RU2644240C2 - Композиции, содержащие секреторноподобные иммуноглобулины - Google Patents
Композиции, содержащие секреторноподобные иммуноглобулины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644240C2 RU2644240C2 RU2014140744A RU2014140744A RU2644240C2 RU 2644240 C2 RU2644240 C2 RU 2644240C2 RU 2014140744 A RU2014140744 A RU 2014140744A RU 2014140744 A RU2014140744 A RU 2014140744A RU 2644240 C2 RU2644240 C2 RU 2644240C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- iga
- chain
- secretory
- composition
- igm
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 title description 5
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 102400001107 Secretory component Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 18
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 13
- 101150095279 PIGR gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 108010046644 Polymeric Immunoglobulin Receptors Proteins 0.000 description 19
- 102100035187 Polymeric immunoglobulin receptor Human genes 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 12
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 12
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 12
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 12
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 208000037384 Clostridium Infections Diseases 0.000 description 5
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 5
- 206010054236 Clostridium difficile infection Diseases 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 201000010927 Mucositis Diseases 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 4
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 4
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 4
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 208000004429 Bacillary Dysentery Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 206010040550 Shigella infections Diseases 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 3
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 2
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N chembl3301825 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)C(O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 description 1
- 208000007924 IgA Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 206010051925 Intestinal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039915 Selective IgA immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- UFUVLHLTWXBHGZ-MGZQPHGTSA-N [(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(1s,2s)-2-chloro-1-[[(2s,4r)-1-methyl-4-propylpyrrolidine-2-carbonyl]amino]propyl]-4,5-dihydroxy-2-methylsulfanyloxan-3-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](SC)O1 UFUVLHLTWXBHGZ-MGZQPHGTSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 231100000569 acute exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001262 anti-secretory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002291 clindamycin phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000010227 enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000052624 human CXCL8 Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 201000007156 immunoglobulin alpha deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940127249 oral antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940126409 proton pump inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000000612 proton pump inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- -1 respectively Proteins 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 208000029138 selective IgA deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018889 transepithelial transport Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения in vitro композиции, содержащей секреторноподобный иммуноглобулин, включающий стадии получения белковой композиции, выделенной из крови, содержащей иммуноглобулин, имеющий в составе J-цепь, в неочищенном виде, и смешивания композиции стадии (а) с секреторным компонентом. Представлена композиция для применения в медицине, содержащая секреторноподобный IgA и/или секреторноподобный IgM или их сочетание, полученная описанным способом. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 пр.
Description
Изобретение относится к способам получения композиций, содержащих секреторноподобный иммуноглобулин, в частности секреторноподобный IgA и/или секреторноподобный IgM, и композициям, получаемым этими способами.
IgA является вторым наиболее широко распространенным классом Ig после IgG в плазме человека, где он находится в концентрации 0,88-4,10 г/л. Существуют два подкласса IgA, IgA1 и IgA2 (фиг. 1) (Zuercher AW et al. Plasma derived immunoglobulins. Principles of Immunopharmacology. 3rd ed. Birkhauser, 2011: p. 271-301), которые отличаются своими дисульфидными связями, соединяющими тяжелые и легкие цепи, а также своим антигенным разнообразием из-за значимых отличий в шарнирной области молекулы. Гликозилированный паттерн двух подклассов является различным: тяжелая цепь обоих подклассов является N-гликозилированной; в отличие от этого O-гликозилирование обнаруживают в IgA1, но не в IgA2, из-за укороченной шарнирной области IgA2.
IgA человека обнаруживают в двух основных формах: или циркулирующим в крови/плазме, или секретированным на поверхностях слизистых оболочек. В плазме IgA преимущественно присутствует в качестве мономеров (80-90%) и его производят плазматические клетки костного мозга; главным подклассом в плазме является IgA1.
Термин полимерный IgA (pIgA) описывает димерный, иногда тетрамерный IgA, ковалентно связанный в своих "концевых частях" посредством соединяющей цепи (J) (фиг. 1).
Молекулы IgM составляют 10% общего содержания Ig в сыворотке. Они ограничены преимущественно внутрисосудистой совокупностью и являются частью первичного, антиген-специфичного, гуморального иммунного ответа; филогенетически и онтогенетически они являются самыми ранними молекулами антител (Ab). IgM существует преимущественно в качестве пентамера, объединенного J-цепью и организованного в планарную структуру; иногда IgM можно также обнаружить в гексамерной форме, в которой отсутствует J-цепь (Zuercher AW et al. Plasma derived immunoglobulins. Principles of Immunopharmacology. 3rd ed. Birkhauser, 2011: p. 271-301).
Поверхности слизистых оболочек пищеварительных, дыхательных и мочеполовых путей, а также протоки экзокринных желез выстланы слоями эпителиальных клеток, которые образуют прочный барьер, отделяющий внутренние отделы тела от внешней среды. У людей эти обширные поверхности покрывают 400 м2, площадь, которая постоянно подвергается экзогенным патогенам (Corthesy, B. (2010) Future Microbiol. 5:817-829). Комбинация внутренних и индуцибельных клеточных и молекулярных механизмов обеспечивает защиту против колонизации и входа/инвазии микробов. У здоровых индивидуумов секреторный IgA (SIgA) является наиболее распространенным антителом (Ab), выполняющим функцию иммунной эксклюзии на люминальной стороне слизистых оболочек (Macpherson, A.J. et al. (2008) Mucosal Immunol. 1:11-22), тогда как секреторные IgM Аb принимают эту функцию на себя у пациентов с недостаточностью IgA. SIgA синтезируется плазматическими клетками собственной пластинки слизистой оболочки кишечника, верхних дыхательных путей или мочеполовых путей. SIgA состоит из димера pIgA и высокогликозилированного секреторного компонента (SC) массой приблизительно 75 кДа (фиг. 1); сходным образом пентамерный IgM, содержащий J цепь, связанный с SC, составляет SIgM. SC представляет внеклеточную часть полимерного рецептора Ig (pIgR). pIgR необходим для трансэпителиального транспорта pIgA или пентамерного IgM от места продуцирования к поверхности слизистой оболочки, где комплекс pIgR-pIgA/pIgR-IgM превращается в SIgA/SIgM посредством ферментативного расщепления (Zuercher AW et al. Plasma derived immunoglobulins. Principles of Immunopharmacology. 3rd ed. Birkhauser, 2011: p. 1-31). Связь с SC защищает IgA или IgM от протеолитического распада. SIgA является преобладающим Ig в серозно-слизистых секретах, таких как слюна, трахео-бронхеальные секреты, молозиво, молоко, слезная жидкость, кишечные секреты и мочеполовые секреты. Это самый значимый Ig, продуцируемый в слизистых оболочках (и таким образом в организме человека); приблизительно 3-5 г SIgA секретируется ежедневно в просвет кишечника. Таким образом SIgA является существенным для иммунной эксклюзии и для поддержания целостности эпителия. SIgM присутствует на более низких уровнях, но выполняет те же функции иммунной эксклюзии, что и SIgA.
Для некоторых патогенов, таких как полиовирус, сальмонелла, или грипп, защиту против инфекции слизистой оболочки можно индуцировать посредством активной иммунизации слизистой оболочки разрешенными к применению вакцинами. Однако для большинства патогенов слизистых оболочек не доступны никакие активные вакцины для слизистых оболочек. Альтернативно, защитные уровни Аb могли бы быть доставлены прямо к поверхностям слизистых оболочек посредством пассивной иммунизации. В природе это происходит физиологически у многих видов млекопитающих посредством переноса материнских антител к их потомству через молоко (Brandtzaeg, P. (2003) Vaccine 21:3382-3388). В исследованиях на человеке и животных посредством пассивной иммунизации слизистой оболочки было продемонстрировано, что молекулы антител pIgA и SIgA, введенные посредством пероральной, интраназальной, внутриматочной или легочной инстилляции, могут предотвратить, ослабить или устранить бактериальные и вирусные инфекции (Corthesy, B. (2003) Curr. Pharm. Biotechnol. 4:51-67). Однако секреторную форму IgA, в естественных условиях обнаруживаемую на поверхностях слизистых оболочек, использовали редко, и крупномасштабное получение SIgA на сегодняшний день невозможно. Конструирование SIgA с применением биотехнологических способов является сложной проблемой, но такие молекулы могли бы иметь важные клинические применения (Corthesy, B. (2002) Trends Biotechnol. 20:65-71). То же самое относится к IgM, содержащему секреторный компонент.
Сущность изобретения
Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что возможно комбинировать иммуноглобулин, содержащий J-цепь, и полученный из плазмы, в частности, IgA и/или IgM, с секреторным компонентом без необходимости в первую очередь очищать иммуноглобулин, содержащий J-цепь. Это изобретение открывает путь к широкомасштабному получению секреторноподобного IgA и/или IgM, которые можно использовать в медицине, например, для предотвращения и лечения инфекций на поверхности слизистых оболочек у субъектов, в частности у субъектов-людей.
Одним из аспектов изобретения является способ получения композиции, содержащей секреторноподобный иммуноглобулин, в частности IgA и/или IgM, in vitro, включающий стадии
(a) получения выделенной из крови белковой композиции, содержащей иммуноглобулин, имеющий в составе J-цепь, в частности IgA и/или IgM, в неочищенном виде; и
(b) смешивания композиции стадии (a) с секреторным компонентом.
