RU2644675C1 - Composition for inhibiting growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells - Google Patents
Composition for inhibiting growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644675C1 RU2644675C1 RU2016145467A RU2016145467A RU2644675C1 RU 2644675 C1 RU2644675 C1 RU 2644675C1 RU 2016145467 A RU2016145467 A RU 2016145467A RU 2016145467 A RU2016145467 A RU 2016145467A RU 2644675 C1 RU2644675 C1 RU 2644675C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- umet
- composition
- phosphate
- dts
- genes
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 230000006659 positive regulation of apoptotic process Effects 0.000 title claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 47
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 101710177963 Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 102100027522 Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 101000615280 Homo sapiens DNA replication licensing factor MCM4 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102100021389 DNA replication licensing factor MCM4 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 9
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 9
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 6
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 claims description 5
- NPRNBAPBGVERRF-ZOQUXTDFSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-2-(hydroxymethyl)-4-methoxyoxolan-3-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 NPRNBAPBGVERRF-ZOQUXTDFSA-N 0.000 claims description 5
- IATVSXSQCCSKNS-ZOQUXTDFSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-2-(hydroxymethyl)-4-methoxyoxolan-3-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 IATVSXSQCCSKNS-ZOQUXTDFSA-N 0.000 claims description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 4
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 3
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 abstract description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 10
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 10
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 10
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- -1 phloxuridine Chemical compound 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 4
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 3
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 3
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 2
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 101150061358 mcm-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 2
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKNLXHRBXYGJOC-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OCC1C(OP(OCCC#N)N(C(C)C)C(C)C)C(O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 SKNLXHRBXYGJOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 6-Mercaptoguanine Natural products N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101000582926 Dictyostelium discoideum Probable serine/threonine-protein kinase PLK Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100272581 Homo sapiens BIRC7 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 description 1
- WDDPHFBMKLOVOX-AYQXTPAHSA-N clofarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1F WDDPHFBMKLOVOX-AYQXTPAHSA-N 0.000 description 1
- 229960000928 clofarabine Drugs 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000002352 nonmutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 1
- 108010056274 polo-like kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229950006896 sapacitabine Drugs 0.000 description 1
- LBGFKUUHOPIEMA-PEARBKPGSA-N sapacitabine Chemical compound O=C1N=C(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C=CN1[C@H]1[C@@H](C#N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LBGFKUUHOPIEMA-PEARBKPGSA-N 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=NC=N[C]21 MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/335—Modified T or U
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к средству терапии онкологических заболеваний, а также транспорта нуклеиновых кислот в клетки.The invention relates to medicine, in particular to a means of treating cancer, as well as the transport of nucleic acids into cells.
Одним из основных терапевтических подходов к лечению рака является использование противоопухолевых химиотерапевтических агентов, в частности оксалиплатина, который относится к цитостатическим противоопухолевым химиотерапевтическим лекарственным препаратам. В результате воздействия препарата раковая клетка подвергается апоптозу. Препараты платины, как и многие другие химиотерапевтические лекарственные препараты, обладают высоким уровнем токсичности, в частности для препаратов платины типична высокая нейротоксичность, в результате которой развивается периферическая нейропатия, а также известны случаи развития глухоты, почечной недостаточности, лейкопении, тромбоцитопении, анемии и т.д. Кроме того, зачастую они недостаточно эффективны, обладают существенным мутагенным эффектом, к ним развивается лекарственная устойчивость.One of the main therapeutic approaches to the treatment of cancer is the use of antitumor chemotherapeutic agents, in particular oxaliplatin, which refers to cytostatic antitumor chemotherapeutic drugs. As a result of exposure to the drug, the cancer cell undergoes apoptosis. Platinum drugs, like many other chemotherapeutic drugs, have a high level of toxicity, in particular, platinum drugs are characterized by high neurotoxicity, which results in peripheral neuropathy, as well as cases of deafness, renal failure, leukopenia, thrombocytopenia, anemia, etc. d. In addition, often they are not effective enough, have a significant mutagenic effect, drug resistance develops to them.
На сегодняшний день рак толстой кишки занимает 3 место по уровню смертности среди всех опухолевых заболеваний. Традиционные подходы для лечения рака не всегда оказываются применимы. Альтернативным и достаточно новым методом лечения опухолевых заболеваний является генная терапия, которая основывается на введении терапевтических нуклеиновых кислот (НК) в опухоль. Разработка препаратов с незначительным спектром побочных действий, но способных обеспечить такой же или более значимый терапевтический эффект представляется одной из первоочередных задач в этой области. В этой связи в последнее десятилетие активно развивается принципиально новое направление по созданию таргетных препаратов, действие которых направлено на регуляцию функциональной активности определенных генов. Как правило, такие препараты представляют собой антитела против конкретных белков или малые молекулы, часто выполняющие функцию ингибиторов. К их недостаткам относится неполная избирательность, что способствует усилению токсического эффекта, особенно в случаи малых молекул. Антитела являются привнесенными в организм компонентами, которые способны проявлять дополнительные активности в результате формирования неспецифических комплексов (перекрестные реакции). Область действия моноклональных антител, применяемых для таргетной терапии, ограничена барьерной функцией клеточной мембраны, что делает невозможным их использование для направленного воздействия на внутриклеточные структуры.To date, colon cancer is the third largest mortality rate among all tumor diseases. Traditional approaches to treating cancer are not always applicable. An alternative and fairly new method of treating tumor diseases is gene therapy, which is based on the introduction of therapeutic nucleic acids (NKs) into the tumor. The development of drugs with an insignificant spectrum of side effects, but capable of providing the same or more significant therapeutic effect seems to be one of the priority tasks in this area. In this regard, in the last decade, a fundamentally new direction has been actively developing for the creation of targeted drugs, the action of which is aimed at regulating the functional activity of certain genes. Typically, such drugs are antibodies against specific proteins or small molecules that often act as inhibitors. Their disadvantages include incomplete selectivity, which contributes to an increase in the toxic effect, especially in cases of small molecules. Antibodies are components introduced into the body that are capable of exhibiting additional activities as a result of the formation of non-specific complexes (cross-reactions). The scope of monoclonal antibodies used for targeted therapy is limited by the barrier function of the cell membrane, which makes it impossible to use them for targeted action on intracellular structures.
Значительная часть современных таргетных препаратов является малыми молекулами. Их основной недостаток - недостаточная специфичность, что приводит к появлению дополнительных эффектов, обусловливающих токсичность.A significant part of modern targeted drugs are small molecules. Their main drawback is the lack of specificity, which leads to the appearance of additional effects causing toxicity.
В отличие от малых молекул миРНК - природные вещества, функционирующие в клетках человека (и других млекопитающих). Искусственно введенные миРНК не являются инородными для организма веществами. Как природные, так и синтезированные миРНК обладают одной и той же структурой, позволяющей воздействовать именно на те гены, функция которых должна быть ингибирована. Они имеют малые размеры, облегчающие их эффективную доставку в раковую клетку. Их основная функция - блокирование синтеза белка путем инактивации работы гена на ранней стадии и делает невозможным его фенотипическое проявление, что, в свою очередь, благотворно сказывается на организме пациента в целом. Кроме того, для РНК интерференции гена в организм реципиента нужно ввести сравнительно небольшое количество посторонних веществ.Unlike small molecules, siRNAs are natural substances that function in human cells (and other mammals). Artificially introduced siRNAs are not substances foreign to the body. Both natural and synthesized siRNAs have the same structure, which allows them to affect precisely those genes whose function should be inhibited. They are small in size, facilitating their efficient delivery to the cancer cell. Their main function is to block protein synthesis by inactivating the gene at an early stage and making its phenotypic manifestation impossible, which, in turn, has a beneficial effect on the patient's body as a whole. In addition, for RNA gene interference, a relatively small amount of foreign substances must be introduced into the recipient's body.
Таргетные препараты, разработанные специально для применения совместно со стандартными химиопрепаратами, в настоящее время отсутствуют. В связи с этим актуально создание новых таргетных препаратов и поиск альтернативных лечебных подходов. Одним из таких подходов является выявление генов, ингибирование которых способно приводить не только к снижению жизнеспособности раковой клетки, но и к усилению чувствительности опухоли к стандартному химиотерапевтическому лечению. Изобретение основано на новых подходах, базирующихся на последних достижениях «постгеномной эры».Targeted drugs designed specifically for use with standard chemotherapeutic agents are currently not available. In this regard, the creation of new targeted drugs and the search for alternative therapeutic approaches are relevant. One of these approaches is the identification of genes, the inhibition of which can lead not only to a decrease in the viability of a cancer cell, but also to an increase in the sensitivity of the tumor to standard chemotherapeutic treatment. The invention is based on new approaches based on the latest achievements of the “postgenomic era”.
Известен способ модулирования функции и/или экспрессии гена-супрессора опухолей в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro, включающий взаимодействие указанных клеток или тканей с малыми интерферирующими РНК (миРНК) длиной от 5 до 30 нуклеотидов, специфически распознающими гены-супрессоры опухолей. Ген-супрессор опухолей (антионкоген, опухолевый супрессор) - ген, который обеспечивает мутацию «потеря функции» (супрессии) в ходе развития опухоли (Haber D & Harlow Ed., 1997). Белковые продукты генов-супрессоров называют белками-супрессорами или антионкобелками. Кроме того, антионкогены могут кодировать и микроРНК (RU №2011127196).A known method for modulating the function and / or expression of a tumor suppressor gene in mammalian cells or tissues in vivo or in vitro, comprising interacting these cells or tissues with small interfering RNAs (siRNAs) of 5 to 30 nucleotides in length that specifically recognize tumor suppressor genes. Tumor suppressor gene (anti-oncogen, tumor suppressor) is a gene that provides a “loss of function” (suppression) mutation during tumor development (Haber D & Harlow Ed., 1997). The protein products of suppressor genes are called suppressor proteins or anti-oncoproteins. In addition, anti-oncogenes can encode microRNAs (RU No. 2011127196).
