RU2642988C2 - Супрессия опухолей с использованием полученных из плаценты человека промежуточных естественных киллерных клеток и иммуномодулирующих соединений - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины. Группа изобретений раскрывает способ лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, предусматривающий введение указанному индивидууму выделенных естественных киллерных клеток, содержащих выделенные CD56⁺CD16^-CD3^- естественные киллерные клетки, происходящие из плаценты, способ лечения индивидуума, страдающего вирусной инфекцией, предусматривающий введение указанному индивидууму выделенных естественных киллерных клеток, содержащих выделенные CD56⁺CD16^-CD3^- естественные киллерные клетки, происходящие из плаценты, а также применение данных клеток для создания фармацевтической композиции. Группа изобретений эффективна в лечении опухолевых и вирусных заболеваний. 4 н. и 32 з.п. ф-лы, 12 ил., 20 табл., 8 пр.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с номером 61/163449, поданной 25 марта 2009 г., полное содержание которой, таким образом, приведено в качестве ссылки.

1. ОБЛАСТЬ

В настоящем документе представлены способы лечения вирусных инфекций и злокачественных опухолей, например, злокачественных опухолей клеток крови и солидных опухолей, и супрессии роста или пролиферации злокачественных опухолей, например, клеток опухолей, с использованием выделенных естественных киллерных клеток из любого источника, например, естественных киллерных клеток из плаценты или других тканей. В конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки используют в сочетании с одним или несколькими иммуномодулирующими соединениями, или после обработки одним или несколькими иммуномодулирующими соединениями, например, иммуномодулирующими соединениями, обозначенными IMiDs™.

2. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перфузат плаценты содержит набор клеток плаценты, полученных пропусканием раствора для перфузии через сосудистую систему плаценты и сбором перфузионной жидкости из сосудистой системы, с материнской стороны плаценты, или с обеих сторон. Способы перфузии плацент млекопитающих описаны, например, в Патенте США No. 7045148 и Патенте США No. 7255879. Популяция клеток плаценты, полученных перфузией, является гетерогенной, содержащей гематопоэтические (CD34⁺) клетки, ядросодержащие клетки, такие как гранулоциты, моноциты и макрофаги, небольшой процент (менее 1%) плацентарных стволовых клеток, адгерентных по отношению к субстрату для культивирования клеток, и естественные киллерные клетки.

Естественные киллерные (NK) клетки представляют собой цитотоксические лимфоциты, составляющие главный компонент врожденной иммунной системы. NK-клетки не экспрессируют T-клеточные рецепторы антигена (TCR), CD3 или B-клеточный рецептор с поверхностными иммуноглобулинами (Ig), но обычно экспрессируют поверхностные маркеры CD16 (FcγRIII) и CD56 у человека. NK-клетки являются цитотоксическими; небольшие гранулы в их цитоплазме содержат специальные белки, такие как перфорин, и протеазы, известные как гранзимы. При высвобождении в непосредственной близости от клетки, подлежащей уничтожению, перфорин образует поры в клеточной мембране клетки-мишени, через которые могут проникать гранзимы и связанные молекулы, индуцирующие апоптоз. Один из гранзимов, гранзим B (известный также как гранзим 2 и связанная с цитотоксическими T-лимфоцитами серинэстераза 1), представляет собой сериновую протеазу, критическую для быстрой индукции направленного апоптоза клеток при опосредованном клетками иммунном ответе.

NK-клетки активируются в ответ на интерфероны или происходящие из макрофагов цитокины. Активированные NK-клетки обозначают как активированные лимфокинами клетки-киллеры (LAK). NK-клетки обладают двумя типами поверхностных рецепторов, обозначенными «активирующие рецепторы» и «ингибирующие рецепторы», контролирующими цитотоксическую активность клеток.

Среди других видов активности, NK-клетки играют роль в отторжении опухолей хозяином. Поскольку в клетках злокачественных опухолей экспрессия MHC класса I уменьшена или отсутствует, они могут становиться мишенями для NK-клеток. Накопленные клинические данные позволяют предполагать, что гаплоидентичная трансплантация NK-клеток человека, выделенных из PBMC или костного мозга, может помогать предотвращать бластный криз после трансплантации костного мозга в отсутствие вызова поддающейся детекции реакции трансплантат против хозяина (GVHD). Смотри Ruggeri et al., Science 295:2097-2100 (2002)). Естественные киллерные клетки могут активироваться клетками, в которых отсутствуют или присутствуют на низких уровнях белки главного комплекса гистосовместимости (MHC). Активированные и размноженные NK-клетки и клетки LAK использовали как для терапии ex vivo, так и для лечения in vivo пациентов со злокачественными опухолями на поздних стадиях, с некоторой долей успеха против связанных с костным мозгом заболеваний, таких как лейкоз; рак молочной железы; и конкретные типы лимфомы. При лечении клетками LAK необходимо сначала вводить пациенту IL-2, с последующим лейкаферезом и затем инкубацией и культивированием собранных аутологичных клеток крови ex vivo в присутствии IL-2 в течение нескольких суток. Клетки LAK необходимо вводить посредством реинфузии вместе с относительно высокими дозами IL-2 для завершения терапии. Это очищающее лечение является дорогостоящим и может вызывать тяжелые побочные эффекты. Они включают в себя задержку жидкости, отек легких, падение кровяного давления и высокую температуру.

Несмотря на свойства NK-клеток, дающие преимущества для уничтожения клеток опухолей и инфицированных вирусом клеток, остаются трудности в работе с ними и в их использовании для иммунотерапии, в первую очередь из-за сложности поддержания их нацеленности на опухоли и туморицидных способностей во время культивирования и размножения. Таким образом, в данной области существует необходимость в готовых к поставке естественных киллерных клетках.

3. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе представлены способы использования перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты, естественных киллерных клеток из любого источника, например, естественных киллерных клеток из перфузата плаценты, естественных киллерных клеток, полученных расщеплением ткани плаценты, или естественных киллерных клеток из другой ткани-источника, для супрессии пролиферации клеток опухоли, лечения вирусной инфекции или лечения злокачественных опухолей, например, злокачественных опухолей клеток крови и/или солидных опухолей. В конкретных вариантах осуществления клетки используют в сочетании с иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом.

В одном из аспектов в настоящем документе представлен способ лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, предусматривающий введение указанному индивидууму эффективного количества выделенных естественных киллерных клеток. В конкретном варианте осуществления выделенные естественные киллерные клетки обрабатывают, например, приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом, до указанного введения. В другом конкретном варианте осуществления выделенные естественные киллерные клетки не обрабатывают, например, не приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением, например, аминозамещенным талидомидом и/или соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом, до указанного введения. В другом конкретном варианте осуществления способ, кроме того, включает в себя дополнительное введение индивидууму эффективного количества иммуномодулирующего соединения или талидомида. «Эффективное количество» в этом контексте обозначает количество естественных киллерных клеток, и, необязательно, иммуномодулирующего соединения или талидомида, приводящее к поддающемуся детекции улучшению одного или нескольких симптомов указанной злокачественной опухоли или указанной вирусной инфекции, по сравнению с индивидуумом, страдающим от указанной злокачественной опухоли или указанной вирусной инфекции, которому не вводили указанные естественные киллерные клетки и, необязательно, указанное иммуномодулирующее соединение или талидомид. В конкретных вариантах осуществления указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой леналидомид или помалидомид. В другом варианте осуществления указанная злокачественная опухоль представляет собой солидную опухоль. В другом варианте осуществления указанная злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль клеток крови. В конкретных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой первичную карциному протоков, лейкоз, острый T-клеточный лейкоз, хроническую миелоидную лимфому (CML), острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз (CML), карциному легкого, аденокарциному толстой кишки, гистиоцитарную лимфому, колоректальную карциному, колоректальную аденокарциному или ретинобластому. В другом варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки включают промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK) CD56⁺,CD16^-. В более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки представляют собой CD56⁺,CD16^- промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK) или в основном состоят из них. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки представляют собой естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки получены из пуповинной крови или периферической крови. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты (например, PINK-клетки), и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови. В более конкретном варианте осуществления указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, отличной от плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки и указанное иммуномодулирующее соединение или талидомид вводят указанному индивидууму по отдельности. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки и указанное иммуномодулирующее соединение или талидомид вводят указанному индивидууму вместе, например, в одном и том же составе или в отдельных составах, но в одно и то же время. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты, и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови. В более конкретном варианте осуществления, указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, отличной от плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки не культивируют перед указанным введением. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки культивируют перед указанным введением.

Другой аспект, представленный в настоящем документе, относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, предусматривающему введение указанному индивидууму эффективного количества выделенных клеток перфузата плаценты, например, клеток перфузата плаценты, содержащих естественные киллерные клетки. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки перфузата плаценты предварительно обрабатывают иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя введение указанному индивидууму эффективного количества иммуномодулирующего соединения или талидомида. «Эффективное количество» в этом контексте обозначает количество клеток перфузата плаценты и, необязательно, иммуномодулирующего соединения или талидомида, приводящее к поддающемуся детекции улучшению одного или нескольких симптомов указанной злокачественной опухоли или указанной вирусной инфекции, по сравнению с индивидуумом, страдающим от указанной злокачественной опухоли или указанной вирусной инфекции, которому не вводили указанные клетки перфузата плаценты, и, необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид. В более конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты предварительно обрабатывают иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом более конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты предварительно не обрабатывают иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом более конкретном варианте осуществления указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой леналидомид или помалидомид. В другом варианте осуществления указанная злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль клеток крови. В конкретном варианте осуществления указанная злокачественная опухоль представляет собой первичную карциному протоков, лейкоз, острый T-клеточный лейкоз, хроническую миелоидную лимфому (CML), острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз (CML), карциному легкого, аденокарциному толстой кишки, гистиоцитарную лимфому, колоректальную карциному, колоректальную аденокарциному или ретинобластому. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты содержат естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки содержат промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK) CD56⁺,CD16^-, в основном состоят из промежуточных естественных киллерных клеток плаценты (PINK) CD56⁺,CD16^- или представляют собой промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK) CD56⁺,CD16^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки получают из пуповинной крови или периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты перед указанным введением приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки в указанных клетках перфузата плаценты приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима B или мРНК, кодирующей гранзим B, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом.

В одном из аспектов в настоящем документе представлен способ супрессии пролиферации клеток опухолей, предусматривающий приведение клеток опухолей в контакт с эффективным количеством выделенных естественных киллерных клеток. В конкретном варианте осуществления выделенные естественные киллерные клетки предварительно обрабатывают иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления клетки опухолей, кроме того, приводят в контакт с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения или талидомида. «Эффективное количество» в этом контексте обозначает количество естественных киллерных клеток, и, необязательно, иммуномодулирующего соединения или талидомида, приводящее к поддающейся детекции супрессии указанных клеток опухолей по сравнению с эквивалентным количеством клеток опухолей, не приведенных в контакт с указанными естественными киллерными клетками, и необязательно, иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки предварительно обрабатывают иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом более конкретном варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки предварительно не обрабатывают иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В конкретном варианте осуществления этого способа клетки опухолей представляют собой клетки злокачественных опухолей клеток крови. В другом конкретном варианте осуществления клетки опухолей представляют собой клетки солидных опухолей. В другом конкретном варианте осуществления клетки опухолей представляют собой клетки солидных опухолей. В другом варианте осуществления клетка опухоли представляет собой клетку первичной карциномы протоков, клетку лейкоза, клетку острого T-клеточного лейкоза, клетку хронической миелоидной лимфомы (CML), клетку острого миелогенного лейкоза, клетку хронического миелогенного лейкоза (CML), клетку карциномы легкого, клетку аденокарциномы толстой кишки, клетку гистиоцитарной лимфомы, клетку множественной миеломы, клетку ретинобластомы, клетку колоректальной карциномы или клетку колоректальной аденокарциномы. В другом конкретном варианте осуществления указанный контакт происходит in vitro. В другом конкретном варианте осуществления, указанный контакт происходит in vivo. В более конкретном варианте осуществления указанный контакт in vivo происходит у человека. В другом варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки содержат промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK) CD56⁺,CD16^-. В более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки представляют собой промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK) CD56⁺,CD16^-. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки получены из пуповинной крови или периферической крови. В другом более конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты, и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови. В более конкретном варианте осуществления указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, отличной от плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

В одном из аспектов в настоящем документе представлен способ супрессии пролиферации клеток опухолей in vivo или in vitro, включающий в себя приведение клеток опухолей в контакт с эффективным количеством выделенных клеток перфузата плаценты, например, клеток перфузата плаценты, содержащих естественные киллерные клетки плаценты. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки перфузата плаценты предварительно обрабатывают иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя приведение клеток опухолей в контакт с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения или талидомида. «Эффективное количество» в этом контексте обозначает количество клеток перфузата плаценты и, необязательно, иммуномодулирующего соединения или талидомида, приводящее к поддающейся детекции супрессии указанных клеток опухолей по сравнению с эквивалентным количеством клеток опухолей, не приведенных в контакт с указанными клетками перфузата плаценты, и, необязательно, иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В более конкретном варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки предварительно обрабатывают иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом более конкретном варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки предварительно не обрабатывают иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В одном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты представляют собой или содержат общие ядросодержащие клетки из перфузата плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанный перфузат плаценты или клетки перфузата плаценты, например, общие ядросодержащие клетки из перфузата плаценты, обрабатывают для удаления по меньшей мере одного типа клеток. В другом конкретном варианте осуществления, указанный контакт происходит in vitro. В другом конкретном варианте осуществления указанный контакт происходит in vivo. В более конкретном варианте осуществления указанный контакт in vivo происходит у млекопитающего, например, у человека. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты обрабатывают для обогащения по меньшей мере одним типом клеток, например, CD56⁺ клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты представляют собой CD56⁺ клетки плаценты. В более конкретном варианте осуществления CD56⁺ клетки представляют собой естественные киллерные клетки CD56⁺CD16^-, например, промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK), например, полученные из клеток перфузата плаценты или клеток плаценты, полученных механическим или ферментативным разрушением ткани плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные CD56⁺ клетки отбирают посредством CD56-конъюгированных микробусин. В другом конкретном варианте осуществления указанные CD56⁺ клетки содержат клетки с поддающейся детекции более низкой экспрессией NKG2D, NKp46 или CD94, как определено, например, проточной цитометрией, чем эквивалентное количество CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток. В другом конкретном варианте осуществления PINK-клетки являются CD3^-. В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере 50% клеток в указанных клетках перфузата плаценты представляют собой указанные CD56⁺ клетки. В более конкретном варианте осуществления, где CD56⁺ клетки составляют по меньшей мере 50% указанных клеток перфузата плаценты, клетки опухолей представляют собой клетки первичной карциномы протоков, клетки лейкоза, клетки острого T-клеточного лейкоза, клетки хронической миелоидной лимфомы (CML), клетки острого миелогенного лейкоза, клетки хронического миелогенного лейкоза (CML), клетки карциномы легкого, клетки аденокарциномы толстой кишки, клетки гистиоцитарной лимфомы, клетки множественной миеломы, клетки ретинобластомы, клетки колоректальной карциномы или клетки колоректальной аденокарциномы. В конкретных вариантах осуществления указанный контакт представляет собой контакт in vitro. В другом варианте осуществления указанный контакт представляет собой контакт in vivo, например, у млекопитающего, например, человека.

В конкретном варианте осуществления вышеуказанных способов с использованием перфузата плаценты или клеток из перфузата плаценты указанный перфузат плаценты представляет собой перфузат, пропущенный через сосудистую систему плаценты, например, только через сосудистую систему плаценты. В другом конкретном варианте осуществления, указанный перфузат плаценты пропущен через сосудистую систему плаценты и собран с материнской стороны плаценты. В другом конкретном варианте осуществления все или по существу все (например, более 90%, 95%, 98% или 99%) клетки в указанном перфузате плаценты представляют собой эмбриональные клетки. В другом конкретном варианте осуществления перфузат плаценты содержит эмбриональные и материнские клетки. В более конкретном варианте осуществления эмбриональные клетки в указанном перфузате плаценты составляют менее приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50% клеток в указанном перфузате. В другом конкретном варианте осуществления указанный перфузат получен пропусканием раствора 0,9% NaCl через сосудистую систему плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанный перфузат содержит культуральную среду. В другом конкретном варианте осуществления указанный перфузат обрабатывают для удаления эритроцитов.

В другом конкретном варианте осуществления вышеуказанных способов естественные киллерные клетки содержат клетки с поддающейся детекции более низкой экспрессией NKG2D, NKp46 или CD94, как определено, например, проточной цитометрией, чем эквивалентное количество CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки экспрессируют одну или несколько из микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a на поддающемся детекции более высоком уровне, чем естественные киллерные клетки периферической крови, как определено, например, посредством количественной ПЦР с детекцией в реальном времени (qRT-PCR). В другом варианте осуществления естественные киллерные клетки не экспрессируют микроРНК hsa-miR-199b или экспрессируют микроРНК hsa-miR-199b на поддающемся детекции более низком уровне, чем естественные киллерные клетки периферической крови.

В другом конкретном варианте осуществления вышеуказанных способов, указанные естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима B или перфорина, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки обладали поддающейся детекции большей цитотоксичностью по отношению к указанным клеткам опухолей, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением, например, леналидомидом или помалидомидом или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, экспрессируют один или несколько из BAX, CCL5, CCR5, CSF2, FAS, GUSB, IL2RA или TNFRSF18 на более высоком уровне, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, экспрессируют один или несколько из ACTB, BAX, CCL2, CCL3, CCL5, CCR5, CSF1, CSF2, ECE1, FAS, GNLY, GUSB, GZMB, IL1A, IL2RA, IL8, IL10, LTA, PRF1, PTGS2, SKI и TBX21 на более высоком уровне, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом.

В конкретных вариантах осуществления вышеуказанных способов лечения или супрессии опухолей, естественные киллерные клетки из плаценты комбинируют с естественными киллерными клетками из пуповинной крови для получения комбинированных естественных киллерных клеток. Как применяют в настоящем документе, фраза «естественная киллерная клетка(и) из плаценты» не включает в себя естественные киллерные клетки из пуповинной крови или плацентарной крови. В более конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки из плаценты комбинируют с естественными киллерными клетками из другого источника в соотношении приблизительно 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100 или т.п.

В других конкретных вариантах осуществления вышеуказанных способов комбинированные естественные киллерные клетки не культивируют, и они содержат: поддающееся детекции большее количество естественных киллерных клеток CD3^-CD56⁺CD16^-, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции меньшее количество естественных киллерных клеток CD3^-CD56⁺CD16⁺, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺2B4⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; или поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD94⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В других конкретных вариантах осуществления комбинированные естественные киллерные клетки культивируют, и они содержат: поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp44⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

В конкретном варианте осуществления любого из вышеуказанных способов клетка опухоли представляет собой клетку солидной опухоли. В другом конкретном варианте осуществления клетка опухоли представляет собой клетку жидкой опухоли, например, клетку опухоли клеток крови. В более конкретных вариантах осуществления клетка опухоли представляет собой клетку первичной карциномы протоков, клетку лейкоза, клетку острого T-клеточного лейкоза, клетку хронической миелоидной лимфомы (CML), клетку острого миелогенного лейкоза, клетку хронического миелогенного лейкоза (CML), клетку карциномы легкого, клетку аденокарциномы толстой кишки, клетку гистиоцитарной лимфомы, клетку множественной миеломы, клетку ретинобластомы, клетку колоректальной карциномы или клетку колоректальной аденокарциномы.

Другой аспект в настоящем документе относится к композиции, содержащей выделенные естественные киллерные клетки плаценты CD56⁺,CD16^-, например, PINK-клетки. В конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки плаценты выделены из перфузата плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки плаценты выделены из плаценты посредством физического разрушения и/или ферментативного расщепления ткани плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки составляют по меньшей мере 50% клеток в композиции. В конкретном варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки составляют по меньшей мере 80% клеток в композиции. В другом конкретном варианте осуществления указанная композиция содержит выделенные CD56⁺,CD16⁺ естественные киллерные клетки. В более конкретном варианте осуществления указанные CD56⁺,CD16⁺ естественные киллерные клетки происходят от другого индивидуума, чем указанные CD56⁺,CD16^- естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD56⁺,CD16^- естественные киллерные клетки происходят от одного индивидуума. В более конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD56⁺,CD16^- естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки по меньшей мере от двух различных индивидуумов. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки плаценты, например, указанные PINK-клетки, размножают. В другом конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима B или перфорина, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления указанная композиция дополнительно содержит иммуномодулирующее соединение или талидомид.

В более конкретном варианте осуществления композиция содержит естественные киллерные клетки плаценты и естественные киллерные клетки из другого источника. В конкретном варианте осуществления указанный другой источник представляет собой плацентарную кровь и/или пуповинную кровь. В другом конкретном варианте осуществления указанный другой источник представляет собой периферическую кровь. В более конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки из плаценты комбинируют с естественными киллерными клетками из другого источника в соотношении приблизительно 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100 или т.п.

В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит выделенный перфузат плаценты. В более конкретном варианте осуществления указанный перфузат плаценты происходит из того же индивидуума, что и указанные естественные киллерные клетки. В другом более конкретном варианте осуществления указанный перфузат плаценты содержит перфузат плаценты от другого индивидуума, чем указанные естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления, все, или по существу все (например, более 90%, 95%, 98% или 99%) клетки в указанном перфузате плаценты представляют собой эмбриональные клетки. В другом конкретном варианте осуществления перфузат плаценты содержит эмбриональные и материнские клетки. В более конкретном варианте осуществления эмбриональные клетки в указанном перфузате плаценты составляют менее приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50% клеток в указанном перфузате. В другом конкретном варианте осуществления, указанный перфузат получен пропусканием раствора 0,9% NaCl через сосудистую систему плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанный перфузат содержит культуральную среду. В другом конкретном варианте осуществления указанный перфузат обрабатывают для удаления эритроцитов. В другом конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит иммуномодулирующее соединение.

В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит клетки перфузата плаценты. В более конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты происходят из того же индивидуума, что и указанные естественные киллерные клетки. В другом более конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты происходят от другого индивидуума, чем указанные естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит выделенный перфузат плаценты и выделенные клетки перфузата плаценты, где указанный выделенный перфузат и указанные выделенные клетки перфузата плаценты происходят из различных индивидуумов. В другом более конкретном варианте осуществления любого из вышеуказанных вариантов осуществления, включающего в себя перфузат плаценты, указанный перфузат плаценты содержит перфузат плаценты по меньшей мере от двух индивидуумов. В другом более конкретном варианте осуществления любого из вышеуказанных вариантов осуществления, включающего в себя клетки перфузата плаценты, указанные выделенные клетки перфузата плаценты происходят по меньшей мере от двух индивидуумов. Композиция может дополнительно содержать выделенные PINK-клетки, где PINK-клетки происходят от другого индивидуума, чем указанный перфузат плаценты или указанные клетки перфузата. В другом конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит иммуномодулирующее соединение или талидомид.

3.1. Определения

Как используют в настоящем документе, «комбинированные естественные киллерные клетки» представляют собой естественные киллерные клетки из пуповинной крови и перфузата плаценты. В конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки происходят из совпадающих пуповинной крови и перфузата плаценты человека, где перфузат плаценты получен из той же самой плаценты, что и пуповинная кровь. Естественные киллерные клетки из перфузата плаценты и пуповинной крови выделяют отдельно или в одно и то же время, и комбинируют.

Как используют в настоящем документе, термины «иммуномодулирующее соединение» и «IMiD» не включают в себя талидомид.

Как используют в настоящем документе, «леналидомид» обозначает 3-(4'-аминоизоиндолин-1’-он)-1-пиперидин-2,6-дион (наименование Химической реферативной службы) или 2,6-пиперидиндион,3-(4-амино-1,3-дигидро-1-оксо-2H-изоиндол-2-ил)- (наименование Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC)).

Как используют в настоящем документе, «мультипотентный», по отношении к клетке, означает, что клетка обладает способностью к дифференцировке в клетку другого типа клеток. В конкретных вариантах осуществления «мультипотентная клетка» представляет собой клетку, обладающую способностью вырастать в любую подгруппу из приблизительно 260 типов клеток организма млекопитающих. В отличие от плюрипотентной клетки, мультипотентная клетка не обладает способностью образовывать все типы клеток.

Как используют в настоящем документе, «естественная киллерная клетка», без дополнительного уточнения, включает в себя естественные киллерные клетки из любой ткани-источника.

Как используют в настоящем документе, «PINK» и «PINK-клетки» относятся к типу естественных киллерных клеток, названных промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, полученных из плаценты человека, например, перфузата плаценты или ткани плаценты, механически и/или ферментативно разрушенных. Клетки являются CD56⁺ и CD16^-, например, как определено проточной цитометрией, например, активированной флуоресценцией сортировкой клеток с использованием антител против CD56 и CD16. PINK-клетки не получают из пуповинной крови или периферической крови. Клетки являются цитолитическими в анализе цитолитической активности, например, с использованием линии клеток опухоли, такой как клетки опухолей K562, в качестве клеток-мишеней.

Как используют в настоящем документе, «перфузат плаценты» обозначает перфузионный раствор, который пропускали по меньшей мере через часть плаценты, например, плаценты человека, например, через сосудистую систему плаценты, включая множество клеток, собранных посредством перфузионного раствора во время пропускания через плаценту.

Как используют в настоящем документе, «клетки перфузата плаценты» обозначают ядросодержащие клетки, например, общие ядросодержащие клетки, выделенные, или поддающиеся выделению из перфузата плаценты.

Как используют в настоящем документе, «помалидомид» обозначает 4-амино-2-[(3RS)-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1H-изоиндол-1,3-(2H)-дион.

Как используют в настоящем документе, «супрессия клеток опухоли», «супрессия пролиферации клеток опухоли» и т.п., включает в себя замедление роста популяции клеток опухолей, например, посредством уничтожения одной или нескольких клеток опухолей в указанной популяции клеток опухолей, например, посредством приведения популяции клеток опухолей в контакт с PINK-клетками, популяцией клеток, содержащей PINK-клетки, комбинированными естественными киллерными клетками, популяцией клеток, содержащей комбинированные естественные киллерные клетки, перфузатом плаценты человека или т.п.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На ФИГ. 1 показаны результаты проточной цитометрии с использованием анти-CD3 антител и анти-CD56 антител для клеток, отобранных посредством микробусин с CD56 из перфузата плаценты человека (HPP). Большинство выделенных клеток являются CD56⁺CD3^-.

На ФИГ. 2A и 2B показана продукция цитокинов PINK-клетками и/или клетками опухолей во время 24-часового культивирования. На ФИГ. 2A изображена секреция интерферона гамма (IFNγ) полученными из перфузата плаценты промежуточными естественными киллерными клетками (PINK) отдельно или в присутствии клеток опухолей KG-1a. PINK-клетки и клетки KG-1a культивировали по отдельности или в комбинации в соотношении 1:1. Ось Y: пикограмм IFNγ, продуцированного культурами. На ФИГ. 2B изображена секреция гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) PINK-клетками отдельно или в присутствии клеток опухолей KG-1a. PINK-клетки и клетки KG-1a культивировали отдельно или в комбинации в соотношении 1:1. Ось Y: пикограмм GM-CSF, продуцированного культурами.

На ФИГ. 3 показана цитотоксичность PINK-клеток по отношению к клеткам опухолей KG-1a при 24-часовом совместном культивировании в соотношении 1:1, 5:1, 10:1 или 20:1 PINK-клеток к клеткам опухолей. Ось X: соотношение PINK-клеток к клеткам опухолей. Ось Y: процент мертвых клеток опухолей по сравнению с клетками опухолей без PINK-клеток.

На ФИГ. 4 показана цитотоксичность NK-клеток плаценты и NK-клеток периферической крови (PB), культивированных в течение 21 суток, по отношению к клеткам K562. Планки погрешностей обозначают стандартное отклонение для 4 единиц NK-клеток плаценты или 3 единиц культивированных NK-клеток периферической крови.

На ФИГ. 5 показана цитотоксичность цельного перфузата плаценты человека, как получено из плаценты, по отношению к клеткам опухолей KG-1a при 24-часовом совместном культивировании в соотношении 1:1, 5:1, 10:1 или 20:1 или 100:1 клеток HPP к клеткам опухолей. Ось X: соотношение клеток HPP к клеткам опухолей. Ось Y: процент мертвых клеток опухолей по сравнению с клетками опухолей в отсутствие клеток HPP.

На ФИГ. 6 показана цитотоксичность цельного перфузата плаценты человека, как получено из плаценты, и пуповинной крови, по отношению к клеткам опухолей KG-1a при 48 часовом совместном культивировании в серийных разведениях 100:1, 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1, 3,12:1, 1,56:1 или 0,78:1 клеток HPP или клеток UCB к клеткам опухолей. Ось X: соотношение клеток HPP или клеток пуповины к клеткам опухолей. Ось Y: процент мертвых клеток опухолей после времени культивирования 48 часов по сравнению с клетками опухолей в отсутствие клеток HPP или клеток пуповины.