Предпочтительно, секреторноподобный иммуноглобулин является секреторноподобным IgA. Предпочтительно, композиция на этапе (a) содержит по меньшей мере 5% IgA, содержащего J-цепь, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере 30%, наиболее предпочтительно она содержит по меньшей мере 50% IgA, содержащего J-цепь. Предпочтительно, композицию на этапе (a) получают из крови человека, например плазмы человека или ее фракций, обогащенных IgA или даже IgA, содержащим J-цепь, но никакой очистки IgA, содержащего J-цепь, не требуется.
Предпочтительно, секреторноподобный иммуноглобулин является секреторноподобным IgM. Предпочтительно, композиция на этапе (a) содержит по меньшей мере 5% IgM, содержащего J-цепь, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере 30%, наиболее предпочтительно она содержит по меньшей мере 50% IgM, содержащего J-цепь. Предпочтительно, композицию на этапе (a) получают из крови человека, например из плазмы человека или ее фракций, обогащенных IgM, или даже IgM, содержащим J-цепь, но никакой очистки IgM, содержащего J-цепь, не требуется.
Секреторный компонент, применяемый на этапе (b), является предпочтительно рекомбинантным секреторным компонентом, более предпочтительно рекомбинантным секреторным компонентом человека, предпочтительно полученным посредством клеточной линии млекопитающих. Однако секреторный компонент из природного источника также можно использовать, такой как секреторный компонент, выделенный из молока, слюны, слизи или сходных источников.
Молярное отношение между секреторным компонентом и J-цепью внутри димеров/полимеров IgA или пентамеров IgM в композиции на этапе (a) находится в диапазоне между 1:10 и 10:1, предпочтительно между 1:5 и 5:1, более предпочтительно между 1:2 и 2:1.
В другом аспекте изобретения молярное отношение между секреторным компонентом и J-цепью внутри композиции на этапе a) находится в диапазоне между 1:10 и 10:1, предпочтительно между 1:5 и 5:1, более предпочтительно между 1:2 и 2:1.
Другом аспектом изобретения является композиция, содержащая секреторноподобный IgA и/или секреторноподобный IgM или их сочетания, получаемые посредством способа по изобретению. Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Дополнительным аспектом изобретения является композиция, описанная выше для медицинского использования.
Подробное описание изобретения
Как уже упоминалось выше, авторы изобретения к удивлению обнаружили, что является возможным сочетать полученные из плазмы иммуноглобулины, содержащие J-цепь, в частности IgA, содержащий J-цепь, и/или IgM, содержащий J-цепь, с секреторным компонентом без необходимости сначала очищать иммуноглобулин, содержащий J-цепь. Это изобретение открывает путь к широкомасштабному получению секреторноподобного IgA и/или секреторноподобного IgM, которые можно использовать в медицине, например, для предотвращения и лечения инфекций на поверхностях слизистых оболочек у субъекта, в частности у субъектов-людей.
Одним из аспектов изобретения является способ получения композиции, содержащей секреторноподобный иммуноглобулин, в частности секреторноподобный IgA или секреторноподобный IgM, in vitro, включающий стадии
(a) получения из крови белковой композиции, содержащей IgA, имеющий в составе J-цепь, или IgM, имеющий в составе J-цепь, в неочищенном виде,
(b) смешивания или сочетание композиции стадии (a) с секреторным компонентом.
Предпочтительно, композиция на этапе (a) содержит по меньшей мере 5% (масс./масс.) IgA, содержащего J-цепь, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно она содержит по меньшей мере 70% IgA, содержащего J-цепь. Предпочтительно, композиция на этапе (a) получена из крови человека, например из плазмы человека или ее фракций, обогащенных IgA, или даже IgA, содержащего J-цепь, но никаких специфических этапов очистки димеров или полимеров IgA, содержащего J-цепь, не требуется. Таким образом, IgA, содержащий J-цепь, также находится в композиции, содержащей другие белки, такие как мономерный IgA, IgM или IgG. Например, композиция может содержать более 10% мономерного IgA, и/или более чем 10% IgG, и/или более чем 10% IgM. В то время как обогащение димерным IgA, содержащим J-цепь, может происходить как часть обработки фракций плазмы человека, для очистки белков плазмы, таких как IgG, альбумин, альфа-1 антитрипсин и факторы свертывания, никакой стадии очистки, специфически спланированной для отделения димерного IgA, содержащего J-цепь, или полимеров из других белков, таких как аффинная хроматография или эксклюзия на основе размера и отбор фракции с релевантной молекулярной массой, для получения композиции на этапе (a), не требуется.
В другом предпочтительном аспекте по изобретению, композиция на этапе (a) содержит по меньшей мере 5% (масс./масс.) IgM, содержащего J-цепь, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно она содержит по меньшей мере 70% IgM, содержащего J-цепь. Предпочтительно, композиция на этапе (a) получена из крови человека, например плазмы человека или ее фракций, обогащенных IgM или даже IgM, содержащим J-цепь, но никаких специфических этапов очистки IgM, содержащего J-цепь, не требуется. Таким образом, IgM, содержащий J-цепь, будет находиться в композиции, также содержащей другие белки, такие как IgA или IgG. Например, композиция может содержать более чем 10% IgA, и/или более чем 10% IgG. В то время как обогащение IgM, содержащим J-цепь, может происходить как часть обработки фракций плазмы человека, для очистки белков плазмы, таких как IgG, альбумин, альфа-1 антитрипсин и факторы свертывания, никакой стадии очистки, специфически спланированной для отделения IgM, содержащего J-цепь, от других белков, таких как аффинная хроматография или эксклюзия на основе размера и отбор фракции с релевантной молекулярной массой, для получения композиции на этапе (a), не требуется.
Как применяют в настоящем документе, термин "секреторный компонент" относится к белку, который специфически связывается с иммуноглобулином, содержащим J-цепь, и относится к или получается из идентичного внеклеточной части рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR), предпочтительно pIgR млекопитающих, более предпочтительно pIGR приматов, наиболее предпочтительно pIgR человека. Предпочтительно, секреторный компонент придает увеличенную стабильность иммуноглобулину, содержащему J-цепь. Секреторный компонент, содержащийся в композиции, может быть рекомбинантным секреторным компонентом, предпочтительно секреторным компонентом, полученным в клеточной линии млекопитающих. Секреторный компонент в его традиционном узком значении (упоминаемый как "естественный секреторный компонент" в настоящем документе) является внеклеточной частью рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR), который, как правило, соединяется во время секреции с димерным или полимерным IgA или пентамерным IgM, содержащим J-цепь. IgA/IgM, содержащий J-цепь, связывается с рецептором полимерного иммуноглобулина на базолатеральной поверхности эпителиальных клеток и захватывается в клетку посредством трансцитоза. Этот рецепторный комплекс затем переходит через клеточные компартменты, перед тем как он транспортируется на люминальную поверхность эпителиальных клеток. Трансцитозный комплекс IgA/IgM-pIgR затем высвобождается посредством протеолиза, и часть рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR), обозначаемая как естественный секреторный компонент, остается связанной с IgA/IgM, содержащим J-цепь, высвобождая секреторный IgA/IgM. Однако существует свидетельство того, что также может иметь место обратный трансцитоз IgA, т.е. от люминальной поверхности к базолатеральной поверхности.
pIgR человека клонируют и секвенируют, его последовательность доступна в качестве SwissProt entry P01833, и представлена в Seq ID NO: 1. pIgR человека является гликопротеином с 764 аминокислотными остатками, содержащими сигнальный пептид (остатки от 1 до 18), внеклеточную часть (остатки от 19 до 638), трансмембранную область (остатки от 639 до 661) и цитоплазматическую область (остатки от 662 до 764). Предполагают, что остатки от 19 до 603 связаны с IgA, содержащим J-цепь, как описано выше, и эту часть этого гликопротеина, как правило, обозначают как секреторный компонент (в настоящем документе упоминается как "естественный секреторный компонент").
Секреторный компонент, применяемый в композиции по изобретению, может содержать любую внеклеточную последовательность pIgR, которая способна соединяться с IgA, содержащим J-цепь. Например, секреторный компонент может содержать внеклеточные домены pIgR из источников млекопитающих, например из приматов, крупного рогатого скота, лошадей, кошек, собак, кроликов, морских свинок, крыс или мышей, или их вариантов. Функциональные гибриды внеклеточных доменов из нескольких видов млекопитающих или их вариантов тоже рассматриваются для применения в изобретении, например, полученные посредством слияния иммуноглобулиноподобных доменов из различных видов в секреторный компонентоподобный белок. Функциональный секреторный компонент может также быть составлен посредством слияния отбора в норме присутствующих иммуноглобулиноподобных доменов, например, секреторный компонент кролика является функционально составленным только из доменов 1, 4 и 5. Предпочтительно, однако, применяют секреторный компонент человека или его функциональные варианты.
Таким образом, секреторный компонент, применяемый в композиции по изобретению, предпочтительно содержит остатки от 19 до 603 в SEQ ID NO: 1 или их функциональные варианты. Функциональные варианты могут включать делеции, вставки и/или замены, предпочтительно замены являются консервативными заменами, например, основный аминокислотный остаток заменен на другую основную аминокислоту, гидрофобная аминокислота заменена на другую гидрофобную аминокислоту и т.д. Вариантный секреторный компонент по меньшей мере на 50% идентичен в последовательности к остаткам от 19 до 603 SEQ ID NO: 1, предпочтительно по меньшей мере на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85% или даже 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 92%, 94%, 95%, 97%, 98%, или даже на 99% идентичен остаткам от 19 до 603 SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, секреторный компонент содержит внеклеточную часть pIgR, более предпочтительно внеклеточную часть pIgR человека, наиболее предпочтительно секреторный компонент содержит или даже состоит из остатков от 19 до 603 SEQ ID NO: 1.