Известны генно-инженерные конструкты, экспрессирующие вектора, несущий многофункциональный промотор, соединенный с определенными транскрибируемыми последовательностями, которые при транскрипции продуцируют информационную РНК, кодирующую фермент, который в результате посттрансляционного процессинга превращается из нетоксичного пептида (пролекарство) во внутриклеточный токсин (лекарство), убивающий клетку. Экспрессирующий вектор представляет собой вирусный вектор или невирусный вектор (RU №2476596).Genetic engineering constructs are known that express vectors carrying a multifunctional promoter linked to specific transcribed sequences that, when transcribed, produce informational RNA that encodes an enzyme that, as a result of post-translational processing, is converted from a non-toxic peptide (prodrug) into an intracellular toxin (drug) that kills the cell . The expression vector is a viral vector or non-viral vector (RU No. 2476596).
Известно средство индукции апоптоза в клетке-мишени, в котором двухцепочечная молекула РНК способна к мишень-специфической РНК-интерференции. Комплементарные друг другу фрагменты РНК имеют длину 23 нуклеотидных остатка и образуют дуплекс с выступающими 3'-концами длиной от 1 до 5 нуклеотидов (RU №2470073).A means of inducing apoptosis in a target cell is known in which a double-stranded RNA molecule is capable of target-specific RNA interference. RNA fragments complementary to each other have a length of 23 nucleotide residues and form a duplex with protruding 3'-ends with a length of 1 to 5 nucleotides (RU No. 2470073).
Известна фармацевтическая композиция, содержащая дезинтегратор митоза/ингибитор биохимического пути polo-подобной киназы (Plk), в частности ON01910, ON01910-Na или миРНК, направленную на Plk1, и химиотерапевтический агент, представляющий собой нуклеотидный аналог, в эффективном количестве, а также фармацевтически и физиологически приемлемый носитель, для использования в качестве лекарственного средства для предупреждения развития резистентности к химиотерапевтическому агенту, представляющему собой нуклеотидный аналог, у субъекта, страдающего раком, или для использования в качестве лекарственного средства для лечения рака, резистентного к химиотерапевтическому агенту, представляющему собой нуклеотидный аналог, у нуждающегося в этом пациента. Химиотерапевтический агент представляет собой нуклеотидный аналог, выбран из группы, состоящей из кладрибина, клофарабина, флударабина, меркаптопурина, пентостатина, тиогуанина, капецитабина, цитарабина, децитабина, фторурацила, флоксуридина, сапацитабина и гемцитабина; или химиотерапевтический агент представляет собой нуклеотидный аналог, представляет собой гемцитабин (RU №2476239).A known pharmaceutical composition comprising a mitosis disintegrator / inhibitor of the biochemical pathway of polo-like kinase (Plk), in particular ON01910, ON01910-Na or siRNA directed to Plk1, and a chemotherapeutic agent, which is a nucleotide analogue, in an effective amount, as well as pharmaceutically and physiologically acceptable carrier, for use as a medicine to prevent the development of resistance to a chemotherapeutic agent, which is a nucleotide analogue, in a subject suffering from ohm, or for use as a medicament for the treatment of cancer that is resistant to the chemotherapeutic agent is a nucleotide analog, in a patient in need thereof. A chemotherapeutic agent is a nucleotide analog selected from the group consisting of cladribine, clofarabine, fludarabine, mercaptopurine, pentostatin, thioguanine, capecitabine, cytarabine, decitabine, fluorouracil, phloxuridine, sapacitabine and gemcitabine; or a chemotherapeutic agent is a nucleotide analogue, is gemcitabine (RU No. 2476239).
Недостатками указанных известных способов и средств индукции апоптоза клетками злокачественных опухолей является недостаточная эффективность, продолжительный период лечения до получения значимых результатов, высокая вероятность побочных эффектов, характерных для химиотерапевтических препаратов, обусловленных тем, что в прототипе обеспечивают и оценивают снижение количества клеток, что может быть связано со снижением пролиферации, т.е. скорости деления раковых клеток. Блокируя ген, обеспечивают повышение чувствительности к противоопухолевому препарату при использовании тех же терапевтических доз. Это позиционируется как преодоление резистентности. Задача снижения дозы химиопрепаратов не решается. Апоптотическая гибель клеток опухоли применяемыми средствами не обеспечивается в достаточной для лечения мере и не определяется. Использование для ингибирования генов малых молекул может иметь недостаточную специфичность, что приведет к существенным нежелательным неспецифическим эффектам, обусловливающим дополнительную токсичность.The disadvantages of these known methods and means of inducing apoptosis by cells of malignant tumors are insufficient effectiveness, a long treatment period until significant results are obtained, a high probability of side effects characteristic of chemotherapeutic drugs, due to the fact that in the prototype they provide and evaluate a decrease in the number of cells, which may be associated with a decrease in proliferation, i.e. cancer cell division rate. By blocking the gene, they provide increased sensitivity to the antitumor drug when using the same therapeutic doses. This is positioned as overcoming resistance. The task of reducing the dose of chemotherapy is not solved. Apoptotic death of tumor cells by the used means is not provided in a measure sufficient for treatment and is not determined. The use of small molecules to inhibit genes may have insufficient specificity, which will lead to significant undesirable non-specific effects causing additional toxicity.
Наиболее близкой к настоящему техническому решению является композиция для индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака, содержащая оксалиплатин и комбинацию комплементарных к мРНК клеток злокачественной опухоли миРНК - олигонуклеотидов в виде коротких петлевых миРНК (shRNA) по меньшей мере одной из следующих структур:Closest to the present technical solution is a composition for inducing apoptosis of colorectal cancer cells, containing oxaliplatin and a combination of miRNA cells complementary to mRNA - oligonucleotides in the form of short loop siRNAs of at least one of the following structures:
(Sense oligo)-CAAGAGA-(Antisense oligo), или (Sense oligo-dtdt)-(Sense oligo)-CAAGAGA-(Antisense oligo-dtdt)-(Antisense oligo), где Sense oligo и Antisense oligo - пары олигонуклеотидов для каждого гена, (Sense oligo-dtdt) и (Antisense oligo-dtdt) - аналогичные последовательности РНК в парах олигонуклеотидов без dtdt, или (Antisense oligo-dtdt)-(Antisense oligo)-CAAGAGA-(Sense deoxyoligo-dtdt)-(Sense deoxyoligo), или CG-(Antisense deoxyoligo-dtdt)-(Antisense deoxyoligo)-CAAGAGA-(Sense deoxyoligo-dtdt)-(Sense deoxyoligo)-TTTTTTGGAAA, где Antisense deoxyoligo и Sense deoxyoligo представляют собой последовательности нуклеотидов с заменой рибонуклеотидов на дезоксирибонуклеотиды, (Antisense deoxyoligo-dtdt) и (Sense deoxyoligo-dtdt) - аналогичные последовательности ДНК в парах олигонуклеотидов без dtdt.(Sense oligo) -CAAGAGA- (Antisense oligo), or (Sense oligo-dtdt) - (Sense oligo) -CAAGAGA- (Antisense oligo-dtdt) - (Antisense oligo), where Sense oligo and Antisense oligo are pairs of oligonucleotides for each gene, (Sense oligo-dtdt) and (Antisense oligo-dtdt) - similar RNA sequences in pairs of oligonucleotides without dtdt, or (Antisense oligo-dtdt) - (Antisense oligo) -CAAGAGA- (Sense deoxyoligo-dtdt) - (Sense deoxyoligo ), or CG- (Antisense deoxyoligo-dtdt) - (Antisense deoxyoligo) -CAAGAGA- (Sense deoxyoligo-dtdt) - (Sense deoxyoligo) -TTTTTTGGAAA, where Antisense deoxyoligo and Sense deoxyoligo are nucleotide sequences replaced by ribonucleotides with deoxyribo nucleotides Antisense deoxyoligo-dtdt) and (Sense deoxyoligo-dtdt) - similar sequence and DNA in oligonucleotide pairs without dtdt.
При этом (Sense oligo) и (Antisense oligo) выбираются в соответствии с ингибируемым геном из следующего:In this case, (Sense oligo) and (Antisense oligo) are selected in accordance with the inhibited gene from the following:
(RU №2551238, прототип).(RU No. 2551238, prototype).
Недостатком прототипа является иммунотоксичность, обусловленная взаимодействием миРНК - олигонуклеотидов в виде коротких петлевых миРНК (shRNA) с толл-подобными рецепторами (англ. Toll-like receptor, TLR), а также неполная избирательность, увеличивающая токсический эффект.The disadvantage of the prototype is immunotoxicity, due to the interaction of siRNA oligonucleotides in the form of short loop siRNAs (shRNAs) with toll-like receptors (English Toll-like receptor, TLR), as well as incomplete selectivity, which increases the toxic effect.
Технической задачей изобретения является создание эффективного средства ингибирования роста и индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли с меньшими побочными эффектами, а также расширение арсенала средств индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака.An object of the invention is to provide an effective means of inhibiting the growth and induction of apoptosis of malignant tumor cells with fewer side effects, as well as expanding the arsenal of means of inducing apoptosis of colorectal cancer malignant tumor cells.
Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, заключается в снижении иммунотоксичности, поскольку разработанная согласно изобретению комбинация модифицированных и немодифицированных нуклеотидов для каждого из олигонуклеотидов уникальна и снижает их сродство к толл-подобным рецепторам (англ. Toll-like receptor, TLR), обеспечивая тем самым пониженную иммуногенность. Применение выбранных в соответствии с заявляемым решением малых интерферирующих РНК (миРНК) для подавления выбранных генов-мишеней является исходной основой технического результата, позволяющего существенно снизить иммунотоксичность средства ингибирования роста и индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли с одновременным снижением дозировки химиопрепарата - производного платины и соответственно свести к минимуму его побочное действие при повышении эффективности терапии. Таким образом, создан препарат с меньшими побочными эффектами, но способный обеспечить такой же или больший терапевтический эффект.The technical result, which provides a solution to the problem, is to reduce immunotoxicity, since the combination of modified and unmodified nucleotides developed according to the invention is unique for each of the oligonucleotides and reduces their affinity for toll-like receptors (English Toll-like receptor, TLR), thereby providing decreased immunogenicity. The use of small interfering RNAs (miRNAs) selected in accordance with the claimed solution to suppress selected target genes is the initial basis for a technical result that can significantly reduce the immunotoxicity of a means of inhibiting the growth and induction of malignant tumor cells while reducing the dosage of a chemotherapeutic drug - a platinum derivative and, accordingly, reduce minimize its side effect while increasing the effectiveness of therapy. Thus, a drug was created with fewer side effects, but capable of providing the same or greater therapeutic effect.