На ФИГ. 7 показана цитотоксичность цельного перфузата плаценты человека, как получено из плаценты, по отношению к клеткам опухолей KG-1a при 48 часовом совместном культивировании в серийных разведениях 100:1, 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1, 3,12:1, 1,56:1 или 0,78:1 клеток HPP к клеткам опухолей. Перфузат либо использовали, как собрано, либо стимулировали в течение 24 часов с помощью 100 Ед./мл или 1000 Ед./мл интерлейкина-2 (IL-2). Ось X: соотношение клеток HPP к клеткам опухолей. Ось Y: процент мертвых клеток опухолей после времени культивирования 48 часов по сравнению с клетками опухолей в отсутствие клеток HPP.

На ФИГ. 8A и 8B показан цитотоксический эффект перфузата плаценты человека по отношению к панели линий клеток опухолей после культивирования с клетками HPP или UCB в соотношении 50:1 к клеткам опухолей. ФИГ 8A: совместное культивирование в течение 24 часов. ФИГ. 8B: совместное культивирование в течение 48 часов. Ось X: тестированные линии клеток опухолей. Ось Y: процент мертвых клеток опухолей после совместного культивирования по сравнению с количеством клеток опухолей в отсутствие клеток опухолей.

На ФИГ. 9 показана продукция IFNγ клетками HPP после совместного культивирования с клетками опухолей KG-1a в различных соотношениях клеток HPP к клеткам опухолей. Ось X: Условия эксперимента, включая соотношение клеток HPP к клеткам опухолей Ось Y: Уровни IFNγ на миллилитр после 24 часов совместного культивирования.

ФИГ. 10A и 10B - продукция IFNγ клетками HPP или UCB при совместном культивировании с панелью клеток опухолей. Клетки HPP или UCB совместно культивировали в соотношении 50:1 с линиями клеток опухолей в течение 24 часов (ФИГ. 10A) или 48 часов (ФИГ. 10B). Уровни IFNγ определяли посредством анализа Luminex (HCYTO-60K-03, Millipore). Ось X: тестированные линии клеток опухолей. Ось Y: пикограмм IFNγ, продуцированного клетками HPP или UCB, по сравнению с пикограммами IFNγ, продуцированного в отсутствие клеток опухолей.

На ФИГ. 11 показано уменьшение размера опухоли при введении 2×10⁷ клеток перфузата плаценты человека (HPP) мышам с клетками опухолей KG-1 объемом приблизительно 332 мм³. Находящиеся внутри опухоли клетки HPP инъецировали непосредственно в участок подкожной опухоли. IV - клетки HPP, введенные внутривенно. Контроль - введение только носителя. Объемы опухолей в мм³.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем документе представлены способы использования перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты или естественных киллерных клеток, например, происходящих из плаценты естественных киллерных клеток («PINK»), полученных из плаценты, необязательно в сочетании с иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом, для лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью, или вирусной инфекцией, или для супрессии роста или пролиферации клетки опухоли или множества клеток опухолей. Естественные киллерные клетки можно получать из любого источника, в качестве неограничивающих примеров, из плаценты, пуповинной крови, плацентарной крови, периферической крови, селезенки, печени. Естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, могут быть аутологичными или гетерологичными для реципиента (например, индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или вирусной инфекцией), или могут происходить от того же самого индивидуума или от другого индивидуума, чем индивидуум, содержащий клетки опухолей, подлежащие супрессии. В конкретных вариантах осуществления описанных в настоящем документе способов используют естественные киллерные клетки (NK), выделенные из перфузата плаценты, например, перфузата плаценты человека, или NK-клетки, выделенные из ткани плаценты, разрушенной механически и/или ферментативно. Способы использования перфузата плаценты, происходящих из перфузата плаценты клеток или происходящих из перфузата плаценты естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток, для лечения индивидуумов, страдающих злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью, или вирусной инфекцией, или для супрессии пролиферации клеток опухолей, описаны в разделе 5.1, ниже. Способы получения перфузата плаценты и получения клеток из перфузата плаценты описаны в разделе 5.2, ниже. Способы получения естественных киллерных клеток плаценты посредством разрушения ткани плаценты описаны в разделе 5.3, ниже. Разрушение ткани плаценты описано в разделе 5.4, ниже. Характеристики естественных киллерных клеток плаценты описаны в разделе 5.5, ниже. Естественные киллерные клетки из совпадающих плаценты и пуповины описаны в разделе 5.6, ниже. Комбинации перфузата плаценты или клеток перфузата плаценты и других клеток, используемые в способах лечения или супрессии опухолей, описанных в настоящем документе, описаны в разделе 5.7, ниже. Хранение перфузата плаценты и клеток перфузата описано в разделе 5.8, ниже. Иммуномодулирующие соединения для использования в способах, описанных в настоящем документе, описаны в разделе 5.9, ниже. Введение клеток, используемых в способах, описанных в настоящем документе, описано в разделе 5.10, ниже.

5.1. Использование перфузата плаценты или естественных киллерных клеток и иммуномодулирующих соединений для лечения злокачественных опухолей или вирусной инфекции и супрессии роста клеток опухолей

Один из аспектов, представленных в настоящем документе, относится к способам супрессии роста, например, пролиферации, клеток опухолей, включающим в себя приведение клеток опухолей в контакт с эффективным количеством выделенного перфузата плаценты, выделенных клеток перфузата плаценты, выделенных естественных киллерных клеток, например, естественных киллерных клеток плаценты, например, происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток, выделенных комбинированных естественных киллерных клеток, и/или их сочетаний. Клетки опухолей могут представлять собой клетки опухолей in vitro, или могут представлять собой клетки опухолей in vivo, например, у млекопитающего, например, человека, страдающего злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью.

В настоящем документе представлены способы лечения индивидуума с дефицитом естественных киллерных клеток, например, с дефицитом абсолютного количества естественных киллерных клеток или с дефицитом количества функциональных естественных киллерных клеток. В конкретных вариантах осуществления дефицит естественных киллерных клеток у индивидуума связан с вирусной инфекцией, злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью, или приводит к ним у индивидуума. Однако, наличие вирусной инфекции или злокачественной опухоли у индивидуума может быть или не быть связанным с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток. В конкретном варианте осуществления указанный дефицит естественных киллерных клеток возникает по причине, связанной с указанной злокачественной опухолью или вирусной инфекцией. В другом варианте осуществления указанный дефицит естественных киллерных клеток возникает по причине, не связанной с указанной злокачественной опухолью или вирусной инфекцией.

5.1.1. Лечение злокачественных опухолей

Один из вариантов осуществления, представленных в настоящем документе, относится к способу лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью, например, индивидуума с дефицитом естественных киллерных клеток, включающему в себя введение указанному индивидууму эффективного количества выделенного перфузата плаценты, выделенных клеток перфузата плаценты, выделенных естественных киллерных клеток, например, естественных киллерных клеток плаценты, например, происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток, выделенных комбинированных естественных киллерных клеток, и/или их комбинаций. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя введение указанному индивидууму эффективного количества иммуномодулирующего соединения, например, иммуномодулирующего соединения, описанного в разделе 5.9, ниже, или талидомида, где указанное эффективное количество представляет собой количество, которое, например, приводит к поддающемуся детекции улучшению, уменьшению прогрессирования или прекращению одного или нескольких симптомов злокачественной опухоли, от которой страдает индивидуум.

В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой, например, лейкоз или лимфому. В более конкретных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой острый лейкоз, например, острый T-клеточный лейкоз, острый миелогенный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый мегакариобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз предшественников B-клеток, острый лимфобластный лейкоз предшественников T-клеток, лейкоз Беркитта (лимфому Беркитта), или острый бифенотипический лейкоз; хронический лейкоз, например, хроническую миелоидную лимфому, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический моноцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)/мелколимфоцитарную лимфому, или B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; волосатоклеточную лимфому; T-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; или лимфому, например, гистиоцитарную лимфому, лимфоплазматическую лимфому (например, макроглобулинемию Вальденстрема), лимфому маргинальной зоны селезенки, неоплазию плазматических клеток (например, миелому плазматических клеток, плазмацитому, болезнь накопления моноклональных иммуноглобулинов или заболевание тяжелых цепей), экстранодальную B-клеточную лимфому маргинальной зоны (MALT лимфому), нодальную B-клеточную лимфому маргинальной зоны (NMZL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную B-крупноклеточную лимфому, медиастинальную (тимическую) B-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую B-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, T-клеточный крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз, агрессивный NK-клеточный лейкоз, T-клеточный лейкоз взрослых/лимфому, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому назального типа, T-клеточную лимфому энтеропатического типа, печеночно-селезеночную T-клеточную лимфому, бластную NK-клеточную лимфому, фунгоидный микоз (синдром Сезари), первичное кожное лимфопролиферативное нарушение CD30-положительных T-клеток (например, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому или лимфоматоидный папулез), ангиоиммунобластную T-клеточную лимфому, неспецифическую периферическую T-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфому Ходжкина или нодулярную лимфому Ходжкина с лимфоидным преобладанием. В другом конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой множественную миелому или миелодиспластический синдром.

В конкретных вариантах осуществления индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью, например, индивидуум с дефицитом естественных киллерных клеток, представляет собой индивидуума, которому проводили трансплантацию костного мозга до указанного введения. В конкретных вариантах осуществления трансплантат костного мозга входил в лечение указанной злокачественной опухоли. В других конкретных вариантах осуществления трансплантат костного мозга входил в лечение состояния, отличного от указанной злокачественной опухоли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму вводили иммунодепрессант в дополнение к указанному трансплантату костного мозга. В конкретных вариантах осуществления у индивидуума, которому введен трансплантат костного мозга, на время указанного введения выявляют один или несколько симптомов реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD). В других конкретных вариантах осуществления, индивидууму, которому введен трансплантат костного мозга, вводят указанные клетки до проявления симптома реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD).

В других конкретных вариантах осуществления индивидууму, страдающему злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови, вводят по меньшей мере одну дозу ингибитора TNFα, например, ЭТАНЕРЦЕПТ® (Enbrel) до указанного введения. В конкретных вариантах осуществления указанному индивидууму вводят указанную дозу ингибитора TNFα в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев после диагностики указанной злокачественной опухоли. В конкретном варианте осуществления индивидуум, которому вводят дозу ингибитора TNFα, страдает острым миелоидным лейкозом. В более конкретном варианте осуществления индивидуум, которому вводят дозу ингибитора TNFα и который страдает острым миелоидным лейкозом, кроме того, имеет делецию длинного плеча хромосомы 5 в клетках крови. В другом варианте осуществления индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови, имеет филадельфийскую хромосому. В других конкретных вариантах осуществления злокачественная опухоль, например, злокачественная опухоль клеток крови или солидная опухоль, у указанного индивидуума, является устойчивой к одному или нескольким противораковым лекарственным средствам. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль является устойчивой к ГЛИВЕК® (мезилату иматиниба).

В конкретных вариантах осуществления злокачественная опухоль, например, злокачественная опухоль клеток крови, у указанного индивидуума отвечает по меньшей мере на одно противораковое лекарственное средство; в этом варианте осуществления, перфузат плаценты, выделенные клетки перфузата плаценты, выделенные естественные киллерные клетки, например, естественные киллерные клетки плаценты, например, происходящие из плаценты промежуточные естественные киллерные клетки, выделенные комбинированные естественные киллерные клетки, и/или их комбинации, и, необязательно, иммуномодулирующее соединение, добавляют в качестве вспомогательной терапии или в качестве комбинированной терапия с указанным противораковым лекарственным средством. В других конкретных вариантах осуществления индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, например, злокачественной опухолью клеток крови, лечили по меньшей мере одним противораковым лекарственным средством, и он перенес рецидив до указанного введения.

5.1.2. Лечение вирусной инфекции

Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к способу лечения индивидуума, страдающего вирусной инфекцией, например, индивидуума с дефицитом естественных киллерных клеток, включающему в себя введение указанному индивидууму эффективного количества выделенного перфузата плаценты, выделенных клеток перфузата плаценты, выделенных естественных киллерных клеток, например, естественных киллерных клеток плаценты, например, происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток, выделенных комбинированных естественных киллерных клеток и/или их комбинаций, и, необязательно, иммуномодулирующего соединения, например, иммуномодулирующего соединения, описанного в разделе 5.9, ниже, или талидомида, где указанное количество представляет собой количество, которое, например, приводит к поддающемуся детекции улучшению, уменьшению прогрессирования или прекращению одного или нескольких симптомов указанной вирусной инфекции. В конкретных вариантах осуществления вирусная инфекция представляет собой инфекцию вирусом из семейства Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papilommaviridae, Rhabdoviridae или Togaviridae. В более конкретных вариантах осуществления указанный вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус Коксаки, вирус гепатита A (HAV), вирус полиомиелита, вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус простого герпеса типа 1 (HSV1), вирус простого герпеса типа 2 (HSV2), цитомегаловирус человека (CMV), вирус герпеса человека типа 8 (HHV8), вирус опоясывающего герпеса (вирус ветряной оспы (VZV) или вирус опоясывающего лишая), вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), вирус гепатита D (HDV), вирус гепатита E (HEV), вирус гриппа (например, вирус гриппа A, вирус гриппа B, вирус гриппа C или тоготовирус), вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа, папилломавирус, вирус бешенства или вирус краснухи. В других более конкретных вариантах осуществления указанный вирус представляет собой аденовирус вида A, серотипа 12, 18 или 31; аденовирус вида B, серотипа 3, 7, 11, 14, 16, 34, 35 или 50; аденовирус вида C, серотипа 1, 2, 5 или 6; вида D, серотипа 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 51; вида E, серотипа 4; или вида F, серотипа 40 или 41.

В других более конкретных вариантах осуществления вирус представляет собой вирус Апои (APOIV), вирус Ароа (AROAV), вирус Багаза (BAGV), вирус Банзи (BANV), вирус Боубоуи (BOUV), вирус Касипакор (CPCV), вирус острова Карей (CIV), вирус Ковбон Ридж (CRV), вирус Денге (DENV), вирус Эдж Хилл (EHV), вирус Гаджетс Галли (GGYV), вирус Ильеус (ILHV), израильский вирус менингоэнцефаломиелита индейки (ITV), вирус японского энцефалита (JEV), вирус Югра (JUGV), вирус Джутиапа (JUTV), вирус Кадам (KADV), вирус Кедоугоу (KEDV), вирус Кокобера (KOKV), вирус Коутанго (KOUV), вирус болезни Кьясанурского Леса (KFDV), вирус Лангат (LGTV), вирус Мибан (MEAV), вирус Модок (MODV), вирус лейкоэнцефаломиелита Монтана (MMLV), вирус энцефалита долины Муррей (MVEV), вирус Нтайя (NTAV), вирус омской геморрагической лихорадки (OHFV), вирус Повассан (POWV), вирус Рио-Браво (RBV), вирус Ройал Фарм (RFV), вирус Сабойа (SABV), вирус энцефалита Сент-Луиса (SLEV), вирус Сал Виеджа (SVV), вирус Сан Перлита (SPV), вирус рифов Саумарез (SREV), вирус Сепик (SEPV), вирус Тембусу (TMUV), вирус клещевого энцефалита (TBEV), вирус Тюлений (TYUV), вирус Уганда S (UGSV), вирус Усуту (USUV), вирус Вессельсброн (WESSV), вирус лихорадки западного Нила (WNV), вирус Яунде (YAOV), вирус желтой лихорадки (YFV), вирус Йокос (YOKV) или вирус Зика (ZIKV).

5.1.3. Супрессия пролиферации клеток опухолей

Далее в настоящем документе представлен способ супрессии пролиферации клеток опухолей, включающий в себя приведение клеток опухолей в контакт с выделенным перфузатом плаценты, выделенными клетками перфузата плаценты, выделенными естественными киллерными клетками, например, естественными киллерными клетками плаценты, например, происходящими из плаценты промежуточными естественными киллерными клетками, выделенными комбинированными естественными киллерными клетками, и/или их комбинациями. В конкретном варианте осуществления клетки опухолей, кроме того, приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом, так что пролиферация клеток опухолей до поддающейся детекции степени уменьшена по сравнению с клетками опухолей того же самого типа, не приведенными в контакт с выделенным перфузатом плаценты, выделенными клетками перфузата плаценты, выделенными естественными киллерными клетками, например, естественными киллерными клетками плаценты, например, происходящими из плаценты промежуточными естественными киллерными клетками, выделенными комбинированными естественными киллерными клетками и/или их комбинациями. В другом конкретном варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки не представляют собой естественные киллерные клетки плаценты, например, не представляют собой PINK-клетки.

Как применяют в настоящем документе, «приведение в контакт», по отношению к клеткам, в одном варианте осуществления включает в себя непосредственный физический контакт, например, клетки с клеткой, между перфузатом плаценты, клетками перфузата плаценты, естественными киллерными клетками, например, промежуточными естественными киллерными клетками плаценты, и/или выделенными комбинированными естественными киллерными клетками и клетками опухолей. В другом варианте осуществления «приведение в контакт» включает в себя присутствие в одном и том же физическом пространстве, например, перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты, естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты и/или выделенных комбинированных естественных киллерных клеток, помещенных в один и тот же контейнер, например, культуральную чашку, многолуночный планшет), как клетки опухолей. В другом варианте осуществления «приведение в контакт» перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток или промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, и клеток опухолей осуществляют, например, посредством инъекции или инфузии перфузата или клеток плаценты, например, клеток перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток или естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, индивидууму, например, человеку, имеющему клетки опухолей, например, пациенту со злокачественной опухолью. «Приведение в контакт», в контексте иммуномодулирующих соединений и/или талидомида, означает, например, что клетки и иммуномодулирующее соединение и/или талидомид приводят в непосредственный физический контакт друг с другом или помещают в один и тот же физический объем (например, в контейнер для культивирования клеток или в организм индивидуума).

В конкретных вариантах осуществления перфузат плаценты используют в любом количестве, приводящем к поддающемуся детекции терапевтическому преимуществу для индивидуума, имеющего клетки опухолей, например, пациента со злокачественной опухолью. В других конкретных вариантах осуществления, клетки перфузата плаценты, естественные киллерные клетки, например, промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, и/или комбинированные естественные киллерные клетки или их комбинации, используют в любом количестве, приводящем к поддающемуся детекции терапевтическому преимуществу для индивидуума, имеющего клетки опухолей. Таким образом, другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к способу супрессии пролиферации клеток опухолей, включающему в себя приведение клеток опухолей в контакт с перфузатом плаценты, клетками перфузата плаценты и/или естественными киллерными клетками, например, происходящими из плаценты промежуточными естественными киллерными клетками, в организме индивидуума, так что для указанного контакта можно детектировать или показать терапевтическое преимущество для указанного индивидуума. В конкретном варианте осуществления, способ, кроме того, относится к приведению клеток опухолей в контакт с иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, ниже, или талидомидом, так что для указанного контакта можно детектировать или демонстрировать терапевтическое преимущество для указанного индивидуума.

В конкретном варианте осуществления клетки опухолей представляют собой клетки злокачественных опухолей клеток крови. В различных конкретных вариантах осуществления клетки опухолей представляют собой клетки первичной карциномы протоков, клетки лейкоза, клетки острого T-клеточного лейкоза, клетки хронической миелоидной лимфомы (CML), клетки острого миелогенного лейкоза, клетки хронического миелогенного лейкоза (CML), клетки карциномы легкого, клетки аденокарциномы толстой кишки, клетки гистиоцитарной лимфомы, клетки множественной миеломы, клетки ретинобластомы, клетки колоректальной карциномы или клетки колоректальной аденокарциномы. В других конкретных вариантах осуществления клетки опухолей могут представлять собой клетки любых типов злокачественных опухолей или опухолей, описанных в разделе 5.1.1, выше.

Как используют в настоящем документе, «терапевтически преимущественный» и «терапевтические преимущества» включают в качестве неограничивающих примеров, например, уменьшение размера опухолей; уменьшение или прекращение разрыва или обширного разрыва опухоли; уменьшение количества клеток злокачественных опухолей в образце ткани, например, образце крови, на единицу объема; клиническое улучшение любого симптома конкретной злокачественной опухоли или опухоли, которой страдает указанный индивидуум, уменьшение или прекращение любого симптома конкретной злокачественной опухоли, которой страдает индивидуум, и т.д. Приведение перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты и/или естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, в контакт с клетками опухолей, необязательно, с иммуномодулирующим соединением, например, иммуномодулирующим соединением, описанным в разделе 5.9, выше, или талидомидом, приводящее к одному или нескольким таким терапевтическим преимуществам, называют терапевтически преимущественным.

5.1.4. Введение

Определение количества клеток, например, клеток перфузата плаценты, например, ядросодержащих клеток из перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток и/или выделенных естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, и определение количества иммуномодулирующего соединения, например, иммуномодулирующего соединения в разделе 5.9, ниже, или талидомида, можно определять независимо друг от друга.

5.1.4.1. Введение клеток

В конкретных вариантах осуществления клетки перфузата плаценты, например, ядросодержащие клетки из перфузата плаценты, комбинированные естественные киллерные клетки, и/или выделенные естественные киллерные клетки, например, промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, используют, например, вводят индивидууму, в любом количестве или числе, которое приводит к поддающемуся детекции терапевтическому преимуществу для индивидуума, например, в эффективном количестве, где индивидуум имеет вирусную инфекцию, злокачественную опухоль или клетки опухолей, например, индивидуум, имеющий клетки опухолей, солидную опухоль или злокачественную опухоль клеток крови, например, пациент со злокачественной опухолью. Такие клетки можно вводить такому индивидууму по абсолютному количеству клеток, например, такому индивидууму можно вводить приблизительно, по меньшей мере, приблизительно или самое большее, приблизительно 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰ или 1×10¹¹ клеток перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток и/или естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток. В других вариантах осуществления клетки перфузата плаценты, комбинированные естественные киллерные клетки, и/или естественные киллерные клетки, например, происходящие из плаценты промежуточные естественные киллерные клетки можно вводить указанному индивидууму по относительному количеству клеток, например, указанному индивидууму можно вводить приблизительно, по меньшей мере, приблизительно или самое большее, приблизительно 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰ или 1×10¹¹ клеток перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток и/или естественных киллерных клеток на килограмм массы индивидуума. Клетки перфузата плаценты и/или естественные киллерные клетки, например, происходящие из плаценты промежуточные естественные киллерные клетки можно вводить указанному индивидууму в соответствии с приблизительным соотношением количества клеток перфузата плаценты и/или естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, и количеством клеток опухолей у указанного индивидуума. Например, клетки перфузата плаценты и/или естественные киллерные клетки, например, промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, можно вводить указанному индивидууму в соотношении приблизительно, по меньшей мере приблизительно или самое большее, приблизительно 1:1, 1:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1 относительно количества клеток опухолей у индивидуума. Количество клеток опухолей у такого индивидуума можно определять, например, подсчетом количества клеток опухолей в образце ткани от индивидуума, например, образце крови, биоптате или т.п. В конкретных вариантах осуществления, например, для солидных опухолей, такой подсчет проводят в сочетании с получением изображения опухоли или опухолей для получения приблизительного объема опухоли. В конкретном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение или талидомид, например, эффективное количество иммуномодулирующего соединения или талидомида, вводят индивидууму.

В конкретных вариантах осуществления способ супрессии пролиферации клеток опухолей, например, у индивидуума; лечения индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; или лечения индивидуума, страдающего вирусной инфекцией; или лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, например, индивидуума, имеющего клетки опухолей, злокачественную опухоль клеток крови или солидную опухоль, включает в себя контакт с клетками опухолей или введение указанному индивидууму комбинации перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток, и/или выделенных естественных киллерных клеток, например, происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида. Например, различные варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к способу супрессии пролиферации клеток опухолей или индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, или индивидуума с дефицитом у индивидуума NK-клеток, включающему в себя контакт с указанными клетками опухолей или введение указанному индивидууму эффективного количества перфузата плаценты, дополненного выделенными клетками перфузата плаценты или выделенными NK-клетками, например, PINK-клетками; выделенных клеток перфузата плаценты, дополненных перфузатом плаценты или выделенными NK-клетками, например, PINK-клетками; выделенных NK-клеток, например, PINK-клеток, и перфузата плаценты и выделенных клеток перфузата плаценты; выделенных NK-клеток, например, PINK-клеток, и комбинированных естественных киллерных клеток; комбинированных естественных киллерных клеток и выделенных клеток перфузата плаценты; перфузата плаценты и комбинированных естественных киллерных клеток; или комбинации всего из перфузата плаценты, выделенных клеток перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток, и выделенных NK-клеток, например, PINK-клеток. В конкретном варианте осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают в себя контакт с клетками опухолей или введение указанному индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида.

В одном конкретном варианте осуществления, например, лечение индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; или лечение индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, или супрессия пролиферации клеток опухоли включает в себя контакт с указанными клетками опухолей или введение указанному индивидууму перфузата плаценты, дополненного выделенными клетками перфузата плаценты, комбинированными естественными киллерными клетками и/или множеством NK-клеток, например, промежуточными естественными киллерными клетками плаценты. В более конкретных вариантах осуществления, например, каждый миллилитр перфузата плаценты дополняют приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰ или более клеток перфузата плаценты или выделенных естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты. В других конкретных вариантах осуществления, перфузат плаценты, например, одну единицу (т.е., сбор с отдельной плаценты), или приблизительно 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата, дополняют приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более выделенных NK-клеток, комбинированных естественных киллерных клеток, и/или выделенных клеток перфузата плаценты на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных NK-клеток, комбинированных естественных киллерных клеток, и/или выделенных клеток перфузата плаценты. В другом конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида.

В другом конкретном варианте осуществления лечение индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; или лечение индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, или супрессия пролиферации клеток опухоли включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму выделенных клеток перфузата плаценты и перфузата плаценты, комбинированных естественных киллерных клеток, и/или выделенных NK-клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты. В более конкретных вариантах осуществления, приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более выделенных клеток перфузата плаценты на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных клеток перфузата плаценты, дополняют приблизительно, или по меньшей мере, приблизительно, 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более выделенных NK-клеток, например, PINK-клеток, и/или комбинированных естественных киллерных клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных NK-клеток, например, PINK-клеток. В других более конкретных вариантах осуществления, приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более выделенных клеток перфузата плаценты, выделенных NK-клеток, и/или комбинированных естественных киллерных клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных клеток перфузата плаценты, выделенных NK-клеток, и/или комбинированных естественных киллерных клеток дополняют приблизительно, или по меньшей мере, приблизительно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата или приблизительно 1 единицей перфузата. В другом конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида.

В другом конкретном варианте осуществления лечение индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; лечение индивидуума, страдающего злокачественной опухолью; лечение индивидуума, страдающего вирусной инфекцией; или супрессия пролиферации клеток опухоли, включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму выделенных естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, дополненных перфузатом плаценты, выделенными клетками перфузата плаценты, и/или комбинированными естественными киллерными клетками. В более конкретных вариантах осуществления приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, дополняют приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, и/или комбинированных естественных киллерных клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более клеток перфузата плаценты и/или комбинированных естественных киллерных клеток. В других более конкретных вариантах осуществления, приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более клеток перфузата плаценты и/или комбинированных естественных киллерных клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных NK-клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, и/или комбинированных естественных киллерных клеток дополняют приблизительно, или по меньшей мере приблизительно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата, или приблизительно 1 единицей перфузата. В другом конкретном варианте осуществления, способ дополнительно включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида.

В другом конкретном варианте осуществления лечение индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; лечение индивидуума, страдающего злокачественной опухолью; лечение индивидуума, страдающего вирусной инфекцией; или супрессия пролиферации клеток опухоли включает в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму выделенных естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, дополненных перфузатом плаценты, выделенных клеток перфузата плаценты и/или комбинированных естественных киллерных клеток, где указанные клетки дополнены адгерентными клетками плаценты, например, адгерентными плацентарными стволовыми клетками или мультипотентными клетками. В конкретных вариантах осуществления перфузат плаценты, клетки перфузата и/или PINK-клетки дополняют приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более адгерентных плацентарных стволовых клеток на миллилитр или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более адгерентных клеток плаценты, например, более адгерентных плацентарных стволовых клеток или мультипотентных клеток. В другом конкретном варианте осуществления, лечение индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; лечение индивидуума, страдающего злокачественной опухолью; лечение индивидуума, страдающего вирусной инфекцией; или супрессию пролиферации клеток опухоли проводят с использованием иммуномодулирующего соединения или талидомида в сочетании с выделенными естественными киллерными клетками, например, промежуточными естественными киллерными клетками плаценты, дополненными перфузатом плаценты, выделенными клетками перфузата плаценты, и/или комбинированными естественными киллерными клетками, где указанные клетки дополнены кондиционированной адгерентными клетками плаценты средой, например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,1, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мл кондиционированной стволовыми клетками культуральной среды на единицу перфузата, клеток перфузата, комбинированных естественных киллерных клеток и/или PINK-клеток, или на 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ или 10¹¹ клеток. В конкретных вариантах осуществления адгерентные клетки плаценты представляют собой мультипотентные адгерентные клетки плаценты, описанные в Патенте США No. 7468276 и Публикации Патентной заявки США No. 2007/0275362, полное описание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылок. В другом конкретном варианте осуществления, способ дополнительно включает в себя контакт клеток с клетками опухолей или введение индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида.

