RU2646446C1 - Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation - Google Patents
Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646446C1 RU2646446C1 RU2016121897A RU2016121897A RU2646446C1 RU 2646446 C1 RU2646446 C1 RU 2646446C1 RU 2016121897 A RU2016121897 A RU 2016121897A RU 2016121897 A RU2016121897 A RU 2016121897A RU 2646446 C1 RU2646446 C1 RU 2646446C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- usa
- medium
- days
- neuronal
- peprotech
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 51
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 30
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 28
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 26
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 25
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 25
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 25
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 16
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 claims description 16
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 10
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 claims description 10
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 10
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 10
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 claims description 10
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 8
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 8
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 6
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 6
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 5
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108700019404 Pro-Gly-Pro- ACTH (4-7) Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- AFEHBIGDWIGTEH-AQRCPPRCSA-N semax Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CNC=N1 AFEHBIGDWIGTEH-AQRCPPRCSA-N 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- ZFIWNOVWFLTRKY-DROSFRCNSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-[4-[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]phenyl]propanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)C=1C=CC(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(O)=O)=CC=1)C1=CN=CN1 ZFIWNOVWFLTRKY-DROSFRCNSA-N 0.000 description 2
- 108010018180 ACTH (6-9) Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102400000740 Melanocyte-stimulating hormone alpha Human genes 0.000 description 2
- 101710200814 Melanotropin alpha Proteins 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N 0.000 description 2
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003293 cardioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001779 embryotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 230000009476 short term action Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к фармакологии. Изобретение позволяет проводить оценку наличия нейропротекторных свойств у соединений, представляющих фармакологический интерес.The invention relates to pharmacology. The invention allows the assessment of the presence of neuroprotective properties in compounds of pharmacological interest.
Одной из актуальных проблем современной фармакологии и медицины является создание эффективных и безопасных лекарственных препаратов, направленных на лечение тех или иных заболеваний. Для их создания необходимы адекватные, высокопроизводительные и воспроизводимые, а главное относительно дешевые технологии скрининга потенциальных лекарственных соединений. Разработка технологии репрограммирования соматических клеток и получения индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток млекопитающих, включая человека, открыла новые перспективы в трансплантологии и изучении молекулярных и клеточных основ тяжелых болезней человека in vitro [1, 2]. Не случайно, что именно за эти работы («за открытие возможности репрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные») японскому ученому Синья Яманака была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине за 2012 г. Развитие технологии репрограммирования соматических клеток человека в ИПС клетки открывает новые возможности для создания моделей ряда тяжелых патологий человека, в том числе нейродегенеративных, а также тест-систем, позволяющих проводить масштабный скрининг и выяснять свойства лекарственных средств, направленных на лечение конкретных заболеваний in vitro, учитывая при этом индивидуальные особенности пациента [3, 4]. Тот факт, что технология репрограммирования позволяет получать ИПС клетки из индивидуальных дифференцированных соматических клеток больных и здоровых пациентов, дает ей существенные преимущества перед технологией эмбриональных стволовых клеток, что, в свою очередь, открывает большие перспективы в развитии персонализированной медицины [5, 6]. Развитие такой технологии позволит существенным образом сократить эксперименты по тестированию перспективных для фармакологии соединений на клетках животных, проводя их сразу на клетках человека. Возможность дифференцировки ИПС клеток в кардиомиоциты, гепатоциты, фибробласты и нейроны позволит проводить прицельный доклинический скрининг соединений на кардиопротекторную, гепатопротекторную и нейропротекторную активность in vitro [7, 8].One of the urgent problems of modern pharmacology and medicine is the creation of effective and safe drugs aimed at the treatment of certain diseases. Their creation requires adequate, high-performance and reproducible, and most importantly relatively cheap screening technologies for potential drug compounds. The development of technology for the reprogramming of somatic cells and the production of induced pluripotent stem (IPA) mammalian cells, including humans, has opened up new prospects in transplantology and the study of molecular and cellular foundations of serious human diseases in vitro [1, 2]. It is no coincidence that it is precisely for these works (“for opening the possibility of reprogramming differentiated cells into pluripotent cells”) that the Japanese scientist Signa Yamanaka was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine for 2012. The development of the technology for reprogramming human somatic cells in IPS cells opens up new possibilities for creating models of a number of severe human pathologies, including neurodegenerative ones, as well as test systems that allow for large-scale screening and ascertain the properties of drugs, patients for the treatment of specific diseases in vitro, taking into account the individual characteristics of the patient [3, 4]. The fact that the technology of reprogramming allows one to obtain IPA cells from individual differentiated somatic cells of patients and healthy patients gives it significant advantages over the technology of embryonic stem cells, which, in turn, opens up great prospects in the development of personalized medicine [5, 6]. The development of this technology will significantly reduce the experiments on testing compounds that are promising for pharmacology on animal cells, conducting them immediately on human cells. The possibility of differentiating IPS cells into cardiomyocytes, hepatocytes, fibroblasts and neurons will allow for preclinical targeted screening of compounds for cardioprotective, hepatoprotective and neuroprotective activity in vitro [7, 8].
Известны первичные культуры нервных и глиальных клеток, полученных из мозга крысы, которые используются для скрининга соединений на наличие нейропротекторной активности [9]. При этом результаты, полученные на животных моделях, не всегда воспроизводятся на человеке. С другой стороны, невозможно получать нервные клетки из мозга взрослого человека в достаточных количествах для проведения скрининга фармакологических соединений. И, к тому же, нейроны из мозга взрослого человека не способны к росту в культуре in vitro.Primary cultures of nerve and glial cells derived from rat brain are known that are used to screen compounds for neuroprotective activity [9]. Moreover, the results obtained in animal models are not always reproduced in humans. On the other hand, it is impossible to obtain nerve cells from the brain of an adult in sufficient quantities to screen pharmacological compounds. And, in addition, neurons from the brain of an adult are not capable of growth in vitro.