Специалист хорошо знает, как получать секреторный компонент посредством рекомбинантных методов. Пример экспрессии секреторного компонента человека в клетках CHO был описан Phalipon et al (Phalipon A et al. (2002) Immunity 17:107-115), но это изобретение не ограничено секреторным компонентом, полученным посредством этой системы. Например, желаемую последовательность кДНК можно получать синтетически или клонировать посредством ПЦР-РВ, с применением РНК, выделенной из клеток или ткани, экспрессирующей pIgR, в качестве образца. кДНК затем может быть вставлена в экспрессирующий вектор млекопитающих, такой как pcDNA3 - доступно много альтернативных экспрессирующих векторов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор затем будет введен в подходящую клеточную линию-хозяина, такую как CHO, Cos, HEK293 или BHK. Другие клеточные линии доступны и также могут быть применены. Способы введения таких векторов в клеточную линию включают липофекцию, электропорацию и другие методы, хорошо известные специалисту. Как правило, клетки, содержащие экспрессирующий вектор и экспрессирующие белок, представляющий интерес, затем отбирают и клонируют. Также можно использовать вирусные экспрессирующие системы, например вирус коровьей оспы можно использовать для экспрессии белков на высоких уровнях в клетках млекопитающих, экспрессирующие системы бакуловируса можно использовать для экспрессии белков в клетках насекомых. Экспрессирующие системы дрожжей или бактерий также могут быть рассмотрены, и такие экспрессирующие системы известны специалисту. Таким же образом, экспрессирующие системы растений также могут быть рассмотрены, и такие системы известны специалисту.
Секреторный компонент или его вариант, применяемый в композиции по изобретению, также может содержать метку, такую как гексагистидиновую метку, которая может помочь в очистке полученного белка. Если такая метка прикреплена посредством расщепляемого линкера, метка может быть расщеплена до использования в изобретении. Сходным образом, секреторный компонент можно получать в качестве белка слияния. Снова расщепляемый линкер можно использовать, чтобы партнер слияния мог быть отщеплен от секреторного компонента до использования в изобретении.
Специалист может затем очистить экспрессированный белок с применением стандартных методов. Рекомбинантный секреторный компонент можно очищать до высокого уровня чистоты с применением подходящего способа, например, эксклюзионной и/или ионообменной хроматографии. Предпочтительно окончательное получение рекомбинантного секреторного компонента будет существенным образом свободным от загрязнений, особенно белков клетки-хозяина. Однако секреторный компонент может также специфичным образом соединяться с иммуноглобулином, содержащим J-цепь, в неочищенном виде, таким образом, очистка перед объединением с иммуноглобулином, содержащим J-цепь, не существенна.
Секреторный компонент может также быть получен из природного источника, предпочтительно из молока, слюны или слизи. Предпочтительно секреторный компонент происходит из человеческого источника, но секреторный компонент других видов может также быть применен в изобретении.
Молярное отношение между секреторным компонентом и J-цепью в димерах/полимерах IgA или пентамерах IgM в композиции стадии (a) находится в диапазоне между 1:10 и 10:1, предпочтительно между 1:5 и 5:1, более предпочтительно между 1:2 и 2:1.
Молярное отношение между секреторным компонентом и J-цепью в композиции на стадии (a) находится между 1:10 и 10:1, предпочтительно между 1:5 и 5:1, более предпочтительно между 1:2 и 2:1.
Количество секреторного компонента, применяемого на стадии (b), может составлять по меньшей мере 1 часть (по массе) секреторного компонента к 50 частям (по массе) от белка в композиции стадии (a), предпочтительно по меньшей мере 1 часть к 40, 30, 20, 15, 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1 часть секреторного компонента к 5 частям белка в композиции стадии (a).
Другим аспектом изобретения является композиция, содержащая секреторноподобный IgA, получаемый способом по изобретению. Еще другим аспектом изобретения является композиция, содержащая секреторноподобный IgM, получаемый способом по изобретению. Еще дополнительным аспектом является композиция, содержащая секреторноподобный IgA и секреторноподобный IgM, получаемый способом по изобретению, например, в молярном отношении между 10:1 и 1:10, предпочтительно между 5:1 и 1:5, более предпочтительно между 2:1 и 1:2. В другом аспекте изобретения комбинированное содержание IgA и IgM в композиции превышает 50%, предпочтительно 60%, более предпочтительно 70%, даже более предпочтительно 80%, даже более предпочтительно 90%, наиболее предпочтительно оно составляет 100%.
Дополнительным аспектом изобретения является композиция, описанная выше, для медицинского применения. Например, композиции по изобретению можно использовать преимущественно для лечения некротического энтероколита и, как правило, инфекций на поверхности слизистых оболочек.
Композиция может дополнительно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов, и/или стабилизаторов. Композицию можно формулировать в жидкой форме, в виде сиропа, лосьона, мази, порошка, который может быть разведен жидкостью перед введением, капсулы, пилюли, геля, крема, желе, состава с контролируемым высвобождением или любого другого состава, подходящего для предполагаемого медицинского применения. Например, для лечения заболеваний ЖКТ композицию можно формулировать с защитным покрытием, которое растворяется в желаемой области ЖКТ для высвобождения композиции. Композицию можно принимать перорально, вводить местно, энтерально, посредством ингаляции или любым другим подходящим способом для назначаемого применения. Для перорального введения можно совместно вводить ингибиторы протонной помпы.
Белки в композиции могут быть концентрированы, например, с использованием диа/ультрафильтрации или других стандартных способов, предшествующих созданию состава. Кроме того, композиция может быть лиофилизирована, а затем растворена в подходящем растворе перед применением.
Определения
Термин "секреторноподобный IgA" или "секреторноподобный IgA плазмы" предназначен охватывать IgA(плазма), содержащий J-цепь, комбинированный с белком, который является секреторным компонентом или его функциональным вариантом, который служит для предоставления некоторой защиты от протеолитического расщепления. Как правило, IgA, содержащий J-цепь, содержит два или четыре, или даже больше мономеров IgA. Как правило, IgA, содержащий J-цепь, смешивают с секреторным компонентом или его вариантом in vitro, т.е. связь между секреторным компонентом и IgA, содержащим J-цепь, имеет место in vitro скорее, чем во время трансцитоза.
Термин "секреторноподобный IgM" предназначен охватывать IgM (плазма), содержащий J-цепь, комбинированный с секреторным компонентом или его функциональным вариантом in vitro. Предпочтительно, IgM, содержащий J-цепь, является пентамерным IgM.
"Специфические стадии очистки димеров или полимеров IgA, содержащего J-цепь" относятся к стадиям очистки, которые были бы включены в процесс очистки, специфически спланированный, чтобы отделить димеры или полимеры IgA, содержащего J-цепь, от других белков, таких как мономерный IgA, другие иммуноглобулины и другие белки плазмы. Такие специфические стадии очистки могут, например, включать аффинную хроматографию с применением лиганда, специфически связывающегося с J-цепью, или эксклюзионную хроматографию, отбирающую фракции, содержащие белки с молекулярной массой, соответствующей димерам IgA, содержащего J-цепь. В то время как процесс получения композиции из плазмы может содержать способы, которые ведут к обогащению IgA или даже IgA, содержащего J-цепь, такие как ионообменная хроматография, IgA, содержащий J-цепь, не является специфически очищенным. Таким образом, "IgA, содержащий J-цепь, в неочищенном виде" относится к композиции, содержащей менее чем 80% IgA, содержащего J-цепь, как правило, менее чем 70%, 60% или 50% IgA, содержащего J-цепь, он может даже сдержать менее чем 40%, 30%, 25%, 20%, 15% или даже 10% IgA, содержащего J-цепь.
"Специфические стадии очистки IgM, содержащего J-цепь" относятся к стадиям очистки, которые были бы включены в процесс очистки, специфически спланированный, чтобы отделить IgM, содержащий J-цепь, от других белков, таких как другие иммуноглобулины, и другие белки плазмы. Такие специфические стадии очистки могут, например, включать аффинную хроматографию с лигандом, специфически связывающимся с IgM или с J-цепью, или эксклюзионную хроматографию, отбирающую фракции, содержащие белки молекулярной массы, соответствующей пентамерам IgM, содержащего J-цепь. В то время как процесс получения композиции из плазмы может содержать способы, которые ведут к обогащению IgM, содержащего J-цепь, такие как ионообменная хроматография, IgM, содержащий J-цепь, не является специфически очищенным. Таким образом "IgM, содержащий J-цепь, в неочищенном виде" относится к композиции, содержащей менее чем 80% IgM, содержащего J-цепь, как правило, менее чем 70%, 60%, или 50% IgM, содержащего J-цепь, он может даже содержать менее чем 40%, 30%, 25%, 20%, 15% или даже 10% IgM, содержащего J-цепь.