В других вариантах осуществления перфузат плаценты, клетки перфузата плаценты, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, комбинированные естественные киллерные клетки и содержащие их комбинации и пулы, используют, как первоначально получено, то есть, перфузат, как получено во время перфузии, клетки перфузата плаценты, как выделено из такого перфузата, комбинированные естественные киллерные клетки из такого перфузата и совпадающую пуповинную кровь, или PINK-клетки, выделенные из такого перфузата, или такие клетки перфузата плаценты. В других вариантах осуществления перфузат плаценты, клетки перфузата плаценты, PINK-клетки, и их комбинации и пулы обрабатывают перед использованием. Например, перфузат плаценты можно использовать в его необработанной форме, как собрано из плаценты. Перфузат плаценты также можно обрабатывать перед использованием, например, посредством отрицательного отбора по одному или нескольким типам клеток, уменьшения объема посредством дегидратации; лиофилизации и регидратации и т.д. Подобным образом, популяции клеток перфузата можно использовать, как первоначально выделено из перфузата плаценты, например, в форме общих ядросодержащих клеток из перфузата плаценты, или их можно обрабатывать, например, для удаления одного или нескольких типов клеток (например, эритроцитов). Естественные киллерные клетки можно использовать, как первоначально выделено из ткани-источника; например, PINK-клетки можно использовать, как первоначально выделено из перфузата плаценты, например, с использованием CD56 микробусин, или их можно обрабатывать, например, для удаления одного или нескольких типов клеток, не относящихся к киллерам.

В другом конкретном варианте осуществления лечение индивидуума с дефицитом у индивидуума естественных киллерных клеток; лечение индивидуума, страдающего злокачественной опухолью; лечение индивидуума, страдающего вирусной инфекцией; или супрессия пролиферации клеток опухоли, с использованием выделенных естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, дополненных перфузатом плаценты, выделенными клетками перфузата плаценты, и/или комбинированными естественными киллерными клетками, или содержащих их пулов или комбинаций, дополнительно включает в себя контакт таких клеток или перфузата с интерлейкином-2 (IL-2) в течение периода времени до указанного контакта. В конкретных вариантах осуществления указанный период времени составляет приблизительно по меньшей мере или самое большее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 или 48 часов до указанного контакта.

Перфузат, клетки перфузата, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, комбинированные естественные киллерные клетки или их пулы и/или комбинации, и необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, можно вводить один раз индивидууму, страдающему вирусной инфекцией, индивидуума, страдающему злокачественной опухолью, или индивидууму, имеющему клетки опухолей, в ходе противораковой терапии; или можно вводить многократно, например, один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа или один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток, или один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более недель в ходе терапии. В вариантах осуществления, в которых используют клетки и иммуномодулирующее соединение или талидомид, иммуномодулирующее соединение или талидомид, и клетки или перфузат можно вводить индивидууму вместе, например, в одном и том же составе; отдельно, например, в отдельных составах, приблизительно в одно и то же время; или их можно вводить отдельно, например, в различных расписаниях дозирования или в различные периоды времени суток. Перфузат, клетки перфузата, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, их пулы и/или комбинации можно вводить вне зависимости от того, вводили ли ранее индивидууму перфузат, клетки перфузата, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, их пулы и/или комбинации. Таким образом, способы, представленные в настоящем документе, относятся к введению индивидууму, имеющему вирусную инфекцию, имеющему злокачественную опухоль или имеющему клетки опухолей, любой комбинации перфузата плаценты, клеток перфузата, естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, содержащих их пулов и/или комбинаций клеток.

Перфузат плаценты, клетки перфузата, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие их пулы и/или комбинации, и необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, могут составлять часть режима противораковой терапии, включающего в себя одно или несколько других противораковых средств. Такие противораковые средства хорошо известны в данной области. Конкретные противораковые средства, которые можно вводить индивидууму, имеющему злокачественную опухоль, например, индивидууму, имеющему клетки опухолей, в дополнение к перфузату, клеткам перфузата, естественным киллерным клеткам, например, PINK-клеткам, их пулам и/или комбинациям, и необязательно, иммуномодулирующему соединению или талидомиду, включают в качестве неограничивающих примеров: ацивицин; акларубицин; гидрохлорид акодазола; акронин; адозелезин; альдеслейкин; алтретамин; амбомицин; ацетат аметантрона; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназа; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалутамид; гидрохлорид бисантрена; димезилат бизнафида; бизелезин; сульфат блеомицина; бреквинарнатрий; бропиримин; бусульфан; сактиномицин; калюстерон; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; гидрохлорид карубицина; карзелезин; цедефингол; целекоксиб (ингибитор COX-2); хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; мезилат криснатола; циклофосфамид; цитарабин; декарбазин; дактиномицин; гидрохлорид даунорубицина; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; мезилат дезагуанина; диазиквон; доцетаксел; доксорубицин; гидрохлорид доксорубицина; дролоксифен; цитрат дролоксифена; пропионат дромостанолона; дуазомицин; эдатрексат; гидрохлорид эфлорнитина; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; гидрохлорид эпирубицина; эрбулозол; гидрохлорид эзорубицина; эстрамустин; фосфат эстрамустина натрия; этанидазол; этопозид; фосфат этопозида; этоприн; гидрохлорид фадрозола; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; фосфат флударабина; фторурацил; фторцитабин; фосквидон; фостриецин натрия; гемцитабин; гидрохлорид гемцитабина; гидроксимочевина; гидрохлорид идарубицина; ифосфамид; илмофосин; ипроплатин; иринотекан; гидрохлорид иринотекана; ацетат ланреотида; лектрозол; ацетат леупролида; гидрохлорид лиарозола; лометрексол натрия; ломустин; гидрохлорид лозоксантрона; мазопрокол; майтанзин; гидрохлорид мехлорэтамина; ацетат магестрола; ацетат меленгестрола; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрия; метоприн; метуредепа; митиндомид; митокарцин; митокромин; митогиллин; митомальцин; митомицин; митоспер; митотан; митоксантрон гидрохлорид; микофеноловая кислота; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксизуран; паклитаксел; пегаспаргаза; пелиомицин; пентамустин; сульфат пепломицина; перфосфамид; пипоброман; пипосульфан; пироксантрон гидрохлорид; пликамицин; пломестан; порфимер натрия; порфиромицин; преднемустин; прокарбазин гидрохлорид; пуромицин; пуромицин гидрохлорид; пиразофурин; рибоприн; сафингол; гидрохлорид сафингола; семустин; симтразен; спарфозат натрия; спарзомицин; гидрохлорид спирогермания; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; тализомицин; текогалан натрия; таксотер; тегафур; гидрохлорид телоксантрона; темопорфин; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепа; тиазофурин; тирапазамин; цитрат торемифена; ацетат трестолона; фосфат трицирибина; триметрексат; глюкуронат триметрексата; трипторелин; гидрохлорид тубулозола; урамустин; уредепа; вапреотид; вертепорфин; сульфат винбластина; сульфат винкристина; виндезин; сульфат виндезина; сульфат винепидина; сульфат винглицината; сульфат винлеурозина; тартрат винорелбина; сульфат винрозидина; сульфат винзолидина; ворозол; зениплатин; зиностатин; и гидрохлорид зорубицина.

Другие противораковые лекарственные средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров: 20-эпи-1,25 дигидроксивитамин D3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфульвен; адеципенол; адозелезин; альдеслейкин; антагонисты ALL-TK; алтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновая кислота; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; антидорсализирующий морфогенетический белок-1; антиандроген карциномы предстательной железы; антиэстроген; антинеопластон; антисмысловые олигонуклеотиды; глицинат афидиколина; модуляторы генов апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; ara-CDP-DL-PTBA; аргинин-дезаминазу; азулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азасетрон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимастат; антагонисты BCR/ABL; бензохлорины; бензоилстауроспорин; производные бета-лактама; бета-алетин; бетакламицин B; бетулиновую кислоту; ингибитор bFGF; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен A; бизелезин; брефлат; бропиримин; будотитан; сульфоксимин бутионина; кальципотриол; кальфостин C; производные камптотецина; капецитабин; карбоксамидаминотриазол; карбоксиамидотриазол; CaRest M3; CARN 700; полученный из хряща ингибитор; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин B; цетрореликс; хлорины; сульфонамид хлорхиноксалина; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллисмицин A; коллисмицин B; комбретастатин A4; аналог комбретастатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина A; курацин A; циклопентантрахиноны; циклоплатам; ципемицин; окфосфат цитарабина; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин B; дезлорелин; дексаметазон; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемнин B; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5-азацитидин; 9-дигидротаксол, диоксамицин; дифенилспиромустин; доцетаксел; докозанол; долазетрон; доксифлуридин; доксорубицин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбселен; экомустин; эделфозин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпристерид; аналог эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидазол; фосфат этопозида; экземестан; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; финастерид; флавопиридол; флезеластин; флуастерон; флударабин; гидрохлорид фтордауноруницина; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; тексафирин гадолиния; нитрат галлия; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсульфам; херегулин; бисацетамид гексаметилена; гиперицин; ибандроновую кислоту; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; иматиниб (например, ГЛИВЕК®), имиквимод; иммуностимулирующие пептиды; ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста-1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгуан; иоддоксорубицин; 4-ипомеанол; ироплакт; ирсогладин; изобенгазол; изогомогаликондрин B; итасетрон; джасплакинолид; кагалалид F; ламелларин-N-триацетат; ланреотид; леинамицин; ленограстим; сульфат лентинана; лептостатин; лектрозол; ингибирующий лейкоз фактор, лейкоцитарный альфа-интерферон; леупролид+эстроген+прогестерон; лейпрорелин; левамизол; лиарозол; аналог линейного полиамина; липофильный дисахаридный пептид, липофильные соединения платины; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; локсорибин; луртотекан; тексафирин лютеция; лизофиллин; литические пептиды; маитансин; манностатин A; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; ингибиторы матриксной металлопротеиназы; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназу; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефосин; миримостим; митогуазон; митолактол; аналоги митомицина; митонафид; митотоксин фактор роста фибробластов-сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостим; эрбитукс, хорионический гонадотропин человека; монофосфориллипид A+клеточная стенка миобактерий sk; мопидамол; ипритное противораковое средство; микапероксид B; экстракт клеточной стенки микобактерий; мириапорон; N-ацетилдиналин; N-замещенные бензамиды; нафарелин; нагрестип; налоксон + пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновую кислоту; нилутамид; низамицин; модуляторы оксида азота; антиоксидант нитроксида; нитруллин; облимерсен (ГЕНАСЕНС®); O⁶-бензилгуанин; октреотид; окиценон; олигонуклеотиды; онапристон; ондансетрон; ондансетрон; орацин; пероральный индуктор цитокинов; ормаплатин; озатерон; оксалиплатин; оксауномицин; паклитаксел; аналоги паклитаксела; паклитаксел производные; палауамин; пальмитоилризоксин; памидроновую кислоту; панакситриол; паномифен; парабактин; пазеллиптин; пегаспаргазу; пелдезин; пентозана полисульфат натрия; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамид; периллиловый спирт; феназиномицин; фенилацетат; ингибиторы фосфатазы; пицибанил; гидрохлорид пилокарпина; пирарубицин; пиритрексим; плацетин A; плацетин B; ингибитор активатора плазминогена; комплекс платины; соединения платины; комплекс платины-триамина; порфимер натрия; порфиромицин; преднизон; пропил-бис-акридон; простагландин J2; ингибиторы протеасом; иммунномодулятор на основе белка А; ингибитор протеинкиназы C; ингибиторы протеинкиназы C, микроалгал; ингибиторы тирозинфосфатазы белка; ингибиторы пурин-нуклеозид-фосфорилазы; пурпурин; пиразолоакридин; конъюгат пиридоксилированного гемоглобина с полиоксиэтиленом; антагонисты raf; ралтитрексид; рамосетрон; ингибиторы ras-фарнезил-протеинтрансферазы; ингибиторы ras; ингибитор ras-GAP; деметилированный ретеллиптин; этидронат рения Re 186; ризоксин; рибозимы; ретинамид RII; рогитукин; ромуртид; роквинимекс; рубигинон B1; рубоксил; сафингол; саинтопин; SarCNU; саркофитол A; сарграмостим; миметики Sdi 1; семустин; полученный из стареющих клеток ингибитор 1; смысловые олигонуклеотиды; ингибиторы передачи сигнала; сизофиран; собузоксан; борокаптат натрия; фенилацетат натрия; солверол; связывающий соматомедин белок; сонермин; спарфозивую кислоту; спикамицин D; спиромустин; спленопентин; спонгистатин 1; свкаламин; стипиамид; ингибиторы стромелизина; сульфинозин; сверхактивный антагонист вазоактивного интестинального пептида; сурадиста; сурамин; сваинсонин; таллимустин; метиодид тамоксифена; тауромустин; тазаротен; текогалан натрия; тегафур; теллурапирилий; ингибиторы теломеразы; темопорфин; тенипозид; тетрахлордекаоксид; тетразомин; талибластин; тиокаралин; тромбопоэтин; миметик тромбопоэтина; тимальфазин; агонист рецептора тимопоэтина; тимотринан; тироид-стимулирующий гормон; тин-этил-этиопурпурин; тирапазамин; дихлорид титаноцена; топсентин; торемифен; ингибиторы трансляции; третиноин; триацетилуридин; трицирибин; триметрексат; трипторелин; трописетрон; туростерид; ингибиторы тирозинкиназы; тирфостины; ингибиторы UBC; убенимекс; ингибиторный фактор роста мочеполового синуса; антагонисты рецептора урокиназы; вапреотид; вариолин B; веларезол; верамин; вердины; вертепорфин; винорелбин; винксалтин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб; и зиностатин стималамер.

В другом варианте осуществления перфузат плаценты, клетки перфузата, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие их пулы и/или комбинации, и, необязательно иммуномодулирующее соединение или талидомид, можно вводить индивидууму, страдающему вирусной инфекцией, в качестве части режима противовирусной терапии, включающего в себя один или несколько других противовирусных средств. Конкретные противовирусные средства, которые можно вводить индивидууму, страдающему злокачественной опухолью, в дополнение к перфузату, клеткам перфузата, клеткам-естественным киллерам, например, PINK-клеткам, их пулы и/или комбинации, включают в качестве неограничивающих примеров: имиквимод, подофилокс, подофиллин, интерферон альфа (IFNα), ретиколос, ноноксинол-9, ацикловир, фамцикловир, валацикловир, ганцикловир, цидофовир; амантадин, римантидин; рибавирин; занамавир и оселтамавир; ингибиторы протеаз, такие как индинавир, нелфинавир, ритонавир или саквинавир; нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как диданозин, ламивудин, ставудин, зальцитабин или зидовудин; и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как невирапин или эфавиренц.

5.2. Выделение естественных киллерных клеток

Способы выделения естественных киллерных клеток известны в данной области. Естественные киллерные клетки можно выделять или обогащать посредством окрашивания клеток из ткани-источника, например, периферической крови, с помощью антител против CD56 и CD5 и отбора клеток CD56⁺CD5^-. Естественные киллерные клетки можно выделять с использованием коммерчески доступного набора, например, набора для выделения NK-клеток (Miltenyi Biotec). Естественные киллерные клетки можно также выделять или обогащать посредством удаления клеток, не относящихся к естественным киллерам, из популяции клеток, содержащей естественные киллерные клетки. Например, естественные киллерные клетки из периферической крови можно выделять или обогащать посредством истощения T-клеток, B-клеток, моноцитов, дендритных клеток, тромбоцитов, гранулоцитов и эритроцитов из периферической крови с использованием, например, антител против каждой из популяций клеток, подлежащих исключению из выделенных или обогащенных естественных киллерных клеток. В конкретных вариантах осуществления антитела включают в себя антитела против CD3, CD14, CD36, CDw123, HLA класса II DR,DP и CD235a (гликофорин A). Негативное выделение можно выполнять с использованием коммерчески доступного набора, например, набора для негативного выделения NK-клеток (Dynal Biotech). Клетки, выделенные этими способами, можно дополнительно сортировать, например, для разделения CD16⁺ и CD16^- клеток.

Конкретные способы выделения естественных киллерных клеток из плаценты описаны ниже.

5.3. Перфузат плаценты

5.3.1. Композиция для сбора клеток

Перфузат плаценты, клетки перфузата и происходящие из перфузата плаценты естественные киллерные клетки, используемые для супрессии опухолей или лечения индивидуума, имеющего клетки опухолей, злокачественную опухоль или вирусную инфекцию, как представлено в настоящем документе, можно собирать посредством перфузии послеродовой плаценты млекопитающего, например, человека, с использованием композиции для сбора клеток плаценты. Перфузат можно собирать из плаценты посредством перфузии плаценты с помощью любого физиологически приемлемого раствора, например, солевого раствора, культуральной среды, или более сложной композиции для сбора клеток. Композиция для сбора клеток, подходящая для перфузии плаценты и для сбора и хранения клеток перфузата, например, общих ядросодержащих клеток перфузата плаценты или PINK-клеток, подробно описана в родственной Публикации патентной заявки США No. 2007/0190042, полное содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Композиция для сбора клеток может содержать любой физиологически приемлемый раствор, подходящий для сбора и/или культивирования стволовых клеток, например, солевой раствор (например, фосфатно-солевой буфер, раствор Кребса, модифицированный раствор Кребса, раствор Игла, 0,9% NaCl и т.д.), культуральную среду (например, DMEM, H.DMEM и т.д.) и т.п.

Композиция для сбора клеток может содержать один или несколько компонентов, действующих для сохранения клеток плаценты, то есть, предохранения клеток плаценты от гибели или задержки гибели клеток плаценты, уменьшения клеток плаценты в популяции погибающих клеток или т.п., со времени сбора до времени культивирования. Такие компоненты могут представлять собой, например, ингибитор апоптоза (например, ингибитор каспазы или ингибитор JNK); сосудорасширяющее средство (например, сульфат магния, антигипертензивное лекарственное средство, предсердный натрийуретический пептид (ANP), адренокортикотропин, высвобождающий кортикотропин гормон, нитропруссид натрия, гидралазин, аденозинтрифосфат, аденозин, индометацин или сульфат магния, ингибитор фосфодиэстеразы и т.д.); ингибитор некроза (например, 2-(1H-индол-3-ил)-3-пентиламино-малеинимид, дитиокарбамат пирролидина или клоназепам); ингибитор TNF-α; и/или кислородосодержащий перфторуглерод (например, бромид перфтороктила, бромид перфтордецила и т.д.).

Композиция для сбора клеток может содержать один или несколько ферментов для разрушения ткани, например, металлопротеиназу, сериновую протеазу, нейтральную протеазу, гиалуронидазу, РНКазу или ДНКазу, или т.п. Такие ферменты включают в себя в качестве неограничивающих примеров, коллагеназы (например, коллагеназу I, II, III или IV, коллагеназу из Clostridium histolyticum и т.д.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, LIBERASE, гиалуронидазу и т.п.

Композиция для сбора клеток может содержать бактерицидно или бактериостатически эффективное количество антибиотика. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления антибиотик представляет собой макролид (например, тобрамицин), цефалоспорин (например, цефалексин, цефрадин, цефуроксим, цефпрозил, цефаклор, цефиксим или цефадроксил), кларитромицин, эритромицин, пенициллин (например, пенициллин V) или хинолон (например, офлоксацин, ципрофлоксацин или норфлоксацин), тетрациклин, стрептомицин и т.д. В конкретном варианте осуществления антибиотик является активным против Грамм(+) и/или Грамм(-) бактерий, например, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и т.д.

Композиция для сбора клеток может содержать также одно или несколько из следующих соединений: аденозин (от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ); D-глюкозу (от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ); ионы магния (от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ); макромолекулу с молекулярной массой более 20000 дальтон, в одном варианте осуществления, присутствующую в количестве, достаточном для поддержания целостности эндотелия и жизнеспособности клеток (например, синтетический или природный коллоид, полисахарид, такой как декстран или полиэтиленгликоль, присутствующие при от приблизительно 25 г/л до приблизительно 100 г/л, или от приблизительно 40 г/л до приблизительно 60 г/л); антиоксидант (например, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, глутатион, витамин C или витамин E, присутствующие при от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 100 мкМ); восстанавливающее средство (например, N-ацетилцистеин, присутствующий при от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 5 мМ); средство, предотвращающее вхождение кальция в клетки (например, верапамил, присутствующий при от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 25 мкМ); нитроглицерин (например, от приблизительно 0,05 г/л до приблизительно 0,2 г/л); антикоагулянт, в одном варианте осуществления, присутствующий в количестве, достаточном, чтобы способствовать предотвращению для свертывания остаточной крови (например, гепарин или гирудин, присутствующие в концентрации от приблизительно 1000 единиц/л до приблизительно 100000 единиц/л); или содержащее амилорид соединение (например, амилорид, этилизопропиламилорид, гексаметиленамилорид, диметиламилорид или изобутиламилорид, присутствующие при от приблизительно 1,0 мкМ до приблизительно 5 мкМ).

5.3.2. Сбор плаценты и манипуляции с ней

Как правило, плаценту человека получают вскоре после ее изгнания после родов. В предпочтительном варианте осуществления плаценту получают у пациента после информированного согласия, и затем получают полный анамнез пациента и соотносят с плацентой. Предпочтительно, анамнез продолжают после родов. Такой анамнез можно использовать для координации последующего использования плаценты или собранных из нее клеток. Например, клетки плаценты человека можно использовать, с учетом анамнеза, для персонализированной медицины для новорожденного, соответствующего плаценте, или для родителей, сибсов или других родственников новорожденного.

До получения перфузата пуповинную кровь и плацентарную кровь удаляют. В конкретных вариантах осуществления после родов выделяют пуповинную кровь из плаценты. Плаценту можно подвергать общепринятой процедуре выделения пуповинной крови. Как правило, используют иглу или канюлю, чтобы выпускать кровь из плаценты с помощью силы тяжести (смотри, например, Anderson, Патент США 5372581; Hessel et al., Патент США 5415665). Иглу или канюлю обычно помещают в пупочную вену, и плаценту можно осторожно массировать, чтобы способствовать выпусканию пуповинной крови из плаценты. Такое выделение пуповинной крови можно проводить на коммерческой основе, например, в LifeBank Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry and CryoCell. Предпочтительно, кровь из плаценты выпускают под действием силы тяжести без дополнительных манипуляций, так чтобы минимизировать разрушение тканей во время выделения пуповинной крови.

Как правило, плаценту транспортируют из родильного зала или родильной палаты в другое помещение, например, в лабораторию, для выделения пуповинной крови и сбора перфузата. Плаценту предпочтительно транспортируют в стерильном, термоизолированном устройстве для транспортировки (поддерживающем температуру плаценты 20-28°C), например, посредством помещения плаценты, с зажатым проксимальным отделом пуповины, в стерильный пластиковый пакет с застежкой, который затем помещают в изолированный контейнер. В другом варианте осуществления плаценту транспортируют в наборе для выделения пуповинной крови, по существу, как описано в Патенте США 7147626. Предпочтительно, плаценту доставляют в лабораторию в течение четырех - двадцати четырех часов после родов. В конкретных вариантах осуществления проксимальный отдел пуповины зажимают, предпочтительно, в пределах 4-5 см (сантиметров) от вставки в плацентарный диск, перед выделением пуповинной крови. В других вариантах осуществления проксимальный отдел пуповины зажимают после выделения пуповинной крови, но до дальнейшей обработки плаценты.

Плаценту до сбора перфузата можно сохранять в стерильных условиях и либо при комнатной температуре, либо при температуре 5-25°C (градусов Цельсия). Плаценту можно сохранять в течение периода, более длительного, чем сорок восемь часов, и предпочтительно, в течение периода от четырех до двадцати четырех часов, до перфузии плаценты для удаления всей остаточной пуповинной крови. Плаценту предпочтительно сохраняют в растворе антикоагулянта при температуре 5°C-25°C (градусов Цельсия). Подходящие растворы антикоагулянтов хорошо известны в данной области. Например, можно использовать раствор гепарина или варфарина натрия. В предпочтительном варианте осуществления раствор антикоагулянта содержит раствор гепарина (например, 1% масс./масс. в растворе 1:1000). Обескровленную плаценту предпочтительно сохраняют в течение не более 36 часов до сбора перфузата плаценты.

5.3.3. Перфузия плаценты

Способы перфузии плацент млекопитающих описаны, например, в Hariri, Патенты США 7045148 и 7255879, и в Публикациях патентных заявок США 2007/0190042 и 20070275362, полное описание которых таким образом приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Перфузат можно получать пропусканием перфузионного раствора, например, солевого раствора, культуральной среды или композиций для сбора клеток, описанных выше, через сосудистую систему плаценты. В одном варианте осуществления перфузию плаценты млекопитающего проводят пропусканием перфузионного раствора через любую или обе из пупочной артерии и пупочной вены. Протекание перфузионного раствора через плаценту можно осуществлять с использованием, например, протекания через плаценту под действием силы тяжести. Предпочтительно, перфузионный раствор прокачивают через плаценту с использованием насоса, например, перистальтического насоса. Пупочную вену можно, например, канюлировать с помощью канюли, например, канюли из ТЕФЛОНА® или пластика, соединенной со стерильным соединительным устройством, таким как стерильная трубка. Стерильное соединительное устройство соединяют с перфузионным коллектором.

При подготовке к перфузии плаценту, предпочтительно, ориентируют таким образом, что пупочная артерия и пупочная вена расположены в наивысшей точке плаценты. Перфузию плаценты можно осуществлять посредством пропускания перфузионного раствора через сосудистую систему плаценты, или через сосудистую систему плаценты и окружающей ткани. В одном варианте осуществления пупочную артерию и пупочную вену одновременно присоединяют к пипетке, которую соединяют через гибкий коннектор с резервуаром для перфузионного раствора. Перфузионный раствор пропускают в пупочную вену и артерию. Перфузионный раствор просачивается и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие плаценту ткани, и его собирают через подходящий открытый сосуд с поверхности плаценты, которая была присоединена к материнской стенке матки во время беременности. Перфузионный раствор можно также вводить через отверстие пуповины и позволять ему протекать или просачиваться через отверстия в стенке плаценты, соприкасавшейся со стенкой матки матери. В другом варианте осуществления перфузионный раствор пропускают через пупочные вены и собирают из пупочной артерии, или его пропускают через пупочную артерию и собирают из пупочных вен, то есть, его пропускают только через сосудистую систему плаценты (эмбриональной ткани).

В одном варианте осуществления, например, пупочную артерию и пупочную вену одновременно присоединяют, например, к пипетке, которую соединяют через гибкий коннектор с резервуаром для перфузионного раствора. Перфузионный раствор пропускают в пупочную вену и артерию. Перфузионный раствор просачивается и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие плаценту ткани, и его собирают через подходящий открытый сосуд с поверхности плаценты, которая была присоединена к матке матери во время беременности. Перфузионный раствор можно также вводить через отверстие пуповины и позволять ему протекать или просачиваться через отверстия в стенке плаценты, соприкасавшейся с материнской стенкой матки. Клетки плаценты, собранные этим способом, который можно обозначать как «пан»-способ, как правило, представляют собой смесь эмбриональных и материнских клеток.

В другом варианте осуществления перфузионный раствор пропускают через пупочные вены и собирают из пупочной артерии, или его пропускают через пупочную артерию и собирают из пупочных вен. Клетки плаценты, собранные этим способом, который можно обозначать как способ «замкнутого контура», как правило, являются почти исключительно эмбриональными.

Способ перфузии по замкнутому контуру можно, в одном варианте осуществления, осуществлять следующим образом. Послеродовую плаценту получают в пределах приблизительно 48 часов после родов. Пуповину зажимают и отрезают выше зажима. Пуповину можно утилизировать, или можно перерабатывать, например, для выделения стволовых клеток пуповины, и/или перерабатывать оболочку пуповины для получения биологического материала. Амниотическую оболочку можно сохранять во время перфузии, или можно отделять от хориона, например, с использованием тупого отделения с помощью пальцев. Если амниотическую оболочку отделяют от хориона до перфузии, ее можно, например, утилизировать, или перерабатывать, например, для получения стволовых клеток ферментативным расщеплением, или для получения, например, биологического материала амниотической оболочки, например, биологического материала, описанного в Публикации патентной заявки США No. 2004/0048796. После очистки плаценты от всех видимых сгустков крови и остаточной крови, например, с использованием стерильной марли, сосуды пуповины обнажают, например, частичным разрезанием оболочки пуповины для обнажения среза пуповины. Сосуды идентифицируют и открывают, например, продвижением закрытого зажима типа «крокодил» через отрезанный конец каждого сосуда. Затем устройство, например, пластиковую трубку, соединенную с устройством для перфузии или перистальтическим насосом, вставляют в каждую артерию плаценты. Насос может представлять собой любой насос, подходящий для этой цели, например, перистальтический насос. Затем пластиковую трубку, соединенную со стерильным резервуаром для сбора, например, мешком для сбора крови, таким как мешок для сбора 250 мл, вставляют в вену плаценты. Альтернативно, трубку, соединенную с насосом, вставляют в вену плаценты, и трубки, ведущие к резервуару(резервуарам) для сбора, вставляют в одну или обе артерии плаценты. Затем проводят перфузию плаценты каким-либо объемом перфузионного раствора, например, приблизительно 750 мл перфузионного раствора. Затем клетки в перфузате собирают, например, центрифугированием.