Сущность изобретения состоит в том, что композиция для ингибирования роста и стимуляции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака путем блокирования функции генов: МСМ4 и Livin в клетках злокачественной опухоли содержит средство для доставки композиции в клетки-мишени и комбинацию олигонуклеотидов миРНК, The essence of the invention lies in the fact that the composition for inhibiting the growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells by blocking the function of the genes: MCM4 and Livin in cancer cells contains a means for delivering the composition to the target cells and a combination of siRNA oligonucleotides,
из которых для блокирования генов МСМ4 она содержит препараты малых интерферирующих олигонуклеотидов:of which, to block the genes of MSM4, it contains preparations of small interfering oligonucleotides:
5'-C-U-C-A-Umet-C-U-C-U-Umet-А-С-С-С-A-С-A-G-G-dTs-dT-3' в качестве пассажирской цепи и5'-C-U-C-A-Umet-C-U-C-U-Umet-A-C-C-C-A-C-A-G-G-dTs-dT-3 'as the passenger chain and
5'-C-C-U-G-U-G-G-G-Umet-A-A-G-A-G-A-Umet-G-A-G-dTs-dT-3' в качестве направляющей (взаимодействующей с целевой РНК) цепи,5'-C-C-U-G-U-G-G-G-Umet-A-A-G-A-G-A-Umet-G-A-G-dTs-dT-3 'as a guide (interacting with the target RNA) of the chain,
а для блокирования генов Livin она содержит препараты малых интерферирующих олигонуклеотидов: 5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-Umet-U-G-U-C-C-A-Cmet-A-dTs-dT-3' в качестве пассажирской цепи иand to block Livin genes, it contains preparations of small interfering oligonucleotides: 5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-Umet-U-G-U-C-C-A-Cmet-A-dTs-dT-3 'as a passenger chain and
5'-U-G-U-G-G-A-Cmet-A-A-A-G-U-C- Umet-C-U-U-C-C-dTs-dT-3' в качестве направляющей (взаимодействующей с целевой РНК) цепи,5'-U-G-U-G-G-A-Cmet-A-A-A-G-U-C-Umet-C-U-U-C-C-dTs-dT-3 'as a guide (interacting with the target RNA) of the chain,
где G, С, A, U - рибонуклеотиды;where G, C, A, U are ribonucleotides;
Umet-2' - O-methyluridine-3'-phosphate(2'-O-метилуридин-3'-фосфат);Umet-2 '- O-methyluridine-3'-phosphate (2'-O-methyluridine-3'-phosphate);
Cmet-2' - O-methylcytidine-3'-phosphate(2'-O-метилцитидин-3'-фосфат);Cmet-2 '- O-methylcytidine-3'-phosphate (2'-O-methylcytidine-3'-phosphate);
dTs-2' - deoxythymidine-3'-phosphorothioate(2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат); dTs -2 '- deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate);
dT-2' - deoxythymidine-3'-phosphate(2'-дезокситимидин-3'-фосфат).dT-2 '- deoxythymidine-3'-phosphate (2'-deoxythymidine-3'-phosphate).
При этом препараты малых интерферирующих миРНК-олигонуклеотидов выполнены в виде дуплексов прямой и обратной комплементарных цепей нуклеотидов следующей структуры:Moreover, the preparations of small interfering siRNA oligonucleotides are made in the form of duplexes of the forward and reverse complementary nucleotide chains of the following structure:
для блокирования генов МСМ4 дуплексfor blocking genes MSM4 duplex
и для блокирования генов Livin дуплексand for blocking Livin duplex genes
где Gp, Cp, Ар, Up - рибонуклеотиды;where Gp, Cp, Ap, Up are ribonucleotides;
Ump - 2'-O-methyluridine-3'-phosphate (2'-O-метилуридин-3'-фосфат);U m p - 2'-O-methyluridine-3'-phosphate (2'-O-methyluridine-3'-phosphate);
Cmp - 2'-Omethylcytidine-3'-phosphate (2'-O-метилцитидин-3'-фосфат);C m p - 2'-Omethylcytidine-3'-phosphate (2'-O-methylcytidine-3'-phosphate);
dTsp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат); dTsp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate);
dTp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphate (2'-дезокситимидин-3'-фосфат).dTp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphate (2'-deoxythymidine-3'-phosphate).
Предпочтительно, в качестве средства для доставки композиции в клетки-мишени она содержит липосому, представляющую собой поликатионный липид в качестве компонента, связывающего и упаковывающего нуклеиновую кислоту, и нейтральные фосфолипиды (DOPE и PC) в качестве структурообразующих и промотирующих компонент, при соотношениях дуплекс:липосома от 1:2 до 1:12.Preferably, as a means for delivering the composition to the target cells, it contains a liposome, which is a polycationic lipid as a component that binds and packs nucleic acid, and neutral phospholipids (DOPE and PC) as structure-forming and promoting components, with duplex: liposome ratios from 1: 2 to 1:12.
Предпочтительно, средство для доставки композиции в клетки-мишени выполнено в форме липидной пленки, состоящей из поликатионного липида и нейтрального фосфолипида, гидратированных в воде с получением эмульсионно-дисперсионной системы, подвергнутой ультразвуковой обработке или экструзии, причем поликатионный липид, DOPE и PC взяты в соотношении 50:45:5 (мольн.).Preferably, the means for delivering the composition to the target cells is in the form of a lipid film consisting of a polycationic lipid and a neutral phospholipid, hydrated in water to obtain an emulsion-dispersion system, subjected to ultrasonic treatment or extrusion, and the polycationic lipid, DOPE and PC are taken in the ratio 50: 45: 5 (mol.).
Предпочтительно, в качестве средства для доставки композиции в клетки-мишени она содержит поликатионный липид в количестве от 25 до 67 мол. % на общее количество липидов в композиции; поликатионный липид выбирается из группы:Preferably, as a means for delivering the composition to the target cells, it contains a polycationic lipid in an amount of from 25 to 67 mol. % on the total amount of lipids in the composition; polycationic lipid is selected from the group:
-{2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate}, или DOSPA (Lipofectamine)- {2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate}, or DOSPA (Lipofectamine)
- Di-octadecyl-amido-glycyl-spermine, or DOGS, Transfectam.- Di-octadecyl-amido-glycyl-spermine, or DOGS, Transfectam.
- 3-β(N-(N',N'-dimethyl,N'-hydroxyethyl aminopropane)carbamoyl) cholesterol iodide (DMHAPC-Chol).- 3-β (N- (N ', N'-dimethyl, N'-hydroxyethyl aminopropane) carbamoyl) cholesterol iodide (DMHAPC-Chol).
- 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol, or DC-Chol.- 3β [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol, or DC-Chol.
- 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3).- 1,26-bis (cholest-5-en-3β-yloxycarbonylamino) -7,11,16,20-tetraazagexacosane tetrahydrochloride (2X3).
Композиция выполнена в фармацевтической форме, пригодной для парентерального применения с целью индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака.The composition is made in a pharmaceutical form suitable for parenteral administration with the goal of inducing apoptosis of colorectal cancer cells.
На фиг. 1 изображена последовательность этапов синтеза миРНК, на фиг. 2 - данные об эффективности трансфекции в зависимости от типа вектора и степени его загрузки, на фиг. 3 - данные о зависимость биологического эффекта от дозы препарата.In FIG. 1 depicts the sequence of steps for the synthesis of siRNA, FIG. 2 - data on the efficiency of transfection depending on the type of vector and the degree of its loading, in FIG. 3 - data on the dependence of the biological effect on the dose of the drug.
Изобретение базируется на современном подходе к созданию эффективных противоопухолевых препаратов с низкой токсичностью. Особый интерес представляют современные разработки по использованию РНК-интерференции в сочетании с липосомальными методами доставки малых интерферирующих РНК в клетки. Малые интерферирующие РНК (миРНК) представляют собой короткие двухцепочечные фрагменты РНК (21-23 пар оснований), комплементарные последовательности мРНК белка, синтез которого должен быть заблокирован. Использование миРНК в терапевтических целях основывается на существующих представлениях о механизме действия РНК-индуцируемого комплекса выключения генов (RISC) и эндонуклеазы Dicer.The invention is based on a modern approach to the creation of effective antitumor drugs with low toxicity. Of particular interest are modern developments on the use of RNA interference in combination with liposomal methods for the delivery of small interfering RNA into cells. Small interfering RNAs (siRNAs) are short double-stranded RNA fragments (21-23 base pairs), complementary to the protein mRNA sequence, the synthesis of which should be blocked. The therapeutic use of siRNA is based on the existing understanding of the mechanism of action of the RNA-induced gene shutdown complex (RISC) and Dicer endonuclease.
миРНК - природные вещества, функционирующие в клетках человека (и других млекопитающих). Искусственно введенные миРНК не будут инородными для организма веществами. Как природные, так и синтезированные, миРНК обладают абсолютной специфичностью, позволяющей воздействовать именно на те гены, функция которых должна быть ингибирована. Они имеют малые размеры, облегчающие их эффективную доставку в раковую клетку. Кроме того, миРНК прерывают процесс функционального проявления генов на более ранней стадии, до синтеза белков, количество которых значительно больше, чем матричной РНК. Вследствие этого требуются меньшие количества вводимых в организм больного веществ.siRNAs are natural substances that function in human cells (and other mammals). Artificially introduced siRNAs will not be substances foreign to the body. Both natural and synthesized siRNAs have absolute specificity, which allows them to affect precisely those genes whose function should be inhibited. They are small in size, facilitating their efficient delivery to the cancer cell. In addition, siRNAs interrupt the process of functional manifestation of genes at an earlier stage, before the synthesis of proteins, the amount of which is significantly greater than the matrix RNA. As a result, smaller amounts of substances introduced into the patient's body are required.