Как используют в настоящем документе, термин "секреторный компонент" относится к белку, который специфически связывается с иммуноглобулином, содержащим J-цепь, и относится к или его получают из, или он идентичен внеклеточной части полимерного рецептора иммуноглобулина (pIgR), предпочтительно pIgR млекопитающих, более предпочтительно pIGR приматов, наиболее предпочтительно pIgR человека. Предпочтительно, секреторный компонент придает увеличенную стабильность иммуноглобулину, содержащему J-цепь. Как было подробно описано выше, наиболее предпочтительным секреторным компонентом является секреторный компонент человека, например, соответствующий остаткам от 19 до 603 SEQ ID NO: 1. Однако аминокислотные делеции, вставки, замены могут быть включены при условии, что они приводят к функциональному белку, т.е. такому, который все еще способен объединяться с IgA, содержащим J-цепь, и предпочтительно придающий ему защиту от протеолитического расщепления. Гомологи из других видов млекопитающих также включены, поскольку они являются химерными белками, содержащими части из различных видов.
Термин "% [процент]", когда его используют для описания содержания иммуноглобулина в композиции/препарате, означает массу на массу белка.
Список чертежей
Изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами, касающимися следующих чертежей и списка последовательностей:
На фигуре 1 представлена диаграмма структуры мономерного, димерного и содержащего J-цепь секреторного IgA.
На фигуре 2 представлены вестерн-блоттинги различных препаратов IgA, полученных с различными антителами:
- На фиг. 2A представлен вестерн-блоттинг различных препаратов IgA, полученных с применением антитела к α-цепи, J-цепи или секреторному компоненту.
- На фиг. 2B представлен вестерн-блоттинг различных препаратов секреторноподобного и секреторного IgA, полученного с применением антитела к антисекреторному компоненту.
- На фиг. 2C представлен вестерн-блоттинг различных фракций эксклюзионной хроматографии секреторноподобного IgAF5, полученного с применением антитела к секреторному компоненту, α-цепи и J-цепи.
- На фиг. 2D представлена хроматограмма цикла эксклюзионной хроматографии секреторноподобного IgAF5.
На фигуре 3 представлены точечные блоты с применением иммобилизованного секреторного компонента:
- На фиг. 3A представлена блок-схема того, как налаживают анализ.
- На фиг. 3B представлен SC, захватывающий IgA, содержащий J-цепь.
- На фиг. 3C представлен SC, захватывающий IgM, содержащий J-цепь.
На фигуре 4 представлены вестерн-блоттинги экспериментов по определению зависимости от времени различных препаратов IgA (A) или препаратов IgM (B), инкубированных с кишечными смывами. Блоты получали с применением антител к тяжелой цепи.
На фигуре 5 представлена защита от инфекции шигелл посредством различных препаратов IgA:
- На фиг. 5A представлено снижение трансэпителиальной устойчивости шигелл к поляризованным монослоям Caco-2, и защита от такого уменьшения в TER посредством SIgA, IgAF5 и SIgAF5 против шигелл (см. Phalipon A et al (1995) J. Exp. Med. 182: 769-778).
- На фиг. 5B представлено снижение численности связанных и интернализированных бактерий посредством SIgA, IgAF5 и SIgAF5 к шигеллам.
На фигуре 6 представлены снимки шигелл в иммунных комплексах, полученных после инкубации с SIgA(SIgAC5), против шигелл, примененных в качестве положительного контроля, и полученные из плазмы полимерные IgAF5, SIgAF5, мономерные IgAF5 и IgG.
На фигуре 7 представлена секреция цитокина TNF-α и хемокинов CXCL8 и CCL3 посредством поляризованных монослоев эпителиальных клеток Caco-2, подвергнутых воздействию шигелл в отдельности или в комплексе с различными Аb.
На фигуре 8 представлена защита от инфицирования шигеллой посредством препаратов пентамерного IgM и SIgM.
- На фиг 8 представлено снижение трансэпителиальной устойчивости шигелл на поляризованных монослоях Caco-2, и защита от такого снижения в TER посредством SIgA, IgM и SIgM против шигелл (см. Phalipon A et al (1995) J. Exp. Med. 182: 769-778).
В SEQ ID NO: 1 представлена белковая последовательность pIgR человека.
Примеры
Пример 1: Вестерн-блоттинг препаратов IgA из плазмы, смешанных с рекомбинантным секреторным компонентом
Материалы и методы
1.1 Получение IgA из плазмы посредством аффинной хроматографии и/или посредством последовательной элюции колонки MPHQ
IgA плазмы человека очищали посредством аффинной хроматографии с применением смолы CaptureSelect Human IgA (Bioaffinity Company BAC, Naarden, Netherlands) в соответствии с протоколом производителя смолы с применением 3 различных источников IgA плазмы в качестве исходного вещества, а именно криообедненной плазмы, повторно растворенной пасты, фракционированной в холодном этаноле, или фракции смыва из анионно-обменной (AIEX) хроматографической колонки, полученные посредством вычищения указанной колонки в соответствии с коммерчески применимым процессом очистки IgG CSL Behring AG (Berne, Switzerland). В кратком изложении, криообедненный пул плазмы, повторно растворенную пасту или фракцию смыва AIEX разбавляли в фосфатно-солевом буфере (PBS) до концентрации IgA приблизительно 1 мг/мл, а затем загружали в уравновешенную PBS колонку CaptureSelect Human IgA, без превышения способности колонки к связыванию IgA. После загрузки колонку отмывали PBS, и IgA элюировали с применением глицинового буфера при pH 3. Элюат доводили до pH 4,5 с применением 0,5M Tris (pH 8) и концентрировали до 16 мг/мл белка в PBS. SIgA из молока человека очищали тем же способом.
Из стадии хроматографии AIEX производственного процесса IVIg CSL Behring AG (Berne, Switzerland), фракцию F4 получали после пост-промывания колонки Macro-Prep High Q (Bio-Rad, Hercule, CA) с применением 10 мМ фосфата/30 мМ ацетата при pH 6,5 посредством элюции с применением 55 мМ тартрата/5 мМ ацетата при pH 7,6. Затем фракцию F5 элюировали с применением 50 мМ фосфата/25 мМ цитрата при pH 5,0. F4 и F5 приводили к приблизительно 1 мг/мл в PBS посредством ультра-/диафильтрации, а затем изымали IgG посредством аффинной хроматографии с применением смолы IgSelect (GE Healthcare, Glattbrugg, Switzerland). IgAF4 был напрямую собран в потоке IgSelect хроматографии загрузки F4. Для получения IgAF5, из IgSelect поток загрузки F5 извлекали IgM посредством аффинной хроматографии с применением смолы CaptureSelect Human IgM (Bioaffinity Company BAC). IgAF4 и IgAF5 приводили к конечным концентрациям посредством ультра-/диафильтрации.
1.2 Получение IgM из плазмы посредством аффинной хроматографии
IgM плазмы человека очищали посредством аффинной хроматографии с применением смолы CaptureSelect Human IgM (Bioaffinity Company BAC, Naarden, Netherlands) в соответствии с протоколом производителя смолы с применением тех же 3 различных источников в качестве исходного вещества, как описано в разделе 1.1 для IgA, а именно криообедненной плазмы, повторно растворенной пасты, фракционированной в холодном этаноле, или фракции смыва из анионо-обменной (AIEX) хроматографической колонки, полученной посредством извлечения из указанной колонки, в соответствии с коммерчески примененным процессом очистки IgG CSL Behring AG (Berne, Switzerland). В кратком изложении, криообедненный пул плазмы, повторно растворенную пасту или фракцию смыва AIEX разбавляли в фосфатно-солевом буфере (PBS) до концентрации IgM приблизительно 1 мг/мл, а затем загружали на уравновешенную PBS колонку CaptureSelect Human IgM, без превышения способности колонки связывать IgM. После загрузки колонку отмывали с применением PBS, и IgM элюировали с применением глицинового буфера при pH 3. Элюат был доведен до pH 4,5 с применением 0,5M Tris (pH 8) и сконцентрирован до 10 мг/мл белка в PBS.
1.3. Вестерн-блоттинги
SDS-PAGE и электроблоттинг на нитроцеллюлозных мембранах (NC) проводили с применением системы мини-клеток из Invitrogen (Carlsbad, CA) по протоколам производителя. В кратком изложении, образцы были денатурированы в буфере для образцов в восстановительных или невосстановительных условиях, соответственно, и электрофоретически отделены на градиентных гелях заводского изготовления, NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12% 1,0 мм 10-луночный, с применением NuPAGE MOPS Electrophoresis Buffer (Invitrogen). Мокрый перенос на NC мембраны (0,2 мкм) проводили с применением XCell II Blot Module (Invitrogen) и NuPAGE Transfer Buffer. Мембраны затем блокировали в течение 30 мин в растворе PBS-0,5% Tween 20 (PBS-T), содержащем 4% порошковое молоко Rapilait skim (Migros, Switzerland). Для иммуноблоттинга поликлональных антител кролика применяли: 1) альфа-цепь кролика против человека (Dako, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP): разведение 1/5000); 2) J-цепь кролика против человека (BioGenex, Fremont, CA; разведение 1/300), с последующей вторичной антисывороткой против кролика, конъюгированной с HRP (Sigma; разведение 1/10000); 3) SC кролика против человека (Dako; разведение 1/5000), с последующей вторичной антисывороткой против кролика, конъюгированной с HRP (Sigma; разведение 1/10000). Все инкубации проводили в PBS-T, содержащем 4% порошковое молоко, при температуре окружающей среды в течение 1-2 часов. После окончательной промывки с применением PBS-T иммунологический анализ на мембране был выявлен посредством хемилюминесценции и записан в цифровом виде в системе ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Lifesciences).