В одном варианте осуществления проксимальный отдел пуповины зажимают во время перфузии, и более предпочтительно, зажимают в пределах 4-5 см (сантиметров) от вставки пуповины в плацентарный диск.

Первая перфузионная жидкость, собранная в ходе процесса обескровливания из плаценты млекопитающих, обычно окрашена остаточными эритроцитами из пуповинной крови и/или плацентарной крови. Перфузионная жидкость становится более бесцветной по мере прохождения перфузии и смыва с плаценты остаточных клеток пуповинной крови. Как правило, 30-100 мл перфузионной жидкости достаточно для первоначального смыва крови с плаценты, но можно использовать больше или меньше перфузионной жидкости в зависимости от наблюдаемых результатов.

Объем перфузионной жидкости, используемой для перфузии плаценты, может меняться в зависимости от количества подлежащих сбору клеток плаценты, размера плаценты, количества сборов, которое необходимо получить с одной плаценты и т.д. В различных вариантах осуществления объем перфузионной жидкости может составлять 50 мл-5000 мл, 50 мл-4000 мл, 50 мл-3000 мл, 100 мл-2000 мл, 250 мл-2000 мл, 500 мл-2000 мл или 750 мл-2000 мл. Как правило, проводят перфузию плаценты с помощью 700-800 мл перфузионной жидкости после обескровливания.

Перфузию плаценты можно проводить множество раз на протяжении нескольких часов или нескольких суток. Когда плацента предназначена для многократной перфузии, ее можно поддерживать или культивировать в стерильных условиях в контейнере или другом подходящем сосуде, и проводить перфузию с помощью композиции для сбора клеток или общепринятого перфузионного раствора (например, нормального солевого раствора, такого как фосфатно-солевой буфер («PBS») в присутствии или в отсутствие антикоагулянта (например, гепарина, варфарина натрия, кумарина, бисгидроксикумарина), и/или в присутствии или в отсутствие противомикробного средства (например, β-меркаптоэтанола (0,1 мМ); антибиотиков, таких как стрептомицин (например, при 40-100 мкг/мл), пенициллин (например, при 40 Ед./мл), амфотерицин B (например, при 0,5 мкг/мл). В одном варианте осуществления выделенную плаценту поддерживают или культивируют в течение какого-либо периода времени без сбора перфузата, так что плаценту поддерживают или культивируют в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов, или 2 или 3 или более суток до перфузии и сбора перфузата. Плаценту после перфузии можно поддерживать в течение одного или нескольких дополнительных периода(периодов) времени, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более часов, и проводить перфузию второй раз, например, с помощью 700-800 мл перфузионной жидкости. Перфузию плаценты можно проводить 1, 2, 3, 4, 5 или более раз, например, один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В предпочтительном варианте осуществления перфузию плаценты и сбор перфузионного раствора, например, композиции для сбора клеток плаценты, повторяют, пока количество выделенных ядросодержащих клеток не упадет ниже 100 клеток/мл. Перфузаты в различных временных точках можно далее перерабатывать по отдельности для выделения изменяющихся со временем популяций клеток, например, общих ядросодержащих клеток. Перфузаты из различных временных точек также можно объединять.

5.3.4. Перфузат плаценты и клетки перфузата плаценты

В конкретных вариантах осуществления, перфузат или клетки перфузата подвергают криоконсервации. В других конкретных вариантах осуществления перфузат плаценты содержит, или клетки перфузата содержат, только эмбриональные клетки, или комбинацию эмбриональных клеток и материнских клеток.

Как правило, перфузат плаценты после однократной перфузии плаценты содержит от приблизительно 100 миллионов до приблизительно 500 миллионов ядросодержащих клеток. В конкретных вариантах осуществления перфузат плаценты или клетки перфузата содержат CD34⁺ клетки, например, гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники. Такие клетки могут, в более конкретном варианте осуществления, содержать CD34⁺CD45^- стволовые клетки или клетки-предшественники, CD34⁺CD45⁺ стволовые клетки или клетки-предшественники, предшественники миелоидных клеток, предшественники лимфоидных клеток, и/или предшественники эритроидных клеток. В других вариантах осуществления, перфузат плаценты и клетки перфузата плаценты содержат адгерентные плацентарные стволовые клетки, например, CD34^- стволовые клетки. В других вариантах осуществления перфузат плаценты и клетки перфузата плаценты содержат, например, предшественники эндотелиальных клеток, остеогенные клетки-предшественники и естественные киллерные клетки.

5.4. Разрушение и расщепление ткани плаценты

Естественные киллерные клетки плаценты, например, PINK-клетки, можно, например, получать из ткани плаценты, механически и/или ферментативно разрушенной.

Ткань плаценты можно разрушать с использованием одного или нескольких ферментов для разрушения ткани, например, металлопротеиназы, сериновой протеазы, нейтральной протеазы, РНКазы или ДНКазы, или т.п. Такие ферменты включают в себя в качестве неограничивающих примеров, коллагеназы (например, коллагеназу I, II, III или IV, коллагеназу из Clostridium histolyticum и т.д.); диспазу, термолизин, эластазу, трипсин, LIBERASE, гиалуронидазу и т.п. Как правило, после расщепления, расщепленную ткань пропускают через сито или фильтр для удаления частично расщепленных агрегатов клеток, оставляя суспензию по существу отдельных клеток.

5.5. Естественные киллерные клетки плаценты

Один аспект, представленный в настоящем документе, относится к выделению, характеризации и использованию естественных киллерных клеток, которые можно получать из плаценты, например, из перфузата плаценты и/или из механически и/или ферментативно разрушенной ткани плаценты, и композиций, содержащих такие естественные киллерные клетки. В конкретном варианте осуществления естественные киллерные клетки плаценты представляют собой «промежуточные естественные киллерные клетки плаценты» или клетки «PINK», характеризующиеся тем, что являются CD56⁺CD16^-, т.е., экспонирующими клеточный маркер CD56 и лишенными клеточного маркера CD16, например, как определено проточной цитометрией, например, активированной флуоресценцией сортировкой клеток с использованием антител против CD16 и CD56, как описано выше. По существу, в настоящем документе представлены выделенные PINK-клетки и выделенные совокупности PINK-клеток. В настоящем документе представлены также выделенные совокупности клеток, содержащие CD56⁺CD16^- PINK-клетки в сочетании с CD56⁺CD16⁺ естественными киллерными клетками. В более конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки CD56⁺CD16⁺ можно выделять из плаценты или из другого источника, например, периферической крови, пуповинной крови, костного мозга или т.п. Таким образом, в различных других вариантах осуществления PINK-клетки можно комбинировать, например, с естественными киллерными клетками CD56⁺CD16⁺, например, в соотношениях приблизительно 1:10, 2:9, 3:8, 4:7:, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 или приблизительно 9:1. Как используют в этом контексте, «выделенный» означает, что клетки удалены из их нормального окружения, например, плаценты.

В конкретных вариантах осуществления PINK-клетки являются CD3^-. В конкретных вариантах осуществления PINK-клетки являются CD3^- и CD56⁺. В конкретных вариантах осуществления популяции естественных киллерных клеток, например, популяции PINK-клеток, содержат по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% CD3^-,CD56⁺ естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки. В конкретных вариантах осуществления любых из этих естественных киллерных клеток естественные киллерные клетки кроме того являются CD16^-.

В других вариантах осуществления PINK-клетки не экспонируют один или несколько клеточных маркеров, экспонируемых полностью зрелыми естественными киллерными клетками (например, CD16), или экспонируют такие один или несколько маркеров на поддающемся детекции более низком уровне по сравнению с полностью зрелыми естественными киллерными клетками, или экспонируют один или несколько клеточных маркеров, связанных с клетками-предшественниками естественных киллерных клеток, но не с полностью зрелыми естественными киллерными клетками. В конкретном варианте осуществления клетка PINK, представленная в настоящем документе, экспрессирует NKG2D, CD94 и/или NKp46, как определено, например, проточной цитометрией, на поддающемся детекции более низком уровне по сравнению с полностью зрелой NK-клеткой. В другом конкретном варианте осуществления множество PINK-клеток, представленных в настоящем документе, экспрессирует, в совокупности, NKG2D, CD94 и/или NKp46 на поддающемся детекции более низком уровне, чем эквивалентное количество полностью зрелых NK-клеток.

В конкретных вариантах осуществления PINK-клетки экспрессируют одну или несколько из микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a на поддающемся детекции более высоком уровне, чем естественные киллерные клетки периферической крови, как определено посредством, например, qRT-PCR. В другом варианте осуществления естественные киллерные клетки не экспрессируют микроРНК hsa-miR-199b или экспрессируют микроРНК hsa-miR-199b на поддающемся детекции более низком уровне, чем естественные киллерные клетки периферической крови, как определено посредством, например, qRT-PCR.

В конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки плаценты, например PINK-клетки, размножают в культуре. В других конкретных вариантах осуществления клетки перфузата плаценты размножают в культуре. В конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты размножают в присутствии фидерного слоя и/или в присутствии по меньшей мере одного цитокина. В более конкретном варианте осуществления указанный фидерный слой содержит клетки K562 или мононуклеарные клетки периферической крови. В другом более конкретном варианте осуществления указанный по меньшей мере один цитокин представляет собой интерлейкин-2.

Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к выделенной совокупности (например, популяции) PINK-клеток. В другом конкретном варианте осуществления выделенную совокупность клеток получают посредством выделения клеток из перфузата плаценты на CD56-микробусинах. В различных конкретных вариантах осуществления популяция содержит по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или по меньшей мере приблизительно 99% PINK-клеток. В другом варианте осуществления совокупность PINK-клеток содержит PINK-клетки или состоит из PINK-клеток, которые не подвергнуты размножению; например, присутствуют, как собраны из перфузата плаценты. В другом варианте осуществления совокупность PINK-клеток содержит PINK-клетки или состоит из PINK-клеток, которые подвергнуты размножению. Способы размножения естественных киллерных клеток описаны, например, в Ohno et al., Публикация патентной заявки США No. 2003/0157713; смотри также Yssel et al., J. Immunol. Methods 72(l):219-227 (1984) и Litwin et al., J. Exp. Med. 178(4): 1321-1326 (1993), и в описании размножения естественных киллерных клеток в примере 1, ниже.

В других вариантах осуществления выделенная совокупность PINK-клеток не экспонирует один или несколько клеточных маркеров, экспонируемых полностью зрелыми естественными киллерными клетками (например, CD16), или экспонирует такие один или несколько маркеров на поддающемся детекции более низком уровне по сравнению с полностью зрелыми естественными киллерными клетками, или экспонирует один или несколько клеточных маркеров, связанных с клетками-предшественниками естественных киллерных клеток, но не связанных с полностью зрелыми естественными киллерными клетками. В конкретном варианте осуществления клетка PINK, представленная в настоящем документе, экспрессирует NKG2D, CD94 и/или NKp46, как определено, например, проточной цитометрией, на поддающемся детекции более низком уровне по сравнению с полностью зрелой NK-клеткой. В другом конкретном варианте осуществления, множество PINK-клеток, представленных в настоящем документе, экспрессирует, в совокупности, NKG2D, CD94 и/или NKp46 на поддающемся детекции более низком уровне, чем эквивалентное количество полностью зрелых NK-клеток.

В конкретных вариантах осуществления популяция PINK-клеток экспрессирует одну или несколько из микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a на поддающемся детекции более высоком уровне, чем естественные киллерные клетки периферической крови, как определено посредством, например, количественной ПЦР с детекцией в реальном времени (qRT-PCR). В другом конкретном варианте осуществления популяция PINK-клеток экспрессирует поддающееся детекции более высокое количество гранзима B, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток периферической крови.

В других вариантах осуществления представленные в настоящем документе PINK-клетки размножают в культуре. В конкретных вариантах осуществления PINK-клетки культивируют, например, размножают в культуре, в течение по меньшей мере, приблизительно, или самое большее, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 суток. В конкретном варианте осуществления PINK-клетки культивируют в течение приблизительно 21 суток.

Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к выделенной популяции клеток, например, клеток плаценты, содержащей PINK-клетки. В конкретном варианте осуществления выделенная популяция клеток представляет собой общие ядросодержащие клетки из перфузата плаценты, например, клетки перфузата плаценты, содержащие аутологичные, выделенные PINK-клетки. В другом конкретном варианте осуществления популяция клеток представляет собой выделенную популяцию клеток, полученную выделением клеток из перфузата плаценты на CD56-микробусинах. В различных конкретных вариантах осуществления популяция содержит по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или по меньшей мере приблизительно 99% PINK-клеток.

Поскольку послеродовая плацента содержит ткани и клетки от эмбриона и от матери, перфузат плаценты, в зависимости от способа сбора, может содержать только эмбриональные клетки, или подавляющее большинство эмбриональных клеток (например, более, чем приблизительно 90%, 95%, 98% или 99%), или может содержать смесь эмбриональных и материнских клеток (например, эмбриональные клетки содержат менее приблизительно 90%, 80%, 70%, 60%, или 50% общих ядросодержащих клеток перфузата). В одном варианте осуществления PINK-клетки происходят только из эмбриональных клеток плаценты, например, клеток, полученных перфузией плаценты по замкнутому контуру (см. выше), где при перфузии получают перфузат, содержащий подавляющее большинство эмбриональных клеток плаценты или только эмбриональные клетки плаценты. В другом варианте осуществления PINK-клетки получены из эмбриональных и материнских клеток, например, клеток, полученных при перфузии пан-способом (смотри выше), где при перфузии получают перфузат, содержащий смесь эмбриональных и материнских клеток плаценты. Таким образом, один вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к популяции происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток, подавляющее большинство которых имеют эмбриональный генотип. Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к популяции происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток, содержащей естественные киллерные клетки, имеющие эмбриональный генотип, и естественные киллерные клетки, имеющие материнский фенотип.

В настоящем документе представлены также популяции происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток, содержащие естественные киллерные клетки из не относящегося к плаценте источника. Например, один из вариантов осуществления, представленных в настоящем документе, относится к популяции PINK-клеток, содержащей также естественные киллерные клетки из пуповинной крови, периферической крови, костного мозга или комбинацию двух или более из вышеуказанного. Популяции естественных киллерных клеток, содержащие PINK-клетки и естественные киллерные клетки из не относящегося к плаценте источника, могут содержать клетки, например, в соотношении приблизительно 1:10, 2:9, 3:8, 4:7:, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 10:1, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, или приблизительно 1:100 или т.п.

Кроме того, в настоящем документе представлены комбинации пуповинной крови и выделенных PINK-клеток. В различных вариантах осуществления пуповинную кровь комбинируют с PINK-клетками при приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸ или 5×10⁸, или более, PINK-клеток на миллилитр пуповинной крови.

В настоящем документе представлены также способы выделения PINK-клеток. В одном варианте осуществления PINK-клетки собирают посредством получения перфузата плаценты, затем контакта перфузата плаценты с композицией, специфически связывающей CD56⁺ клетки, например, антителом против CD56, с последующим выделением CD56⁺ клеток на основании указанного связывания для получения популяции CD56⁺ клеток. Популяция клеток CD56⁺ содержит выделенную популяцию естественных киллерных клеток. В конкретном варианте осуществления клетки CD56⁺ приводят в контакт с композицией, специфически связывающей CD16⁺ клетки, например, антителом против CD16, и исключают CD16⁺ клетки из популяции CD56⁺ клеток. В другом конкретном варианте осуществления CD3⁺ клетки также исключают из популяции CD56⁺ клеток.

В одном варианте осуществления PINK-клетки можно получать из перфузата плаценты следующим образом. Из послеродовой плаценты человека выпускают кровь и проводят перфузию, например, с помощью приблизительно 200-800 мл перфузионного раствора, только через сосудистую систему плаценты. В конкретном варианте осуществления из плаценты выпускают пуповинную кровь и промывают ее, например, с помощью перфузионного раствора, через сосудистую систему плаценты для удаления остаточной крови перед указанной перфузией. Перфузат собирают и обрабатывают для удаления всех остаточных эритроцитов. Естественные киллерные клетки из общих ядросодержащих клеток в перфузате можно выделять на основе экспрессии CD56 и CD16. В конкретных вариантах осуществления выделение PINK-клеток включает в себя выделение с использованием антитела против CD56, где выделенные клетки являются CD56⁺. В другом варианте осуществления выделение PINK-клеток включает в себя выделение с использованием антитела против CD16, где выделенные клетки являются CD16^-. В другом варианте осуществления выделение PINK-клеток включает в себя выделение с использованием антитела против CD56, и исключение совокупности не относящихся к PINK клеток с использованием антитела против CD16, где выделенные клетки содержат CD56⁺,CD16^- клетки.

После получения суспензии клеток плаценты, например, из перфузата плаценты или из ферментативно расщепленной ткани плаценты, естественные киллерные клетки можно выделять или обогащать с использованием, например, антител против CD3 и CD56. В конкретном варианте осуществления естественные киллерные клетки плаценты выделяют посредством отбора клеток, являющихся CD56⁺, для получения первой популяции клеток; контакта указанной первой популяции клеток с антителами, специфическими для CD3 и/или CD16; и удаления клеток, являющихся CD3⁺ или CD16⁺, из указанной первой популяции клеток с получением таким образом второй популяции клеток, являющихся по существу CD56⁺ и CD3^-, CD56⁺ и CD16^-, или CD56⁺, CD3^- и CD16^-.

В одном из аспектов в настоящем документе представлен способ выделения естественных киллерных клеток плаценты, включающий в себя получение совокупности клеток плаценты, и выделение естественных киллерных клеток из указанной совокупности клеток плаценты. В конкретном варианте осуществления клетки плаценты представляют собой или содержат клетки перфузата плаценты, например, общие ядросодержащие клетки из перфузата плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанная совокупность клеток плаценты представляет собой или содержит клетки плаценты, полученные механическим и/или ферментативным расщеплением ткани плаценты. В другом варианте осуществления указанное выделение проводят с использованием одного или нескольких антител. В более конкретном варианте осуществления, указанные одно или несколько антител включают в себя одно или несколько антител против CD3, CD16 или CD56. В более конкретном варианте осуществления указанное выделение включает в себя отделение CD56⁺ клеток от CD56^- клеток в указанной совокупности клеток плаценты. В более конкретном варианте осуществления указанное выделение включает в себя отделение CD56⁺, CD16^- клеток плаценты, например, естественных киллерных клеток плаценты, например, PINK-клеток, от клеток плаценты, являющихся CD56^- или CD16⁺. В более конкретном варианте осуществления указанное выделение включает в себя отделение CD56⁺, CD16^-,CD3^- клеток плаценты от клеток плаценты, являющихся CD56^-, CD16⁺, или CD3⁺. В другом варианте осуществления NK-клетки из плаценты, например, PINK-клетки, выделяют или обогащают посредством контакта совокупности клеток, содержащих NK-клетки, с антителом против CD5 и с антителом против CD56, и выделения клеток, являющихся CD56⁺ и CD5^-, где указанные CD56⁺ и CD5^- являются обогащенными естественными киллерными клетками плаценты, например, PINK-клетками. В другом варианте осуществления указанным способом выделения естественных киллерных клеток плаценты получают популяцию клеток плаценты, которые по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или по меньшей мере на 99% представляют собой CD56⁺,CD16^- естественные киллерные клетки.

Разделение клеток можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, проточной цитометрией, активированной флуоресценцией сортировкой клеток (FACS), или магнитной сортировкой клеток с использованием микробусин, конъюгированных со специфическими антителами. Клетки можно выделять, например, с использованием способа магнитной сортировки активированных клеток (MACS), способа разделения частиц, основанного на их способности связывать магнитные бусины (например, диаметром приблизительно 0,5-100 мкм), содержащие одно или несколько специфических антител, например, анти-CD56 антител. Магнитное разделение клеток можно проводить и автоматизировать с использованием, например, сепаратора AUTOMACS™ (Miltenyi). Для магнитных микросфер можно осуществлять множество полезных модификаций, включая ковалентное добавление антитела, специфически узнающего конкретную молекулу поверхности клеток или гаптен. Затем бусины смешивают с клетками, чтобы позволить связывание. Затем клетки пропускают через магнитное поле для отделения клеток, обладающих специфическим маркером поверхности клеток. В одном варианте осуществления эти клетки затем можно выделять и снова смешивать с магнитными бусинами с присоединенным антителом против дополнительных маркеров поверхности клеток. В этом варианте осуществления клетки снова пропускают через магнитное поле, выделяя клетки, связывающие оба антитела. Затем такие клетки можно разводить в отдельных чашках, таких как чашки для микротитрования, для клонального выделения. Необязательно, выделение или обогащение естественных киллерных клеток можно подтверждать анализом цитотоксичности с использованием клеток опухолей, например, культивированных клеток опухолей K562 или т.п., в качестве клеток-мишеней.

5.6. Естественные киллерные клетки плаценты из совпадающих перфузата и пуповинной крови

Кроме того, в настоящем документе представлены естественные киллерные клетки, которые получают и которые можно получать из комбинаций совпадающих единиц перфузата плаценты и пуповинной крови, обозначенные в настоящем документе как комбинированные естественные киллерные клетки. «Совпадающие единицы», как применяют в настоящем документе, указывают на то, что NK-клетки получены из клеток перфузата плаценты и клеток пуповинной крови, где клетки пуповинной крови получены из пуповинной крови из плаценты, из которой получен перфузат плаценты, т.е., клетки перфузата плаценты и клетки пуповинной крови, и таким образом, естественные киллерные клетки из каждых из них, происходят от одного и того же индивидуума.

В конкретных вариантах осуществления комбинированные киллерные клетки плаценты содержат только, или по существу только естественные киллерные клетки, являющиеся CD56⁺ и CD16^-. В других конкретных вариантах осуществления комбинированные киллерные клетки плаценты содержат NK-клетки, являющиеся CD56⁺ и CD16^-, и NK-клетки, являющиеся CD56⁺ и CD16⁺. В конкретных вариантах осуществления комбинированные киллерные клетки плаценты содержат по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% CD56⁺CD16^- естественных киллерных клеток (PINK-клеток). В конкретных вариантах осуществления естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, кроме того, являются CD3^-.

В одном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки не культивируют. В конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD16^- естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺2B4⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺CD94⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

В другом варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки культивируют, например, в течение 21 суток. В конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки не культивируют. В другом конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp44⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови. В конкретном варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки содержат поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

В другом варианте осуществления комбинированные естественные киллерные клетки экспрессируют поддающееся детекции большее количество гранзима B, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

Кроме того, в настоящем документе представлены комбинации пуповинной крови и комбинированных естественных киллерных клеток. В различных вариантах осуществления пуповинную кровь комбинируют с комбинированными естественными киллерными клетками при приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ комбинированных естественных киллерных клеток на миллилитр пуповинной крови.

5.7. Комбинации перфузата/клеток

В дополнение к перфузату плаценты, клеткам перфузата плаценты, комбинированным естественным киллерным клеткам и естественным киллерным клеткам плаценты, например, промежуточным естественным киллерным клеткам плаценты, в настоящем документе представлены композиции, содержащие перфузат или клетки, для использования для супрессии пролиферации клетки опухоли или множества клеток опухолей.

5.7.1. Комбинации перфузата плаценты, клеток перфузата и происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток

Кроме того, в настоящем документе представлены композиции, содержащие комбинации перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты, естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, и/или комбинированных естественных киллерных клеток, описанных в разделах выше. Один из вариантов осуществления, представленных в настоящем документе, относится, например, к какому-либо объему перфузата плаценты, дополненному клетками перфузата плаценты и/или естественными киллерными клетками, например, промежуточными естественными киллерными клетками плаценты, например, полученными из клеток перфузата плаценты или ткани плаценты, механически или ферментативно разрушенной. В конкретных вариантах осуществления, например, каждый миллилитр перфузата плаценты дополнен приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более клеток перфузата плаценты, естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты и/или комбинированных естественных киллерных клеток. В другом варианте осуществления клетки перфузата плаценты дополнены перфузатом плаценты, промежуточными естественными киллерными клетками плаценты, и/или комбинированными естественными киллерными клетками. В другом варианте осуществления естественные киллерные клетки, например, промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, дополнены перфузатом плаценты, клетками перфузата плаценты и/или комбинированными естественными киллерными клетками.

В конкретных вариантах осуществления, когда перфузат используют для дополнения, объем перфузата составляет приблизительно, более, чем приблизительно, или менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% общего объема клеток (в растворе) плюс перфузат. В других конкретных вариантах осуществления, когда клетки перфузата плаценты комбинируют с совокупностью естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток и/или комбинированных естественных киллерных клеток, клетки перфузата плаценты, как правило, составляют приблизительно, более, чем приблизительно, или менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% общего количества клеток. В других конкретных вариантах осуществления, когда естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, комбинируют с совокупностью клеток перфузата плаценты и/или комбинированных естественных киллерных клеток, NK-клетки, как правило, составляют приблизительно, более, чем приблизительно, или менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% общего количества клеток. В других конкретных вариантах осуществления, когда комбинированные естественные киллерные клетки комбинируют с естественными киллерными клетками, например, PINK-клетками, и/или клетками перфузата плаценты, комбинированные естественные киллерные клетки, как правило, составляют приблизительно, более, чем приблизительно, или менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% общего количества клеток. В других конкретных вариантах осуществления, когда естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, комбинированные естественные киллерные клетки или клетки перфузата плаценты используют для дополнения перфузата плаценты, объем раствора (например, солевого раствора, культуральной среды или т.п.), в котором суспендируют клетки, составляет приблизительно, более, чем приблизительно, или менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% общего объема перфузата плюс клетки, где NK-клетки суспендируют до приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более клеток на миллилитр перед дополнением.

В других вариантах осуществления любую из вышеуказанных комбинаций клеток, в свою очередь, комбинируют с пуповинной кровью или ядросодержащими клетками из пуповинной крови.

Кроме того, в настоящем документе представлен объединенный перфузат плаценты, который получают из двух или более источников, например, двух или более плацент, и комбинируют, например, объединяют. Такой объединенный перфузат может содержать приблизительно равные объемы перфузата из каждого источника или может содержать различные объемы из каждого источника. Относительные объемы из каждого источника могут быть выбраны случайным образом или могут быть основаны, например, на концентрации или количестве одного или нескольких клеточных факторов, например, цитокинов, факторов роста, гормонов или т.п.; количестве клеток плаценты в перфузате из каждого источника; или других характеристиках перфузата из каждого источника. Перфузат после многократных перфузий одной и той же плаценты можно подобным образом объединять.

Подобным образом, в настоящем документе представлены клетки перфузата плаценты и происходящие из плаценты промежуточные естественные киллерные клетки, полученные из двух или более источников, например, двух или более плацент, и объединенные. Такие объединенные клетки могут содержать приблизительно равные количества клеток из двух или более источников, или различные количества клеток из одного или нескольких объединенных источников. Относительные количества клеток из каждого источника могут быть выбраны на основании, например, количества одного или нескольких конкретных типов клеток в клетках, подлежащих объединению, например, количества CD34⁺ клеток, количества CD56⁺ клеток и т.д.

Пулы могут содержать, например, перфузат плаценты, дополненный клетками перфузата плаценты; перфузат плаценты, дополненный происходящими из плаценты промежуточными естественными киллерными клетками (PINK); перфузат плаценты, дополненный как клетками перфузата плаценты, так и PINK-клетками; клетки перфузата плаценты, дополненные перфузатом плаценты; клетки перфузата плаценты, дополненные PINK-клетками; клетки перфузата плаценты, дополненные как перфузатом плаценты, так и PINK-клетками; PINK-клетки, дополненные перфузатом плаценты; PINK-клетки, дополненные клетками перфузата плаценты; или PINK-клетки, дополненные как клетками перфузата плаценты, так и перфузатом плаценты.

Кроме того, в настоящем документе представлены перфузат плаценты, клетки перфузата плаценты и промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, и их пулы или их комбинации, проанализированные для определения степени или количества супрессии опухолей (то есть, активности), которых можно ожидать, например, от данного количества перфузата плаценты или PINK-клеток, или данного объема перфузата. Например, аликвоту или тестовое количество клеток приводят в контакт с известным количеством клеток опухолей в условиях, при которых клетки опухолей в ином случае подвергаются пролиферации, и степень пролиферации клеток опухолей в присутствии перфузата плаценты, клеток перфузата, естественных киллерных клеток плаценты или их комбинаций, с течением времени (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель, или дольше) сравнивают с пролиферацией эквивалентного количества клеток опухолей в отсутствие перфузата, клеток перфузата, естественных киллерных клеток плаценты или их комбинаций. Активность перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты и/или PINK-клеток, или их комбинаций или пулов, можно выражать, например, как количество клеток или объем раствора, необходимые для супрессии роста клеток опухоли, например, приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или т.п.

В конкретных вариантах осуществления перфузат плаценты, клетки перфузата плаценты и PINK-клетки предоставлены в качестве пригодных для введения единиц фармацевтической степени очистки. Такие единицы можно предоставлять в дискретных объемах, например, 100 мл, 150 мл, 200 мл, 250 мл, 300 мл, 350 мл, 400 мл, 450 мл, 500 мл или т.п. Такие единицы можно предоставлять таким образом, чтобы они содержали указанное количество, например, клеток перфузата плаценты, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты или и тех, и других, например, 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более клеток на единицу. Такие единицы можно предоставлять таким образом, чтобы они содержали указанное количество любых двух, или всех трех, из перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты и/или PINK-клеток.