Известны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из фибробластов кожи человека, которые используются для оценки цито- и эмбриотоксических свойств фармакологических соединений [10]. В данной заявке идет речь о недифференцированных ИПС клетках и их производных в виде эмбриоидных тел и производных трех зародышевых листков.Induced pluripotent stem cells derived from human skin fibroblasts are known to be used to evaluate the cyto- and embryotoxic properties of pharmacological compounds [10]. This application is about undifferentiated IPA cells and their derivatives in the form of embryoid bodies and derivatives of three germ layers.
Таким образом, создание адекватной модели для изучения нейродегенеративных заболеваний у человека и оценка нейропротекторных свойств различных соединений с целью создания на их основе эффективных лекарственных средств для лечения этих заболеваний, является в настоящее время чрезвычайно актуальной.Thus, the creation of an adequate model for the study of neurodegenerative diseases in humans and the assessment of the neuroprotective properties of various compounds in order to create effective drugs on their basis for the treatment of these diseases is currently extremely relevant.
С целью устранения указанных выше недостатков предлагается:In order to eliminate the above disadvantages, it is proposed:
1. Способ оценки нейропротекторных свойств веществ in vitro, с использованием тест-системы, содержащей дифференцированные в нейрональном направлении индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПС) человека, включающий этап репрограммирования фибробластов кожи человека в ИПС клеток, после чего ИПС клетки неоднократно помещают в культуральную среду, обеспечивающую их дифференцировку в нейрональном направлении и формирование на них дофаминергических нейронов, полученную тест-систему подвергают повреждающему воздействию в присутствии исследуемых веществ и по результатам выживаемости клеток оценивают их протекторное действие.1. A method for assessing the neuroprotective properties of substances in vitro, using a test system containing differentiated neuronally induced human pluripotent stem cells (IPA), comprising the step of reprogramming human skin fibroblasts in IPA cells, after which IPA cells are repeatedly placed in the culture medium, providing their differentiation in the neuronal direction and the formation of dopaminergic neurons on them, the resulting test system is subjected to damaging effects in the presence of and the test substances and the results of cell survival rate their protective effect.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ИПС клетки помещают в среду DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% N2 («Life Technologies», США), 10 мкМ SB431542 («Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США).2. The method according to p. 1, characterized in that the IPA cells are placed in DMEM / F12 medium, 2% serum substitute ("Gibco", USA), 1 mM non-essential amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% N2 (Life Technologies, USA), 10 μM SB431542 (Stemgent, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA).
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что смену среды осуществляют ежедневно в течение 7-10 дней, сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяют и переносят в 24-луночный плашет с предельно низкой адгезией («Costar», США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5-7 дней культивируют в планшете, нейросферы собирают в центрифужные пробирки, диссоциируют до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0.25%) и высевают на чашки Петри, покрытые матригелем, и получают культуру нейрональных предшественников.3. The method according to p. 2, characterized in that the medium is changed daily for 7-10 days, the formed neuronal rosettes and combs are mechanically separated and transferred to a 24-well plate with extremely low adhesion (Costar, USA), where subsequently, neurospheres were formed, which were cultivated for another 5-7 days in a plate, neurospheres were collected in centrifuge tubes, dissociated to a monocellular suspension using trypsin (0.25%) and plated on Matriel coated Petri dishes to obtain a culture of neuronal precursors.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что далее полученную культуру нейрональных предшественников культивируют до плотного монослоя и рассевают 1:4 или 1:5 на новые чашки Петри 35 мм, покрытые матригелем.4. The method according to p. 3, characterized in that then the resulting culture of neuronal precursors is cultivated to a dense monolayer and sown 1: 4 or 1: 5 on new 35 mm Petri dishes coated with matrigel.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что полученные нейрональные предшественники культивируют 10 дней в среде для нейрональных предшественников: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh (PeproTech), 20 нг/мл FGF8 (PeproTech) и 2 мкМ пуроморфамин (Stemgent), далее еще 14 дней в среде для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF (PeproTech), 20 нг/мл GDNF (PeproTech), 200 мкМ аскорбиновая кислота, 5 мкМ форсколин (Stemgent).5. The method according to p. 4, characterized in that the obtained neuronal precursors are cultured for 10 days in a medium for neuronal precursors: DMEM / F12, 2% serum substitute ("Gibco", USA), 1 mM non-essential amino acids ("PanEco", RF ), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 100 ng / ml Shh (PeproTech), 20 ng / ml FGF8 (PeproTech) and 2 μM puromorphamine (Stemgent), then another 14 days in a maturing medium: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 IU / ml; 50 mk / Ml), 1% supplement B27 ( «Life Technologies», USA), 20 ng / ml BDNF (PeproTech), 20 ng / ml of GDNF (PeproTech), 200 uM ascorbic acid, 5 .mu.M forskolin (Stemgent).
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что смену среды осуществляют каждые 48 часов впервые дни культивирования и далее каждые 24 часа, дифференцировку проводят в течение 24-32 дней.6. The method according to p. 5, characterized in that the medium is changed every 48 hours for the first days of cultivation and then every 24 hours, differentiation is carried out within 24-32 days.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемое соединение добавляют однократно в объеме 100 мкл за сутки до повреждающего воздействия в виде окислительного стресса.7. The method according to p. 1, characterized in that the test compound is added once in a volume of 100 μl a day before the damaging effect in the form of oxidative stress.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемое соединение добавляют однократно в объеме 100 мкл за 40 мин до повреждающего воздействия в виде добавления перекиси водорода.8. The method according to p. 1, characterized in that the test compound is added once in a volume of 100
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оценку выживаемости нейронов проводят через 24 часа после повреждающего воздействия в виде добавления перекиси водорода.9. The method according to p. 1, characterized in that the assessment of the survival of neurons is carried out 24 hours after the damaging effect in the form of adding hydrogen peroxide.