В то же время к проблемам в применении миРНК (как и других нуклеиновых кислот) относится их способность взаимодействовать с толл-подобными рецепторами, что способно вызывать иммунный ответ, а также возможность деградации вследствие действия внутриклеточных ферментов.At the same time, problems in the use of siRNAs (as well as other nucleic acids) include their ability to interact with toll-like receptors, which can cause an immune response, as well as the possibility of degradation due to the action of intracellular enzymes.
В организме человека существуют вне- и внутриклеточные барьеры, которые не позволяют самостоятельно проникать НК к месту их терапевтического действия. Для введения НК могут быть использованы вирусные системы доставки. Однако такие системы обладают рядом недостатков, таких как иммуногенность, мутагенность, ограниченный размер переносимой НК, трудности масштабирования, воспроизводства, стабильности, высокая стоимость. Альтернативными невирусными системами доставки НК, которые на сегодняшний день получили широкое распространение, являются катионные липосомы. За счет электростатического взаимодействия они могут компактизовать разные по размеру НК, формируя комплексы - липоплексы. Катионные липосомы неиммуногенны, немутагенны, стабильны при хранении, относительно дешевые по сравнению с вирусными системами доставки.In the human body, there are extra- and intracellular barriers that do not allow NK to independently penetrate to the place of their therapeutic action. For the introduction of NK, viral delivery systems can be used. However, such systems have a number of disadvantages, such as immunogenicity, mutagenicity, the limited size of the transferred NK, difficulties in scaling, reproduction, stability, and high cost. Alternative non-viral delivery systems of NK, which today are widely used, are cationic liposomes. Due to the electrostatic interaction, they can compact different sizes of nanocrystals, forming complexes - lipoplexes. Cationic liposomes are non-immunogenic, non-mutagenic, storage stable, relatively cheap compared to viral delivery systems.
На модели культивируемых клеток колоректального рака ранее показана принципиальная возможность индукции апоптотического эффекта при инактивации генов Livin и МСМ4. Обнаружено, что совместное ингибирование генов дает синергетический апоптотический эффект при низких дозах оксалиплатина. Полученные результаты открывают возможность разработки лекарственного средства на основе малых интерферирующих РНК к генам Livin и МСМ4 для лечения рака толстой кишки.In a model of cultured colorectal cancer cells, the fundamental possibility of inducing an apoptotic effect upon inactivation of the Livin and MCM4 genes has been previously shown. It was found that joint inhibition of genes gives a synergistic apoptotic effect at low doses of oxaliplatin. The results open up the possibility of developing a drug based on small interfering RNAs for the Livin and MCM4 genes for the treatment of colon cancer.
Предлагаемая композиция включает созданные олигонуклеотиды миРНК и катионные липосомы. При решении указанных выше проблем применения миРНК при разработке их конструкции и состава были учтены необходимость повышения устойчивости к воздействию нуклеаз и понижения иммуногенности олигонуклеотидов миРНК, что является одним их технических результатов разработки. С этой целью в состав последовательности олигонуклеотидов миРНК был введен 2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат в положении 20-го нуклеотида, который через остаток фосфорной кислоты связан с концевым 2'-дезокситимидин-3'-фосфатом в положении 21-го. Такая структура обеспечивает устойчивость олигонуклеотидов миРНК и их дуплексов к воздействию нуклеаз. Кроме того, в первичную структуру олигонуклеотидов введены модифицированные основания: 2'-ОМе-уридин-3'-фосфат и 2'-ОМе-цитидин-3'-фосфат. Введение модифицированных нуклеотидов способствует усилению устойчивости к гидролизу внутри нуклеотидных фосфорных связей, а, следовательно, и всего нуклеотидного комплекса. Для каждого из олигонуклеотидов разработана своя схема чередования фосфодиэфирных связей между рибозой (Р), дезоксирибозой (ДР) и 2'ОМе-рибозой (МеР):The proposed composition includes created miRNA oligonucleotides and cationic liposomes. In solving the above problems of the use of siRNAs in the development of their design and composition, the need to increase the resistance to the effects of nucleases and reduce the immunogenicity of siRNA oligonucleotides was taken into account, which is one of their technical development results. For this purpose, 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate was introduced into the sequence of siRNA oligonucleotides at the position of the 20th nucleotide, which, through the remainder of phosphoric acid, is bound to the terminal 2'-deoxythymidine-3'-phosphate at the 21st position. Such a structure ensures the resistance of siRNA oligonucleotides and their duplexes to the action of nucleases. In addition, modified bases were introduced into the primary structure of oligonucleotides: 2'-OMe-uridine-3'-phosphate and 2'-OMe-cytidine-3'-phosphate. The introduction of modified nucleotides enhances the resistance to hydrolysis inside nucleotide phosphorus bonds, and, consequently, the entire nucleotide complex. For each of the oligonucleotides, a different scheme of alternating phosphodiester bonds between ribose (P), deoxyribose (DR) and 2'OMeribose (MeP) has been developed:
Олигонуклеотид №1Oligonucleotide No. 1
5'-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-ДР-ДР-3'5'-R-R-R-R-MeR-R-R-R-R-MeR-R-R-R-R-R-R-R-R-R-DR-DR-3 '
Олигонуклеотид №2Oligonucleotide No. 2
5'-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-ДР-ДР-3'5'-R-R-R-R-R-R-R-R-R-MeR-R-R-R-R-R-R-MeR-R-R-DR-DR-3 '
Олигонуклеотид №3Oligonucleotide No. 3
5'-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-ДР-ДР-3'5'-R-R-R-R-R-R-R-R-R-R-MeR-R-R-R-R-R-R-MeR-R-DR-DR-3 '
Олигонуклеотид №4Oligonucleotide No. 4
5'-Р-Р-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-Р-Р-Р-Р-МеР-Р-Р-Р-Р-Р-ДР-ДР-3'5'-R-R-R-R-R-R-MeR-R-R-R-R-R-R-MeR-R-R-R-R-R-DR-DR-3 '
При модификации олигонуклеотидов учитывалось, что нуклеотидные остатки в позициях 2-6 в направляющих олигонуклеотидах №2 и №4 не могут быть изменены, так как являются затравочной областью (seed-регион), которая обеспечивает первоначальное связывание белкового комплекса с таргетной последовательностью РНК. Для олигонуклеотидов №1 и №3 позицию модифицированного нуклеотидного остатка определяли, основываясь на требовании, что модифицированные нуклеотидные остатки прямой последовательности не должны образовывать пару с модифицированными нуклеотидными остатками комплементарной последовательности. Олигонуклеотиды №1 и №3 не участвуют в распознавании таргетной РНК («пассажирская» цепь). Так как модифицированный нуклеотид меняет энергию связывания нуклеотидной пары, постулировали, что между модифицированными нуклеотидными остатками внутри олигонуклеотида должно быть не менее трех немодифицированных нуклеотидных остатков.When modifying the oligonucleotides, it was taken into account that nucleotide residues at positions 2–6 in the guiding oligonucleotides No. 2 and No. 4 cannot be changed, since they are the seed region (seed region) that provides the initial binding of the protein complex to the target RNA sequence. For oligonucleotides No. 1 and No. 3, the position of the modified nucleotide residue was determined based on the requirement that the modified nucleotide residues of the direct sequence should not pair with the modified nucleotide residues of the complementary sequence. Oligonucleotides No. 1 and No. 3 do not participate in the recognition of targeted RNA ("passenger" chain). Since the modified nucleotide changes the binding energy of the nucleotide pair, it was postulated that there should be at least three unmodified nucleotide residues between the modified nucleotide residues within the oligonucleotide.
В результате получены следующие олигонуклеотиды миРНК для ингибирования генов МСМ4 и Livin:As a result, the following siRNA oligonucleotides for inhibiting the MCM4 and Livin genes were obtained:
Олигонуклеотид №1 - МСМ4, «пассажирская» цепьOligonucleotide No. 1 - MSM4, "passenger" chain
5'-C-U-C-A-Umet-C-U-C-U-Umet-A-C-C-C-A-C-A-G-G-dTs-Dt-3'5'-C-U-C-A-Umet-C-U-C-U-Umet-A-C-C-C-A-C-A-G-G-dTs-Dt-3 '
Олигонуклеотид №2 - МСМ-4, направляющая (взаимодействующая с целевой РНК) цепьOligonucleotide No. 2 - MSM-4, directing (interacting with the target RNA) chain
5'-C-C-U-G-U-G-G-G-Umet-A-A-G-A-G- A-Umet-G-A-G-dTs-dT-3'5'-C-C-U-G-U-G-G-G-Umet-A-A-G-A-G-A-Umet-G-A-G-dTs-dT-3 '
Олигонуклеотид №3 - Livin, «пассажирская» цепьOligonucleotide No. 3 - Livin, the "passenger" chain
5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-Umet-U-G-U-C-C-A-Cmet-A-dTs-dT-3'5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-Umet-U-G-U-C-C-A-Cmet-A-dTs-dT-3 '
Олигонуклеотид №4 - Livin, направляющая (взаимодействующая с целевой РНК) цепьOligonucleotide No. 4 - Livin, directing (interacting with the target RNA) chain
5'-U-G-U-G-G-A-Cmet-A-A-A-G-U-C-Umet-C-U-U-C-C-dTs-dT-3'5'-U-G-U-G-G-A-Cmet-A-A-A-G-U-C-Umet-C-U-U-C-C-dTs-dT-3 '
где G, С, A, U – рибонуклеотиды;where G, C, A, U are ribonucleotides;
Umet - 2'-O-methyluridine-3'-phosphate (2'-О-метилуридин-3'-фосфат);Umet - 2'-O-methyluridine-3'-phosphate (2'-O-methyluridine-3'-phosphate);
Cmet - 2'-Omethylcytidine-3'-phosphate (2'-O-метилцитидин-3'-фосфат);Cmet - 2'-Omethylcytidine-3'-phosphate (2'-O-methylcytidine-3'-phosphate);
dTs - 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат); dTs - 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate);
dT - 2'-deoxythymidine-3'-phosphate (2'-дезокситимидин-3'-фосфат).dT - 2'-deoxythymidine-3'-phosphate (2'-deoxythymidine-3'-phosphate).