В вышеуказанных комбинациях перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты и/или PINK-клеток, любое одно, любые два или все три из перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты и/или PINK-клеток могут быть аутологичными для реципиента (то есть, полученными от реципиента) или гомологичными для реципиента (то есть, полученными по меньшей мере от одного индивидуума, отличного от указанного реципиента).

Любые из вышеуказанных комбинаций или пулов PINK-клеток, клеток перфузата плаценты и/или перфузата плаценты могут содержать CD56⁺CD16⁺ естественные киллерные клетки, например, из перфузата плаценты, периферической крови, пуповинной крови, костного мозга или т.п. В конкретных вариантах осуществления комбинации содержат приблизительно, по меньшей мере приблизительно или не более чем приблизительно 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более таких естественных киллерных клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более клеток на единицу. CD56⁺CD16⁺ естественные киллерные клетки можно использовать, как выделено из природного источника, или можно размножать до включения в одну из вышеуказанных комбинаций или пулов. CD56⁺CD16⁺ NK-клетки могут быть аутологичными (то есть, полученными от того же самого индивидуума, что и перфузат плаценты, клетки перфузата плаценты и/или PINK-клетки; или полученными от реципиента) или гомологичными (то есть, полученными от индивидуума, отличного от того, от которого получены перфузат плаценты, клетки перфузата плаценты и/или PINK-клетки; или от индивидуума, не являющегося реципиентом).

Предпочтительно, каждую единицу маркируют для указания объема, количества клеток, типа клеток, того, является ли единица обогащенной конкретным типом клеток, активности данного количества клеток в единице, или данного количества миллилитров в единице, и/или того, вызывают ли клетки поддающуюся измерению супрессию пролиферации конкретного типа или типов клеток опухолей.

В настоящем документе представлены также композиции, содержащие промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, отдельно или в сочетании с клетками перфузата плаценты и/или перфузатом плаценты. Таким образом другой аспект, представленный в настоящем документе, относится к композиции, содержащей выделенные CD56⁺,CD16^- естественные киллерные клетки, где указанные естественные киллерные клетки выделены из перфузата плаценты, и где указанные естественные киллерные клетки составляют по меньшей мере 50% клеток в композиции. В конкретном варианте осуществления указанные естественные киллерные клетки составляют по меньшей мере 80% клеток в композиции. В другом конкретном варианте осуществления, указанная композиция содержит выделенные CD56⁺, CD16⁺ естественные киллерные клетки. В более конкретном варианте осуществления указанные CD56⁺,CD16⁺ естественные киллерные клетки происходят от другого индивидуума, чем указанные CD56⁺,CD16^- естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления, указанные естественные киллерные клетки происходят от одного индивидуума. В более конкретном варианте осуществления указанные выделенные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки по меньшей мере от двух различных индивидуумов. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит выделенный перфузат плаценты. В более конкретном варианте осуществления указанный перфузат плаценты происходит от того же самого индивидуума, что и указанные естественные киллерные клетки. В другом более конкретном варианте осуществления указанный перфузат плаценты содержит перфузат плаценты от другого индивидуума, чем указанные естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит клетки перфузата плаценты. В более конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты происходят из того же индивидуума, что указанные естественные киллерные клетки. В другом более конкретном варианте осуществления указанные клетки перфузата плаценты происходят от другого индивидуума, чем указанные естественные киллерные клетки. В другом конкретном варианте осуществления композиция дополнительно содержит выделенный перфузат плаценты и выделенные клетки перфузата плаценты, где указанный выделенный перфузат и указанные выделенные клетки перфузата плаценты происходят из различных индивидуумов. В другом более конкретном варианте осуществления любого из вышеуказанных вариантов осуществления, включающего в себя перфузат плаценты, указанный перфузат плаценты содержит перфузат плаценты по меньшей мере от двух индивидуумов. В другом более конкретном варианте осуществления любого из вышеуказанных вариантов осуществления, включающего в себя клетки перфузата плаценты, указанные выделенные клетки перфузата плаценты происходят по меньшей мере из двух индивидуумов.

5.7.2. Композиции, содержащие адгерентные плацентарные стволовые клетки

В других вариантах осуществления перфузат плаценты, совокупность клеток перфузата плаценты, и/или совокупность PINK-клеток, или комбинацию или пул любого из вышеуказанного, дополняют выделенными адгерентными клетками плаценты, например, плацентарными стволовыми клетками, как описано, например, в Патентах США No. 7045148 и 7255879, и в Публикациях патентных заявок США No. 2007/0275362 и 2008/0032401, полные описания которых приведены в настоящем описании в качестве ссылки. «Адгерентные клетки плаценты» означает, что клетки являются адгерентными по отношению к пластику для культивирования клеток. Термин «клетки плаценты», как применяют в настоящем документе, не включает в себя естественные киллерные клетки, если конкретно не указано иначе. Адгерентные клетки плаценты, используемые в композициях и способах, описанных в настоящем документе, не являются трофобластами, эмбриональными зародышевыми клетками или эмбриональными стволовыми клетками.

Перфузат плаценты, совокупность клеток перфузата плаценты, и/или совокупность естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, или комбинацию или пул любого из вышеуказанного можно дополнять, например, 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸ или более клеток на миллилитр, или 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более адгерентных клеток плаценты. Адгерентные клетки плаценты в комбинациях могут представлять собой, например, адгерентные клетки плаценты, культивированные в течение, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений популяций, или более.

Выделенные адгерентные клетки плаценты при культивировании в первичных культурах или в культуре клеток проявляют адгезию к субстрату для культивирования клеток, например, к поверхности контейнера для культивирования клеток (например, к пластику для культивирования клеток). Адгерентные клетки плаценты в культуре принимают в основном фибробластоидный, звездчатый вид, с несколькими цитоплазматическими отростками, распространяющимися от основного тела клетки. Однако адгерентные клетки плаценты можно морфологически отличать от фибробластов, культивируемых в таких же условиях, поскольку адгерентные клетках плаценты имеют большее количество таких отростков, чем фибробласты. Морфологически, адгерентные клетки плаценты можно также отличать от гематопоэтических стволовых клеток, которые, как правило, принимают в культуре более округлую или подобную булыжной мостовой морфологию.

Выделенные адгерентные клетки плаценты и популяции адгерентных клеток плаценты, используемые в композициях и способах, представленных в настоящем документе, экспрессируют множество маркеров, которые можно использовать для идентификации и/или выделения клеток или популяций клеток, содержащих адгерентные клетки плаценты. Адгерентные клетки плаценты и популяции адгерентных клеток плаценты, используемые в композициях и способах, представленных в настоящем документе, включают в себя адгерентные клетки плаценты и содержащие адгерентные клетки плаценты популяции клеток, полученные непосредственно из плаценты или любой его части (например, амнион, хорион, амнионально-хориальная пластинка, котиледоны плаценты, пуповина и т.п.). Популяция адгерентных плацентарных стволовых клеток, в одном варианте осуществления, представляет собой популяцию (то есть, две или более) адгерентных плацентарных стволовых клеток в культуре, например, популяцию в контейнере, например, в пакете.

В конкретных вариантах осуществления, выделенные адгерентные клетки плаценты представляют собой выделенные плацентарные стволовые клетки. В других конкретных вариантах осуществления выделенные клетки плаценты представляют собой выделенные мультипотентные клетки плаценты. В одном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD34^-, CD10⁺ и CD105⁺, как детектировано проточной цитометрией. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты обладают потенциалом для дифференцировки в клетки, имеющие характеристики нервной клетки, клетки, имеющие характеристики остеогенной клетки, и/или клетки, имеющие характеристики хондрогенной клетки, например, in vitro или in vivo, или in vitro и in vivo. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD45^- или CD90⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD45^- и CD90⁺, как детектировано проточной цитометрией. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ или CD45^-, как детектировано проточной цитометрией. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ и CD45^-, как детектировано проточной цитометрией, т.е., клетки представляют собой CD34^-, CD10⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺ и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления, указанные CD34^-, CD10⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки, кроме того, являются CD44⁺, CD80^- и/или CD86^-. В другом конкретном варианте осуществления, указанные CD34^-, CD10⁺, CD44⁺, CD45^-, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки, кроме того, являются одним или несколькими из CD80^-, CD86^-, CD117^-, CD133^-, цитокератин⁺, KDR⁺, HLA-A,B,C⁺, HLA-DR,DP,DQ^- и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки, кроме того, являются одним или несколькими из SSEA1^-, SSEA3^- и/или SSEA4^-. В другом конкретном варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки, кроме того, являются SSEA1^-, SSEA3^- и SSEA4^-.

В конкретных вариантах осуществления указанные клетки плаценты представляют собой CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ и CD200⁺, и одно или несколько из CD38^-, CD45^-, CD80^-, CD86^-, CD133^-, HLA-DR,DP,DQ^-, SSEA3^-, SSEA4^-, CD29⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, HLA-A,B,C⁺, PDL1⁺, ABC-p⁺ и/или OCT-4⁺, как детектировано проточной цитометрией. В других вариантах осуществления любые из CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клеток, описанных выше, кроме того, являются одним или несколькими из CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, SH3⁺ или SH4⁺. В другом конкретном варианте осуществления клетки, кроме того, являются CD44⁺. В другом конкретном варианте осуществления любых из выделенных CD34^-,CD10⁺,CD105⁺ клеток плаценты выше, клетки, кроме того, являются одним или несколькими из CD117^-, CD133^-, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, или лиганд-1 программируемой гибели клеток (PDL1)⁺, или любой комбинацией этого.

В другом варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются одним или несколькими из CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^низкий, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G^-, или лиганд-1 программируемой гибели клеток (PDL1)⁺ или любой комбинацией этого. В другом варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD 106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^низкий, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-р⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G^- и лиганд-1 программируемой гибели клеток (PDL1)⁺.

В другом конкретном варианте осуществления любые из клеток плаценты, описанных в настоящем документе, являются ABC-p⁺, как детектировано проточной цитометрией, или OCT-4⁺ (POU5F1⁺), как определено посредством ОТ-ПЦР, где ABC-p представляет собой специфический для плаценты транспортерный белок ABC (известный также как белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP) и как белок устойчивости к митоксантрону (MXR)), и OCT-4 представляет собой белок октамер-4 (POU5F1). В другом конкретном варианте осуществления любые из клеток плаценты, описанных в настоящем документе, кроме того, являются SSEA3^- или SSEA4^-, как определено проточной цитометрией, где SSEA3 представляет собой стадиеспецифический эмбриональный антиген 3, и SSEA4 представляет собой стадиеспецифический эмбриональный антиген 4. В другом конкретном варианте осуществления любые из клеток плаценты, описанных в настоящем документе, кроме того, являются SSEA3^- и SSEA4^-.

В другом конкретном варианте осуществления любые из клеток плаценты, описанных в настоящем документе, являются одним или несколькими из MHC-I⁺ (например, HLA-A,B,C⁺), MHC-II^- (например, HLA-DP,DQ,DR^-) или HLA-G^-.

В настоящем документе представлены также популяции выделенных клеток плаценты или популяции клеток, например, популяции клеток плаценты, содержащие, например, в результате обогащения, выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе. Предпочтительные популяции клеток содержат выделенные клетки плаценты, где популяции клеток содержат, например, по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% выделенных CD10⁺, CD105⁺ и CD34^- клеток плаценты; то есть, по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% клеток в указанной популяции представляют собой выделенные CD10⁺, CD105⁺ и CD34^- клетки плаценты. В конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ или CD45^-, как детектировано проточной цитометрией. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ и CD45^-, как детектировано проточной цитометрией. В другом конкретном варианте осуществления любые из выделенных CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клеток плаценты, описанные выше, кроме того, являются одним или несколькими из CD29⁺, CD38^-, CD44⁺, CD54⁺, SH3⁺ или SH4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты или выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD44⁺. В конкретном варианте осуществления любой из популяций клеток, содержащей выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты, выше, выделенные клетки плаценты, кроме того, являются одним или несколькими из CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^низкий, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G^-, или лиганд-1 программируемой гибели клеток (PDL1)⁺, или любой их комбинацией. В другом конкретном варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки, кроме того, являются CD13⁺, CD29⁺, CD33⁺, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, SH3⁺ (CD73⁺), SH4⁺ (CD73⁺), CD80^-, CD86^-, CD90⁺, SH2⁺ (CD105⁺), CD106/VCAM⁺, CD117^-, CD144/VE-кадгерин^низкий, CD184/CXCR4^-, CD200⁺, CD133^-, OCT-4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, ABC-p⁺, KDR^- (VEGFR2^-), HLA-A,B,C⁺, HLA-DP,DQ,DR^-, HLA-G^- и лиганд-1 программируемой гибели клеток (PDL1)⁺.

В конкретных вариантах осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются одним или несколькими, или всеми, из CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺ и ABC-p⁺, где указанные выделенные клетки плаценты получают физическим и/или ферментативным разрушением ткани плаценты. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺ и ABC-p⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺ и CD34^-, где указанные выделенные клетки плаценты имеют по меньшей мере одну из следующих характеристик: CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, и SSEA4^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺, CD34^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺ и CD34^-, и являются либо SH2⁺, либо SH3⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺, CD34^-, SH2⁺ и SH3⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^-, и являются либо SH2⁺, либо SH3⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺ и CD34^-, и либо SH2⁺, либо SH3⁺, и являются по меньшей мере одним из CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SSEA3^- или SSEA4^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺, CD34^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SSEA3^- и SSEA4^-, и либо SH2⁺, либо SH3⁺.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ и OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, CD34^-, CD45^-, SSEA3^- или SSEA4^-. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^- и SSEA4^-, CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, OCT-4⁺, CD34^- или CD45^-.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺ и SH4⁺; где указанные выделенные клетки плаценты, кроме того, являются одним или несколькими из OCT-4⁺, SSEA3^- или SSEA4^-.

В конкретных вариантах осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются CD200⁺ или HLA-G^-. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD200⁺ и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты, кроме того, являются CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные стволовые клетки являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺ или HLA-G^- клетки плаценты способствуют формированию эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, содержащей выделенные клетки плаценты, в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся стволовыми или мультипотентными клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, CD200⁺, HLA-G^- стволовые клетки. В конкретном варианте осуществления указанная популяция представляет собой популяцию клеток плаценты. В различных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, или по меньшей мере приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD200⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD200⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В других конкретных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 99% указанных клеток являются выделенными CD200⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления популяций клеток указанные выделенные CD200⁺, HLA-G^- клетки плаценты являются также CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, HLA-G^- клетки плаценты являются также CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, HLA-G^- клетки плаценты являются также CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺ и CD105⁺. В другом варианте осуществления указанная популяция клеток образует одно или несколько эмбриоидоподобных телец при культивировании в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не являющихся стволовыми клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, HLA-G^- клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются CD73⁺, CD105⁺, и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD34^-, CD38^-, CD45^- и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺ и CD200⁺ клетки плаценты способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, содержащей выделенные клетки плаценты, когда популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся выделенными клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, выделенные CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетки плаценты. В различных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50% или по меньшей мере приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 70% указанных клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления указанных популяций выделенные клетки плаценты являются HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^-, CD45^- и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления указанная популяция клеток образует одно или несколько эмбриоидоподобных телец при культивировании в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся стволовыми клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не имеющих этих характеристик.

В других конкретных вариантах осуществления выделенные клетки плаценты являются одним или несколькими из CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3-, SSEA4^-, OCT-4⁺, HLA-G^- или ABC-p⁺. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^- и OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺ и SH4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD54⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ и OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, HLA-G^-, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺ и ABC-p⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺ и OCT-4⁺. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^-. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺, CD34^-, SSEA3^- и SSEA4^- клетки плаценты, кроме того, являются CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺ и SH4⁺. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются OCT-4⁺ и CD34^-, и либо SH3⁺, либо SH4⁺. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD34^- и либо CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD54⁺, CD90⁺, либо OCT-4⁺.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются CD200⁺ и OCT-4⁺. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты являются HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, содержащей выделенные клетки, когда популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся стволовыми клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не имеющих этих характеристик.

В другом варианте осуществления, популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, или по меньшей мере приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD200⁺, OCT-4⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 70% указанных клеток являются указанными выделенными CD200⁺, OCT-4⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 80%, 90%, 95%, или 99% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными CD200⁺, OCT-4⁺ клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления выделенных популяций указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD200⁺, OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления популяция клеток образует одно или несколько эмбриоидоподобных телец при культивировании в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не являющихся выделенными CD200⁺, OCT-4⁺ клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты способствуют формированию эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, содержащей указанные клетки, когда популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся выделенными CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, выделенные CD73⁺, CD105⁺ и HLA-G^- клетки плаценты. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, или по меньшей мере приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В другом варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В другом варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления вышеуказанных популяций указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не являющихся CD73⁺, CD105⁺, HLA-G^- клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются CD73⁺ и CD105⁺ и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции выделенных клеток плаценты, содержащей CD73⁺, CD105⁺ клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются OCT-4⁺, CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не имеющих этих характеристик.

В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, выделенные клетки плаценты, являющиеся CD73⁺, CD105⁺ и способствующие формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции выделенных клеток плаценты, содержащей указанные клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В различных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, или по меньшей мере приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными CD73⁺, CD105⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными CD73⁺, CD105⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными CD73⁺, CD105⁺ клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления вышеуказанных популяций указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются OCT-4⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD73⁺, CD105⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ и CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными выделенными CD73⁺, CD105⁺ клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются OCT-4⁺ и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции выделенных клеток плаценты, содержащей указанные клетки, при культивировании в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся OCT-4⁺ клетки плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты отделяют от клеток плаценты, не имеющих этих характеристик.

В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, выделенные клетки плаценты, являющиеся OCT-4⁺ и способствующие формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции выделенных клеток плаценты, содержащей указанные клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец. В различных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, или по меньшей мере приблизительно 60% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными OCT-4⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 70% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными OCT-4⁺ клетками плаценты. В другом варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 80%, 90%, 95% или 99% клеток в указанной популяции клеток являются указанными выделенными OCT-4⁺ клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления вышеуказанных популяций указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- или CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD73⁺ и CD105⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные OCT-4⁺ клетки плаценты, кроме того, являются CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- и CD45^-. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными выделенными клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются выделенными HLA-A,B,C⁺, CD45^-, CD133^- и CD34^- клетками плаценты. В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую выделенные клетки плаценты, где по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток в указанной выделенной популяции клеток являются выделенными HLA-A,B,C⁺, CD45^-, CD133^- и CD34^- клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся HLA-A,B,C⁺, CD45^-, CD133^- и CD34^- клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления любых из клеток плаценты, описанных в настоящем документе, указанные выделенные клетки плаценты не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления указанная выделенная популяция клеток плаценты является по существу свободной от материнских компонентов; например, по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 5-0%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной выделенной популяции клеток плаценты не являются материнскими по происхождению.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются выделенными CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- и CD133^- клетками плаценты. В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую выделенные клетки плаценты, где по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- и CD133^- клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными выделенными клетками плаценты. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные CD10⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD45^-, CD117^- и CD133^- клетки плаценты не являются материнскими по происхождению, т.е., имеют эмбриональный генотип. В другом конкретном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной выделенной популяции клеток плаценты не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления, указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не имеющих этих характеристик.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются выделенными CD10^-, CD33^-, CD44⁺, CD45^-, и CD117^- клетками плаценты. В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, выделенные клетки плаценты, где по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными CD10^-, CD33^-, CD44⁺, CD45^-, и CD117^- клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются выделенными CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- и CD117^- клетками плаценты. В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую, например, в результате обогащения, выделенные CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- и CD117^- клетки плаценты, где по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток в указанной популяции являются CD10^-, CD13^-, CD33^-, CD45^- и CD117^- клетками плаценты. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не имеющих этих характеристик.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, являются HLA A,B,C⁺, CD45^-, CD34^- и CD133^-, и, кроме того, являются CD10⁺, CD13⁺, CD38⁺, CD44⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺ и/или HLA-G^-, и/или отрицательными по CD117. В другом варианте осуществления, популяция клеток, используемая в способах, описанных в настоящем документе, представляет собой популяцию клеток, содержащую выделенные клетки плаценты, где по меньшей мере приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или приблизительно 99% клеток в указанной популяции клеток являются выделенными клетками плаценты, которые являются HLA A,B,C^-, CD45^-, CD34^-, CD133^- и которые, кроме того, являются положительными по CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200, и/или отрицательными по CD117 и/или HLA-G. В конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не являющихся указанными клетками. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты или популяцию выделенных клеток плаценты отделяют от клеток плаценты, не экспонирующих эти маркеры.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные клетки плаценты, являющиеся CD200⁺ и CD10⁺, как определено по связыванию антитела, и CD117^-, как определено и по связыванию антитела, и по ОТ-ПЦР. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные клетки плаценты, например, плацентарные стволовые клетки или мультипотентные клетки плаценты, являющиеся CD10⁺, CD29^-, CD54⁺, CD200⁺, HLA-G^-, MHC класса I⁺ и β-2-микроглобулин⁺. В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляют собой клетки плаценты, где экспрессия по меньшей мере одного клеточного маркера по меньшей мере в два раза превышает экспрессию в мезенхимальной стволовой клетке (например, происходящей из костного мозга мезенхимальной стволовой клетке). В другом конкретном варианте осуществления указанные выделенные клетки плаценты не являются материнскими по происхождению. В другом конкретном варианте осуществления, по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% указанных клеток в указанной популяции клеток не являются материнскими по происхождению.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные клетки плаценты, например, плацентарные стволовые клетки или мультипотентные клетки плаценты, являющиеся одним или несколькими из CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62E^-, CD62L^-, CD62P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-кадгерин^низкий, CD184/CXCR4^-, β2-микроглобулин^низкий, MHC-I^низкий, MHC-II^-, HLA-G^низкий и/или PDL1^низкий. В конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются по меньшей мере CD29⁺ и CD54⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются по меньшей мере CD44⁺ и CD106⁺. В другом конкретном варианте осуществления выделенные клетки плаценты являются по меньшей мере CD29⁺.

В другом варианте осуществления популяция клеток, используемая в способах и композициях, описанных в настоящем документе, содержит выделенные клетки плаценты, и по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции клеток представляют собой выделенные клетки плаценты, являющиеся одним или нескольким из CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62-E^-, CD62-L^-, CD62-P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-кадгерин^{следовый}, CD184/CXCR4^-, β2-микроглобулин^{следовый}, HLA-I^{следовый}, HLA-II^-, HLA-G^{следовый}, и/или PDL1^{следовый}. В другом конкретном варианте осуществления, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% клеток в указанной популяции клеток являются CD10⁺, CD29⁺, CD44⁺, CD45^-, CD54/ICAM⁺, CD62-E^-, CD62-L^-, CD62-P^-, CD80^-, CD86^-, CD103^-, CD104^-, CD105⁺, CD106/VCAM⁺, CD144/VE-кадгерин^{следовый}, CD184/CXCR4^-, β2-микроглобулин^{следовый}, MHC-I^{следовый}, MHC-IF, HLA-G^{следовый} и PDL1^{следовый}.

В другом варианте осуществления выделенные клетки плаценты, используемые в способах и композициях, описанных в настоящем документе, представляют собой выделенные клетки плаценты, являющиеся одним или несколькими, или всеми, из CD10⁺, CD29⁺, CD34^-, CD38^-, CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD90⁺, SH2⁺, SH3⁺, SH4⁺, SSEA3^-, SSEA4^-, OCT-4⁺, и ABC-p⁺, где ABC-p представляет собой специфический для плаценты транспортерный белок ABC (известный также как белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP) и как белок устойчивости к митоксантрону (MXR)), где указанные выделенные клетки плаценты получают перфузией плаценты млекопитающего, например, человека, для которой проведено выпускание пуповинной крови и перфузия для удаления остаточной крови.

В другом конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления клеток плаценты, описанных в настоящем документе, клетки плаценты являются отрицательными по экспрессии гена теломеразы, отрицательными по активности теломеразы, или и по тому, и по-другому. Экспрессию гена теломеразы можно детектировать с использованием, например, детекции РНК теломеразы с использованием, например, дот-блотов или слот-блотов; или анализа по протоколу амплификации теломерных повторов (TRAP) (например, TRAPEZE® ELISA, наборы для флуорометрических анализов или анализов на основе геля от Millipore).

В другом конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления клеток плаценты, описанных в настоящем документе, клетки плаценты являются положительными по виментину, например, по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% указанных клеток плаценты экспрессируют виментин. Виментин можно детектировать, например, проточной цитометрией с использованием одного или нескольких антител против виментина, например, доступных из Abcam; флуоресцентным окрашиванием in situ или т.п.

В другом конкретном варианте осуществления любого из вариантов осуществления клеток плаценты, описанных в настоящем документе, клетки плаценты не секретируют поддающиеся детекции количества хорионического гонадотропина человека (hCG). Хорионический гонадотропин человека можно детектировать, например, посредством ELISA или иммунофлуоресценции с использованием, например, hCG моноклонального антитела HCG1 (Abcam), или поликлональных анти-hCG антител (Abcam, Novus Biologicals).

В другом варианте осуществления любых из выделенных клеток плаценты, описанных в настоящем документе, популяция выделенных клеток плаценты содержит CD56⁺ адгерентные по отношению к культуральному пластику клетки плаценты, не являющиеся естественными киллерными клетками. В конкретном варианте осуществления популяция содержит от приблизительно 1% до приблизительно 27% указанных CD56⁺ клеток плаценты в указанной популяции выделенных клеток плаценты, как определено проточной цитометрией с использованием CD56-FITC (изотиоцианат флуоресцеина). В другом конкретном варианте осуществления популяция содержит от приблизительно 16% до приблизительно 62% указанных CD56⁺ клеток плаценты в указанной популяции выделенных клеток плаценты, как определено проточной цитометрией с использованием CD56-APC (аллофикоцианина).

В другом конкретном варианте осуществления любой из вышеуказанных характеристик, экспрессию клеточного маркера (например, кластера дифференцировки или иммуногенного маркера) определяют проточной цитометрией; в другом конкретном варианте осуществления экспрессию маркера определяют посредством ОТ-ПЦР.

В любом из вариантов осуществления адгерентных клеток плаценты, например, плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе, в конкретном варианте осуществления клетки дополнительно идентифицируют как супрессирующие на поддающемся детекции уровне пролиферацию клеток злокачественных опухолей или рост опухолей. В любом из вариантов осуществления адгерентных клеток плаценты, например, плацентарных стволовых клеток, описанных в настоящем документе, в конкретном варианте осуществления клетки на поддающемся детекции уровне супрессируют пролиферацию клеток злокачественных опухолей или рост опухолей, например, in vitro.

Каждые из вышеуказанных адгерентных клеток плаценты или их популяций могут содержать клетки, полученные и выделенные непосредственно из плаценты млекопитающих, или клетки, культивированные и пассированные по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 или более раз, или их комбинации. Супрессирующие клетки опухолей совокупности выделенных адгерентных клеток плаценты, описанных выше, могут содержать приблизительно по меньшей мере или самое большее, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ или более выделенных адгерентных клеток плаценты.

5.7.3. Композиции, содержащие среду, кондиционированную адгерентными клетками плаценты

В настоящем документе представлено также использование композиции, содержащей естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, перфузат плаценты и/или перфузат плаценты, и кроме того, кондиционированную среду, где указанная композиция является супрессирующей опухоли или является эффективной для лечения злокачественной опухоли или вирусной инфекции. Адгерентные клетки плаценты, как описано в разделе 5.6.2, выше, клетки перфузата плаценты и/или естественные киллерные клетки, например, промежуточные естественные киллерные клетки плаценты, можно использовать для получения кондиционированной среды, которая является супрессирующей клетки опухолей, противораковой или противовирусной то есть, среды, содержащей одну или несколько биологических молекул, секретируемых или экскретируемых клетками, оказывающих поддающийся детекции эффект супрессии клеток опухоли, противораковый эффект или противовирусный эффект. В различных вариантах осуществления кондиционированная среда содержит среду, в которой клетки (например, выделенные адгерентные клетки плаценты, клетки перфузата плаценты, и/или естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки) выращивали (то есть, культивировали) в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или более суток. В других вариантах осуществления кондиционированная среда содержит среду, в которой такие клетки выращивали по меньшей мере до 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% конфлюэнтности, или вплоть до 100% конфлюэнтности. Такую кондиционированную среду можно использовать для поддержания культуры отдельной популяции клеток, например, клеток плаценты, или клеток другого вида. В другом варианте осуществления кондиционированная среда, представленная в настоящем документе, содержит среду, в которой культивировали выделенные адгерентные клетки плаценты, например, выделенные адгерентные плацентарные стволовые клетки или выделенные адгерентные мультипотентные клетки плаценты, и клетки, отличные от выделенных адгерентных клеток плаценты, например, не относящиеся к плацентарным стволовым клеткам или мультипотентным клеткам.

Такую кондиционированную среду можно комбинировать с любым из или с любой комбинацией из перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты, и/или естественных киллерных клеток, например, промежуточных естественных киллерных клеток плаценты, для получения композиции, являющейся супрессирующей клетки опухолей, противораковой или противовирусной. В конкретных вариантах осуществления композиция содержит менее половины кондиционированной среды по объему, например, приблизительно, или менее, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% по объему.