10. Способ по пп. 1-9, отличающийся тем, что культивирование всех используемых в работе клеток проводят в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха.10. The method according to PP. 1-9, characterized in that the cultivation of all cells used in the work is carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air.
11. Способ по пп. 1-10, отличающийся тем, что для оценки нейропротекторных свойств веществ in vitro индуцированные плюрипотентные стволовые клетки неоднократно помещают в культуральную среду, обеспечивающую их дифференцировку в нейрональном направлении и формирование дофаминергических нейронов.11. The method according to PP. 1-10, characterized in that to assess the neuroprotective properties of substances in vitro induced pluripotent stem cells are repeatedly placed in a culture medium that ensures their differentiation in the neuronal direction and the formation of dopaminergic neurons.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки помещают в среду DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement N2 («Life Technologies», США), 10 мкМ SB431542 («Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США).12. The method according to p. 11, characterized in that the induced pluripotent stem cells are placed in DMEM / F12 medium, 2% serum substitute ("Gibco", USA), 1 mm replaceable amino acids ("PanEco", RF), 2 mm L -glutamine, penicillin-streptomycin (50 IU / ml; 50 μg / ml), 1% supplement N2 (Life Technologies, USA), 10 μM SB431542 (Stemgent, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA).
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что смену среды осуществляют ежедневно в течение 7-10 дней, сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяют и переносят в 24-луночный плашет с предельно низкой адгезией («Costar», США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5-7 дней культивируют в планшете, нейросферы собирают в центрифужные пробирки, диссоциируют до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0.25%) и высевают на чашки Петри, покрытые матригелем.13. The method according to p. 12, characterized in that the medium is changed daily for 7-10 days, the formed neuronal rosettes and combs are mechanically separated and transferred to a 24-well plate with extremely low adhesion (Costar, USA), where subsequently, neurospheres were formed, which were cultured in the plate for another 5-7 days, neurospheres were collected in centrifuge tubes, dissociated to a monocellular suspension using trypsin (0.25%) and plated on Petri dishes coated with matrigel.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что далее полученную культуру нейрональных предшественников культивируют до плотного монослоя и рассевают 1:4 или 1:5 на новые чашки Петри 35 мм, покрытые матригелем.14. The method according to p. 13, characterized in that further the resulting culture of neuronal precursors is cultured to a dense monolayer and sown 1: 4 or 1: 5 into new 35 mm Petri dishes coated with matrigel.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что полученные нейрональные предшественники культивируют 10 дней в среде для нейрональных предшественников: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco)), США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh (PeproTech), 20 нг/мл FGF8 (PeproTech) и 2 мкМ пуроморфамин (Stemgent), далее еще 14 дней в среде для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF (PeproTech), 20 нг/мл GDNF, до полной зрелости полученных нейронов.15. The method according to p. 14, characterized in that the obtained neuronal precursors are cultured for 10 days in a medium for neuronal precursors: DMEM / F12, 2% serum substitute ("Gibco)", USA), 1 mm interchangeable amino acids ("PanEco", RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 100 ng / ml Shh (PeproTech), 20 ng / ml FGF8 (PeproTech) and 2 μM puromorphamine (Stemgent), then another 14 days in a maturing medium: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 m g / ml), 1% supplement B27 ( «Life Technologies», USA), 20 ng / ml BDNF (PeproTech), 20 ng / ml GDNF, to full maturity derived neurons.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что смену среды осуществляют каждые 48 часов в первые дни культивирования и далее каждые 24 часа, дифференцировку проводят в течение 24-32 дней.16. The method according to p. 15, characterized in that the medium is changed every 48 hours in the first days of cultivation and then every 24 hours, differentiation is carried out within 24-32 days.
17. Способ по пп. 11-16, отличающийся тем, что культивирование всех используемых в работе клеток проводят в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха.17. The method according to PP. 11-16, characterized in that the cultivation of all cells used in the work is carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является поиск и ускорение тестирования соединений, представляющих фармакологический интерес, на наличие нейропротекторной активности или соответственно нейротоксической активности, а также получение более точной информации относительно степени активности тестируемых соединений. Указанный технический результат достигается за счет использования дифференцированных в нейрональном направлении ИПС клеток, полученных репрограммированием фибробластов кожи человека в ИПС клетки, после чего ИПС клетки помещают в культуральную среду, обеспечивающую дифференцировку ИПС клеток в нейрональном направлении с формированием нейронов определенной ергичности, в частности дофаминергических нейронов, что особенно важно в случае болезни Паркинсона, для которой доказана избирательная гибель именно нейронов этого типа в определенных отделах мозга.The technical result achieved by the implementation of the present invention is the search and acceleration of testing of compounds of pharmacological interest for the presence of neuroprotective activity or, respectively, neurotoxic activity, as well as obtaining more accurate information regarding the degree of activity of the tested compounds. The specified technical result is achieved through the use of differentiated in the neuronal direction IPA cells obtained by reprogramming human skin fibroblasts into IPA cells, after which IPA cells are placed in a culture medium that differentiates IPA cells in the neuronal direction with the formation of neurons of a certain ergidity, in particular dopaminergic neurons, which is especially important in the case of Parkinson's disease, for which the selective death of precisely this type of neurons has been proved venous parts of the brain.
Определение терминовDefinition of Terms
Под культурой ИПС клеток понимается клеточная культура, полученная репрограммированием фибробластов кожи взрослого человека по описанной ранее методике [1, 2, 11].Under the culture of IPS cells is understood a cell culture obtained by reprogramming fibroblasts of adult skin using the previously described method [1, 2, 11].
Под культурой дифференцированных в нейрональном направлении ИПС клеток понимается клеточная культура, содержащая до 90% нейронов, которые детектируются иммуноцитохимически.Under the culture of IPS cells differentiated in the neuronal direction, we mean a cell culture containing up to 90% of neurons that are detected immunocytochemically.