1.4 Объединение IgA, полученного из плазмы, с рекомбинантным секреторным компонентом
Секреторноподобный IgA получали посредством комбинирования in vitro 100 мг IgAF5 с 4 мг рекомбинантного секреторного компонента человека (recSC). Объединение проводили в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, как описано ранее в (Crottet, P., и Corthesy, B. (1998) J. Immunol. 161:5445-5453).
1.5 Фракционирование посредством эксклюзионной хроматографии (SEC)
IgAF5, содержащий секреторноподобный IgA (объединенный in vitro с recSC), инъецировали при 200 мкг/20 мкл в Agilent Technologies 1050 HPLC system для эксклюзионной хроматографии при скорости потока 1,5 мл/мин на TSKgel G3000SWXL 7,8 мм ID Ч30 см колонке (Tosoh Bioscience). Фракции 0,75 мл собирали между 8,0 и 13,5 мин времени удержания с интервалами в 30 сек.
Результаты
Результаты представлены на фигуре 2. На фигуре 2A представлено сравнение IgA, очищенного посредством аффинной хроматографии от плазмы, от повторно растворенной пасты и от фракции смыва AIEX или посредством последовательной элюции для получения IgAF5, как описано в 1.1 с SIgA из молока человека. Секреторный компонент был обнаружен в SIgA из молока, но ни в одной из фракций IgA, очищенной от плазмы человека. Все препараты содержали то же самое количество тяжелой цепи/альфа-цепи IgA. Как и ожидалось, SIgA из молока содержал наивысшее количество J-цепи, поскольку существенным образом ожидается, что все молекулы IgA присутствуют в качестве димеров, содержащих J-цепь. Количество J-цепи и, таким образом, димеров IgA, содержащих J-цепь, в IgA, очищенном от плазмы, было низким. Ожидается, что только малая часть IgA в плазме присутствует в димерной форме. Сходное содержание J-цепи наблюдали в IgA, очищенном от повторно растворенной пасты. Удивительно, что увеличенная фракция IgA присутствовала в качестве димеров, содержащих J-цепь, во фракции смыва с колонки, о чем свидетельствует повышенное количество J-цепи. Удивительно, что оно было дополнительно увеличено в IgAF5. Это накопление произошло без применения специфической стадии процесса для обогащения.
На фигуре 2B представлено, что в IgAF5 не присутствует никакого секреторного компонента, содержащего IgA. После объединения с recSC были обнаружены свободный recSC (75 кДа) и димерный IgA, объединенный с recSC. Фактически секреторноподобный IgA плазмы оказался сходным с SIgA из молока. Было определено, что в препарате IgAF5, примененном в представленном эксперименте, содержание IgAF5, содержащего J-цепь, составляло приблизительно 20%. Фактически, сила сигнала, наблюдаемого в дорожке 2, была сравнима с сигналом SIgA молока человека, разведенного 1:5.
На фигуре 2C представлено содержание SC, альфа-цепи и J-цепи IgA во фракциях, полученных посредством эксклюзионной хроматографии секреторноподобного IgAF5. recSC наблюдали в ранних фракциях, соответствующих формам с высокой молекулярной массой IgA-подобных полимерных и димерных форм. Появление SC совпадало с появлением J-цепи, указывая на то, что фактически фракция IgAF5, содержащая SC, была димерной фракцией, содержащей J-цепь. Кроме того, альфа-цепь IgA обнаружили во фракциях с более маленькой молекулярной массой, вероятно содержащей мономерную фракцию IgAF5; эти фракции были лишены SC и J-цепи. Эти данные продемонстрировали, что recSC, смешанный с IgA, полученным из плазмы, содержащим мономерные и димерные формы IgA, специфически объединен с димерными формами IgA, содержащим J-цепь.
На фигуре 2D представлена хроматограмма цикла SEC, в течение которого фракции собирали между временем удержания 8,0 мин и 13,5 мин. Пики, представляющие полимеры, димеры и мономеры IgA, указаны.
Пример 2: Анализ точечного блота реассоциации (DORA)
Анализ точечного блота реассоциации применяли, чтобы продемонстрировать объединение иммобилизованного секреторного компонента с IgA или IgM, полученными из плазмы, in vitro. В кратком изложении, как представлено на фигуре 3A, секреторный компонент был точечно нанесен на мембраны блоттинга; участки неспецифического связывания блокировали. После этого IgA, полученный из плазмы (фигура 3B), или IgM, полученный посредством аффинной хроматографии из плазмы (фигура 3C) (дорожка 4), из повторно растворенной пасты (дорожка 5) или из фракции смыва AIEX (дорожка 6), полученной, как описано в 1.1 и 1.2, наносили на мембрану. После отмывания несвязанных IgA или IgM, связанный IgA/IgM обнаруживали, как описано в кратком изложении ниже.
DORA проводили существенным образом, как описано (Rindisbacher, L. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:14220-14228), со следующими модификациями: мембраны для блоттинга состояли из полимера фторида поливинилидона (PVDF), блокирующий раствор был фосфатно-солевой буфер-0,05% Tween-20 (PBS-T), содержащий 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), сырьевые препараты, обогащенные IgA, применяли для оверлейной инкубации в 200 мкл PBS-T, содержащем 0,1% BSA, и обнаружение антител было непосредственно соединено с HRP.
Результаты для IgA представлены на фигуре 3B. Иммобилизованный секреторный компонент был способен захватывать IgA, полученный из плазмы. Сходно с тем, что представлено на фигуре 2C, это демонстрирует, что recSC объединен с димерами IgA, полученными из плазмы.
Результаты для IgM представлены на фигуре 3C. Иммобилизованный секреторный компонент был способен захватывать IgM, полученный из плазмы. Это демонстрирует, что recSC связан с IgM, полученным из плазмы.
Пример 3: Расщепление секреторноподобного IgA и секреторноподобного IgM с применением кишечных смывов
Чтобы доказать функциональное преимущество объединения очищенного секреторного компонента с IgA и IgM, содержащими J-цепь, соответственно, IgA и IgM получали, как описано в параграфе 1.1 и 1.2. Секреторноподобный IgA получали посредством обогащения IgA, содержащего J-цепь, с применением эксклюзионной хроматографии и комбинирования in vitro их 10 мкг с 2,5 мкг рекомбинантного секреторного компонента человека (hSCrec). Секреторноподобный IgM получали посредством обогащения пентамерного IgM с применением эксклюзионной хроматографии и комбинирования in vitro их 25 мкг с 2,5 мкг рекомбинантного секреторного компонента человека (hSCrec). Объединение проводили в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, как описано ранее (Crottet, P., и Corthesy, B. (1998) J. Immunol. 161:5445-5453). Целостность и надлежащая сборка молекул в возможно ковалентные комплексы проверяли посредством SDS-PAGE в невосстановительных и восстановительных условиях, с последующим вестерн-блоттингом и иммунологическим анализом с применением антисыворотки, специфичной для hSC, как указано выше.
Сбор кишечных смывов из мышей BALB/c (возрастом 4-6 недель) проводили в соответствии с опубликованной процедурой (Crottet, P., и Corthesy, B. (1998) J. Immunol. 161:5445-5453). Для расщепления in vitro 120 нг очищенного IgA, содержащего J-цепь, и повторно растворенного секреторноподобного IgA смешивали (или нет) с 1 или 2 мкл кишечных смывов в окончательно объеме 20 мкл PBS и инкубировали при 37°C в течение различных периодов времени, как показано на фигуре 4 (T=время в часах). Для расщепления IgM in vitro 250 нг очищенного IgM и секреторноподобного IgM смешивали с 4 мкл кишечных смывов. Реакции останавливали посредством добавления 2 мкл смеси ингибиторов протеазы Complete™ (Roche Applied Science, Rotkreuz, Switzerland) и держали в замороженном состоянии до проведения анализа посредством вестерн-блоттинга, детектирующего восстановленную форму тяжелой цепи антитела.
Результаты представлены на фигуре 4A и B. IgA из повторно растворенной пасты и со смыва с колонки, полученный, как описано в 1.1, и IgM со смыва с колонки, как описано в 1.2, были либо применены как таковые, либо оба после объединения с recSC для формирования секреторноподобного IgA (фиг. 4A) или секреторноподобного IgM (фиг. 4B). Для IgA после 4 часов расщепления с применением кишечных ферментов сигнал необъединенного IgA начал уменьшаться, указывая на протеолитическое расщепление; эффект был сильнее через 6 часов и после расщепления в течение ночи, никакой интактной альфа-цепи IgA не было выявлено посредством вестерн-блоттинга. В отличие от этого, секреторноподобный IgA был гораздо менее чувствителен к расщеплению посредством кишечных протеаз и даже после воздействия в течение ночи значительная часть альфа-цепи IgA внутри секреторноподобного IgA оставалась интактной.
Для IgM (фиг. 4B) представлено сравнение IgM и только что объединенного секреторноподобного IgM (SIgM) с теми же препаратами после 24 часов и 48 часов расщепления. Появление деградированных фрагментов mu-цепей произошло быстрее и интенсивнее для IgM по сравнению с SIgM, подтверждая для IgM - сходно как для IgA, - что объединение с recSC обеспечивало улучшенную структурную стабильность.
В общем, это демонстрирует, что специфическое объединение с recSC обеспечивало улучшенную структурную стабильность и создаст склонные к расщеплению молекулы IgA плазмы, подходящие для применения на слизистой оболочке, например, посредством перорального пути введения.