Разработанная комбинация модифицированных и немодифицированных нуклеотидов для каждого из олигонуклеотидов уникальна и позволяет получать миРНК и их дуплексы с измененными стереохимическими характеристиками, что помимо повышения устойчивости к действию нуклеаз снижает их сродство к толл-подобным рецепторам (англ. Toll-like receptor, TLR), обеспечивая тем самым пониженную иммуногенность лекарственного средства. В клетках млекопитающих в составе рибосомальных и транспортных РНК встречаются 2'ОМе-рибонуклеотиды и они не являются токсичными.The developed combination of modified and unmodified nucleotides for each of the oligonucleotides is unique and allows one to obtain miRNAs and their duplexes with altered stereochemical characteristics, which, in addition to increasing resistance to the action of nucleases, reduces their affinity for toll-like receptors (English Toll-like receptor, TLR), providing thereby reducing the immunogenicity of the drug. In mammalian cells, 2'OMe ribonucleotides are found in ribosomal and transport RNAs and are not toxic.
Полученные дуплексы миРНК были оценены на предмет функциональной активности с использованием коммерческого вектора Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, США) и культуры клеток карциномы толстой кишки НТ-29 (АРС-/-). Трансфекцию проводили комбинацией дуплексов Livin + MCM4 в соотношении 1:1 прямым методом по протоколу производителя. Результаты трансфекции анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии с использованием стандартного набора для определения апоптоза (Vybrant Apoptosis Assay Kit №5, Invitrogen, США).The resulting siRNA duplexes were evaluated for functional activity using the commercial Lipofectamine RNAiMAX vector (Invitrogen, USA) and HT-29 colon carcinoma cell culture (APC - / -). Transfection was performed by a combination of Livin + MCM4 duplexes in a 1: 1 ratio by direct method according to the manufacturer's protocol. Transfection results were analyzed by fluorescence microscopy using a standard apoptosis test kit (Vybrant Apoptosis
Проведенное исследование позволяет заключить, что разработанная конструкция и состав олигонуклеотидов миРНК не оказывают существенного влияния на получение конечного эффекта и могут быть применены для получения эффекта апоптоза.The study allows us to conclude that the developed design and composition of siRNA oligonucleotides do not significantly affect the final effect and can be used to obtain the apoptosis effect.
Олигонуклеотиды миРНК были синтезированы амидофосфитным триэфирным методом с использованием твердофазного ДНК синтезатора ASM-1000 («Биосет», Новосибирск) по схеме, включающей следующие этапы (шаги синтеза):The miRNA oligonucleotides were synthesized by the amidophosphite triester method using the ASM-1000 solid-phase DNA synthesizer (Bioset, Novosibirsk) according to a scheme that included the following steps (synthesis steps):
- удаление тритильной защиты;- removal of trityl protection;
- конденсация;- condensation;
- блокирование непрореагировавших 5'-гидроокислов;- blocking unreacted 5'-hydroxides;
- окисление;- oxidation;
Второй шаг синтеза:The second step of the synthesis:
- удаление тритильной защиты и промывка;- removal of trityl protection and washing;
- конденсация;- condensation;
- блокирование непрореагировавших 5'-гидроокислов;- blocking unreacted 5'-hydroxides;
- сульфирование;- sulfonation;
Третий шаг синтеза:The third step of the synthesis:
- удаление тритильной защиты и промывка;- removal of trityl protection and washing;
- конденсация;- condensation;
- блокирование непрореагировавших 5'-гидроокислов;- blocking unreacted 5'-hydroxides;
- окисление;- oxidation;
Затем последовательное наращивание олигонуклеотида: 4-21 шаг синтеза, аналогично первому шагу синтеза.Then the sequential buildup of the oligonucleotide: 4-21 synthesis step, similar to the first synthesis step.
Олигонуклеотид №1Oligonucleotide No. 1
5'-C-U-C-A-Umet-C-U-C-U-Umet-A-C-C-C-A-C-A-G-G-dTs-Dt-3'5'-C-U-C-A-Umet-C-U-C-U-Umet-A-C-C-C-A-C-A-G-G-dTs-Dt-3 '
Олигонуклеотид №2Oligonucleotide No. 2
5'-C-C-U-G-U-G-G-G-Umet-A-A-G-A-G-A-Umet-G-A-G-dTs-dT-3'5'-C-C-U-G-U-G-G-G-Umet-A-A-G-A-G-A-Umet-G-A-G-dTs-dT-3 '
Олигонуклеотид №3Oligonucleotide No. 3
5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-Umet-U-G-U-C-C-A-Cmet-A-dTs-dT-3'5'-G-G-A-A-G-A-G-A-C-U-Umet-U-G-U-C-C-A-Cmet-A-dTs-dT-3 '
Олигонуклеотид №4Oligonucleotide No. 4
5'-U-G-U-G-G-A-Cmet-A-A-A-G-U-C-Umet-C-U-U-C-C-dTs-dT-3';5'-U-G-U-G-G-A-Cmet-A-A-A-G-U-C-Umet-C-U-U-C-C-dTs-dT-3 ';
И получение целевого промежуточного продукта:And obtaining the target intermediate:
- аммонолиз;- ammonolysis;
- снятие силильной защиты;- removal of silyl protection;
- переосаждение.- reprecipitation.
В процессе синтеза олигонуклеотидов: при реализации перечисленных этапов малые интерферирующие РНК (миРНК) и комплементарные им последовательности к генам Livin и МСМ4 получали путем стандартного синтеза, амидофосфитным триэфирным методом на основе О-нуклеофильного внутримолекулярного катализа при помощи коммерческого синтезатора со стандартным циклом элонгации. Основная часть синтеза, наращивание цепи соответствующим активированным мономером, для каждого из олигонуклеотидов состояла из 21 шага. В качестве полимерного носителя использовали универсальный CPG носитель (Glen Research) с размером пор
Структурные схемы этапов синтеза приведены на фиг. 1.The structural diagrams of the synthesis steps are shown in FIG. one.
На базе синтезированных олигонуклеотидов получены дуплексы миРНК:Based on the synthesized oligonucleotides, miRNA duplexes were obtained:
Для ингибирования гена МСМ4 получен дуплексDuplex obtained for inhibiting the MCM4 gene
Для ингибирования гена Livin получен дуплексDuplex obtained for inhibiting the Livin gene
где Gp, Ср, Ар, Up – рибонуклеотиды;where Gp, Cp, Ap, Up are ribonucleotides;
Ump -2'-O-methyluridine-3'- phosphate (2'-О-метилуридин-3'-фосфат);U m p -2'-O-methyluridine-3'-phosphate (2'-O-methyluridine-3'-phosphate);
Cmp - 2'-Omethylcytidine-3'-phosphate (2'-O-метилцитидин-3'-фосфат);C m p - 2'-Omethylcytidine-3'-phosphate (2'-O-methylcytidine-3'-phosphate);
dTsp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат); dTs p - 2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate (2'-deoxythymidine-3'-phosphorothioate);
dTp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphate (2'-дезокситимидин-3'-фосфат).dTp - 2'-deoxythymidine-3'-phosphate (2'-deoxythymidine-3'-phosphate).
Получение дуплексов миРНК проводили в следующем растворе: 5Х раствор для миРНК (300 мM KCl; 30 мM Hepes рН7,5; 1 мM MgCl2).The preparation of siRNA duplexes was carried out in the following solution: 5X siRNA solution (300 mM KCl; 30 mM Hepes pH 7.5; 1 mM MgCl 2 ).
Для создания эффективных катионных липосом в их состав должен входить катионный липид, функцией которого является компактизация НК, и фосфолипиды -липиды-помощники, способствующие проникновению НК в клетку. При этом катионный липид присутствует в количестве от 25 до 67 мол. % на общее количество липидов в композиции. Спермин является природным соединением, участвует в клеточном метаболизме и присутствует во всех эукариотических клетках. Катионные липиды на основе спермина содержат четыре вторичные аминогруппы, благодаря которым происходит конденсация НК. Известно, что катионные липиды, содержащие полиамин, показывают более высокую эффективность трансфекции НК по сравнению с липидами, в состав которых входит четвертичный амин или один вторичный амин. В качестве наиболее эффективных липидов-помощников используются 1,2-ди-О-олеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), который способствует переходу из ламелярной фазы в инвертированную гексагональную и яичный фосфатидилхолин (PC), способствующий проникновению в опухоль.To create effective cationic liposomes, their composition must include a cationic lipid, the function of which is to compact NK, and phospholipids - lipid assistants that facilitate the penetration of NK into the cell. In this case, the cationic lipid is present in an amount of from 25 to 67 mol. % of the total amount of lipids in the composition. Spermine is a natural compound, is involved in cellular metabolism and is present in all eukaryotic cells. Spermine-based cationic lipids contain four secondary amino groups, due to which condensation of NK occurs. It is known that cationic lipids containing a polyamine show a higher transfection efficiency of NK compared with lipids that include a quaternary amine or a single secondary amine. As the most effective helper lipids, 1,2-di-O-oleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) is used, which facilitates the transition from the lamellar phase to the inverted hexagonal and egg phosphatidylcholine (PC), which facilitates penetration into the tumor.
Техническим результатом изобретения также является расширение арсенала средств, способных эффективно доставлять НК в клетки в присутствии сыворотки в ростовой среде. Технический результат достигается предлагаемыми композициями, которые содержат: 1) поликатионный амфифил в качестве компонента, связывающего и упаковывающего нуклеиновую кислоту; 2) нейтральные фосфолипиды (DOPE и PC) в качестве структурообразующих и промотирующих компонентов. При этом катионный липид присутствует в количестве от 25 до 67 мол. % на общее количество липидов в композиции.The technical result of the invention is also the expansion of the arsenal of agents capable of efficiently delivering NK to cells in the presence of serum in a growth medium. The technical result is achieved by the proposed compositions, which contain: 1) polycationic amphiphile as a component that binds and packs a nucleic acid; 2) neutral phospholipids (DOPE and PC) as structure-forming and promoting components. In this case, the cationic lipid is present in an amount of from 25 to 67 mol. % of the total amount of lipids in the composition.