Под нейропротекцией понимается способность тестируемого соединения замедлять или предотвращать гибель нервных клеток по сравнению с контролем (без добавления тестируемого соединения).Neuroprotection refers to the ability of a test compound to slow down or prevent nerve cell death compared to a control (without adding a test compound).
Под нейротоксичностью понимается способность тестируемого соединения вызывать или ускорять гибель нервных клеток по сравнению с контролем (без добавления тестируемого соединения)Neurotoxicity refers to the ability of a test compound to cause or accelerate the death of nerve cells compared to a control (without adding a test compound)
Примеры собственных экспериментовExamples of own experiments
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.The following are examples illustrating the invention.
Пример 1. Получение репрограммированных клеток, а именно ИПС клеток из фибробластов кожи взрослого донора.Example 1. Obtaining reprogrammed cells, namely IPA cells from fibroblasts of the skin of an adult donor.
Фибробласты кожи взрослого донора были разморожены и в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха, посеяны на лунки 12-луночного планшета с плотностью 30% монослоя в среде: DMEM («ПанЭко», РФ), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10% эмбриональная телячья сыворотка («HyClone», США), 2 нг/мкл bFGF («Peprotech», США). Через 2 дня после рассева клетки достигли плотности 60% монослоя и в этот момент они были инфицированы четырьмя вирусами в следующем количестве LeGO-hOct4 - MOI 5, LeGO-hSox2 - MOI 5, LeGO-hc-Myc - MOI 2.5, LeGO-hKlf4-MOI 5. Через 4 дня клетки были пересеяны на новые чашки Петри 1:22,5 в среде DMEM («ПанЭко», РФ), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10% эмбриональная телячья сыворотка («HyClone», США). На следующий день среда была заменена на среду mTeSR1. Затем клетки культивировали в этой среде в течение 8-10 дней, среду меняли раз в 2 дня. К этому моменту на чашках образовалось множество клонов с различной морфологией. Эти клоны были механически пересеяны 1:1 на матригель в среде mTeSR1 («STEM CELL Technologies», США). Через несколько дней некоторые из колоний стали расти и морфологически становиться более похожими на эмбриональные стволовые клетки, другие же дифференцировались и перестали расти.Fibroblasts of the skin of an adult donor were thawed and in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO2 and 95% air, seeded in the wells of a 12-well plate with a density of 30% monolayer in the medium: DMEM (PanEco, RF ), penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum (HyClone, USA), 2 ng / μl bFGF (Peprotech, USA). 2 days after sieving, the cells reached a density of 60% of the monolayer and at that moment they were infected with four viruses in the following quantities LeGO-hOct4 - MOI 5, LeGO-hSox2 - MOI 5, LeGO-hc-Myc - MOI 2.5, LeGO-hKlf4- MOI 5. After 4 days, the cells were seeded into new Petri dishes 1: 22.5 in DMEM (PanEco, RF), penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum ("HyClone", USA). The next day, the medium was replaced with mTeSR1. Then the cells were cultured in this medium for 8-10 days, the medium was changed every 2 days. At this point, many clones with different morphologies formed on the plates. These clones were mechanically seeded 1: 1 on matrigel in mTeSR1 medium (STEM CELL Technologies, USA). After a few days, some of the colonies began to grow and morphologically become more like embryonic stem cells, while others differentiated and stopped growing.
Через неделю был произведен отбор клонов на 24-луночный планшет, покрытый матригелем («BD Biosciences», США), в среде mTeSR1 было посеяно 15 различных клонов, после чего их культивировали раздельно. В итоге 6 клонов показали способность к стабильному росту на подложке матригель в среде mTeSR1. Два клона были использованы для дальнейшей работы, оставшиеся заморожены в жидком азоте. Все полученные клоны ИПС клеток методом иммуноцитохимического анализа были исследованы на маркеры плюрипотентности, на способность формировать эмбриоидные тела и давать начало трем зародышевым листкам (эктодерме, мезодерме, энтодерме).A week later, clones were selected for a 24-well Matrigel coated plate (BD Biosciences, USA), 15 different clones were seeded in mTeSR1 medium, and then they were cultured separately. As a result, 6 clones showed the ability to stably grow on a matrigel substrate in mTeSR1 medium. Two clones were used for further work; the remaining ones were frozen in liquid nitrogen. All obtained clones of IPA cells by immunocytochemical analysis were tested for pluripotency markers, for the ability to form embryoid bodies and give rise to three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm).
Пример 2. Получение нейрональных предшественников из ИПС клеток.Example 2. Obtaining neuronal precursors from IPA cells.
После достижения ИПС клетками 50-60% монослоя делали смену среды на нейрональную DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement N2 («Life Technologies», США), 10 мкМ SB431542 («Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США). Инкубацию проводили в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха. Смена среды осуществлялась ежедневно в течение 7-10 дней. За это время происходило образование нейрональных розеток и гребней (рис. 1).After IPA reached 50-60% of the monolayer, the medium was changed to neuronal DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement N2 (Life Technologies, USA), 10 μM SB431542 (Stemgent, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA). Incubation was carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air. The change of environment was carried out daily for 7-10 days. During this time, the formation of neuronal rosettes and ridges occurred (Fig. 1).
Сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяли и переносили в 24-луночный плашет с предельно низкой адгезией («Costar», США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5-7 дней культивировали в планшете.The formed neuronal rosettes and ridges were mechanically separated and transferred to a 24-well plate with extremely low adhesion (Costar, USA), where neurospheres were subsequently formed, which were cultivated for another 5-7 days in a plate.