Пример 4: Shigella flexneri
Эпителиальную клеточную линию аденокарциномы кишечника человека Caco-2 (American Type Tissue Collection) высевали на полиэстеровые фильтры Snapwell (диаметр 12 мм; размер пор 0,4 мкм; Corning Costar), как описано (Crottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., и Corthesy, B. (2002) J. Biol. Chem. 277:33978-33986). Целостность поляризованного клеточного монослоя Caco-2 проверяли посредством измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TER) с применением устройства Millicell-ERS (Millipore). Значения TER хорошо дифференцированных монослоев варьировали между 450 и 550 ΩЧсм2.
2×107 бактерий (Phalipon A. et al. (1995) J. Exp. Med. 182:769-778) смешивали со 100 мкг IgA, 125 мкг секреторноподобного IgA, 275 мкг IgM или 300 мкг SIgM в окончательном объеме 500 мкл простого DMEM (P-DMEM: DMEM, дополненный 10 мМ HEPES, 20 мкг/мл трансферрина, 2 мМ глутамином, 1% заменимых аминокислот, 1 мМ пируватом натрия) и инкубировали в течение 1 часа при КТ при легком перемешивании. Смеси ресуспендировали в P-DMEM для инфицирования поляризованных клеточных монослоев Caco-2.
За 1 час перед применением поляризованных клеточных монослоев Caco-2 C-DMEM заменяли на P-DMEM в обоих апикальном и базолатеральном компартментах. Апикальную среду затем заменяли посредством 500 мкл бактериальных суспензий (2×107 бактерий) отдельно или в комбинации с антителом. Значения TER измеряли в выбранных временных точках от начала инфекционного периода.
Для определения количества бактерий, которые адгезировались и инфицировали клетки, клетки Caco-2 в фильтрах отмывали три раза с применением PBS, клетки инкубировали в 500 мкл холодного лизирующего буфера [10 мМ Tris-HCl (pH 7), 0,2% Nonidet P-40, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА (pH 8)] в течение 5 мин на льду и лизировали посредством пипетирования. Серийные разведения лизатов клеток (10-2-10-6) наносили на чашки с агаром LB и через 24 часа инкубации при 37°C, колониеобразующие единицы (КОЕ) определяли, подсчитывая на глаз дубликатные чашки.
Для изучения целостности клеточных монослоев Caco-2 отмывали Snapwells с применением PBS с последующей фиксацией в течение ночи с 5 мл 4% параформальдегида при 4°C. После промывания с применением PBS фильтры пермеабилизировали и неспецифически связывающие участки были блокированы с применением PBS, содержащим 5% ЭТС и 0,2% Triton X-100 (PBS-Tr), в течение 30 мин при КТ. Все антитела разбавляли в PBS-Tr. Фильтры инкубировали с антителами кролика против человека ZO-1 (1/200, Invitrogen) в течение 2 часов при КТ, промывали в PBS, с последующей обработкой антителами IgG козы против кролика, конъюгированными с Alexa Fluor® 647 (1/100, Invitrogen), в течение 90 мин при КТ. Для визуализации клеток фильтры в конце инкубировали с 100 нг/мл 4ʹ,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в PBS (Invitrogen) в течение 30 мин. Фильтры вынимали из их подставок и покрывали раствором Vectashield для наблюдения с применением конфокального микроскопа Zeiss LSM 710 Meta (Carl Zeiss, Germany), оснащенного объективом 10x или 40x. Изображения обрабатывали с применением программного обеспечения Zeiss ZEN 2009 light.
Для изучения комплексов Shigella-IgA применяли бактерии, постоянно экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, и образование иммунных комплексов верифицировали после инкубации с биотинилированными антителами IgA1/IgA2 мыши против человека (1/10, BD) в течение 30 мин при КТ при легком перемешивании, с последующей обработкой стрептовидином, конъюгированным с цианином 5 (1/400, GE HealthCare), в течение 30 мин при КТ при легком перемешивании. Три промывки с применением PBS проводили между каждым этапом, и все антитела разбавляли с применением PBS/5% FCS. Меченые иммунные комплексы наносили на предметные стекла (Thermo Scientific), готовили препарат и немедленно визуализировали с применением конфокального микроскопа Zeiss LSM 710 Meta (Carl Zeiss, Germany), оснащенного 63x объективом. Изображения обрабатывали с применением программного обеспечения Zeiss ZEN 2009 light.
CXCL8 (IL-8), TNF-α, и CCL3 (MIP-3a) человека в базолатеральном компартменте поляризованных клеточных монослоев Caco-2 количественно определяли посредством ELISA с применением коммерческих наборов (BD Biosciences и R&D Systems, соответственно).
Результаты
Воздействие шигелл на поляризованный монослой эпителиальных клеток кишечника привел к разрыву целостности монослоя, о чем свидетельствовало снижение TER (фигура 5A), к массивной инвазии, о которой свидетельствовали повышенная численность бактерий, обнаруженная при объединении с эпителиальными клетками (фигура 5B), и посредством заметно нарушенного клеточного монослоя, как наблюдали посредством лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Добавление секреторноподобного IgA задерживало и частично ингибировало разрушение монослоя, о чем свидетельствовало значительное ингибирование уменьшения TER (фигура 5A), посредством снижения количества бактерий, связанных с эпителиальными клетками (фигура 5B), и посредством более сохраненной целостности клеточного монослоя при анализе посредством конфокальной микроскопии.
Объединение специфичного к шигеллам моноклонального SIgA SIgAC5, полимерного IgA и секреторноподобного IgA привело к образованию иммунных агрегатов (фигура 6) множества бактерий, в отличие от мономерных IgA и IgG, которые покрывали только бактерию (фигура 6). Вероятно, что агрегация бактерий посредством специфического mAb и полученного из плазмы pIgA и секреторноподобного IgA содействовала уменьшению бактериальной адгезии к клеткам Caco-2, наблюдаемым на фигуре 5B. Те же три препарата антитела значимо снижали продуцирование провоспалительных цитокинов/хемокинов посредством клеток Caco-2, в то время как мономерный IgAF4 и IgG не имел (TNF-α и CCL3) или обладал слабым (CXCL8) эффектом (фигура 7). Это указывает на то, что нейтрализация шигелл посредством секреторного и полимерного IgA уменьшает способность Caco-2 клеток отвечать, окончательно приводя к общим противовоспалительным качествам IgA.
Защиту поляризованного монослоя клеток Caco-2 от инфицирования шигеллой достигали сходным образом с применением IgM и секреторноподобного IgM, до уровня, по меньшей мере, сходного с тем, который достигается, когда используется специфический SIgAC5 (фигура 8). Поддержание TER, по меньшей мере, в течение 12 ч 30 минут указывало на то, что изотип IgM обладает нейтрализующими качествами, защищающими монослой Caco-2 от повреждений, наносимых воздействием шигелл.
Пример 5: Предотвращение рецидива инфекции Clostridium difficile (CDI)
Композицию по изобретению применяют в мышиной модели инфицирования Clostridium difficile.
Мыши C57BL/6 обрабатывают с применением смеси пероральных антибиотиков (канамицина, гентамицина, колистина, метронидазола, и ванкомицина) в течение 3 суток, как описано ранее (Chen X, et al. Gastroenterology 2008 Dec;135(6):1984-92). Двумя сутками позже им дают парентеральный фосфат клиндамицина (10 мг/кг s.c.) [Сутки - 1]. Через одни сутки [Сутки 0] их испытывают посредством принудительного кормления 0,5×105 КОЕ токсиногенным штаммом 10465 C. difficile. Через от 1 до 5 суток после введения C. difficile развивается от умеренного до острого колита. Будучи нелеченным, он быстро прогрессирует в тяжелый и фатальный колит у большинства животных. Для лечения первичной инфекции животные получают ванкомицин, в течение 5 суток после испытания посредством C. difficile, и животных мониторируют на предмет смертности, а также присутствия или отсутствия тяжелого CDI с диареей. Животных, оцениваемых как находящихся в предсмертном состоянии, подвергают эвтаназии посредством единичной инъекции пентобарбиталом натрия. Для исследования рецидива CDI у животных, переживших первичное испытание C. difficile, поддерживают под наблюдением до 28 суток. Животных взвешивают 3 раза в неделю от 7 до 28 суток. После прекращения лечения ванкомицином животные получают IgA или секреторноподобный IgA (400 мг/кг массы тела посредством перорального пути введения) в течение 5 суток, начиная с суток после последней дозы ванкомицина.
Результат
Животные, получившие лечение ванкомицином, выживают после первичного инфицирования C. difficile. Однако значительная часть животных - до 70% - погибают от рецидива инфекции C. difficile в течение 3-4 суток после окончания лечения ванкомицином. В противоположность этому, рецидив инфекции предотвращают, если животных лечат секреторноподобным IgA посредством перорального пути введения. IgA плазмы в отдельности не эффективен (или, по меньшей мере, не так эффективен), как секреторноподобный IgA, при предотвращении рецидива инфекции C. difficile.
Альтернативно, композицию применяют в модели перорального воспаления слизистой оболочки, сходной с описанной в Watkins et al. (Oral Dis 2010, 16:655-660).