Поликатионный липид может иметь, например, один из следующих составов:The polycationic lipid may have, for example, one of the following compositions:
-{2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate}, или DOSPA (Lipofectamine);- {2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate}, or DOSPA (Lipofectamine);
- Di-octadecyl-amido-glycyl-spermine, или DOGS, Transfectam;- Di-octadecyl-amido-glycyl-spermine, or DOGS, Transfectam;
- 3-β(N-(N',N'-dimethyl,N'-hydroxyethyl aminopropane)carbamoyl) cholesterol iodide (DMHAPC-Chol);- 3-β (N- (N ', N'-dimethyl, N'-hydroxyethyl aminopropane) carbamoyl) cholesterol iodide (DMHAPC-Chol);
- 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol, или DC-Chol;- 3β [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol, or DC-Chol;
- 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2X3).- 1,26-bis (cholest-5-en-3β-yloxycarbonylamino) -7,11,16,20-tetraazagexacosane tetrahydrochloride (2X3).
Технический результат также достигается способом получения композиции для доставки малых интерферирующих РНК, характеризующимся тем, что липидную пленку, состоящую из поликатионного амфифила и нейтрального фосфолипида DOPE, гидратируют в воде, и полученную эмульсионно-дисперсионную систему подвергают ультразвуковой обработке или экструзии.The technical result is also achieved by a method for preparing a composition for delivery of small interfering RNAs, characterized in that the lipid film consisting of polycationic amphiphilum and neutral DOPE phospholipid is hydrated in water, and the resulting emulsion-dispersion system is subjected to ultrasonic treatment or extrusion.
На основе поликатионного амфифила, предпочтительно, 2X3, нейтрального фосфолипида DOPE и нейтрального яичного фосфатидилхолина (PC) была приготовлена композиция (2X3:DOPE:PC, 50:45:5, мольное соотношение). DOPE и PC не могут самостоятельно переносить НК, так как не имеют в своей структуре катионной группировки, необходимой для связывания и компактизации нуклеиновых кислот. Для формирования композиций использовали гидратирование липидной пленки, состоящей из поликатионного амфифила, DOPE и PC, взятых в соотношении 50:45:5 (мольное соотношение), с последующей ультразвуковой обработкой или экструзией.A composition (2X3: DOPE: PC, 50: 45: 5, molar ratio) was prepared on the basis of polycationic amphiphile, preferably 2X3, neutral DOPE phospholipid and neutral egg phosphatidylcholine (PC). DOPE and PC cannot independently transfer NAs, since they do not have in their structure the cationic moiety necessary for the binding and compaction of nucleic acids. To form the compositions, hydration of the lipid film consisting of polycationic amphiphile, DOPE and PC, taken in a ratio of 50: 45: 5 (molar ratio), followed by ultrasonic treatment or extrusion, was used.
Липосомы получали различными способами. В зависимости от используемого метода получают липосомы разного размера и с различающимися характеристиками. Размер липосом важен с точки зрения их применения. В некоторых случаях, например, для инкапсуляции бактерий или крупных белков, нужны крупные липосомы, однако для фармацевтического применения предпочтительны мелкие липосомы, поскольку такие липосомы медленнее выводятся, чем крупные частицы. Кроме того, крупные липосомы могут вызывать эмболию сосудов или не достигать места своего терапевтического воздействия.Liposomes were obtained in various ways. Depending on the method used, liposomes of different sizes and with different characteristics are obtained. The size of liposomes is important in terms of their application. In some cases, for example, for the encapsulation of bacteria or large proteins, large liposomes are needed, however, small liposomes are preferred for pharmaceutical use, since such liposomes are slower to excrete than large particles. In addition, large liposomes may cause vascular embolism or may not reach their therapeutic effect.
Для получения липосом было выбрано два способа. Two methods were chosen to produce liposomes.
Первый способ основан на гидратации липидной пленки; для этого смесь липидов в колбе растворяют в органическом растворителе (хлороформ, дихлорметан или спирт) и удаляют растворитель в вакууме в токе аргона, после чего на стенке колбы образуется липидная пленка. Добавление к этой пленке воды или буфера приводит к образованию многослойных липосом. Последующая обработка таких липосом ультразвуком приводит к образованию однослойных липосом.The first method is based on hydration of a lipid film; for this, the lipid mixture in the flask is dissolved in an organic solvent (chloroform, dichloromethane or alcohol) and the solvent is removed in vacuo under argon flow, after which a lipid film forms on the wall of the flask. Adding water or buffer to this film leads to the formation of multilayer liposomes. Subsequent sonication of such liposomes leads to the formation of single-layer liposomes.
Второй способ включает стадию гидратации липидной пленки с образованием многослойных липосом, которые превращают в однослойные путем процесса продавливания (экструзии) липидной дисперсии через поликарбонатные фильтры с определенным размером пор. В нашем случае были выбраны мембраны с размером пор 100 нм.The second method includes the stage of hydration of the lipid film with the formation of multilayer liposomes, which are converted into single layers by the process of forcing (extrusion) of the lipid dispersion through polycarbonate filters with a specific pore size. In our case, membranes with a pore size of 100 nm were chosen.
В качестве жидкой фазы были выбраны стерильная вода и раствор Рингера, которые разрешены к медицинскому применению в Российской Федерации.Sterile water and Ringer's solution, which are approved for medical use in the Russian Federation, were chosen as the liquid phase.
Были получены три образца катионных липосом:Three cationic liposome samples were obtained:
Образец Л2 приготовлен в стерильной воде методом ультразвукового озвучивания.Sample L2 was prepared in sterile water by ultrasonic sonication.
Образец Л3 приготовлен в стерильной воде методом экструзии.Sample L3 was prepared in sterile water by extrusion.
Образец Л4 приготовлен в растворе Рингера методом ультразвукового озвучивания.Sample L4 was prepared in Ringer's solution by sonication.
Образцы Л2 и Л3 представляли собой бесцветные слегка опалесцирующие растворы, в то время как образец Л4 являлся раствором с высокой степенью мутности.Samples L2 and L3 were colorless slightly opalescent solutions, while sample L4 was a solution with a high degree of turbidity.
Изучение физико-химических характеристик - размера и поверхностного потенциала (ζ-потенциала) - липосом, связанных с их коллоидной стабильностью, является одним из необходимых этапов при создании липосомальных систем доставки НК.The study of the physicochemical characteristics — size and surface potential (ζ potential) —of liposomes associated with their colloidal stability is one of the necessary steps in the creation of liposome delivery systems for NK.
Для определения размера и ζ-потенциала липосом использовали метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС). Метод ДЛС используется при анализе размера частиц и их поверхностного потенциала в растворе. Распределение по размерам, полученное в ходе ДЛС-измерений, является зависимостью относительной интенсивности рассеяния света от размера частиц и известно как распределение по интенсивности. Из этого распределения после математической обработки получают распределение по количеству частиц.The method of dynamic laser light scattering (DLS) was used to determine the size and ζ potential of liposomes. The DLS method is used to analyze the size of particles and their surface potential in solution. The size distribution obtained in the course of DLS measurements is the dependence of the relative light scattering intensity on the particle size and is known as the intensity distribution. From this distribution, after mathematical processing, a distribution according to the number of particles is obtained.
Определение размеров и поверхностного потенциала полученных образцов катионных липосом проводили на анализаторах Delsa Nano С (Beckman Coulter, США) и Nano ZS (Malvern, Великобритания). Для осуществления измерений готовили 1 мл растворов образцов Л2, Л3 и Л4 в стерильной воде с конечной концентрацией по катионному липиду 0,05 мМ (0,1 мл основного раствора + 0,9 мл стерильной воды).The size and surface potential of the obtained samples of cationic liposomes were determined using Delsa Nano C (Beckman Coulter, USA) and Nano ZS (Malvern, UK) analyzers. For measurements, 1 ml of solutions of samples L2, L3 and L4 in sterile water with a final concentration of 0.05 mM cationic lipid was prepared (0.1 ml of basic solution + 0.9 ml of sterile water).
Как следует из полученных результатов, липосомы Л2, приготовленные в стерильной воде с помощью ультразвука, имели средний размер около 100 нм, индекс полидисперсности указывал на их умеренное распределение по размерам. Липосомы Л3, полученные экструзией через фильтр с диаметром пор 100 нм, имели размер около 120 нм, что соответствует размеру пор, а небольшое значение индекса полидисперсности свидетельствовало об образовании фракции частиц с узким распределением по размерам. Для липосом Л4, приготовленных в растворе Рингера, характерно наличие двух фракций частиц и широкое распределение по размерам. Также следует отметить, что липосомы были стабильны в течение 2 недель, поскольку их размеры не изменялись.As follows from the results obtained, L2 liposomes prepared in sterile water using ultrasound had an average size of about 100 nm, the polydispersity index indicated their moderate size distribution. L3 liposomes obtained by extrusion through a filter with a pore diameter of 100 nm had a size of about 120 nm, which corresponds to the pore size, and a small polydispersity index indicated the formation of a fraction of particles with a narrow size distribution. L4 liposomes prepared in Ringer's solution are characterized by the presence of two particle fractions and a wide size distribution. It should also be noted that liposomes were stable for 2 weeks, since their size did not change.
Все липосомы являются положительно заряженными, о чем свидетельствуют положительные значения ζ-потенциалов. Следует отметить, что разница в значениях ζ-потенциалов связана как с размером липосом, так и с ионной силой растворов, в которых они были приготовлены. Так, заряд липосом, приготовленных в растворе Рингера (многокомпонентный физиологический раствор с теоретической осмолярностью 309 мосмоль), был больше заряда липосом Л2 и Л3, приготовленных в стерильной воде. Самыми неудачными липосомами следует признать образец Л4, который имеет тенденцию к агрегации и характеризуется очень широким распределением частиц по размерам. Полученные образцы были проверены на наличие бактериальной обсемененности. Посторонней микрофлоры не обнаружено.All liposomes are positively charged, as evidenced by the positive values of ζ potentials. It should be noted that the difference in the values of ζ potentials is associated both with the size of the liposomes and with the ionic strength of the solutions in which they were prepared. So, the charge of liposomes prepared in Ringer's solution (a multicomponent physiological solution with a theoretical osmolarity of 309 mosmol) was greater than the charge of liposomes L2 and L3 prepared in sterile water. The most unsuccessful liposomes should be recognized as sample L4, which tends to aggregate and is characterized by a very wide particle size distribution. The resulting samples were tested for bacterial contamination. Extraneous microflora was not detected.