Нейросферы собирали в центрифужные пробирки, диссоциировали до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0.25%) и высевали на чашки Петри, покрытые матригелем, в нейрональную среду DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement N2 («Life Technologies)), США), 10 мкМ SB431542(«Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США). Далее полученную культуру нейрональных предшественников культивировали до плотного монослоя (рис. 2) и рассевали 1:4 или 1:5 на новые чашки Петри 35 мм, покрытые матригелем. Пассирование нейрональных предшественников осуществляли каждые 3-5 дней, в зависимости от плотности посева. Нейрональные предшественники имеют высокую пролиферативную активность, за 2-3 пассирования наращивается большое количество клеток, которые успешно подвергаются криоконсервации и хранению в жидком азоте, с высоким процентом (от 50 до 70%) выхода живых клеток из заморозки. При дальнейшей направленной дифференцировке нейрональных предшественников после 8 пассажа пролиферативная активность клеток существенно снижалась и начиналось формирование сети нейритов (рис. 3).Neurospheres were collected in centrifuge tubes, dissociated to a single cell suspension using trypsin (0.25%) and plated on Matrigel coated Petri dishes in DMEM / F12 neuronal medium, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids ( “PanEco”, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement N2 (“Life Technologies)”, USA), 10 μM SB431542 (“Stemgent”, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA). Next, the resulting culture of neuronal precursors was cultured to a dense monolayer (Fig. 2) and scattered 1: 4 or 1: 5 into new 35 mm Matriel Petri dishes. Passivation of neuronal precursors was carried out every 3-5 days, depending on the density of seeding. Neuronal precursors have high proliferative activity, a large number of cells that successfully undergo cryopreservation and storage in liquid nitrogen, with a high percentage (from 50 to 70%) of the release of living cells from freezing, grow in 2-3 passages. With further directed differentiation of neuronal precursors after passage 8, the proliferative activity of cells decreased significantly and the formation of a network of neurites began (Fig. 3).
Пример 3. Дифференцировка нейрональных предшественников в культуры зрелых нейронов, обогащенных дофаминергическими нейронами.Example 3. Differentiation of neuronal precursors in the culture of mature neurons enriched in dopaminergic neurons.
Полученные нейрональные предшественники культивировали в CO2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха в среде DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США). Для получения терминально дифференцированных дофаминергических нейронов клетки рассевали в количестве 200 тыс./см2 на чашки Петри, покрытые матригелем. На следующий день делали смену среды на среду для нейрональных предшественников: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh («PeproTech», США), 20 нг/мл FGF8 («PeproTech», США) и 2 мкМ пуроморфамин («Stemgent», США). Клетки культивировали в течение 10 дней, смену среды осуществляли каждые 48 часов. На 11 сутки культивирования нейрональную среду заменяли на среду для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF («PeproTech», США), 20 нг/мл GDNF («PeproTech», США), 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина («Stemgent», США). Клетки культивировали еще 14 дней до полной зрелости нейронов. Смену среды осуществляли каждые 48 часов в первые дни культивирования и далее каждые 24 часа.The resulting neuronal precursors were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air in DMEM / F12 medium, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM non-essential amino acids (PanEco ”, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA). To obtain terminally differentiated dopaminergic neurons, the cells were scattered in an amount of 200 thousand / cm 2 on Petri dishes coated with matrigel. The next day, we changed the medium to the medium for neuronal precursors: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin ( 50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 100 ng / ml Shh (PeproTech, USA), 20 ng / ml FGF8 (PeproTech, USA) and 2 μM puromorphamine (Stemgent, USA). Cells were cultured for 10 days, medium change was carried out every 48 hours. On the 11th day of cultivation, the neuronal medium was replaced with a maturation medium: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin ( 50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 20 ng / ml BDNF (PeproTech, USA), 20 ng / ml GDNF (PeproTech, USA), 200 μM ascorbic acid, 5 μM forskolin (Stemgent, USA). Cells were cultured another 14 days until the neurons were fully matured. A change of medium was carried out every 48 hours in the first days of cultivation and then every 24 hours.
В результате разработанной методики была получена морфологически гомогенная популяция нейрональных клеток, в которой не менее 90% клеток окрашивались антителами к нейрон-специфическому белку бета-III-тубулину (рис. 4). Более того, согласно разработанной модели были получены нейрональные культуры, обогащенные дофаминергическими нейронами (рис. 5), что особенно важно в случае болезни Паркинсона, для которой доказана избирательная гибель именно нейронов этого типа в определенных отделах мозга. В качестве маркера дофаминергических нейронов использовались антитела к ферменту синтеза катехоламинов-тирозингидроксилазе.As a result of the developed technique, a morphologically homogeneous population of neuronal cells was obtained in which at least 90% of the cells were stained with antibodies to the neuron-specific beta-III-tubulin protein (Fig. 4). Moreover, according to the developed model, neuronal cultures enriched with dopaminergic neurons were obtained (Fig. 5), which is especially important in the case of Parkinson’s disease, for which the selective death of precisely this type of neurons in certain parts of the brain was proved. Antibodies to the enzyme for the synthesis of catecholamines tyrosine hydroxylase were used as a marker of dopaminergic neurons.
Пример 4. Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений в культурах дифференцированных в нейрональном направлении ИПС клеток.Example 4. Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds in cultures of differentiated in the neuronal direction IPA cells.