Соответствующим образом сформулированные препараты IgA (или раствор носителя для контроля) дают профилактически (например, начиная с -3 суток) три раза ежесуточно сирийским золотистым хомячкам в течение всей продолжительности исследования до 28 суток. В модели острого мукозита, вызванного радиацией, на 0 сутки облучали один вывернутый защечный мешок (40 Gy), другой защечный мешок оставляли нетронутым для контроля. Альтернативно, в модели мукозита, вызванного фракционированным облучением, применяли суммарную дозу 60 Gy, разделенную на восемь фракций по 7,5 Gy, как описано в (Watkins, Oral Dis 2010, 16:655-660). В еще другой модели мукозита, индуцированного комбинированным воздействием цисплатина и острого облучения, заболевание вызвано посредством комбинации цисплатина (5 мг/кг) и облучения 35 Gy на 0 сутки. Клиническая оценка перорального мукозита и мониторинг массы тела проводят ежесуточно, начиная с 6 суток и до конца исследования, как правило, на 28 сутки. Система расчета описана в (Watkins Oral Dis, 2010 16:655-660). Кроме того, образцы ткани и плазмы собирают и соответствующим образом обрабатывают в течение всего исследования для гистологического анализа, определения воспалительных маркеров в плазме и для исследований генной экспрессии в различных тканях.
Результаты
У нелеченого/леченого носителем животного развивается пероральный мукозит, с пиком заболевания приблизительно на 16-18 сутки, спонтанным излечением, о котором свидетельствует регрессия мукозита, начинающаяся приблизительно на 18-20 сутки. Животные, леченные IgA и, в частности, секреторноподобным IgA, имеют существенно более низкие показатели мукозита по сравнению с контрольными животными и теряют меньше массы, параллельно с менее тяжелыми гистологическими проявлениями и уменьшенными уровнями воспалительных маркеров (включая в качестве неограничивающих примеров воспалительные цитокины и хемокины). Уменьшение воспаления и продвижение заживления раны подтверждается на уровне экспрессии мРНК посредством методов анализа генной экспрессии.
Claims (19)
1. Способ получения in vitro композиции, содержащей секреторноподобный иммуноглобулин, включающий стадии
(a) получения белковой композиции, выделенной из крови, содержащей иммуноглобулин, имеющий в составе J-цепь, в неочищенном виде,
(b) смешивания композиции стадии (а) с секреторным компонентом.
2. Способ по п. 1, где секреторноподобный иммуноглобулин является секреторноподобным IgA и/или секреторноподобным IgM.
3. Способ по п. 1 или 2, где композиция стадии (а) содержит по меньшей мере 5% IgA, связанного J-цепью.
4. Способ по п. 3, где композиция стадии (а) содержит по меньшей мере 10% IgA, связанного J-цепью.
5. Способ по п. 3, где композиция стадии (а) содержит по меньшей мере 20% IgA, связанного J-цепью.
6. Способ по п. 3, где композиция стадии (а) содержит по меньшей мере 30% IgA, связанного J-цепью.
7. Способ по п. 3, где композиция стадии (а) содержит по меньшей мере 50% IgA, связанного J-цепью.
8. Способ по п. 1, где композицию стадии (а) получают из крови человека.
9. Способ по п. 1, где секреторный компонент на этапе (b) является рекомбинантным секреторным компонентом.
10. Способ по п. 1, где секреторный компонент является секреторным компонентом человека.
11. Способ по п. 1, где секреторный компонент получают в клеточной линии млекопитающего.
12. Способ по п. 1, где секреторный компонент является внеклеточной частью рецептора полимерного иммуноглобулина pIgR.
13. Способ по п. 1, где на этапе (b) молярное отношение между добавленным секреторным компонентом и J-цепью в димерах/полимерах IgA варьирует между 1:10 и 10:1.
14. Способ по п. 13, где соотношение варьирует приблизительно от 1:5 до 5:1.
15. Способ по п. 14, где соотношение варьирует приблизительно от 1:2 до 2:1.
16. Композиция для применения в медицине, содержащая секреторноподобный IgA и/или секреторноподобный IgM или их сочетание, получаемые посредством способа по любому из пп. 1-15.
17. Композиция по п. 16, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20120158931 EP2636682A1 (en) | 2012-03-09 | 2012-03-09 | Compositions comprising secretory-like immunoglobulins |
| EP12158931.1 | 2012-03-09 | ||
| EP12168343.7 | 2012-05-16 | ||
| EP12168343 | 2012-05-16 | ||
| PCT/EP2013/054697 WO2013132052A1 (en) | 2012-03-09 | 2013-03-08 | Compositions comprising secretory - like immunoglobulins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014140744A RU2014140744A (ru) | 2016-04-27 |
| RU2644240C2 true RU2644240C2 (ru) | 2018-02-08 |
Family
ID=47846003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014140744A RU2644240C2 (ru) | 2012-03-09 | 2013-03-08 | Композиции, содержащие секреторноподобные иммуноглобулины |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10221233B2 (ru) |
| EP (1) | EP2822967B1 (ru) |
| JP (3) | JP2015510875A (ru) |
| KR (1) | KR102142261B1 (ru) |
| CN (2) | CN104254542A (ru) |
| AU (1) | AU2013201393B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014022240A2 (ru) |
| CA (1) | CA2866634C (ru) |
| DK (1) | DK2822967T3 (ru) |
| ES (1) | ES2751976T3 (ru) |
| IL (1) | IL234449B (ru) |
| MX (1) | MX360245B (ru) |
| NZ (1) | NZ629072A (ru) |
| PL (1) | PL2822967T3 (ru) |
| RU (1) | RU2644240C2 (ru) |
| SG (1) | SG11201404958SA (ru) |
| WO (1) | WO2013132052A1 (ru) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2636684A1 (en) * | 2012-03-09 | 2013-09-11 | CSL Behring AG | Prevention of infection |
| WO2013132052A1 (en) * | 2012-03-09 | 2013-09-12 | Csl Behring Ag | Compositions comprising secretory - like immunoglobulins |
| EP2636681A1 (en) | 2012-03-09 | 2013-09-11 | CSL Behring AG | Process for enriching IgA |
| US9458230B2 (en) | 2013-01-04 | 2016-10-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Secretory IGA compositions, methods of making and methods of use thereof |
| US9468674B2 (en) | 2013-09-24 | 2016-10-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods of use of secretory IgA |
| KR102337927B1 (ko) | 2014-04-03 | 2021-12-14 | 체에스엘 베링 아게 | 면역글로불린의 분무 |
| RU2599029C1 (ru) * | 2015-07-16 | 2016-10-10 | Игорь Геннадьевич Ковшик | Химерный иммуноглобулиновый препарат, обладающий специфическим противовирусным или антибактериальным действием |
| WO2017157850A1 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Biotest Ag | Treatment of severe community acquired pneumonia |
| US10829542B2 (en) | 2016-12-20 | 2020-11-10 | Csl Behring Ag | Methods for affecting Salmonella infections |
| MX2020003201A (es) | 2017-09-21 | 2020-08-13 | Umc Utrecht Holding Bv | Anticuerpo anti-gd2 para el tratamiento del neuroblastoma. |
| CN110724176B (zh) * | 2018-07-16 | 2021-10-26 | 北京豪思生物科技有限公司 | 一种治疗阿尔茨海默症的血浆蛋白分离物及其制备方法和应用 |
| KR102875179B1 (ko) | 2018-11-30 | 2025-10-23 | 체에스엘 베링 아게 | 폴리클로날 면역글로불린을 사용한 급성 악화를 예방하거나 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
| CA3131705A1 (en) | 2019-03-27 | 2020-10-01 | Umc Utrecht Holding B.V. | Engineered iga antibodies and methods of use |
| US20240092940A1 (en) * | 2022-09-21 | 2024-03-21 | Michael R. Simon | Treatment of necrotizing enterocolitis with semisynthetic polyclonal human secretory immunoglobin a |
| US20250326821A1 (en) * | 2023-01-13 | 2025-10-23 | Michael R. Simon | PROCESS FOR PREPARATION OF SECRETORY IgA AND SECRETORY IgM AND USE THEREOF FOR TREATING NECROTIZING ENTEROCOLITIS |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU745523A1 (ru) * | 1978-06-15 | 1980-07-05 | Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа | Способ профилактики и лечени острых респираторных заболеваний вирусной этиологии |
| EP0839915A1 (en) * | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Institut Suisse De Recherches Experimentales Sur Le Cancer Isrec | Secretory immunoglobulin A as a mucosal vaccine delivery system |
Family Cites Families (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4703004A (en) | 1984-01-24 | 1987-10-27 | Immunex Corporation | Synthesis of protein with an identification peptide |
| US5500345A (en) | 1989-04-25 | 1996-03-19 | Iatron Laboratories, Inc. | Hybridomas producing monoclonal antibodies specific for C-reactive protein and methods for detection of C-reactive protein |
| DE3927111C3 (de) | 1989-08-17 | 1994-09-01 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung nicht modifizierter intravenös verabreichbarer IgM- und/oderIgA-haltiger Immunglobulinpräparate |
| US5258177A (en) | 1991-12-10 | 1993-11-02 | Alpha Therapeutic Corporation | IgA preparation and process of making the same |