В то же время в экспериментах на мышиной модели была выявлена токсичность липосом. Было предположено и подтверждено с помощью масс-спектрометрии наличие в липосомах побочных продуктов синтеза. Для их устранения был проведен диализ липосом с использованием диализных мешков с размером пор 3.5 кДа в течение 3 дней с трехкратной заменой воды в течение суток. Такая процедура позволила существенно снизить токсичность липосом. Двукратное с интервалом два часа внутривенное введение 0,5 мл 0,814 мМ суспензии липосом не приводило к гибели подопытных мышей.At the same time, experiments on a mouse model revealed the toxicity of liposomes. Mass spectrometry was used to suggest and confirm the presence of synthesis by-products in liposomes. To eliminate them, liposome dialysis was performed using dialysis bags with a pore size of 3.5 kDa for 3 days with a three-fold replacement of water during the day. This procedure has significantly reduced the toxicity of liposomes. Intravenous administration of 0.5 ml of 0.814 mM liposome suspension twice with an interval of two hours did not lead to the death of experimental mice.
Наилучший результат по обеспечению минимальной токсичности был достигнут при получении липосом в стерильной воде путем озвучивания и фильтрования через фильтр с порами наноразмеров и с очисткой путем диализа.The best result in ensuring minimal toxicity was achieved when liposomes were obtained in sterile water by sounding and filtering through a filter with nanoscale pores and purifying by dialysis.
Разработанная композиция включает несколько действующих веществ: олигонуклеотиды миРНК к гену МСМ4 и миРНК к гену Livin. На заключительной стадии получения базового препарата для ингибирования роста и стимуляции апоптоза клеток колоректального рака липосомальный вектор объединяют с дуплексами миРНК. Для определения наилучших соотношений миРНК-липосомальный вектор при их комплексообразовании по эффективности переноса малых РНК в клетку были проведены специальные исследования с использованием стандартного флуоресцентного дуплекса (BLOCK-iT Fluorescent, Invitrogen, США, препарат сравнения). Для этого 10 пикомоль миРНК смешивали с липосомальными векторами в разных соотношениях с учетом заряда. Трансфекцию проводили на клетках карциномы толстой кишки НТ-29. Эффективность переноса оценивали при помощи проточной цитометрии через 24 ч после трансфекции. Результаты анализа представлены на фиг. 2, где представлена эффективность трансфекции в зависимости от типа вектора и степени его загрузки. По оси x - соотношение дуплекс:липосома с учетом заряда. По оси y - процент клеток с привнесенным флуоресцентным сигналом.The developed composition includes several active substances: siRNA oligonucleotides for the MCM4 gene and siRNA for the Livin gene. At the final stage of obtaining the basic preparation for inhibiting the growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells, the liposome vector is combined with siRNA duplexes. To determine the best miRNA-liposomal vector ratios during their complexation by the efficiency of transferring small RNAs into the cell, special studies were carried out using a standard fluorescent duplex (BLOCK-iT Fluorescent, Invitrogen, USA, comparison drug). For this, 10 picomoles of miRNAs were mixed with liposomal vectors in different ratios, taking into account the charge. Transfection was performed on NT-29 colon carcinoma cells. Transfer efficiency was evaluated by flow cytometry 24 hours after transfection. The analysis results are presented in FIG. 2, which shows the efficiency of transfection depending on the type of vector and the degree of its loading. The x-axis represents the duplex: liposome ratio, taking into account the charge. The y axis is the percentage of cells with an introduced fluorescent signal.
Было показано, что липосомальные векторы, полученные разными методами, но идентичные по химическому составу, отличаются друг от друга по эффективности переноса миРНК в клетку. Наихудший результат зафиксирован для липосом L3, полученных в среде с раствором Рингера. Наилучшая эффективность переноса была показана для вектора L2. Максимальная эффективность наблюдалась при соотношениях дуплекс:липосома от 1:2 до 1:12.It was shown that liposomal vectors obtained by different methods, but identical in chemical composition, differ from each other in the efficiency of siRNA transfer into the cell. The worst result was recorded for L3 liposomes obtained in a medium with Ringer's solution. The best transfer efficiency was shown for the vector L2. Maximum efficiency was observed at duplex: liposome ratios from 1: 2 to 1:12.
Полученная композиция была оценена на предмет функциональной активности с использованием культуры клеток карциномы толстой кишки НТ-29. Трансфекцию проводили комбинацией дуплексов Livin + MCM4 в соотношении 1:1. Результаты трансфекции анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии с использованием стандартного набора для определения апоптоза (Vybrant Apoptosis Assay Kit №5, Invitrogen, США).The resulting composition was evaluated for functional activity using NT-29 colon carcinoma cell culture. Transfection was performed with a combination of Livin + MCM4 duplexes in a 1: 1 ratio. Transfection results were analyzed by fluorescence microscopy using a standard apoptosis test kit (Vybrant Apoptosis
В серии специальных экспериментов in vitro определена доза препарата, обеспечивающая максимальный биологический эффект. В частности показано, что превышение дозы в три раза (150 нM по дуплексу) не приводит к усилению биологического эффекта. Зависимость биологического эффекта от дозы препарата (композиции) представлена на фиг. 3.In a series of special in vitro experiments, the dose of the drug is determined that provides the maximum biological effect. In particular, it was shown that a three-fold excess (150 nM in duplex) does not increase the biological effect. The dependence of the biological effect on the dose of the drug (composition) is shown in FIG. 3.
Оценку цитотоксичности субстанции провели с использованием МТТ-теста на эпителиальных клетках человека. Показано, что определенная в условиях in vitro доза дуплексов миРНК (50 нM), обеспечивающая максимальный биологический эффект, не токсична.The cytotoxicity of the substance was evaluated using the MTT test on human epithelial cells. It was shown that the dose of siRNA duplexes determined in vitro (50 nM), which provides the maximum biological effect, is non-toxic.
Способность композиции ингибировать рост опухолевых клеток колоректального рака изучали на мышах-самцах Balb/c nude с подкожными ксенографтами РТК-8. Были опробованы три дозы: 1,25; 2,5 и 5,0 мг/кг, которые вводили внутривенно в режиме трехкратного курса с интервалом 48 ч, что соответствует суммарным дозам: 3,75; 7,5 и 15 мг/кг. Режим введения композиции и диапазон доз выбраны на основании экспериментов in vitro. Дозы рассчитывали индивидуально на массу тела каждой мыши. Введение композиции начинали при появлении пальпируемых опухолей на 4-е сутки.The ability of the composition to inhibit the growth of tumor cells of colorectal cancer was studied on male Balb / c nude mice with subcutaneous PTK-8 xenografts. Three doses were tested: 1.25; 2.5 and 5.0 mg / kg, which were administered intravenously in the regimen of three courses with an interval of 48 hours, which corresponds to the total doses: 3.75; 7.5 and 15 mg / kg. The mode of administration of the composition and the dose range are selected based on in vitro experiments. Doses were calculated individually for the body weight of each mouse. The introduction of the composition began with the appearance of palpable tumors on the 4th day.
Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали при помощи Т-теста. Соотношение объемов опухолевых узлов в последующий срок наблюдения к предыдущему [VII/VI] (на 6-е и 1-е сутки) и [VIII/VII] (на 12-е и 6-е сутки) использовали для оценки скорости роста опухоли внутри каждой группы.The significance of differences between the compared groups was evaluated using the T-test. The ratio of the volumes of tumor nodes in the subsequent follow-up to the previous [VII / VI] (on the 6th and 1st day) and [VIII / VII] (on the 12th and 6th day) was used to assess the tumor growth rate inside each group.
В группе MCM4/LIVIN при минимальной суммарной дозе 3,75 мг/кг достоверное (р<0,05) ингибирование роста РТК-8 получено на 12-е сутки после окончания введения (21-е сутки роста опухоли) Т/С=40%; при дозе 2,5 мг/кг - на 6-е и 12-е сутки (15-е и 21-е сутки роста опухоли), Т/С=42 и 37% соответственно. Максимальная суммарная доза 15,0 мг/кг вызывала достоверное (р<0,05) ингибирование роста опухоли на все сроки после окончания введения (9-21-е сутки роста опухоли), Т/С=36, 32 и 31% соответственно. На всех сроках прослеживалось возрастание эффекта во времени и прямая дозовая зависимость. Лучшей по всем показателям эффективности была разовая доза 5 мг/кг в режиме трехкратного введения с интервалом 48 ч (суммарно 15 мг/кг).In the MCM4 / LIVIN group, with a minimum total dose of 3.75 mg / kg, significant (p <0.05) inhibition of PTK-8 growth was obtained on the 12th day after the end of administration (21st day of tumor growth) T / C = 40 %; at a dose of 2.5 mg / kg - on the 6th and 12th day (15th and 21st day of tumor growth), T / C = 42 and 37%, respectively. The maximum total dose of 15.0 mg / kg caused significant (p <0.05) inhibition of tumor growth for all periods after the end of administration (9-21 days of tumor growth), T / C = 36, 32 and 31%, respectively. At all periods, an increase in effect over time and a direct dose dependence were observed. The best in all performance indicators was a single dose of 5 mg / kg in a regimen of three doses with an interval of 48 hours (a total of 15 mg / kg).
Переносимость композиции в изученном диапазоне доз при трехкратном через 48 ч введении была удовлетворительной, без побочных эффектов. Все мыши нормально принимали корм и питьевую воду, шерсть гладкая, признаков агрессивности или адинамии, а также диареи не выявлено. При внесении руки в клетку поведение мышей обычное, изменения двигательной активности не наблюдали. Уменьшения массы тела под действием лечения не было. У умерщвленных после окончания наблюдения мышей при аутопсии не выявлено каких-либо патологических изменений внутренних органов. Кроме этого, были проведены дополнительные исследования, в частности исследовано влияние композиции на массу некоторых внутренних органов. Различий между группами не было обнаружено.Tolerance of the composition in the studied dose range for three times after 48 hours of administration was satisfactory, without side effects. All mice normally took food and drinking water, the coat was smooth, and there were no signs of aggressiveness or adynamia, as well as diarrhea. When the hands were introduced into the cell, the behavior of mice was normal; no changes in motor activity were observed. There was no decrease in body weight under the influence of treatment. Autopsy did not reveal any pathological changes in the internal organs of the mice that were euthanized after the end of observation. In addition, additional studies were carried out, in particular, the effect of the composition on the mass of some internal organs was investigated. No differences between the groups were found.