Модель цитотоксического повреждения нейронов с применением перекиси водорода. Для создания модели цитотоксического повреждения нейронов, полученных при дифференцировке ИПС клеток, был использован подход с применением перекиси водорода. Подбор концентраций перекиси водорода, оказывающих токсическое действие на клетки, проводили на нейронах, полученных от здорового донора. В этом случае нейрональные предшественники культивировали в присутствии соответствующих факторов дифференцировки в течение 24 суток. Перекись водорода в широком диапазоне концентраций (50-500 мкМ) вносили одновременно со сменой среды и клетки инкубировали 24 ч. Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали специфическими антителами против бета-III-тубулина. Было показано, что перекись водорода в концентрации 50 мкм существенно снижает количество тубулин положительных клеток, в концентрации 200 мкм гибель клеток составила более 50%, при 500 мкм все клетки погибали (рис. 6).A model of cytotoxic damage to neurons using hydrogen peroxide. To create a model of cytotoxic damage to neurons obtained by differentiation of IPA cells, an approach using hydrogen peroxide was used. The selection of the concentrations of hydrogen peroxide, which have a toxic effect on the cells, was carried out on neurons obtained from a healthy donor. In this case, neuronal precursors were cultured in the presence of appropriate differentiation factors for 24 days. Hydrogen peroxide in a wide range of concentrations (50-500 μM) was introduced simultaneously with the change of medium and the cells were incubated for 24 hours. Then the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with specific antibodies against beta-III-tubulin. It was shown that hydrogen peroxide at a concentration of 50 μm significantly reduces the number of tubulin-positive cells, at a concentration of 200 μm, cell death was more than 50%, at 500 μm all cells died (Fig. 6).
В аналогичных экспериментах исследование гибели дофаминергических нейронов (ТГП нейроны) в дифференцированных культурах ИПС клеток выявило более существенную чувствительность этих клеток к действию перекиси. Так, было показано, что перекись водорода в концентрации 50 мкМ убивает около 60% клеток, а при 200 мкМ живыми оставались менее 5% клеток (рис. 7).In similar experiments, the study of the death of dopaminergic neurons (TGP neurons) in differentiated cultures of IPA cells revealed a more significant sensitivity of these cells to the action of peroxide. Thus, it was shown that hydrogen peroxide at a concentration of 50 μM kills about 60% of the cells, while at 200 μM less than 5% of the cells remained alive (Fig. 7).
Таким образом, установлен важный факт разной чувствительности дифференцированных в нейральном направлении ИПС клеток к такому цитотоксическому соединению, как перекись водорода. В дальнейшем, разработанная модель позволяет проводить скрининг соединений на наличие нейропротекторной активности как для общей нейрональной популяции, так и для нейронов определенной ергичности.Thus, an important fact has been established that the sensitivity of differentiated in the neural direction of IPA cells to such a cytotoxic compound as hydrogen peroxide is different. In the future, the developed model allows screening of compounds for the presence of neuroprotective activity both for the general neuronal population and for neurons of a certain ergotity.
Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений на модели цитотоксического повреждения нейронов с применением перекиси водорода. Добавление тестируемых соединений в объеме 100 мкл за 24 ч до внесения перекиси водорода.Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds on the model of cytotoxic damage to neurons using hydrogen peroxide. The addition of test compounds in a volume of 100
Для этого нейрональные предшественники, прошедшие 1 этап дифференцировки (культивирование в течение 10 дней, в присутствии 100 нг/мл Shh, 20 нг/мл FGF8 и 2 мкМ пуроморфамин) высевали по 20 тыс. клеток в 100 мкл нейрональной среды (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh (PeproTech), 20 нг/мл FGF8 («PeproTech», США) и 2 мкМ пуроморфамин («Stemgent», США) на лунку 96-луночной плашки, покрытой матригелем. Через 24 часа среду заменяли на среду для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF («PeproTech», США), 20 нг/мл GDNF («PeproTech», США), 200 мкМ аскорбиновая кислота, 5 мкМ форсколина («Stemgent», США). Клетки культивировали еще 7-14 дней. За 24 ч до внесения перекиси водорода делали смену среды в объеме 100 мкл с соответствующими пептидами (тестируемыми соединениями) до конечных концентраций 10-7 М и 10-9 М. Через 24 часа делали смену среды с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 250 мкМ. Клетки инкубировали 3 часа, после чего делали полную смену среды на ростовую (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки, 1 мМ заменимые аминокислоты, 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27, 20 нг/мл BDNF, 20 нг/мл GDNF, 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина). Через 24 часа определяли количество жизнеспособных клеток. Оптическую плотность измеряли на приборе Metertech ∑960. Полученные результаты представлены на рис. 8.For this, neuronal precursors that underwent
АКТГ (6-9), Семакс и альфа-МСГ увеличивали число выживших клеток при воздействии перекиси водорода, то есть обладали нейропротекторным эффектом.ACTH (6-9), Semax and alpha-MSH increased the number of surviving cells when exposed to hydrogen peroxide, that is, they had a neuroprotective effect.
Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений на модели цитотоксического повреждения нейронов с применением перекиси водорода. Добавление тестируемых соединений в объеме 100 мкл за 40 мин до внесения перекиси водорода.Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds on the model of cytotoxic damage to neurons using hydrogen peroxide. The addition of test compounds in a volume of 100
Для этого нейрональные предшественники, прошедшие 1 этап дифференцировки (культивирование в течение 10 дней, в присутствии 100 нг/мл Shh, 20 нг/мл FGF8 и 2 мкМ пуроморфамин) высевали по 20 тыс. клеток в 100 мкл нейрональной среды (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh («PeproTech», США), 20 нг/мл FGF8 («PeproTech»», США) и 2 мкМ пуроморфамин («Stemgent», США) на лунку 96-луночной плашки, покрытой матригелем. Через 24 часа среду заменяли на среду для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF («PeproTech», США), 20 нг/мл GDNF («PeproTech», США), 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина («Stemgent», США). Клетки культивировали еще 7-14 дней. За 40 минут до внесения перекиси водорода делали смену среды (100 мкл) с соответствующими пептидами до конечных концентраций 10-7 М и 10-9 М. Через 40 мин вносили еще 100 мкл среды с перекисью водорода до конечной ее концентрации 250 мкМ. Клетки инкубировали 3 часа, после чего делали полную смену среды на ростовую (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки, 1 мМ заменимые аминокислоты, 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27, 20 нг/мл BDNF, 20 нг/мл GDNF, 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина). Через 24 часа определяли количество жизнеспособных клеток. Оптическую плотность измеряли на приборе Metertech ∑960.For this, neuronal precursors that underwent
Полученные результаты представлены на рис. 9. Было показано, что АКТГ (6-9), Семакс и альфа-МСГ увеличивали число выживших клеток при воздействии перекиси водорода, то есть обладали нейропротекторным эффектом.The results are presented in Fig. 9. It was shown that ACTH (6–9), Semax, and alpha-MSH increased the number of surviving cells when exposed to hydrogen peroxide, that is, they had a neuroprotective effect.
Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений на модели цитотоксического повреждения нейронов при кратковременном действии (30 мин) перекиси водорода. Добавление тестируемых соединений в объеме 100 мкл в течение 7 дней до внесения перекиси водорода.Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds on the model of cytotoxic damage to neurons under the short-term action (30 min) of hydrogen peroxide. The addition of test compounds in a volume of 100 μl for 7 days before the introduction of hydrogen peroxide.
На данном этапе работы исследовали действие ряда пептидных соединений на жизнеспособность нейронов при кратковременном воздействии перекиси водорода. Для этого нейрональные предшественники, прошедшие 1-й этап дифференцировки в течение 10 дней в присутствии таких факторов, как FGF8, Shh, Puromorfamin, были рассеяны на 96-луночный планшеты по 40 тыс./лунку в 100 мкл среды. Клетки культивировали еще 7 дней с пептидами и факторами второго этапа дифференцировки - BDNF, GDNF, аскорбиновая кислота, форсколин. На 8 сутки культивирования осуществляли полную смену среды, добавляли перекись водорода (15 мМ), инкубировали 30 минут, затем опять полностью заменяли среду и проводили МТТ тест для определения количества живых клеток. Данные этих экспериментов представлены на рис. 10. АКТГ 6-9, Семакс увеличивали число выживших клеток при кратковременном действии высоких концентраций перекиси водорода на 15-30%, то есть обладали нейропротекторным эффектом.At this stage of the study, the effect of a number of peptide compounds on the viability of neurons under short-term exposure to hydrogen peroxide was investigated. For this, neuronal precursors that underwent the 1st stage of differentiation for 10 days in the presence of factors such as FGF8, Shh, Puromorfamin were scattered on 96-well plates at 40 thousand / well in 100 μl of medium. Cells were cultured for another 7 days with peptides and factors of the second stage of differentiation - BDNF, GDNF, ascorbic acid, forskolin. On the 8th day of cultivation, a complete change of the medium was carried out, hydrogen peroxide (15 mM) was added, incubated for 30 minutes, then the medium was completely replaced again and an MTT test was performed to determine the number of living cells. The data of these experiments are presented in Fig. 10. ACTH 6-9, Semax increased the number of surviving cells under the short-term effect of high concentrations of hydrogen peroxide by 15-30%, that is, they had a neuroprotective effect.
ЛитератураLiterature
1. Takahashi, K., Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126, 663-676.1. Takahashi, K., Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126, 663-676.
2. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, Т., Tomoda, K., Yamanaka, S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, 861-872.2. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, 861-872.
3. Лебедева O.C., Лагарькова M.A., Гривенников И.А. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: получение и перспективы применения. В Сборнике «Стволовые клетки и регенеративная медицина» 2011, 304-318. МАКС Пресс, ISBN 978-5-317-03583-9.3. Lebedeva O.C., Lagarkova M.A., Grivennikov I.A. Induced pluripotent stem cells: preparation and application prospects. In the collection "Stem Cells and Regenerative Medicine" 2011, 304-318. MAX Press, ISBN 978-5-317-03583-9.
4. Е.В. Новосадова, И.А. Гривенников. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: от получения до применения в биохимических и биомедицинских исследованиях. Успехи биологической химии. (2014), 54, 3-38.4. E.V. Novosadova, I.A. Grivennikov. Induced pluripotent stem cells: from receipt to use in biochemical and biomedical research. Advances in biological chemistry. (2014), 54, 3-38.
5. Grskovic, М., Javaherian, A., Strulovici, В., Daley, G.Q. (2011) Induced pluripotent stem cells-opportunities for disease modeling and drug discovery, Nature Reviews Drug Discovery, 10, 915-929.5. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G.Q. (2011) Induced pluripotent stem cells-opportunities for disease modeling and drug discovery, Nature Reviews Drug Discovery, 10, 915-929.
6. Mackay-Sim, A. (2013) Patient-derived stem cells: pathways to drug discovery for brain diseases, Frontiers in Cellular Neuroscience, 7, Article 29, 1-10.6. Mackay-Sim, A. (2013) Patient-derived stem cells: pathways to drug discovery for brain diseases, Frontiers in Cellular Neuroscience, 7, Article 29, 1-10.
7. Maury, Y., Gauthier, M., Peschanski, M., Martinat, C. (2012) Human pluripotent stem cells for disease modelling and drug screening, Bioessays, 34, 61-71.7. Maury, Y., Gauthier, M., Peschanski, M., Martinat, C. (2012) Human pluripotent stem cells for disease modeling and drug screening, Bioessays, 34, 61-71.
8. Гривенников И.А. (2008) Эмбриональные стволовые клетки и проблема направленной дифференцировки, Успехи биологической химии, 48, 181-220.8. Grivennikov I.A. (2008) Embryonic stem cells and the problem of directed differentiation, Advances in Biological Chemistry, 48, 181-220.
9. Гривенников И.А., О.В. Долотов, Н.Ф. Мясоедов. «Способ скрининга фармакологических соединений на нейропротекторную активность». Патент РФ №2383615. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 10.03.2010 г. Приоритет от 12 марта 2009 г.9. Grivennikov I.A., O.V. Dolotov, N.F. Meat eaters. "A method for screening pharmacological compounds for neuroprotective activity." RF patent No. 2383615. Registered in the State Register of Inventions of the Russian Federation on March 10, 2010. Priority dated March 12, 2009.