Таким образом, один вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к композиции, содержащей культуральную среду из культуры выделенных адгерентных клеток плаценты, где указанные выделенные адгерентные клетки плаценты (a) обладают адгезией к субстрату; и (b) являются CD34^-, CD10⁺ и CD105⁺; где указанная композиция на поддающемся детекции уровне супрессирует рост или пролиферацию клеток опухолей, или является противораковой или противовирусной. В конкретном варианте осуществления выделенные адгерентные клетки плаценты являются CD34^-, CD10⁺ и CD105⁺, как детектируют проточной цитометрией. В более конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ адгерентные клетки плаценты представляют собой плацентарные стволовые клетки. В другом более конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты представляют собой мультипотентные адгерентные клетки плаценты. В другом конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ клетки плаценты обладают потенциалом к дифференцировке в клетки, имеющие характеристики нервной клетки, клетки, имеющие характеристики остеогенной клетки, и/или клетки, имеющие характеристики хондрогенной клетки. В более конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ адгерентные клетки плаценты, кроме того, являются CD200⁺. В другом более конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ адгерентные клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ или CD45^-, как детектируют проточной цитометрией. В другом более конкретном варианте осуществления выделенные CD34^-, CD10⁺, CD105⁺ адгерентные клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ и CD45^-, как детектируют проточной цитометрией. В более конкретном варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ адгерентные клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ или CD45^-, как детектируют проточной цитометрией. В другом более конкретном варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺ адгерентные клетки плаценты, кроме того, являются CD90⁺ и CD45^-, как детектируют проточной цитометрией. В другом более конкретном варианте осуществления CD34^-, CD10⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD90⁺, CD45^- адгерентные клетки плаценты, кроме того, являются CD80^- и CD86^-, как детектируют проточной цитометрией.

Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к композиции, содержащей культуральную среду из культуры выделенных адгерентных клеток плаценты, где указанные выделенные адгерентные клетки плаценты (a) обладают адгезией к субстрату; и (b) экспрессируют CD200 и не экспрессируют HLA-G, или экспрессируют CD73, CD105 и CD200, или экспрессируют CD200 и OCT-4, или экспрессируют CD73 и CD105, и не экспрессируют HLA-G, или экспрессируют CD73 и CD105 и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, содержащей плацентарные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец, или экспрессируют OCT-4 и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, содержащей плацентарные стволовые клетки, когда указанную популяцию культивируют в условиях, позволяющих формирование эмбриоидоподобных телец; где указанная композиция на поддающемся детекции уровне супрессирует рост или пролиферацию клеток опухолей, или является противораковой или противовирусной. В конкретном варианте осуществления композиция дополнительно содержит совокупность указанных выделенных адгерентных клеток плаценты. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит совокупность клеток, не относящихся к клеткам плаценты. В более конкретном варианте осуществления указанные клетки, не относящиеся к клеткам плаценты, содержат CD34⁺ клетки, например, гематопоэтические клетки-предшественники, такие как гематопоэтические клетки-предшественники периферической крови, гематопоэтические клетки-предшественники пуповинной крови или гематопоэтические клетки-предшественники плацентарной крови. Клетки, не относящиеся к клеткам плаценты, могут также содержать стволовые клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки, например, происходящие из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки. Клетки, не относящиеся к клеткам плаценты, могут также представлять собой один или несколько типов клеток или линий клеток взрослого. В другом конкретном варианте осуществления композиция содержит антипролиферативное средство, например, анти-MIP-1α или анти-MIP-1β антитело.

В конкретном варианте осуществления культуральную среду, кондиционированную одной из клеток или комбинаций клеток, описанных выше, получают из совокупности выделенных адгерентных клеток плаценты, совместно культивированных с совокупностью клеток опухолей в соотношении приблизительно 1:1, приблизительно 2:1, приблизительно 3:1, приблизительно 4:1 или приблизительно 5:1 выделенных адгерентных клеток плаценты к клеткам опухолей. Например, кондиционированную культуральную среду или супернатант можно получать из культуры, содержащей приблизительно 1×10⁵ выделенных адгерентных клеток плаценты, приблизительно 1×10⁶ выделенных адгерентных клеток плаценты, приблизительно 1×10⁷ выделенных адгерентных клеток плаценты, или приблизительно 1×10⁸ выделенных адгерентных клеток плаценты, или более. В другом конкретном варианте осуществления кондиционированную культуральную среду или супернатант получают из совместной культуры, содержащей от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 5×10⁵ выделенных адгерентных клеток плаценты и приблизительно 1×10⁵ клеток опухолей; от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 5×10⁶ выделенных адгерентных клеток плаценты и приблизительно 1×10⁶ клетки опухолей; от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 5×10⁷ выделенных адгерентных клеток плаценты и приблизительно 1×10⁷ клеток опухолей; или от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 5×10⁸ выделенных адгерентных клеток плаценты и приблизительно 1×10⁸ клеток опухолей.

В конкретном варианте осуществления кондиционированная среда, подходящая для введения индивидууму массой 70 кг, содержит супернатант, кондиционированный приблизительно 70 миллионами плацентарных стволовых клеток в приблизительно 200 мл культуральной среды.

Кондиционированную среду можно конденсировать для получения пригодного для введения продукта фармацевтической степени очистки. Например, кондиционированную среду можно конденсировать до приблизительно 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или более удалением воды, например, посредством выпаривания, лиофилизации или т.п. В конкретном варианте осуществления, например, 200 мл кондиционированной среды от приблизительно 70 миллионов плацентарных стволовых клеток можно конденсировать до объема приблизительно 180 мл, 160 мл, 140 мл, 120 мл, 100 мл, 80 мл, 60 мл, 40 мл, 20 мл или менее. Кондиционированную среду можно также в основном высушивать, например, до порошка, например, посредством выпаривания, лиофилизации или т.п.

5.8. Хранение перфузата, клеток перфузата плаценты и естественных киллерных клеток

Перфузат плаценты, например, перфузат, содержащий клетки плаценты, или клетки плаценты, например, клетки перфузата плаценты, комбинированные естественные киллерные клетки или естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, можно хранить, то есть, помещать в условия, позволяющие длительное хранение, или в условия, ингибирующие гибель клеток, например, из-за апоптоза или некроза.

Перфузат плаценты можно получать пропусканием композиции для сбора клеток по меньшей мере через часть плаценты, например, через сосудистую систему плаценты. Композиция для сбора клеток содержит одно или несколько соединений, действующие для сохранения клеток, содержащихся в перфузате. Такая композиция для сбора клеток плаценты может содержать ингибитор апоптоза, ингибитор некроза и/или кислородосодержащий перфторуглерод, как описано в родственной Публикации патентной заявки США No. 20070190042, полное содержание которой таким образом приведено в качестве ссылки.

В одном варианте осуществления перфузат или популяцию клеток плаценты собирают из послеродовой плаценты млекопитающего, например, человека, посредством контакта перфузата или популяции клеток с композицией для сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и кислородосодержащий перфторуглерод, где указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение периода времени, достаточного для уменьшения или предотвращения апоптоза в популяции клеток плаценты, например, адгерентных клеток плаценты, например, плацентарных стволовых клеток или мультипотентных клеток плаценты, по сравнению с популяцией клеток, не приведенной в контакт с ингибитором апоптоза. Например, можно проводить перфузию плаценты с помощью композиции для сбора клеток и выделять из нее клетки плаценты, например, общие ядросодержащие клетки плаценты. В конкретном варианте осуществления ингибитор апоптоза представляет собой ингибитор каспазы. В другом конкретном варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза представляет собой ингибитор JNK. В более конкретном варианте осуществления указанный ингибитор JNK не модулирует дифференцировку или пролиферацию адгерентных клеток плаценты, например, адгерентных плацентарных стволовых клеток или адгерентных мультипотентных клеток плаценты. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный кислородосодержащий перфторуглерод в отдельных фазах. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный кислородосодержащий перфторуглерод в эмульсии. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток, кроме того, содержит эмульгатор, например, лецитин. В другом варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся при приблизительно 0°C и приблизительно 25°C на время контакта с клетками плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод находятся при приблизительно между 2°C и 10°C, или между приблизительно 2°C и приблизительно 5°C, на время контакта с клетками плаценты. В другом более конкретном варианте осуществления указанный контакт осуществляют во время транспортировки указанной популяции клеток. В другом более конкретном варианте осуществления указанный контакт осуществляют во время замораживания и размораживания указанной популяции клеток.

В другом варианте осуществления перфузат плаценты и/или клетки плаценты можно собирать и сохранять посредством контакта перфузата и/или клеток с помощью ингибитора апоптоза и соединения для сохранения органов, где указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение периода времени, достаточного для уменьшения или предотвращения апоптоза клеток, по сравнению с перфузатом или клетками плаценты, не приведенными в контакт с ингибитором апоптоза. В конкретном варианте осуществления соединение для сохранения органов представляет собой раствор UW (описанный в Патенте США 4798824; известный также как VIASPAN™; смотри также Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990) или раствор, описанный в Stern et al., Патент США 5552267, полные содержания которых, таким образом, приведены в качестве ссылки. В другом варианте осуществления, указанная композиция для сохранения органов представляет собой гидроксиэтилкрахмал, лактобионовую кислоту, рафинозу или их комбинацию. В другом варианте осуществления композиция для сбора клеток плаценты, кроме того, содержит кислородосодержащий перфторуглерод, либо в двух фазах, либо в форме эмульсии.

В другом варианте осуществления способа клетки плаценты приводят в контакт с композицией для сбора клеток, содержащей ингибитор апоптоза и кислородосодержащий перфторуглерод, соединение для сохранения органов или их комбинацию, во время перфузии. В другом варианте осуществления клетки плаценты приводят в контакт с указанным соединением для сбора клеток после сбора посредством перфузии.

Как правило, во время сбора, обогащения и выделения клеток плаценты является предпочтительным минимизировать или исключать клеточный стресс из-за гипоксии и механического стресса. В другом варианте осуществления способа, таким образом, перфузат плаценты или популяцию клеток плаценты подвергают условиям гипоксии во время сбора, обогащения или выделения в течение менее шести часов во время указанного хранения, где условия гипоксии представляют собой концентрацию кислорода, меньшую, чем нормальная концентрация кислорода в крови. В более конкретном варианте осуществления указанный перфузат или популяцию клеток плаценты подвергают указанным условиям гипоксии в течение менее шести часов во время указанного хранения. В другом более конкретном варианте осуществления указанную популяцию клеток плаценты подвергают указанным условиям гипоксии в течение менее одного часа или менее тридцати минут, или не подвергают условиям гипоксии во время сбора, обогащения или выделения. В другом конкретном варианте осуществления указанную популяция клеток плаценты не подвергают напряжению сдвига во время сбора, обогащения или выделения.

Выделенные адгерентные клетки плаценты или клетки перфузата плаценты, представленные в настоящем документе, можно подвергать криоконсервации, например, в среде для криоконсервации в небольших контейнерах, например, ампулах. Подходящая среда для криоконсервации включает в себя в качестве неограничивающих примеров, культуральную среду, включая, например, среду для роста, или среду для замораживания клеток, например, коммерчески доступную среду для замораживания клеток, например, C2695, C2639 или C6039 (Sigma). Среда для криоконсервации, предпочтительно, содержит DMSO (диметилсульфоксид), в концентрации, например, приблизительно 10% (об./об.). Среда для криоконсервации может содержать дополнительные средства, например, метилцеллюлозу и/или глицерин. Клетки плаценты предпочтительно охлаждают при приблизительно 1°C/мин во время криоконсервации. Предпочтительная температура криоконсервации составляет от приблизительно -80°C до приблизительно -180°C, предпочтительно, от приблизительно -125°C до приблизительно -140°C. Клетки плаценты после криоконсервации можно переносить в жидкий азот до размораживания для использования. В некоторых вариантах осуществления, например, как только ампулы достигают приблизительно -90°C, их переносят в участок хранения в жидком азоте. Клетки после криоконсервации, предпочтительно, размораживают при температуре от приблизительно 25°C до приблизительно 40°C, предпочтительно, при температуре приблизительно 37°C.

5.9. Иммуномодулирующие соединения

В конкретных вариантах осуществления способы супрессии опухолей, лечения индивидуумов, страдающих злокачественной опухолью (например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью), и лечения индивидуумов, страдающих вирусной инфекцией, представленные в настоящем документе, включают в себя контакт с клетками опухолей или введение указанному индивидууму иммуномодулирующего соединения или предварительную обработку перфузата плаценты, клеток перфузата плаценты или естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, иммуномодулирующим соединением.

Иммуномодулирующие соединения, представленные в настоящем документе, включают соединения, известные как IMiDs® (Celgene Corporation). Как применяют в настоящем документе и если нет иных указаний, термины «иммуномодулирующие соединения» могут включать в себя конкретные малые органические молекулы, ингибирующие продукцию моноцитами TNF-α, IL-1β, IL-12, IL-6, MIP-1α, MCP-1, GM-CSF, G-CSF и COX-2.

Иллюстративные иммуномодулирующие соединения включают в себя в качестве неограничивающих примеров, N-{[2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил)-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}циклопропилкарбоксамид; 3-[2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил]-1,1-диметил-мочевину; (-)-3-(3,4-диметоксифенил)-3-(1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пропионамид; (+)-3-(3,4-диметоксифенил)-3-(1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пропионамид; (-)-{2-[1-(3-этокси-4-метоксифенил)-2-метилсульфонилэтил]-4-ацетиламиноизоиндолин-1,3-дион}; (+)-{2-[1-(3-этокси-4-метоксифенил)-2-метилсульфонилэтил]-4-ацетиламиноизоиндолин-1,3-дион}; дифторметокси SelCID; 1-фталимидо-1-(3,4-диэтоксифенил)этан; 3-(3,4-диметоксифенил)-3-(3,5-диметоксифенил)акрилонитрил; 1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин; 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин; 4-амино-2-(3-метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-изоиндол-1,3-дион; 3-(3-ацетоамидофталимидо)-3-(3-этокси-4-метоксифенил)-N-гидроксипропионамид; 1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-метилизоиндолин; циклопропил-N-{2-[(1S)-1-(3-этокси-4-метоксифенил)-2-(метилсульфонил)этил]-3-оксоизоиндолин-4-ил}карбоксамид; замещенный 2-(3-гидрокси-2,6-диоксопиперидин-5-ил)-изоиндолин; N-[2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-5-илметил]-4-трифторметоксибензамид; (S)-4-хлор-N-((2-(3-метил-2,6- диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксоизоиндолин-5-ил)метил)бензамид; [2-[(3S)-3-метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил]-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-5-илметил]амид пиридин-2-карбоновой кислоты; (S)-N-((2-(3-метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксоизоиндолин-5-ил)метил)-4-(трифторметил)бензамид; 3-(2,5-диметил-4-оксо-4H-хиназолин-3-ил)пиперидин-2,6-дион и т.п.

Конкретные примеры иммуномодулирующих соединений включают в себя циано- и карбоксипроизводные замещенных стиролов, таких как описанные в Патенте США No. 5929117; 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины, такие как описанные в Патентах США No. 5874448 и 5955476; тетразамещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, описанные в Патенте США No. 5798368; 1-оксо и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил) изоиндолины (например, 4-метилпроизводные талидомида), замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)фталимиды и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолы, включая, в качестве неограничивающих примеров, описанные в Патентах США No. 5635517, 6281230, 6316471, 6403613, 6476052 и 6555554; 1-оксо и 1,3-диоксоизоиндолины, замещенные в 4- или 5-положении индолинового кольца (например, 4-(4-амино-1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-4-карбамоилбутановая кислота), описанные в Патенте США No. 6380239; изоиндолин-1-он и изоиндолин-1,3-дион, замещенный в 2-положении 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом (например, 2-(2,6-диоксо-3-гидрокси-5-фторпиперидин-5-ил)-4-аминоизоиндолин-1-он), описанные в Патенте США No. 6458810; класс неполипептидных циклических амидов, описанных в Патентах США No. 5698579 и 5877200; и изоиндол-имидные соединения, такие как описанные в Публикации Патентной заявки США No. 20030045552, Патенте США No. 7091353 и Международной заявке No. PCT/US01/50401 (Международная публикация No. WO 02/059106). В Публикации патента США No. 20060205787 описаны композиции 4-амино-2-(3-метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндол-1,3-диона. В Публикации патента США No. 20070049618 описаны изоиндол-имидные соединения. Полные содержания каждого из патентов и патентных заявок, указанных в настоящем документе, приведены в настоящем документе в качестве ссылок.

Различные иммуномодулирующие соединения, описанные в настоящем документе, содержат один или несколько хиральных центров и могут существовать в форме рацемических смесей энантиомеров или смесей диастереомеров. Это изобретение относится к использованию стереомерно чистых форм таких соединений, так же как к использованию смесей этих форм. Например, можно использовать смеси, содержащие эквивалентные или неэквивалентные количества энантиомеров конкретных иммуномодулирующих соединений. Эти изомеры можно асимметрично синтезировать или разделять с использованием общепринятых способов, например, с помощью хиральных колонок или хиральных разделяющих средств. (Смотри, например, Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); и Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972)).

Иммуномодулирующие соединения, представленные в настоящем документе, включают в себя в качестве неограничивающих примеров, 1-оксо- и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, замещенные аминогруппами в бензольном кольце, как описано в Патенте США No. 5635517, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Эти соединения имеют структуру I:

,

в которой один из X и Y представляет собой C=O, другой из X и Y представляет собой C=O или CH₂, и R² представляет собой водород или низший алкил, в частности, метил. Конкретные иммуномодулирующие соединения включают в себя в качестве неограничивающих примеров:

1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин;

1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин;

и

1,3-диоксо-2-(3-метил-2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндол и его оптически чистые изомеры.

Соединения можно получать общепринятыми способами синтеза (смотри, например, Патент США No. 5635517, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки). Соединения доступны также из Celgene Corporation, Warren, NJ.

Другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат к классу замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-фталимидов и замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолов, таких как описанные в Патентах США No. 6281230; 6316471; 6335349; и 6476052 и Международной патентной заявке No. PCT/US97/13375 (Международная публикация No. WO 98/03502), содержание каждого из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

в которых:

один из X и Y представляет собой C=O, и другой из X и Y представляет собой C=O или CH₂;

(i) каждый из R¹, R², R³ и R⁴, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода, или алкокси из 1-4 атомов углерода, или (ii) один из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой -NHR⁵, и оставшиеся из R¹, R², R³ и R⁴ представляют собой водород;

R⁵ представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода;

R⁶ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, бензил или гало;

при условии, что R⁶ отличается от водорода, если X и Y представляют собой C=O, и (i) каждый из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой фтор или (ii) один из R¹, R², R³ или R⁴ представляет собой амино.

Соединения, репрезентативные для этого класса, представляют собой соединения формул:

и

,

где R¹ представляет собой водород или метил. В отдельном варианте осуществления изобретение относится к использованию энантиомерно чистых форм (например, оптически чистых (R) или (S) энантиомеров) этих соединений.

Другие специфические иммуномодулирующие соединения, описанные в настоящем документе, принадлежат к классу изоиндол-имидов, описанных в Патенте США No. 7091353, Публикации патента США No. 20030045552, содержание каждой из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылок, и в Международной заявке No. PCT/US01/50401 (Публикация международной заявки No. WO 02/059106). Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы II:

II

и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, клатраты, энантиомеры, диастереомеры, рацематы и смеси их стереоизомеров, где:

один из X и Y представляет собой C=O, и другой представляет собой CH₂ или C=O;

R¹ представляет собой H, (C₁-C₈)алкил, (C₃-C₇)циклоалкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)алкил-N(R⁶)2, (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' или (C₁-C₈)алкил-O(CO)R⁵;

R² представляет собой H, F, бензил, (C₁-C₈)алкил, (C₂-C₈)алкенил или (C₂-C₈)алкинил;

R³ и R^3' независимо представляют собой (C₁-C₈)алкил, (C₃-C₇)циклоалкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, (C₀-C₈)алкил-N(R⁶)2, (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)алкил-O(CO)R⁵ или C(O)OR⁵;

R⁴ представляет собой (C₁-C₈)алкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, (C₁-C₄)алкил-OR⁵, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил или (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил;

R⁵ представляет собой (C₁-C₈)алкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил или (C₂-C₅)гетероарил; каждый присутствующий R⁶ независимо представляет собой H, (C₁-C₈)алкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, (C₂-C₅)гетероарил или (C₀-C₈)алкил-C(O)O-R⁵, или группы R⁶ могут соединяться с формированием гетероциклоалкильной группы;

n представляет собой 0 или 1; и

* представляет собой хирально-углеродный центр.

В конкретных соединениях формулы II, когда n представляет собой 0, тогда R¹ представляет собой (C₃-C₇)циклоалкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, C(O)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)алкил-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, C(S)NHR³ или (C₁-C₈)алкил-O(CO)R⁵;

R² представляет собой H или (C₁-C₈)алкил; и

R³ представляет собой (C₁-C₈)алкил, (C₃-C₇)циклоалкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, (C₅-C₈)алкил-N(R⁶)2; (C₀-C₈)алкил-NH-C(O)O-R⁵; (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)алкил-O(CO)R⁵ или C(O)OR⁵; и другие варианты имеют такие же определения.

В других конкретных соединениях формулы II R² представляет собой H или (C₁-C₄)алкил.

В других конкретных соединениях формулы II R¹ представляет собой (C₁-C₈)алкил или бензил.

В других конкретных соединениях формулы II, R¹ представляет собой H, (C₁-C₈)алкил, бензил, CH₂OCH₃, CH₂CH₂OCH₃ или

В другом варианте осуществления соединений формулы II, R¹ представляет собой

где Q представляет собой O или S, и каждый присутствующий R⁷ независимо представляет собой H,(C₁-C₈)алкил, (C₃-C₇)циклоалкил, (C₂-C₈)алкенил, (C₂-C₈)алкинил, бензил, арил, галоген, (C₀-C₄)алкил-(C₁-C₆)гетероциклоалкил, (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, (C₀-C₈)алкил-N(R⁶)2, (C₁-C₈)алкил-OR⁵, (C₁-C₈)алкил-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)алкил-O(CO)R⁵ или C(O)OR⁵, или смежные присутствующие R⁷ могут, вместе взятые, формировать бициклическое алкильное или арильное кольцо.

В других конкретных соединениях формулы II, R¹ представляет собой C(O)R³.

В других конкретных соединениях формулы II, R³ представляет собой (C₀-C₄)алкил-(C₂-C₅)гетероарил, (C₁-C₈)алкил, арил или (C₀-C₄)алкил-OR⁵.

В других конкретных соединениях формулы II гетероарил представляет собой пиридил, фурил или тиенил.

В других конкретных соединениях формулы II R¹ представляет собой C(O)OR⁴.

В других конкретных соединениях формулы II H из C(O)NHC(O) можно заменять на (C₁-C₄)алкил, арил или бензил.

Дополнительные соединения этого класса включают в себя в качестве неограничивающих примеров: [2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил]амид; трет-бутиловый эфир (2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)карбаминовой кислоты; 4-(аминометил)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-изоиндолин-1,3-дион; N-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)-ацетамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил)-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-циклопропилкарбоксамид; 2-хлор-N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}ацетамид; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-3-пиридилкарбоксамид; 3-{1-оксо-4-(бензиламино)изоиндолин-2-ил}пиперидин-2,6-дион; 2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-4-(бензиламино)изоиндолин-1,3-дион; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}пропанамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-3-пиридилкарбоксамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}гептанамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-2-фурилкарбоксамид; {N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)карбамоил}метилацетат; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)пентанамид; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-2-тиенилкарбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(бутиламино)карбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(октиламино)карбоксамид; и N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(бензиламино)карбоксамид.

Другие конкретные иммуномодулирующие соединения, описанные в настоящем документе, принадлежат к классу изоиндол-имидов, описанных в Патенте США No. 6555554, Международной публикации No. WO 98/54170 и Патенте США No. 6395754, содержание которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы III:

и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, клатраты, энантиомеры, диастереомеры, рацематы и смеси их стереоизомеров, где:

один из X и Y представляет собой C=O, и другой представляет собой CH₂ или C=O;

R представляет собой H или CH₂OCOR';

(i) каждый из R¹, R², R³ или R⁴, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода, или алкокси из 1-4 атомов углерода, или (ii) один из R¹, R², R³ или R⁴ представляет собой нитро или -NHR⁵, и остальные из R¹, R², R³ или R⁴ представляют собой водород;

R⁵ представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода

R⁶ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, бензо, хлор, или фтор;

R' представляет собой R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R⁷ представляет собой м-фенилен или п-фенилен, или -(CnH2n)-, где n имеет значение от 0 до 4; каждый из R⁸ и R⁹, взятый независимо от другого, представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода, или R⁸ и R⁹, взятые вместе, представляют собой тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CH₂CH₂X¹CH₂CH₂-, где X¹ представляет собой -O-, -S- или -NH-;

R¹⁰ представляет собой водород, алкил из 8 атомов углерода или фенил; и

* представляет собой хирально-углеродный центр.

Другие репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где:

один из X и Y представляет собой C=O, и другой из X и Y представляет собой C=O или CH₂;

(i) каждый из R¹, R², R³, или R⁴, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода или алкокси из 1-4 атомов углерода, или (ii) один из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой -NHR⁵, и оставшиеся из R¹, R², R³ и R⁴ представляют собой водород;

R⁵ представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода;

R⁶ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, бензо, хлор или фтор;

R⁷ представляет собой м-фенилен или п-фенилен, или -(CnH2n)-, где n имеет значение от 0 до 4;

каждый из R⁸ и R⁹, взятый независимо от другого, представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода, или R⁸ и R⁹, взятые вместе, представляют собой тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CH₂CH₂X¹CH₂CH₂-, где X¹ представляет собой -O-, -S- или -NH-; и

R¹⁰ представляет собой водород, алкил из 8 атомов углерода или фенил.

Другие репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где

один из X и Y представляет собой C=O, и другой из X и Y представляет собой C=O или CH₂;

каждый из R¹, R², R³, и R⁴, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода или алкокси из 1-4 атомов углерода, или (ii) один из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой нитро или защищенную аминогруппу, и оставшиеся из R¹, R², R³ и R⁴ представляют собой водород; и

R⁶ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, бензо, хлор или фтор.

Другие репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где:

один из X и Y представляет собой C=O, и другой из X и Y представляет собой C=O или CH₂;

(i) каждый из R¹, R², R³ и R⁴, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода или алкокси из 1-4 атомов углерода, или (ii) один из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой -NHR⁵, и оставшиеся из R¹, R², R³ и R⁴ представляют собой водород;

R⁵ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, или CO-R⁷-CH(R¹⁰)NR⁸R⁹, где каждый из R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ является таким, как определено в настоящем документе; и

R⁶ представляет собой алкил из 1-8 атомов углерода, бензо, хлор или фтор.

Конкретными примерами соединений являются соединения формулы:

,

где:

один из X и Y представляет собой C=O, и другой из X и Y представляет собой C=O или CH₂;

R⁶ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, бензил, хлор или фтор;

R⁷ представляет собой м-фенилен, п-фенилен или -(CnH2n)-, где n имеет значение от 0 до 4; каждый из R⁸ и R⁹, взятый независимо от другого, представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода, или R⁸ и R⁹, взятые вместе, представляют собой тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CH₂CH₂X¹CH₂CH₂-, где X¹ представляет собой -O-, -S- или -NH-; и

R¹⁰ представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, или фенил.

Другие конкретные иммуномодулирующие соединения представляют собой 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)-изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)-изоиндолины, такие как описаны в Патентах США No. 5874448 и 5955476, содержание каждого из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где:

Y представляет собой кислород или H₂, и

каждый из R¹, R², R³ и R⁴, независимо от других, представляет собой водород, гало, алкил из 1-4 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода или амино.

Другие специфические иммуномодулирующие соединения представляют собой тетразамещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, описанные в Патенте США No. 5798368, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где каждый из R¹, R², R³ и R⁴, независимо от других, представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода, или алкокси из 1-4 атомов углерода.

Другие конкретные иммуномодулирующие соединения представляют собой 1-оксо и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, описанные в Патенте США No. 6403613, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где

Y представляет собой кислород или H₂, первый из R¹ и R² представляет собой гало, алкил, алкокси, алкиламино, диалкиламино, циано или карбамоил, второй из R¹ и R², независимо от первого, представляет собой водород, гало, алкил, алкокси, алкиламино, диалкиламино, циано или карбамоил, и

R³ представляет собой водород, алкил или бензил.

Конкретные примеры соединений представляют собой соединения формулы:

,

где

первый из R¹ и R² представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода, диалкиламино, где каждый алкил состоит из 1-4 атомов углерода, циано, или карбамоил; второй из R¹ и R², независимо от первого, представляет собой водород, гало, алкил из 1-4 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода, алкиламино, где алкил состоит из 1-4 атомов углерода, диалкиламино, где каждый алкил состоит из 1-4 атомов углерода, циано или карбамоил; и

R³ представляет собой водород, алкил из 1-4 атомов углерода или бензил. Конкретные неограничивающие примеры включают в себя 1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-метилизоиндолин.

