Shinke et al. | A histochemical study of plant nuclei in rest and mitosis | |
| RU2647420C1 (en) | Combined method of hystochemical detection of dezoxyribonucleoprotenins, polysaccharides and hydrocarbon components of bio polymers in semitinous sections of tissues and organs | |
| Carson et al. | Histotechnology | |
| Hasan et al. | A better and copacetic protocol for histopathological slide preparation using H&E stain: A review | |
| GERSH | Fixation and staining | |
| Sobin et al. | Histochemical characterization of the aging microvasculature in the human and other mammalian and non-mammalian vertebrates by the periodic acid-Schiff reaction | |
| Burkl et al. | A study of osmium tetroxide fixation | |
| Shires et al. | Hematoxylin staining of tissues embedded in epoxy resins | |
| Horobin et al. | The influence of the embedding medium when staining for electron microscopy: the penetration of stains into plastic sections | |
| LU101831B1 (en) | A Method for Staining Adipocytes and Application Thereof | |
| Lee | Identification of argyrophilic cells in pancreatic islets by light and electron microscopy in osmium-fixed plastic-embedded sections |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201206 |