10. Е.В. Новосадова, Л.А. Андреева, Е.Л. Арсеньева, И.А. Гривенников, С.Н. Иллариошкин, О.С. Лебедева, И.В. Макарова, Е.С. Мануйлова, Н.Ф. Мясоедов, В.З. Тарантул. «Применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для оценки цито- и эмбриотоксических свойств фармакологических соединений». Заявка на патент от 10.09.2015 г. рег. №2015138572.10. E.V. Novosadova, L.A. Andreeva, E.L. Arsenyev, I.A. Grivennikov, S.N. Illarioshkin, O.S. Lebedeva, I.V. Makarova, E.S. Manuylova, N.F. Myasoedov, V.Z. Tarantula. "The use of induced human pluripotent stem cells to evaluate the cyto- and embryotoxic properties of pharmacological compounds." Application for a patent dated September 10, 2015 reg. No. 2015138572.
11. Гривенников И.А., О.С. Лебедева, Е.В. Новосадова, С.Л. Киселев, М.А. Лагарькова, С.Н. Иллариошкин, С.А. Клюшников. «Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов пациентов с болезнью Гентингтона». Патент №2458983. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20 августа 2012 г. Приоритет от 18 июля 2011 г.11. Grivennikov I.A., O.S. Lebedeva, E.V. Novosadova, S.L. Kiselev, M.A. Lagarkova, S.N. Illarioshkin, S.A. Klyushnikov. "A method for producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with Huntington's disease." Patent No. 2458983. Registered in the State Register of Inventions of the Russian Federation on August 20, 2012. Priority dated July 18, 2011.
Claims (17)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016121897A RU2646446C1 (en) | 2016-06-02 | 2016-06-02 | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016121897A RU2646446C1 (en) | 2016-06-02 | 2016-06-02 | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646446C1 true RU2646446C1 (en) | 2018-03-05 |
Family
ID=61568604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016121897A RU2646446C1 (en) | 2016-06-02 | 2016-06-02 | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646446C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114441413A (en) * | 2022-01-24 | 2022-05-06 | 南京医科大学 | A method for the analysis of single vesicle storage in iPSC-induced differentiated dopaminergic neurons |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2383615C1 (en) * | 2009-03-12 | 2010-03-10 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) | Method of screening pharmacological compounds according to neuroprotective activity |
| RU2458983C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-08-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Method of producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with huntington's disease |
| WO2015049677A1 (en) * | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kadimastem Ltd. | Directed differentiation of astrocytes from human pluripotent stem cells for use in drug screening and the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
-
2016
- 2016-06-02 RU RU2016121897A patent/RU2646446C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2383615C1 (en) * | 2009-03-12 | 2010-03-10 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) | Method of screening pharmacological compounds according to neuroprotective activity |
| RU2458983C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-08-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Method of producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with huntington's disease |
| WO2015049677A1 (en) * | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kadimastem Ltd. | Directed differentiation of astrocytes from human pluripotent stem cells for use in drug screening and the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MAURY Y. et al. Human pluripotent stem cells for disease modelling and drug screening // Bioessays,2012, 34, 61-71. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114441413A (en) * | 2022-01-24 | 2022-05-06 | 南京医科大学 | A method for the analysis of single vesicle storage in iPSC-induced differentiated dopaminergic neurons |
| CN114441413B (en) * | 2022-01-24 | 2024-05-14 | 南京医科大学 | Analysis method for single vesicle storage in dopaminergic neurons induced to differentiate by iPSC technology |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tucker et al. | Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation | |
| KR102210180B1 (en) | Method for producing ciliary marginal zone-like structure | |
| KR20220088800A (en) | Methods for differentiating pluripotent cells | |
| JP2014509192A (en) | Methods and compositions for generating patient-specific pluripotent neuronal stem cells | |
| Bojnordi et al. | Differentiation of spermatogonia stem cells into functional mature neurons characterized with differential gene expression | |
| CN106701824B (en) | The method that dynamoneure and its functional cell are obtained based on people iPS cells | |
| KR20170051497A (en) | Method for producing cerebellar progenitor tissue | |
| AU2025202036A1 (en) | Method for preserving neural tissue | |
| JP2019517257A (en) | In vitro method of differentiating stem cells into neurons, and neurons generated using this method | |
| CN103740757A (en) | Method for preparing pig neural stem cells by reprogramming | |
| CN105861428A (en) | Inducing culture medium for inducing fibroblast to trans-differentiate into cardiac muscle cells and application of inducing culture medium | |
| Major et al. | Derivation of telencephalic oligodendrocyte progenitors from human pluripotent stem cells | |
| RU2690846C1 (en) | Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directed differentiation of induced human pluripotent stem cells | |
| RU2646446C1 (en) | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation | |
| RU2690498C1 (en) | Method for preparing a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directional differentiation of induced human pluripotent stem cells | |
| Sareen et al. | Human neural progenitor cells generated from induced pluripotent stem cells can survive, migrate, and integrate in the rodent spinal cord | |
| JP7520120B2 (en) | Differentiation method for obtaining large amounts of oligodendrocytes by disaggregating 3D organoids prepared from human pluripotent stem cells | |
| CN114729323B (en) | Rotationally aggregated neural microspheres and their applications | |
| Shamekh et al. | Effects of Sertoli cell-conditioned medium on ventral midbrain neural stem cells: a preliminary report | |
| RU2823290C1 (en) | Improved method for differentiation of induced pluripotent human stem cells into dopaminergic neurons | |
| Sukhinich et al. | Cerebral organoids: a model of brain development | |
| EP4570903A1 (en) | Method for preparing cerebellar organoid | |
| RU2752906C2 (en) | Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under heat shock and method for production thereof | |
| RU2599847C1 (en) | Use of induced pluripotent human stem cells for assessing cito- and embryotoxic properties of pharmacological compounds | |
| RU2732599C1 (en) | Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from glial progenitor cells under conditions of heat shock, and a method for production thereof |