| FR2706466B1 (fr) | 1993-06-14 | 1995-08-25 | Aetsrn | Concentré d'immunoglobulines G à usage thérapeutique et procédé de production dudit concentré. |
| CN1132516A (zh) | 1993-07-30 | 1996-10-02 | 奥拉维克斯公司 | 抗呼吸道合胞体病毒的单克隆IgA抗体 |
| JPH10505358A (ja) | 1994-09-06 | 1998-05-26 | ギャラゲン・インコーポレイテッド | クロストリジウム・ディフィシル関連疾患の治療処置 |
| DE19600939C1 (de) | 1996-01-12 | 1997-08-28 | Immuno Ag | Verfahren zur Trennung von IgG und IgA |
| WO1998057993A1 (en) * | 1997-06-19 | 1998-12-23 | The Regents Of The University Of California | Secretory immunoglobulin produced by single cells and methods for making and using same |
| US5886154A (en) | 1997-06-20 | 1999-03-23 | Lebing; Wytold R. | Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies |
| US20020114802A1 (en) * | 1998-02-10 | 2002-08-22 | Tjellstrom Bo Arthur Einar | Oral immunoglobulin treatment for inflammatory bowel disease |
| PL196770B1 (pl) | 1998-06-09 | 2008-01-31 | Statens Seruminstitut | Sposób oczyszczania immunoglobuliny, produkt immunoglobuliny i jego zastosowanie |
| JP2000103800A (ja) | 1998-09-29 | 2000-04-11 | Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd | 免疫グロブリンａの精製方法 |
| AUPP806999A0 (en) | 1999-01-08 | 1999-02-04 | Csl Limited | Process for purifying immunoglobulins |
| EP1068871A1 (en) | 1999-07-07 | 2001-01-17 | Jean-Paul Perraudin | Novel methods and medicament for treating infections diseases involving microbial biofilms |
| US6974573B2 (en) | 1999-11-01 | 2005-12-13 | Mucovax Holdings, B.V. | Antibody production in farm animals |
| AU2234801A (en) | 1999-12-13 | 2002-04-29 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Immunoenzymatic quantification method |
| US6696620B2 (en) | 2000-05-02 | 2004-02-24 | Epicyte Pharmaceutical, Inc. | Immunoglobulin binding protein arrays in eukaryotic cells |
| EP1370588A2 (en) | 2001-02-12 | 2003-12-17 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies to fc alpha receptor (cd89) |
| US6932967B2 (en) | 2001-03-22 | 2005-08-23 | Michael R. Simon | Human medical treatment by aerosol inhalation of immunoglobulin A |
| FR2824568B1 (fr) * | 2001-05-11 | 2004-04-09 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique |
| US20060165675A1 (en) | 2002-08-02 | 2006-07-27 | Richman-Eisenstat Janice Beth | Modulation of mesenchymal cells via iga-receptors |
| JP4762904B2 (ja) | 2003-11-13 | 2011-08-31 | ハンミ ホールディングス カンパニー リミテッド | 免疫グロブリン不変領域の量産方法 |
| US8709413B2 (en) | 2006-12-13 | 2014-04-29 | Michael R. Simon | Treatment of celiac disease with IgA |
| US8021645B2 (en) | 2006-12-13 | 2011-09-20 | Simon Michael R | Synthesis of human secretory IgA and IgM and the formation of a medicament therefrom |
| US8313730B2 (en) | 2006-12-13 | 2012-11-20 | Michael R. Simon | Treatment of celiac disease with IgA |
| US7794721B2 (en) * | 2006-12-13 | 2010-09-14 | Simon Michael R | Synthesis of human secretory IgM and the treatment of clostridium difficile associated diseases herewith |
| US7597891B2 (en) * | 2006-12-13 | 2009-10-06 | Simon Michael R | Synthesis of human secretory IgA for the treatment of Clostridium difficile associated diseases |
| US8119104B2 (en) | 2006-12-13 | 2012-02-21 | Michael R. Simon | Treatment of celiac disease with IgA |
| US20080145420A1 (en) | 2006-12-13 | 2008-06-19 | Simon Michael R | HUMAN SECRETORY IgA FOR THE TREATMENT OF CLOSTRIDIUM DIFFICILE ASSOCIATED DISEASES |
| EP2244735A4 (en) | 2007-10-02 | 2011-02-23 | Avaxia Biologics Inc | ANTIBODY THERAPY FOR USE IN THE DIGESTIVE TUBE |
| CN102124027B (zh) | 2008-05-15 | 2015-01-21 | 温氏健康有限公司 | 产生富含分泌型免疫球蛋白的乳组分的方法 |
| GB201006753D0 (en) * | 2010-04-22 | 2010-06-09 | Biotest Ag | Process for preparing an immunolobulin composition |
| JP5753998B2 (ja) | 2010-11-02 | 2015-07-22 | 国立大学法人三重大学 | ウレタン硬化性組成物、その硬化体、キットおよび硬化体の製造方法 |
| EP2465536A1 (en) | 2010-12-14 | 2012-06-20 | CSL Behring AG | CD89 activation in therapy |
| SG11201400916XA (en) | 2011-08-22 | 2014-06-27 | Cangene Corp | Clostridium difficile antibodies |
| WO2013122834A1 (en) | 2012-02-14 | 2013-08-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | REDUCING pH EXCURSIONS IN ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY |
| EP2636684A1 (en) | 2012-03-09 | 2013-09-11 | CSL Behring AG | Prevention of infection |
| WO2013132052A1 (en) | 2012-03-09 | 2013-09-12 | Csl Behring Ag | Compositions comprising secretory - like immunoglobulins |
| EP2636681A1 (en) | 2012-03-09 | 2013-09-11 | CSL Behring AG | Process for enriching IgA |
| EP2636683A1 (en) | 2012-03-09 | 2013-09-11 | CSL Behring AG | Treatment of mucositis with Immunoglobulin |
| US9150645B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-10-06 | Abbvie, Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
-
2013
- 2013-03-08 WO PCT/EP2013/054697 patent/WO2013132052A1/en not_active Ceased
- 2013-03-08 CN CN201380013073.8A patent/CN104254542A/zh active Pending
- 2013-03-08 ES ES13708786T patent/ES2751976T3/es active Active
- 2013-03-08 NZ NZ629072A patent/NZ629072A/en not_active IP Right Cessation
- 2013-03-08 RU RU2014140744A patent/RU2644240C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-03-08 PL PL13708786T patent/PL2822967T3/pl unknown
- 2013-03-08 US US14/380,521 patent/US10221233B2/en active Active
- 2013-03-08 JP JP2014560387A patent/JP2015510875A/ja active Pending
- 2013-03-08 CN CN201911079922.5A patent/CN111116735A/zh active Pending
- 2013-03-08 EP EP13708786.2A patent/EP2822967B1/en active Active
- 2013-03-08 DK DK13708786.2T patent/DK2822967T3/da active
- 2013-03-08 BR BR112014022240A patent/BR112014022240A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-03-08 AU AU2013201393A patent/AU2013201393B2/en active Active
- 2013-03-08 CA CA2866634A patent/CA2866634C/en active Active
- 2013-03-08 SG SG11201404958SA patent/SG11201404958SA/en unknown
- 2013-03-08 KR KR1020147028261A patent/KR102142261B1/ko active Active
- 2013-03-08 MX MX2014010754A patent/MX360245B/es active IP Right Grant
-
2014
- 2014-09-03 US US14/476,559 patent/US10385117B2/en active Active
- 2014-09-03 IL IL234449A patent/IL234449B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-10-31 JP JP2018204590A patent/JP2019038834A/ja active Pending
-
2019
- 2019-05-02 US US16/401,322 patent/US11623948B2/en active Active
-
2020
- 2020-11-20 JP JP2020192922A patent/JP7575920B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU745523A1 (ru) * | 1978-06-15 | 1980-07-05 | Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа | Способ профилактики и лечени острых респираторных заболеваний вирусной этиологии |
| EP0839915A1 (en) * | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Institut Suisse De Recherches Experimentales Sur Le Cancer Isrec | Secretory immunoglobulin A as a mucosal vaccine delivery system |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ARMELLE PHALIPON и др. Secretory component: a new role in secretory IgA-mediated immune exclusion in vivo, Immunity. v. 17, p. 107-115, 2002. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2644240C2 (ru) | Композиции, содержащие секреторноподобные иммуноглобулины | |
| AU2023216791A1 (en) | Antibodies with improved stability to intestinal digestion | |
| US20100330070A1 (en) | Methods Of Making An Antibody And Compositions Thereof | |
| JP2922955B2 (ja) | トロンビン阻害因子に特異的なモノクローナル抗体 | |
| WO2015158851A1 (en) | Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes | |
| CN102070718A (zh) | 人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10多克隆抗体 | |
| WO2024027771A1 (zh) | 靶向FAP和TGFβ的抗体融合蛋白及其用途 | |
| AU2015258242A1 (en) | Compositions | |
| HK1204628B (en) | Compositions comprising secretory - like immunoglobulins | |
| EP2636682A1 (en) | Compositions comprising secretory-like immunoglobulins | |
| CN112513075A (zh) | 用多克隆抗TNFα抗体治疗直肠炎的疗法 | |
| Griffiths | The development and preclinical assessment of ovine anti-TNF-α polyclonal antibodies for the oral treatment of inflammatory bowel disease | |
| JP4256497B2 (ja) | 血管炎治療剤 | |
| WO2018226493A1 (en) | Purified human antibody binding the microbial heparin binding motif and method of using | |
| JP2022537031A (ja) | プロテアーゼネキシン－１に対する立体構造的な単一ドメイン抗体及びその使用 | |
| CN118742563A (zh) | 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体 | |
| US20050090447A1 (en) | Peptides that promote complement activation | |
| KR20210158693A (ko) | 항 ｐｃｓｋ９ 항체 및 이의 용도 | |
| US20120121605A1 (en) | Anti sulfatides and anti sufated proteoglycans antibodies and their use | |
| HK1168362B (en) | Antibodies that recognize sulphatides and sulphated proteoglycans and the use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210309 |