Другие репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где:

первый из R¹ и R² представляет собой гало, алкил из 1-4 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода, диалкиламино, где каждый алкил состоит из 1-4 атомов углерода, циано или карбамоил; второй из R¹ и R², независимо от первого, представляет собой водород, гало, алкил из 1-4 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода, алкиламино, где алкил состоит из 1-4 атомов углерода, диалкиламино, где каждый алкил состоит из 1-4 атомов углерода, циано или карбамоил; и

R³ представляет собой водород, алкил из 1-4 атомов углерода или бензил.

Другие конкретные иммуномодулирующие соединения, описанные в настоящем документе, представляют собой 1-оксо и 1,3-диоксоизоиндолины, замещенные в 4- или 5-положении индолинового кольца, описанные в Патенте США No. 6380239 и Патенте США No. 7244759, содержание обоих из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где атом углерода, обозначенный C*, представляет собой центр хиральности (когда n не равен нулю, и R¹ не является таким же как R²); один из X¹ и X² представляет собой амино, нитро, алкил из одного-шести атомов углерода или NH-Z, и другой из X¹ или X² представляет собой водород; каждый из R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой гидрокси или NH-Z; R³ представляет собой водород, алкил из одного-шести атомов углерода, гало, или галоалкил; Z представляет собой водород, арил, алкил из одного-шести атомов углерода, формил или ацил из одного-шести атомов углерода; и n имеет значение 0, 1 или 2; при условии, что, если X¹ представляет собой амино, и n представляет собой 1 или 2, тогда R¹ и R² не оба представляют собой гидрокси; и их соли.

Дополнительные репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где атом углерода, обозначенный C*, представляет собой центр хиральности, когда n не равен нулю, и R¹ не представляет собой R²; один из X¹ и X² представляет собой амино, нитро, алкил из одного-шести атомов углерода или NH-Z, и другой из X¹ или X² представляет собой водород; каждый из R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой гидрокси или NH-Z; R³ представляет собой алкил из одного-шести атомов углерода, гало или водород; Z представляет собой водород, арил или алкил или ацил из одного-шести атомов углерода; и n имеет значение 0, 1 или 2.

Конкретные неограничивающие примеры включают в себя 2-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляную кислоту и 4-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-изоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляную кислоту, имеющие следующие структуры, соответственно, и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и стереоизомеры:

Другие репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

в которых атом углерода, обозначенный C*, представляет собой центр хиральности, когда n не равен нулю и R¹ не представляет собой R²; один из X¹ и X² представляет собой амино, нитро, алкил из одного-шести атомов углерода, или NH-Z, и другой из X¹ или X² представляет собой водород; каждый из R¹ и R² независимо друг от друга, представляют собой гидрокси или NH-Z; R³ представляет собой алкил из одного-шести атомов углерода, гало или водород; Z представляет собой водород, арил или алкил или ацил из одного-шести атомов углерода; и n имеет значение 0, 1, или 2; и их соли.

Конкретные неограничивающие примеры включают в себя 4-карбамоил-4-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидро-изоиндол-2-ил}масляную кислоту, 4-карбамоил-2-{4-[(фуран-2-ил-метил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидро-изоиндол-2-ил}масляную кислоту, 2-{4-[(фуран-2-ил-метил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-4-фенилкарбамоилмасляную кислоту и 2-{4-[(фуран-2-ил-метил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-пентадионовую кислоту, имеющие следующие структуры, соответственно, и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и стереоизомеры:

Другие конкретные примеры соединений представляют собой формулу:

,

где:

один из X¹ и X² представляет собой нитро или NH-Z, и другой из X¹ или X² представляет собой водород;

каждый из R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой гидрокси или NH-Z;

R³ представляет собой алкил из одного-шести атомов углерода, гало, или водород;

Z представляет собой водород, фенил, ацил из одного-шести атомов углерода, или алкил из одного-шести атомов углерода; и

n имеет значение 0, 1 или 2; и

если -COR² и -(CH₂)_nCOR¹ являются различными, атом углерода, обозначенный C*, представляет собой центр хиральности.

Другие репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где:

один из X¹ и X² представляет собой алкил из одного-шести атомов углерода;

каждый из R¹ и R², независимо друг от друга, представляют собой гидрокси или NH-Z;

R³ представляет собой алкил из одного-шести атомов углерода, гало, или водород;

Z представляет собой водород, фенил, ацил из одного–шести атомов углерода, или алкил из одного–шести атомов углерода; и

n имеет значение 0, 1 или 2; и,

если -COR² и -(CH₂)_nCOR¹ являются различными, атом углерода, обозначенный C*, представляет собой центр хиральности.

Другие конкретные иммуномодулирующие соединения представляют собой изоиндолин-1-он и изоиндолин-1,3-дион, замещенные в 2-положении 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом, описанные в Патенте США No. 6458810, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Репрезентативные соединения представляют собой соединения формулы:

,

где:

атомы углерода, обозначенные ^*, представляют собой центры хиральности;

X представляет собой -C(O)- или -CH₂-;

R¹ представляет собой алкил из 1-8 атомов углерода или -NHR³;

R² представляет собой водород, алкил из 1-8 атомов углерода, или галоген; и

R³ представляет собой водород,

алкил из 1-8 атомов углерода, незамещенный или замещенный с помощью алкокси из 1-8 атомов углерода, гало, амино, или алкиламино из 1-4 атомов углерода,

циклоалкил из 3-18 атомов углерода, фенил, незамещенный или замещенный алкилом из 1-8 атомов углерода, алкокси из 1-8 атомов углерода, гало, амино, или алкиламино из 1-4 атомов углерода,

бензил, незамещенный или замещенный алкилом из 1-8 атомов углерода, алкокси из 1-8 атомов углерода, гало, амино или алкиламино из 1-4 атомов углерода, или -COR⁴, где

R⁴ представляет собой водород,

алкил из 1-8 атомов углерода, незамещенный или замещенный с помощью алкокси из 1-8 атомов углерода, гало, амино, или алкиламино из 1-4 атомов углерода,

циклоалкил из 3-18 атомов углерода,

фенил, незамещенный или замещенный алкилом из 1-8 атомов углерода, алкокси из 1-8 атомов углерода, гало, амино, или алкиламино из 1-4 атомов углерода, или

бензил, незамещенный или замещенный алкилом из 1-8 атомов углерода, алкокси из 1-8 атомов углерода, гало, амино или алкиламино из 1-4 атомов углерода.

Все описанные соединения можно либо закупать из коммерческих источников, либо получать способами, описанными в патентах или патентных публикациях, описанных в настоящем документе. Кроме того, оптически чистые соединения можно ассиметрично синтезировать или разделять с использованием известных разделяющих средств или хиральных колонок, так же как других общепринятых способов синтеза органических химических соединений. Дополнительную информацию об иммуномодулирующих соединениях, их получении и использовании можно найти, например, в Публикациях патентных заявок США No. 20060188475, 20060205787, и 20070049618, полное содержание каждой из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Соединения могут представлять собой малые органические молекулы, имеющие молекулярную массу менее, чем приблизительно 1000 г/моль, и не являющиеся белками, пептидами, олигонуклеотидами, олигосахаридами или другими макромолекулами.

Следует отметить, что, если существует несоответствие между изображенной структурой и названием, данной этой структуре, изображенная структура должна иметь преимущество. Кроме того, если стереохимия структуры или части структуры не указана, например, посредством жирных или пунктирных линий, структуру или часть структуры следует интерпретировать как включающую все ее стереоизомеры.

Иммуномодулирующие соединения можно либо закупать из коммерческих источников, либо получать способами, описанными в патентах или патентных публикациях, на которые ссылаются в настоящем документе, содержание всех из которых приведено в качестве ссылки. Кроме того, оптически чистые композиции можно ассиметрично синтезировать или разделять с использованием известных разделяющих средств или хиральных колонок, так же как других общепринятых способов синтеза органических химических соединений. Иммуномодулирующие соединения могут быть рацематами, обогащенными стереоизомерами или чистыми стереоизомерами, и могут включать в себя их фармацевтически приемлемые соли, сольваты и пролекарства.

5.10. Введение PINK-клеток, перфузата плаценты человека или комбинированных естественных киллерных клеток и иммуномодулирующего соединения

Способы супрессии опухолей, лечения индивидуумов, страдающих злокачественной опухолью (например, злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью) и лечения индивидуумов, страдающих вирусной инфекцией, представленные в настоящем документе, включают в себя контакт с клетками опухолей или введение указанному индивидууму естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, комбинированных естественных киллерных клеток или их комбинаций. В конкретных вариантах осуществления способы супрессии и лечения опухолей дополнительно включают в себя контакт с клетками опухолей или введение индивидууму иммуномодулирующего соединения или талидомида.

5.10.1. Предварительная обработка естественных киллерных клеток иммуномодулирующими соединениями или талидомидом

В одном из вариантов осуществления естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом до введения клеток согласно способам, представленным в настоящем документе. Например, такие клетки можно приводить в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом во время размножения естественных киллерных клеток. В конкретных вариантах осуществления пролиферация и/или цитотоксичность естественных киллерных клеток после контакта до поддающейся детекции степени увеличена по сравнению с естественными киллерными клетками, не приведенными в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом. Естественные киллерные клетки можно приводить в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 100 мкМ.

Выделенные естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки или комбинированные естественные киллерные клетки, как описано в другом месте в настоящем документе, можно обрабатывать иммуномодулирующим соединением или талидомидом, например, приводить в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом, для увеличения противораковой или противоопухолевой активности клеток, или для увеличения активности клеток против вирусной инфекции, например, против клеток, инфицированных вирусом. Таким образом, в настоящем документе представлен способ увеличения цитотоксичности естественной киллерной клетки по отношению к клеткам опухоли, предусматривающий контакт естественной киллерной клетки с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в течение периода времени и в концентрации, достаточных для того, чтобы естественная киллерная клетка обладала увеличенной цитотоксичностью по отношению к клетке опухоли по сравнению с естественной киллерной клеткой, не приведенной в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом. Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к способу увеличения экспрессии гранзима B или перфорина в естественной киллерной клетке, включающему в себя контакт естественной киллерной клетки с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в течение периода времени и в концентрации, достаточных для того, чтобы естественная киллерная клетка обладала увеличенной экспрессией гранзима B или перфорина по сравнению с естественной киллерной клеткой, не приведенной в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом. Иммуномодулирующее соединение может представлять собой любое соединение, описанное в разделе 5.9, выше, например, леналидомид или помалидомид.

В конкретных вариантах осуществления вышеуказанного естественные киллерные клетки представляют собой CD56⁺,CD16^- промежуточные естественные киллерные клетки плаценты (PINK-клетки). В другом конкретном варианте осуществления вышеуказанных вариантов осуществления, естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, т.е., естественные киллерные клетки из совпадающих перфузата плаценты и пуповинной крови.

В другом конкретном варианте осуществления указанная совокупность естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток или комбинированных естественных киллерных клеток, приведенная в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом, экспрессирует один или несколько из BAX, CCL5, CCR5, CSF2, FAS, GUSB, IL2RA, или TNFRSF18 на более высоком уровне, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В другом конкретном варианте осуществления указанная совокупность естественных киллерных клеток, например, PINK-клеток, приведенная в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом, экспрессирует один или несколько из ACTB, BAX, CCL2, CCL3, CCL5, CCR5, CSF1, CSF2, ECE1, FAS, GNLY, GUSB, GZMB, IL1A, IL2RA, IL8, IL10, LTA, PRF1, PTGS2, SKI и TBX21 на более высоком уровне, чем эквивалентное количество указанных естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанным иммуномодулирующим соединением или талидомидом.

В настоящем документе представлен также способ увеличения цитотоксичности популяции клеток перфузата плаценты человека, например, общих ядросодержащих клеток из перфузата плаценты, по отношению к совокупности клеток опухолей, включающий в себя контакт клеток перфузата плаценты с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в течение периода времени и в концентрации, достаточных для того, чтобы клетки перфузата плаценты обладали поддающейся детекции увеличенной цитотоксичностью по отношению к указанной совокупности клеток опухолей по сравнению с эквивалентным количеством клеток перфузата плаценты, не приведенных в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом. Другой вариант осуществления, представленный в настоящем документе, относится к способу увеличения экспрессии гранзима B в популяции клеток перфузата плаценты, включающему в себя контакт популяции клеток перфузата плаценты с иммуномодулирующим соединением или талидомидом в течение периода времени и в концентрации, достаточных для экспрессии в популяции клеток перфузата плаценты поддающегося детекции большего количества гранзима B по сравнению с эквивалентным количеством клеток перфузата плаценты, не приведенных в контакт с иммуномодулирующим соединением или талидомидом.

5.10.2. Введение клеток и иммуномодулирующих соединений или талидомида

Клетки и иммуномодулирующие соединения, как описано выше, или талидомид, можно вводить индивидууму, имеющему злокачественную опухоль, например, индивидууму, имеющему клетки опухолей, например, индивидууму со злокачественной опухолью клеток крови или солидной опухолью; или индивидууму, имеющему вирусную инфекцию, для лечения указанной злокачественной опухоли клеток крови, солидной опухоли или вирусной инфекции. В конкретных вариантах осуществления клетки не приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением перед использованием, например, перед введением указанному индивидууму в сочетании с иммуномодулирующим соединением или талидомидом. В других конкретных вариантах осуществления клетки приводят в контакт с иммуномодулирующим соединением перед использованием, например, перед введением указанному индивидууму в сочетании с иммуномодулирующим соединением или талидомидом.

В одном из вариантов осуществления естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, и иммуномодулирующее соединение или талидомид комбинируют, например, после размножения естественных киллерных клеток или во время составления естественных киллерных клеток для введения индивидууму, страдающему злокачественной опухолью или вирусной инфекцией. В другом варианте осуществления естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, и иммуномодулирующее соединение или талидомид объединяют непосредственно перед введением индивидууму, страдающему злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, например, в учреждении для наблюдения за пациентами, в котором проводят лечение индивидуума. В другом варианте осуществления естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, и иммуномодулирующее соединение или талидомид вводят индивидууму, страдающему злокачественной опухолью или вирусной инфекцией, по отдельности, например, в различных составах. В конкретном варианте осуществления естественные киллерные клетки можно вводить индивидууму до введения иммуномодулирующего соединения или талидомида. В другом конкретном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение или талидомид вводят индивидууму после введения естественных киллерных клеток индивидууму. В другом конкретном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение или талидомид и естественные киллерные клетки вводят в одно и то же время или приблизительно в одно и то же время.

В конкретном варианте осуществления представленные в настоящем документе способы лечения индивидуума, имеющего клетки опухолей, злокачественную опухоль клеток крови или солидную опухоль, например, индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, или индивидуума, имеющего вирусную инфекцию, включающие в себя введение естественных киллерных клеток, и необязательно, иммуномодулирующего соединения или талидомида, дополнительно включают в себя введение индивидууму иммуносупрессивного соединения, например, циклоспорина; FK506; 2-ацетил-4(5)-(1,2,3,4-тетрагидроксибутил)имидазола (THI); циамексона; или т.п. В конкретных вариантах осуществления иммуносупрессивное соединение представляет собой или содержит адгерентные клетки плаценты (например, адгерентные плацентарные стволовые или мультипотентные клетки, описанные в Патенте США No. 7468276 и Публикации патентной заявки США No. 2007/0275362, полные описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки, или мезенхимальные стволовые клетки, например, происходящие из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки.

Клетки, например, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки; клетки перфузата плаценты человека; комбинированные естественные киллерные клетки; популяции клеток, содержащие такие клетки; или их комбинации, и необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, можно вводить индивидууму профилактически. Например, клетки и необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, как описано выше, можно вводить индивидууму, подверженному риску развития метастазирующей злокачественной опухоли, например, индивидууму, страдающему раком молочной железы, раком предстательной железы, множественной миеломой или другим типом злокачественной опухоли, проявляющей тенденцию к метастазированию, например, в ткань кости или мозга. Доказательство метастазирования или его отсутствия не является необходимым условием для профилактического использования иммуномодулирующих соединений или талидомида и клеток.

Клетки, например, естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки; клетки перфузата плаценты человека; комбинированные естественные киллерные клетки; популяции клеток, содержащие такие клетки; или их комбинации, и необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, можно вводить индивидууму, например, индивидууму, имеющему клетки опухолей или индивидууму, имеющему злокачественную опухоль клеток крови или солидную опухоль, например, пациенту со злокачественной опухолью или индивидууму, страдающему вирусной инфекцией, любым приемлемым в медицине способом, известным в данной области, подходящим для введения живых клеток. В различных вариантах осуществления клетки, представленные в настоящем документе, можно хирургически имплантировать, инъецировать, вводить посредством инфузии, например, посредством катетера или шприца, или иным образом вводить напрямую или опосредованно в участок, где необходима репарация или усиление. В одном варианте осуществления клетки вводят указанному индивидууму; то есть, внутрь опухоли. В другом варианте осуществления клетки и, необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, вводят индивидууму в участок опухоли, например, любой солидной опухоли, например, посредством внутриопухолевой инъекции. В конкретных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой опухоль рак мочевого пузыря или опухоль рак печени. В конкретном варианте осуществления, в которых индивидуум имеет опухоль более, чем в одном участке, клетки и, необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, вводят по меньшей мере в два, или во все, участки опухолей. В других конкретных вариантах осуществления клетки, представленные в настоящем документе, или композиции, содержащие клетки, вводят перорально, назально, внутриартериально, парентерально, в глаз, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, интрацеребрально, интравентрикулярно, интрацеребровентрикулярно, интратекально, интрацистернально, интраспинально и/или периспинально. В конкретных вариантах осуществления клетки вводят посредством интракраниальных или интравертебральных игл и/или катетеров с насосами или без них.

Естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, клетки перфузата плаценты человека, комбинированные естественные киллерные клетки или их комбинации, или популяции клеток, содержащие такие клетки, и необязательно, иммуномодулирующее соединение или талидомид, можно вводить индивидууму в композиции, например, матриксе, гидрогеле, каркасе или т.п., содержащей клетки.

В одном из вариантов осуществления клетки, представленные в настоящем документе, рассевают на природном матриксе, например, плацентарном биологическом материале, таком как материал амниотической оболочки. Такой материал амниотической оболочки может представлять собой, например, амниотическую оболочку, нарезанную непосредственно из плаценты млекопитающих; фиксированную или обработанную нагреванием амниотическую оболочку, по существу сухую (т.е., <20% H₂O) амниотическую оболочку, хорионическую оболочку, по существу сухую хорионическую оболочку, по существу сухую амниотическую и хорионическую оболочку, и т.п. Предпочтительные плацентарные биологические материалы, на которых можно рассевать плацентарные стволовые клетки, описаны в Hariri, Публикация патентной заявки США No. 2004/0048796, полное содержание которой, таким образом, приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

В другом варианте осуществления естественные киллерные клетки, например, PINK-клетки, клетки перфузата плаценты человека, комбинированные естественные киллерные клетки или их комбинации, или популяции клеток, содержащие такие клетки, суспендируют в растворе гидрогеля, например, пригодного для инъекции. Подходящие гидрогели для таких композиций включают в себя самособирающиеся пептиды, такие как RAD16. В одном из вариантов осуществления раствору гидрогеля, содержащему клетки, можно позволять затвердевать, например, в форме, для образования матрикса с распределенными в нем клетками для имплантации. Клетки в таком матриксе можно также культивировать таким образом, что клетки размножаются посредством митоза до имплантации. Гидрогель может представлять собой, например, органический полимер (природный или синтетический), сшитый посредством ковалентных, ионных или водородных связей для создания трехмерной структуры открытой решетки, захватывающей молекулы воды для образования геля. Образующие гидрогель материалы включают в себя полисахариды, такие как альгинат и его соли, пептиды, полифосфазины и полиакрилаты с ионной сшивкой, или блок-полимеры, такие как блок-сополимеры полиэтиленоксид-полипропиленгликоль, сшитые посредством температуры или pH, соответственно. В некоторых вариантах осуществления гидрогель или матрикс по изобретению является биоразлагаемым.

В некоторых вариантах осуществления изобретения состав содержит гель, способный полимеризоваться in situ (см., например, Публикацию патентной заявки США 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).

В некоторых вариантах осуществления полимеры являются по меньшей мере частично растворимыми в водных растворах, таких как вода, забуференные солевые растворы или водно-спиртовые растворы, имеющие заряженные боковые группы или их соли с моновалентными ионами. Примеры полимеров, имеющих кислые боковые группы, которые могут вступать в реакцию с катионами, представляют собой поли(фосфазены), поли(акриловые кислоты), поли(метакриловые кислоты), сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, поли(винилацетат), и сульфонированные полимеры, такие как сульфонированный полистирол. Можно использовать также сополимеры, имеющие кислые боковые группы, полученные реакцией акриловой или метакриловой кислоты и мономеры или полимеры винилэфира. Примеры кислых групп представляют собой группы карбоновой кислоты, группы сульфоновой кислоты, группы галогенированного (предпочтительно, фторированного) спирта, фенольные OH-группы и кислые OH-группы.

Плацентарные стволовые клетки по изобретению или их совместные культуры можно рассевать на трехмерную основу или каркас и имплантировать in vivo. Такую основу можно имплантировать в сочетании с любым одним или несколькими факторами роста, клетками, лекарственными средствами или другими компонентами, стимулирующими образование ткани или иным образом усиливающие или улучшающие практическое осуществление изобретения.

Примеры каркасов, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают нетканые маты, поропласты или самособирающиеся пептиды. Нетканые маты можно формировать с использованием волокон, состоящих из синтетического рассасывающегося сополимера гликолевой и молочной кислот (например, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Пены, состоящие, например, из сополимера поли(ε-капролактон)/поли(гликолевой кислоты) (PCL/PGA), сформированные такими способами, как высушивание в вакууме замороженного материала или лиофилизация (см., например, Патент США No. 6355699), также можно использовать в качестве каркасов.

Плацентарные стволовые клетки по изобретению можно также рассевать в физиологически приемлемый керамический материал или приводить в контакт с физиологически приемлемым керамическим материалом, включая, в качестве неограничивающих примеров, моно-, ди-, три-, альфа-три-, бета-три-, и тетра-фосфат кальция, гидроксиапатит, фторапатиты, сульфаты кальция, фториды кальция, оксиды кальция, карбонаты кальция, фосфаты магния-кальция, биологически активные виды стекла, такие как BIOGLASS®, и их смеси. Пористые биосовместимые керамические материалы, коммерчески доступные в настоящее время, включают в себя SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canada), ENDOBON® (Merck Biomaterial France, France), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Switzerland), и продукты для трансплантации кости из минерализованного коллагена, такие как HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) и VITOSS®, RHAKOSS™, и CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). Основа может представлять собой смесь, сочетание или композит из природных и/или синтетических материалов.

В другом варианте осуществления плацентарные стволовые клетки можно рассевать на фетр или приводить в контакт с фетром, который может состоять, например, из многоволоконной пряжи, изготовленной из биорассасывающегося материала, такого как сополимеры или смеси PGA, PLA, PCL или гиалуроновой кислоты.

Плацентарные стволовые клетки по изобретению можно, в другом варианте осуществления, рассевать на пенистые каркасы, которые могут представлять собой композитные структуры. Такие пенистые каркасы можно формовать в нужную форму, такую как часть конкретной структуры организма, подлежащей репарации, замене или поддержке. В некоторых вариантах осуществления основу обрабатывают, например, 0,1 M уксусной кислотой с последующей инкубацией в полилизине, PBS и/или коллагене, до инокуляции клеток по изобретению, для увеличения прикрепления клеток. Внешние поверхности матрикса можно модифицировать для улучшения прикрепления или роста клеток и дифференцировки ткани, например, посредством покрытия матрикса плазмой или добавления одного или нескольких белков (например, коллагенов, эластичных волокон, ретикулярных волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, гепаринсульфата, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератинсульфат и т.д.), клеточного матрикса и/или других материалов, таких как, в качестве неограничивающих примеров, желатин, альгинаты, агар, агароза и растительные смолы и т.п.

В некоторых вариантах осуществления каркас содержит материалы или обработан материалами, которые придают ему нетромбогенность. Эти обработки и материалы могут также стимулировать и поддерживать рост, миграцию эндотелия и накопление внеклеточного матрикса. Эти материалы и обработки включают в себя в качестве неограничивающих примеров природные материалы, например, белки базальной мембраны, такие как ламинин и коллаген IV типа, синтетические материалы, такие как EPTFE и силиконы из фрагментированной полиуретанмочевины, такие как PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif). Каркас может также содержать противотромботические средства, такие как гепарин; каркасы можно также обрабатывать для изменения поверхностного заряда (например, покрывать плазмой) до рассева плацентарных стволовых клеток.

5.10.3. Введение иммуномодулирующих соединений или талидомида

В конкретных вариантах осуществления, в которых иммуномодулирующие соединения или талидомид вводят индивидууму, имеющему клетки опухолей, например, злокачественной опухоли, например, злокачественной опухоли клеток крови или солидной опухоли; или индивидууму, имеющему вирусную инфекцию, иммуномодулирующее соединение или талидомид можно, как указано выше, вводить отдельно, и таким образом, составлять отдельно от клеток.

Можно использовать любой способ введения. Например, иммуномодулирующее соединение или талидомид можно вводить пероральным, парентеральным, внутривенным, чрескожным, внутримышечным, ректальным, подъязычным, мукозальным, назальным или другим способом. Кроме того, иммуномодулирующее соединение или талидомид можно вводить в форме фармацевтической композиции и/или единичной дозированной формы. Подходящие лекарственные формы включают в себя в качестве неограничивающих примеров, капсулы, таблетки (включая таблетки с быстрым растворением и замедленным высвобождением), порошок, сиропы, пероральные суспензии и растворы для парентерального введения. Подходящие способы введения для иммуномодулирующих соединений или талидомида, так же как подходящие лекарственные формы и фармацевтические композиции, можно найти в Публикациях патентных заявок США No. 20060188475, 20060205787 и 20070049618, полное содержание каждой из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Типичные лекарственные формы содержат иммуномодулирующее соединение или талидомид, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, стереоизомер или пролекарство, в количестве от приблизительно 0,001 до приблизительно 150 мг. В частности, лекарственные формы содержат иммуномодулирующее соединение или талидомид, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, стереоизомер или пролекарство в количестве приблизительно 0,001, 0,01, 0,1, 1, 2, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 50, 100, 150 или 200 мг. В конкретном варианте осуществления лекарственная форма содержит 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-изоиндолин-1,3-дион в количестве приблизительно 0,001, 0,01, 0,1, 1, 2, 5, 10, 25 или 50 мг.

Фармацевтические композиции, содержащие иммуномодулирующее соединение или талидомид, могут также содержать один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей. Смотри, например, Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4^th Ed. (2003), полное содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

В конкретном варианте осуществления лекарственная форма содержит 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион в количестве приблизительно 0,001, 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 25 или 50 мг. Типичные лекарственные формы содержат второй активный ингредиент в количестве от 1 мкг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 500 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 350 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 200 мг. Это изобретение относится также к использованию рацемической смеси, (S)-изомера и (R)-изомера 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пиперидин-2,6-диона. Как правило, рацемический 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион можно вводить в количестве 1, 5, 10, 15, 25 или 50 мг в сутки. Оптические изомеры можно вводить также в количестве, сравнимом с количеством рацемической смеси. Дозы можно регулировать в зависимости от типа заболевания или нарушения, подлежащего лечению, предотвращению или управлению течением, и количество иммуномодулирующего соединения или талидомида и любых необязательных дополнительных средств, одновременно вводимых пациенту, полностью находится в компетенции специалиста в данной области.

6. ПРИМЕРЫ

6.1. Пример 1: Характеризация полученных из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток из перфузата плаценты и пуповинной крови

В настоящем примере показано выделение и культивирование естественных киллерных клеток из перфузата плаценты человека.

Выделение естественных киллерных клеток плаценты. Естественные киллерные клетки выделяли из 8 единиц перфузата плаценты человека (HPP) и из 4 единиц пуповинной крови (UCB), с использованием CD56-конъюгированных микробусин. Выделение PINK-клеток проводили отбором на магнитных бусинах (Miltenyi Biotec). Из послеродовой плаценты выпускали кровь и проводили ее перфузию с помощью от приблизительно 200 до приблизительно 750 мл перфузионного раствора (раствор 0,9% NaCl для инъекций степени чистоты, установленной Фармакопеей США (Кат. No. 68200-804, VWR). Необработанный перфузат собирали и обрабатывали для удаления эритроцитов. Мононуклеарные клетки из HPP или UCB промывали один раз с помощью буфера для флуоресцентной сортировки клеток (FACS) (RPMI 1640, без фенола красного, плюс 5% FBS), затем центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 6 минут. Подсчитывали число клеток, и осадок клеток ресуспендировали в 80 мкл буфера на 10⁷ общих клеток с 20 мкл CD3 микробусин (Каталожный No. 130-050-101, Miltenyi). Систему хорошо перемешивали и инкубировали в течение 15 минут при 4-8°C. Добавляли 1-2 мл буфера на 10⁷ общих клеток, и смесь затем центрифугировали при 300 g в течение 10 минут. Супернатант полностью убирали с помощью пипетки. Осадок клеток ресуспендировали вплоть до 10⁸ клеток 500 мкл буфера и подготавливали для магнитного разделения. Колонку LS (Miltenyi Biotec) помещали в магнитное поле в сепараторе клеток MIDIMACS™ (Miltenyi Biotec), 3 мл буфера применяли для промывки колонки, и суспензию клеток/микробусин наносили на колонку. Немеченые CD3^- клетки, которые проходят через колонку и которые могут включать естественные киллерные клетки, собирали, вместе с 2×3 мл буфера для промывки. CD3^- клетки подсчитывали, промывали один раз, затем окрашивали с помощью CD56 микробусин (Кат#: 130-050-401, Miltenyi), и разделяли/выделяли с использованием такого же способа, как для разделения на CD3 микробусинах, описанного выше. Популяция CD56+CD3- таким образом была собрана и готова для дальнейшего анализа. Диапазон процентного содержания естественных киллерных клеток составлял 3,52-11,6 (медиана 6,04, среднее 5,22) в HPP, и 1,06-8,44 в UCB (медиана: 3,42, среднее: 4,2). В результате отбора естественных киллерных клеток из HPP на CD56 микробусинах получили популяцию, чистую приблизительно на 80%. См. Фиг. 1. Среди всей популяции CD56⁺, CD3^- естественных киллерных клеток, диапазон процентного содержания CD56⁺, CD16^- естественных киллерных клеток (то есть, PINK-клеток) составлял 56,6-87,2 (медиана 74,2, среднее 65,5) для HPP, и 53,7-96,6 (медиана 72,8) для UCB. Диапазон процентного содержания CD56⁺, CD16⁺ естественных киллерных клеток составлял 12,8-43,3 (медиана 25,8, среднее 34,5) для HPP и 3,4-46,3 (медиана 27,3, среднее 33,4) для UCB.