Для подтверждения способности введенных модификаций нуклеотидов ингибировать иммуногенность олигонуклеотидов миРНК были проведены соответствующие исследования. Под иммунотоксическим действием понимают модифицирующее влияние изучаемого вещества на иммуногенез, включая иммуносуппрессию и гиперстимуляцию иммунитета, способное привести к снижению резистентности организма к инфекции, повышению риска онкологических заболеваний, развитию аутоиммунной патологии и аллергизации организма. Существующий подход к изучению иммунотоксического действия включает в себя исследование действия изучаемого вещества при однократном и курсовом введении. Однократное введение фармакологического средства через 1 ч после введения антигена позволяет выявить прямое действие на иммунные реакции и клетки иммунной системы. Курсовое введение позволяет оценить и непрямое иммунотоксическое действие, связанное с нарушением органов и систем организма, сопряженных с иммунной системой.To confirm the ability of the introduced nucleotide modifications to inhibit the immunogenicity of siRNA oligonucleotides, relevant studies were conducted. Under the immunotoxic effect is understood the modifying effect of the studied substance on immunogenesis, including immunosuppression and hyperstimulation of the immune system, which can lead to a decrease in the body's resistance to infection, an increase in the risk of cancer, the development of autoimmune pathology and allergization of the body. The existing approach to studying the immunotoxic effect includes the study of the action of the studied substance with a single and course administration. A single administration of a
Была исследована способность композиции влиять на иммуногенез, включая иммуносуппрессию и гиперстимуляцию иммунитета, с использованием теста по определению числа антителообразующих клеток (АОК). С помощью теста АОК иммунотоксическое действие исследуемого препарата выявлено не было.The ability of a composition to influence immunogenesis, including immunosuppression and hyperstimulation of immunity, was tested using a test to determine the number of antibody-forming cells (AOKs). Using the AOK test, the immunotoxic effect of the study drug was not detected.
При изучении иммунотоксичности наиболее информативной считается оценка гуморального иммунного ответа при иммунизации животных Т-зависимым антигеном (в частности, эритроцитами барана). Процесс антителообразования в ответ на такой антиген включает в себя главные этапы формирования иммунного ответа: фагоцитоз, презентацию антигена, распознавание и активацию Т-хелперов 2-го типа, активацию, пролиферацию В-клеток и созревание антителопродуцирующих клеток, а также синтез антител. Таким образом, появляется возможность изучить интегральный процесс формирования иммунного ответа.When studying immunotoxicity, the most informative is the assessment of the humoral immune response during immunization of animals with a T-dependent antigen (in particular, sheep erythrocytes). The process of antibody formation in response to such an antigen includes the main stages of the formation of the immune response: phagocytosis, presentation of the antigen, recognition and activation of type 2 T-helpers, activation, proliferation of B cells and maturation of antibody-producing cells, as well as antibody synthesis. Thus, it becomes possible to study the integral process of the formation of the immune response.
В данном исследовании гуморальный иммунный ответ оценивали методом определения числа антителообразующих клеток в селезенке иммунных животных.In this study, the humoral immune response was evaluated by determining the number of antibody-forming cells in the spleen of immune animals.
На 5-е сутки после иммунизации мышей и введения им препарата животных умерщвляли путем цервикальной дислокации и в камере Горяева подсчитывали общее количество лейкоцитов в селезенке.On the 5th day after the mice were immunized and the drug was administered to them, the animals were euthanized by cervical dislocation and the total number of leukocytes in the spleen was counted in the Goryaev’s chamber.
Достоверных различий в абсолютном количестве спленоцитов животных всех групп выявлено не было. При подсчете количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунных животных также не обнаружено отличий между контролем и экспериментальной группой и группой контроль-плацебо (пустые липосомы).No significant differences in the absolute number of splenocytes of animals of all groups were detected. When counting the number of antibody-forming cells (AOKs) in the spleen of immune animals, there were also no differences between the control and the experimental group and the control placebo group (empty liposomes).
Таким образом, создан препарат с меньшими побочными эффектами, но способный обеспечить такой же или больший терапевтический эффект.Thus, a drug was created with fewer side effects, but capable of providing the same or greater therapeutic effect.
Claims (31)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016145467A RU2644675C1 (en) | 2016-11-21 | 2016-11-21 | Composition for inhibiting growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016145467A RU2644675C1 (en) | 2016-11-21 | 2016-11-21 | Composition for inhibiting growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2644675C1 true RU2644675C1 (en) | 2018-02-13 |
Family
ID=61227061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016145467A RU2644675C1 (en) | 2016-11-21 | 2016-11-21 | Composition for inhibiting growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2644675C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2832798C1 (en) * | 2023-12-22 | 2025-01-09 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" (ФГБНУ "МГНЦ") | SIRNA-BASED COMPOSITION FOR INHIBITING Gal-9 (LGALS9), PREPARATION BASED THEREON AND METHOD OF USING IT AS TARGETED IMMUNOSTIMULANT IN ANTI-PD-L1 THERAPY |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130136786A1 (en) * | 2011-02-10 | 2013-05-30 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Long non-coding rna spry4-it1 as a diagnostic and therapeutic agent |
| RU2551238C2 (en) * | 2013-08-02 | 2015-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук | Method of inducing apoptosis of malignant tumour cells of colorectal cancer and means for its realisation |
-
2016
- 2016-11-21 RU RU2016145467A patent/RU2644675C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130136786A1 (en) * | 2011-02-10 | 2013-05-30 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Long non-coding rna spry4-it1 as a diagnostic and therapeutic agent |
| RU2551238C2 (en) * | 2013-08-02 | 2015-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук | Method of inducing apoptosis of malignant tumour cells of colorectal cancer and means for its realisation |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| WANG H. et al. Silencing livin gene by siRNA leads to apoptosis induction, cell cycle arrest, and proliferation inhibition in malignant melanoma LiBr cells, Acta Pharmacol Sin., 2007, 28(12), p. 1968-1974. * |
| WANG H. et al. Silencing livin gene by siRNA leads to apoptosis induction, cell cycle arrest, and proliferation inhibition in malignant melanoma LiBr cells, Acta Pharmacol Sin., 2007, 28(12), p. 1968-1974. КОРОТАЕВА А.А. и др. Ингибирование потенциальных генов-мишеней с помощью интерферирующих РНК в клетках колоректального рака, Интеграл, 2012, 5, 26-28. * |
| КОРОТАЕВА А.А. и др. Ингибирование потенциальных генов-мишеней с помощью интерферирующих РНК в клетках колоректального рака, Интеграл, 2012, 5, 26-28. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2832798C1 (en) * | 2023-12-22 | 2025-01-09 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" (ФГБНУ "МГНЦ") | SIRNA-BASED COMPOSITION FOR INHIBITING Gal-9 (LGALS9), PREPARATION BASED THEREON AND METHOD OF USING IT AS TARGETED IMMUNOSTIMULANT IN ANTI-PD-L1 THERAPY |
| RU2849623C1 (en) * | 2024-12-09 | 2025-10-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" | Antitumour liposomal preparation for targeted delivery of antitumour glycerolipid to target cancer cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2011353233B2 (en) | Carrier for negatively charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof | |
| Raouane et al. | Synthesis, characterization, and in vivo delivery of siRNA-squalene nanoparticles targeting fusion oncogene in papillary thyroid carcinoma | |
| WO2022173667A1 (en) | Polyoxazoline-lipid conjugates and lipid nanoparticles and pharmaceutical compositions including same | |
| Wang et al. | Targeting oncogenic KRAS with molecular brush-conjugated antisense oligonucleotides | |
| WO2013158141A1 (en) | Poly(acrylate) polymers for in vivo nucleic acid delivery | |
| CN104159615A (en) | Lipid nanoparticles containing combinations of cationic lipids | |
| JP6272226B2 (en) | KRAS gene expression-suppressing RNAi pharmaceutical composition | |
| JP2014177477A (en) | Composition for suppressing expression of target gene | |
| Safaei et al. | Enzyme-sensitive nanoparticles, smart TAT and cetuximab conjugated immunoliposomes to overcome multidrug resistance in breast cancer cells | |
| US20250064940A1 (en) | Degradable lipid compound for active molecule delivery and nanocomplex thereof | |
| CN116790594A (en) | Interference RNA for inhibiting B7-H3 gene expression and application thereof | |
| US20250135013A1 (en) | Targeting Oncogenic KRAS with Molecular Brush-Conjugated Antisense Oligonucleotide | |
| US20240165263A1 (en) | Targeting multiple t cell types using spherical nucleic acid vaccine architecture | |
| RU2644675C1 (en) | Composition for inhibiting growth and stimulation of apoptosis of colorectal cancer cells | |
| KR20220034014A (en) | Complex | |
| US20250304613A1 (en) | Aminooxy click chemistry (aocc): a versatile conjugation approach | |
| TWI317286B (en) | Targeting delivery system | |
| WO2015160271A1 (en) | Lipid composition used for construction of liposomal genetic drug carrier targeted with antibodies, and use thereof | |
| Abdelaal | Enhancing miRNA Therapeutics Using Ligand Conjugated and Chemically Modified Tumor Suppressive miRNAs | |
| WO2018225873A1 (en) | Nucleic-acid-containing nanoparticles | |
| WO2025031498A1 (en) | Toll-like receptor agonists and use thereof | |
| KR20240159310A (en) | Lipid nanoparticle compositions using novel ionizable lipids | |
| HK40120777A (en) | Degradable liposome for active molecule delivery and nanocomposite thereof | |
| KR20160124279A (en) | 2-aminoethyl methacrylate-grafted chitosan copolymer for gene deslivery using radiation technology and method for preparing the same | |
| CN117157104A (en) | Targeting multiple T cell types using spherical nucleic acid vaccine constructs |