В других экспериментах естественные киллерные клетки выделяли с использованием набора для магнитного негативного отбора, нацеленного на антигены клеточной поверхности клеток крови (CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD66b, CD123, HLA-DR, гликофорин A). Единицы HPP и UCB после криоконсервации размораживали и разводили 1:1 с помощью среды для размораживания (Среда RPMI 1640 (Каталожный #22400, Gibco) плюс 20% эмбриональная бычья сыворотка, инактивированная нагреванием (Каталожный #SH30070,03, Hyclone)) и центрифугировали при 1500 об./мин в течение 8 минут. Супернатант удаляли и проводили обработку хлоридом аммония для дальнейшего истощения эритроцитов; каждую единицу ресуспендировали приблизительно в 30 мл ледяного буфера для FACS (RPMI 1640, без фенола красного, плюс 5% FBS), и затем добавляли 60 мл ледяного хлорида аммония (Каталожный #07850, Stem Cell), раствор встряхивали и затем инкубировали на льду в течение 5 минут. Затем мононуклеарные клетки промывали буфером для FACS 3 раза и затем центрифугировали при 1500 об./мин в течение 8 минут. Подсчитывали число клеток, и осадок клеток ресуспендировали при 5×10⁷ живых клеток/мл в буфере RoboSep (Каталожный #20104, Stem Cell) плюс раствор 0,1 мг/мл ДНКазы I (Каталожный #07900, Stem Cell) добавляли к суспензии клеток, осторожно перемешивали пипетированием и инкубировали 15 минут при комнатной температуре до выделения. Агрегаты удаляли из суспензии клеток фильтрацией через нейлоновое сито с сеткой 40 мкм (Каталожный #352340, BD Falcon) перед тем, как приступить к выделению. Выделение автоматизировали посредством устройства RoboSep (Каталожный #20000, Stem Cell) и программы «Негативный отбор 19055 и высокопроизводительное выделение NK человека» (добавление 50 мкл/мл коктейля, добавление 100 мкл/мл микрочастиц, инкубация 10 и 5, разделение 1×2,5 минут) с помощью набора для обогащения NK клеток человека (Каталожный #19055, Stem Cell), включающего коктейль для обогащения NK клеток человека при негативном отборе EasySep и магнитные частицы EasySep. Популяция CD56⁺CD3^- таким образом была собрана и готова для дальнейшего анализа.

Размножение естественных киллерных клеток. В общем, естественные киллерные клетки размножали следующим образом. Исходную среду для культивирования естественных киллерных клеток получали на основе модификации способа, описанного в Yssel et al., J. Immunol. Methods 72(l):219-227 (1984) и Litwin et al., J. Exp. Med. 178(4):1321-1326 (1993). Кратко, исходная среда содержит IMDM (Invitrogen) с 10% FCS (Hyclone), содержащую следующие реагенты с конечной концентрацией 35 мкг/мл трансферрина (Sigma-Aldrich), 5 мкг/мл инсулина (Sigma-Aldrich), 2×10^-5 M этаноламина (Sigma-Aldrich), 1 мкг/мл олеиновой кислоты (Sigma-Aldrich), 1 мкг/мл линолеиновой кислоты (Sigma-Aldrich), 0,2 мкг/мл пальмитиновой кислоты (Sigma-Aldrich), 2,5 мкг/мл BSA (Sigma-Aldrich) и 0,1 мкг/мл фитогемагглютинина (PHA-P, Sigma-Aldrich). CD56⁺CD3^- NK-клетки ресуспендировали при 2,5×10⁵ живых клеток/мл исходной среды плюс 200 МЕ/мл IL-2 (R&D Systems) в обработанном для культивирования клеток 24-луночном планшете или T-флаконе. Обработанные митомицином C аллогенные PBMC и клетки K562 (линия клеток хронического миелогенного лейкоза) добавляли к исходной среде в качестве фидерных клеток до конечной концентрации 1×10⁶ на мл. NK-клетки культивировали в течение 5-6 суток при 37°C в 5% CO₂. Через 5-6 суток и затем каждые 3-4 суток в культуру добавляли равный объем поддерживающей среды (IMDM с 10% FCS, 2% сывороткой AB человека, антибиотиками, L-глутамином и 400 единиц IL-2 на мл). NK-клетки собирали на сутки 21.

Характеризация происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток. Размораживали HPP и CB от совпадающего донора, и клетки промывали буфером для FACS (RPMI-1640 с 5% FBS). Затем естественные киллерные клетки обогащали с помощью CD56 микробусин с использованием системы для магнитного разделения ROBOSEP® (StemCell Technologies), согласно инструкциям производителя. Обогащенную CD56 популяцию естественных киллерных клеток окрашивали с помощью следующих антител (BD Bioscience, если не указано иначе) для иммунофенотипической характеризации: анти-CD56, конъюгированное с PE-Cy-7, анти-CD3 APC Cy7, анти-CD16 FITC, анти-NKG2D APC, анти-NKp46 APC, анти-CD94 PE(R&D), анти-NKB1 PE, и анти-KIR-NKAT2 PE. CD94, NKG2D и NKp46 представляют собой маркеры, отсутствующие или обладающие уменьшенной экспрессией в предшественниках NK-клеток, но присутствующие в полностью дифференцированных NK-клетках. Смотри Freud et al., «Evidence for Discrete States of Human Natural Killer Cell Differentiation In Vivo,» J. Exp. Med. 203(4): 1033-1043 (2006); Eagle & Trowsdale, «Promiscuity and the Single Receptor: NKG2D,» Nature Reviews Immunology, опубликовано онлайн 3 августа 2007 г.; Walzer et al., «Natural Killer Cells: From CD3^-NKp46⁺ to Post-Genomics Meta-Analyses,» Curr. Opinion Immunol. 19:365-372 (2007). Как показано в таблице 1, экспрессия KIR3DL1, KIR2DL2/L3, NKG2D, NKp46 и CD94 значимо не отличалась в обогащенной популяции CD56⁺ клеток из HPP и совпадающей по HLA CD56⁺ популяции клеток из пуповинной крови (CB).

6.2. Пример 2: Характеризация происходящих из плаценты промежуточных естественных киллерных клеток из комбинированных перфузата плаценты и пуповинной крови

Мононуклеарные клетки из пуповинной крови и перфузата плаценты (комбинация) от совпадающего донора смешивали и промывали буфером для FACS (RPMI-1640 с 5% FBS) один раз, и иммунофенотипически характеризовали с использованием антител, перечисленных в таблице 2, на BD FACSCanto (BD Biosciences). Данные анализировали посредством программного обеспечения Flow Jo (Tree Star).

Иммунофенотипическая характеризация NK-клеток плаценты и NK-клеток периферической крови (PB). NK-клетки можно разделить на две главные группы: CD56⁺CD16⁺ NK-клетки и CD56⁺CD16^- клетки. CD56⁺CD16⁺ NK-клетки имеют множество цитолитических гранул и высокую экспрессию CD16, и таким образом, являются способными вызывать антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC). CD56⁺CD16^- NK-клетки, напротив, имеют очень мало цитолитических гранул, низкую или отсутствующую экспрессию CD16, но являются способными продуцировать цитокины и хемокины при активации. Индивидуальные NK-клетки экспонируют разнообразный репертуар активирующих и ингибирующих рецепторов, включая иммуноглобулиноподобные рецепторы киллеров (KIR, например, KIR3DL1, и KIR2DL2/3), рецепторы естественной цитотоксичности NCR (например, NKp30, NKp44 и NKp46), лектиноподобные рецепторы клеток-киллеров (KLR; например, CD94, NKG2D), 2B4 и CD226.

Анализ FACS проводили для NK плаценты и NK-клеток периферической крови с использованием конъюгированных с флуоресцентным веществом mAb против конкретных рецепторов NK. Среди 11 охарактеризованных подгрупп NK, для количества клеток в семи из 11 подгрупп NK (CD3^-CD56⁺CD16^-, CD3^-CD56⁺CD16⁺, CD3^-CD56⁺KIR2DL2/3⁺, CD3^-CD56⁺NKp46⁺, CD3^-CD56⁺NKp30⁺, CD3^-CD56⁺2B4⁺ и CD3^-CD56⁺CD94⁺) показано значимое различие (p<0,05) между NK плаценты и NK-клетками периферической крови (различие составляло 64%) (таблица 3 A; см. также таблицы 3B и 3C).

Таблица 3A. Фенотипическая характеризация CD3-CD56+ NK-клеток в 16 единицах комбинированной пуповинной крови и перфузата плаценты человека от совпадающего донора (комбинация) и 13 единицах периферической крови (PB). Средний % для рядов, содержащих CD3, CD56 и третий маркер, представляет собой процент CD3-CD56+ клеток, экспрессирующих также третий маркер. t-критерий для двух выборок используют для определения, являются ли популяционные средние равными в единицах из плаценты и периферической крови.
	Комбинация (16 единиц)	PB (13 единиц)
Поверхностные маркеры	Средний %	Средний %	значение p
CD3-CD56+	2,2	2,4	0,728
CD3-CD56+CD16-	60,9	21,4	0,000
CD3-CD56+CD16+	30,1	78,6	0,000
CD3-CD56+KIR3DL1+	12,3	7,1	0,099
CD3-CD56+KIR2DL2/L3+	21,9	9,5	0,004
CD3-CD56+NKG2D+	42,1	29,9	0,126
CD3-CD56+NKp46+	7,0	18,9	0,011
CD3-CD56+CD226+	16,0	26,7	0,135
CD3-CD56+NKp44+	9,5	4,9	0,073
CD3-CD56+NKp30+	39,1	19,0	0,006
CD3-CD56+2B4+	11,1	4,5	0,019
CD3-CD56+CD94+	71,3	26,2	0,000

В таблицах 3B и 3C показана фенотипическая характеризация CD3^-CD56⁺CD16^- и CD3^-CD56⁺CD16⁺ NK-клеток в 16 единицах комбинированной пуповинной крови и перфузата плаценты человека от совпадающего донора (комбинация) и 13 единицах периферической крови (PB) в отдельном эксперименте. Средний % для рядов, содержащих CD3, CD56, CD16 и четвертый маркер, представляет собой процент CD3^-CD56⁺CD16⁺ или CD3^-CD56⁺CD16^- клеток, экспрессирующих также четвертый маркер.

Таблица 3B.
	Комбинация	PB
Поверхностные маркеры	Средний %	Средний %	значение p
CD3-CD56+CD16-	62,3	14,1	0,000
CD3-CD56+CD16-KIR3DL1+	7,8	1,5	0,004
CD3-CD56+CD16-NKG2D+	43,5	42,7	0,941
CD3-CD56+CD16-KIR2DL2/L3+	13,6	2,4	0,000
CD3-CD56+CD16-NKp46+	6,7	43,6	0,001
CD3-CD56+CD16-CD94+	89,8	48,5	0,057
CD3-CD56+CD16-CD226+	7,6	4,9	0,068
CD3-CD56+CD16-NKp44+	3,4	0,6	0,076
CD3-CD56+CD16-NKp30+	46,7	22,0	0,000
CD3-CD56+CD16-2B4+	3,7	0,5	0,078

Таблица 3C.
	Комбинация	PB
Поверхностные маркеры	Средний %	Средний %	значение p
CD3-CD56+CD16+	37,7	85,9	0,000
CD3-CD56+CD16+KIR3DL1+	21,5	8,9	0,014

CD3-CD56+CD16+NKG2D+	42,1	28,5	0,066
CD3-CD56+CD16+KIR2DL2/L3+	34,5	12,1	0,000
CD3-CD56+CD16+NKp46+	10,4	14,5	0,242
CD3-CD56+CD16+CD94+	72,9	23,8	0,000
CD3-CD56+CD16+CD226+	35,5	32,6	0,347
CD3-CD56+CD16+NKp44+	22,6	6,4	0,016
CD3-CD56+CD16+NKp30+	45,7	19,7	0,000
CD3-CD56+CD16+2B4+	31,2	6,1	0,008

60,9% NK-клеток плаценты являются CD56⁺CD16^- (полученными из плаценты промежуточными естественными киллерными клетками (PINK)), в то время как только 21,4% NK-клеток периферической крови являются CD56⁺CD16^-. После культивирования в течение 21 суток, для процентного содержания четырех из 11 подгрупп NK (CD3^-CD56⁺KIR2DL2/3⁺, CD3^-CD56⁺NKp46⁺, CD3^-CD56⁺NKp44⁺ и CD3^-CD56⁺NKp30⁺) показано значимое различие (p<0,05) между NK-клетками плаценты и периферической крови (Таблица 4).

Кроме того, в отдельном эксперименте определили, что после культивирования в течение 21 суток для NK-клеток плаценты и периферической крови показаны уникальные профили цитокинов, в частности, для IL-8, как определено анализом Luminex (Таблица 5).

Таблица 5
Цитокин	PB (пг/мл)	Комбинация (пг/мл)
IL-13	1,26	1,89
IL-8	6,61	15,77
IL-10	1,26	2,23
TNFa	0,28	0,34
MCP-1	10,49	11,32

Определение профиля микроРНК NK-клеток плаценты и NK-клеток периферической крови. Выделенные или размноженные NK-клетки подвергали выделению микроРНК (мкРНК) с использованием набора для выделения мкРНК MIRVANA™ (Ambion, Кат.# 1560). NK-клетки (0,5-1,5×10⁶ клеток) разрушали в денатурирующем буфере для лизиса. Затем образцы подвергали экстракции кислым-фенолом+хлороформом для выделения РНК, высоко обогащенной молекулами малой РНК. Добавляли 100% этанол для доведения образца до 25% этанола. Когда эту смесь лизат/этанол пропускали через фильтр из стекловолокна, большие РНК были иммобилизованы, и молекулы малых РНК собирались в фильтрате. Затем концентрацию этанола в фильтрате увеличивали до 55%, и смесь пропускали через второй фильтр из стекловолокна, где малые РНК становились иммобилизованными. Эту РНК промывали несколько раз и элюировали в растворе низкой ионной силы. Концентрацию и чистоту выделенной малой РНК определяли измерением ее оптического поглощения при 260 и 280 нм.

мкРНК, как обнаружено, являющиеся уникальными для PINK-клеток, показаны в таблице 6. Обнаружено, что одна из мкРНК, обозначенная hsa-miR-199b, является уникальной для NK-клеток периферической крови.

Иммунофенотипическая характеризация культивированных NK-клеток плаценты и не культивированных NK-клеток. Общие свойства культивированных PINK-клеток оценивали в расширенных иммунофенотипических исследованиях и анализах цитотоксичности. Для определения фенотипа размноженных NK-клеток, анализировали экспрессию NK рецепторов (NKR), таких как KIR, NKG2D, NKp46, NKp44 и 2B4. Анализы цитотоксичности проводили посредством мечения клеток опухолей (клеток K562) с помощью PKH26, затем совместного культивирования с PINK-клетками в течение 4 часов. От суток 0 до суток 21 экспрессия NKG2D увеличивалась от 60,9%±4,8% до 86%±17,4% (значение p 0,024); экспрессия NKp46 увеличивалась от 10,5%±5,4% до 82,8%±9,0% (значение p 0,00002); экспрессия NKp44 увеличивалась от 9,6%±6,5% до 51,6%±27,5% (значение p 0,022); и экспрессия 2B4 уменьшалась от 13,0%±7,1% до 0,65%±0,5% (значение p 0,009%)(Таблица 7). В этих условиях культивирования ингибирующие KIR, включая KIR3DL1 (иммуноглобулиноподобный рецептор клеток-киллеров, три домена, длинный цитоплазматический хвост 1, ингибирующий рецептор) и KIR2DL2/L3 (иммуноглобулиноподобный рецептор клеток-киллеров, два домена, длинный цитоплазматический хвост 2 и длинный цитоплазматический хвост 3; ингибирующие рецепторы), оставались без изменения во время размножения в течение 21 суток. Кроме того, изменения экспрессии NKR коррелировали со значительным увеличением цитолитической активности против клеток K562 на сутки 21 по сравнению с сутками 14 (63%±15% по сравнению с 45%±4%, значение p 0,0004). Эти обнаружения привели к идентификации предположительных маркеров NK-клеток с хорошей корреляцией с активностью цитотоксичности NK-клеток.

Определение протеомного профиля мембраны культивированных NK-клеток плаценты и культивированных NK-клеток периферической крови посредством способа иммобилизации белков на основе липидов и LC/MS с линейной ионной ловушкой. Очистка мембранных белков: Естественные киллерные клетки плаценты из комбинированных перфузата плаценты и клеток пуповинной крови, и NK-клетки PB, культивированные в течение 21 суток, инкубировали в течение 15 мин с раствором коктейля ингибиторов протеаз (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO; содержит 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид (AEBSF), пепстатин A, E-64, бестатин, лейпептин и апротинин, без хелаторов металлов) до лизиса клеток. Затем клетки лизировали добавлением раствора 10 мМ HCl, без детергентов, и центрифугировали в течение 10 мин при 400 g для осаждения и удаления ядер. Супернатант после удаления ядер переносили в пробирку для ультрацентрифугирования и центрифугировали в ультрацентрифуге WX80 с ротором T-1270 (Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC) при 100000 g в течение 150 минут, получая осадок мембранных белков.

Получение, иммобилизация и расщепление протеолипосом: Осадок мембранных белков промывали несколько раз с использованием буфера NANOXIS® (10 мМ Трис, 300 мМ NaCl, pH 8). Осадок мембранных белков суспендировали в 1,5 мл буфера NANOXIS® и затем обрабатывали ультразвуком с помощью наконечника с использованием ультразвуковой установки VIBRA-CELL™ VC505 (Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT) в течение 20 минут на льду. Размер протеолипосом определяли окрашиванием с помощью красителя FM1-43 (Invitrogen, Carlsbad, CA) и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Концентрацию белка в суспензии протеолипосом определяли анализом BCA (Thermo Scientific). Затем протеолипосомы инъецировали в LPI™Flow Cell (Nanoxis AB, Gothenburg, Sweden) с использованием обычного наконечника для пипетки и позволяли иммобилизацию в течение 1 часа. После иммобилизации проводили серии стадий промывки и трипсин при 5 мкг/мл (Princeton Separations, Adelphi, NJ) инъецировали непосредственно в LPI™ Flow Cell. Чип инкубировали в течение ночи при 37°C. Затем полученные с помощью трипсина пептиды элюировали с чипа и затем обессоливали с использованием картриджа Sep-Pak (Waters Corporation, Milford, MA).

Сильное катионообменное фракционирование (SCX): Полученные обработкой трипсином пептиды разводили в растворе 0,1% муравьиной кислоты/воды и наносили на сильную катионообменную (SCX) колонку TOP-TIP™ (PoIyLC, Columbia, MD), наконечник для пипетки, набитый SCX сорбентом 30 мкм полисульфоЭТИЛ-аспартамидом. Пептиды элюировали с SCX TOP-TIP™ с использованием ступенчатого градиента буфера формата аммония, pH 2,8 (10 мМ-500 мМ). Каждую фракцию SCX сушили с использованием системы центрифугирования под вакуумом и разводили 5% ацетонитрилом, 0,1% муравьиной кислотой при подготовке к следующему далее анализу LC/MS.

Анализ LC/MS/MS в линейной ионной ловушке LTQ: Каждую фракцию SCX разделяли на колонке 0,2 мм×150 мм 3мкм 200 Å MAGIC C18 (Michrom Bioresources, Inc., Auburn, CA), присоединенной непосредственно к источнику для вакуумной нанокапиллярной ионизации электрораспылением с аксиальной десольватацией (ADVANCE) (Michrom Bioresources, Inc.) с использованием 180 мин градиента (Буфер A: Вода, 0,1% Муравьиная кислота; Буфер B: Ацетонитрил, 0,1% Муравьиная кислота). Источник ADVANCE достигает чувствительности, сравнимой с традиционным nanoESI, в то время как действует со значительно более высокой скоростью потока 3 мкл/мин. Элюированные пептиды анализировали на масс-спектрометре с линейной ионной ловушкой LTQ (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) с использованием десяти зависимых от данных сканирований MS/MS после каждого полного сканирования масс-спектра.

Биоинформатика: Для шести файлов RAW, соответствующих 6 солевым фракциям, собранным из каждой линии клеток опухолей (AML, CML), проводили поиск в форме однократного поиска в базе данных IPI Human с использованием реализации алгоритма SEQUEST на рабочей станции SORCERER™ SOLO™ (Sage-N Research, San Jose, CA). Указывали допуск на расхождение между теоретической и экспериментальной массой пептида 1,2 а.е.м. (1,993×10^-24 г), окисление метионина указывали в качестве дифференциальной модификации, и карбамидометилирование указывали в качестве статической модификации. Реализацию Trans-Proteomic Pipeline (TPP) в программном обеспечении Scaffold использовали для сортировки и анализа протеомных данных для мембраны. Белки рассматривали для анализа, если их идентифицировали со значимостью для пептида 95%, со значимостью для белка 95% и с 1 уникальным пептидом. Сравнения между наборами протеомных данных для мембран проводили с использованием заказных сценариев Perl собственной разработки.

В результате анализа идентифицировано 8 мембранных белков из культивированных NK-клеток плаценты, являвшихся уникальными по сравнению с мембранными белками, идентифицированными в NK-клетках из периферической крови. Смотри таблицу 8. Кроме того, идентифицировано 8 мембранных белков из NK-клеток периферической крови, являвшихся уникальными по сравнению с мембранными белками, идентифицированными в культивированных NK-клетках плаценты. Смотри таблицу 8. Белки, специфические для PINK-клеток и NK-клеток периферической крови.

Таблица 8.
БЕЛКИ, СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ДЛЯ NK-КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ	БЕЛКИ, СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ДЛЯ NK-КЛЕТОК PB
Аминопептидаза N	Предшественник рецептора 4 фактора роста фибробластов
Аполипопротеин E	Подобный иммуноассоциированному нуклеотиду 4 белок-1
Взаимодействующий с атрофином-1 белок 1	Предшественник интегрина альфа-L
Иннексин inx-3	Предшественник интегрина бета-2
Предшественник интегрина альфа-2	Предшественник интегрина бета-4
Предшественник интегрина бета-5	Предшественник мембраносвязанной литической муреин-трансгликозилазы D
Предшественник поверхностного гликопротеина GP49B тучных клеток	Белок 8, родственный оксистерол-связывающему белку
Рецептор рианодина 1	Предшественник перфорина 1

6.3. Пример 3: Цитотоксичность естественных киллерных клеток по отношению к клеткам опухолей

Этот пример показывает, что промежуточные естественные киллерные клетки плаценты являются цитотоксическими по отношению к клеткам опухолей. PINK-клетки из HPP являются цитотоксическими для клеток острого миелогенного лейкоза, как показано в анализе цитотоксичности и посредством анализа Luminex секреции цитокинов NK-клетками.

В анализе секреции цитокинов обогащенные с помощью CD56 микробусин NK-клетки из HPP смешивали с клетками острого миелогенного лейкоза KG-1a в соотношении 1:1. После инкубации в течение 24 часов супернатант собирали и подвергали анализу Luminex секреции IFN-γ и GM-CSF. Увеличенные уровни IFN-γ и GM-CSF наблюдали после 24 час инкубации CD56-обогащенных клеток HPP с клетками KG-1a, как показано на ФИГ. 2.

Цитотоксичность PINK-клеток

В анализе цитотоксичности с использованием PINK-клеток клетки опухолей - мишени метили карбоксифлуоресцеин-сукцинимидил эфиром (CFSE). CFSE представляет собой прижизненный краситель, не являющийся токсичным для клеток, и распределяющийся между дочерними клетками в ходе деления клеток. Затем клетки помещали в 96-луночные круглодонные культуральные планшеты и инкубировали со свежевыделенными CD56⁺CD16^- PINK-клетками в соотношениях эффектор-мишень (E:T) 20:1, 10:1, 5:1 и 1:1 в RPMI 1640, дополненной 10% FBS. После времени инкубации 4 часа, клетки собирали и проверяли проточной цитометрией присутствие CFSE. Количество клеток-мишеней, выделенных из культуры без NK-клеток, использовали в качестве сравнительного. Цитотоксичность определяли как: (1-CFSE_{образца}/CFSE_{контроля})*100%. Значительную цитотоксичность для клеток опухолей наблюдали при соотношении 20:1. Смотри ФИГ. 3.

Чувствительность клеток опухолей к культивированным PINK-клеткам

Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH). Анализ высвобождения LDH проводили с использованием набора для колориметрического анализа цитотоксичности CYTOTOX 96® (Promega, Кат.# G1780). В этом анализе культивированные NK-клетки, содержащие комбинацию CD56⁺CD16^- клеток и CD56⁺CD16⁺ клеток, происходящих из совпадающих HPP/UCB, являлись эффекторными клетками, и клетки опухолей являлись клетками-мишенями. Эффекторные клетки и клетки-мишени помещали в 96-луночные круглодонные культуральные планшеты и инкубировали при различных соотношениях эффектор-мишень (E:T) в 100 мкл RPMI 1640 без фенола красного (Invitrogen, Кат.# 11835-030), дополненного 2% сывороткой AB человека (Gemini, Кат.# 100-512). Культуры инкубировали в течение 4 час при 37°C в 5% CO₂. После инкубации 50 мкл супернатанта переносили в планшет для ферментативного анализа, активность LDH детектировали, согласно рекомендациям производителя, и оптическое поглощение измеряли при 490 нм в считывателе для ELISA (Synergy HT, Biotek). Степень цитотоксичности рассчитывали по следующему уравнению: %Цитотоксичности = (Образец – Спонтанная для эффектора – Спонтанная для мишени)/(Максимальная для мишени - Спонтанная для мишени)* 100.

Определенные типы опухолей могут лучше отвечать на NK-клетки, чем другие. Для анализа чувствительности клеток опухолей к культивированным PINK-клеткам двенадцать различных линий клеток опухоли, совместно культивированных с PINK-клетками, анализировали в анализе высвобождения LDH. 12 линий клеток опухоли включали клетки хронического миелогенного лейкоза человека (CML), лимфомы, ретинобластомы (RB) и множественной миеломы (MM) (Таблица 9). Цитотоксичность NK-клеток измеряли анализом высвобождения LDH после 4-часового совместного культивирования.

Таблица 9. Линии клеток опухолей из ATCC
Наименование	Описание
CCRF-CEM	Лейкоз человека
KG-1	Острый миелолейкоз человека
KG-1A	Острый миелолейкоз человека
K562	Хронический миелолейкоз человека
KU812	Хронический миелолейкоз человека
U-937	Гистиоцитарная лимфома человека
WERI-RB-1	Ретинобластома человека
HCC2218	Рак молочной железы человека
RPMI 8226	Множественная миелома человека
HCT116	Колоректальная карцинома человека
HT29	Колоректальная аденокарцинома человека
U266	Множественная миелома человека

При соотношении эффектор-мишень (E:T) 10:1 наблюдали значительную цитотоксичность культивированных PINK-клеток по отношению к клеткам K562 (CML) - 88,6%±5,6%, по отношению к клеткам U937 (лимфома) - 89,2%±9,8%, по отношению к клеткам WERI-RB-1 (RB) - 73,3%±11,8%, по отношению к клеткам RPMI8226 (MM) - 61,3%±1,3% и по отношению к клеткам U266 (MM) - 57,4%±4,7% (Таблица 10).

Таблица 10. Диференциальная чувствительность клеток опухолей к культивированным PINK-клеткам. Стандартную ошибку среднего (S. E. M.) рассчитывали для средней цитотоксичности для 3 доноров.
Линия клеток	% цитотоксичности	S.E.M.
CCRF-CEM	7,6	1,2
KG-1	20,5	1,5
KG-1a	6,0	3,2
K562	88,6	5,6
KU812	40,3	8,2
U937	89,2	9,8
WERI-RB-1	73,3	11,8
RPMI8226	61,3	1,3
U266	57,4	4,7
HCT-116	61,0	5,1
HCC2218	14,8	3,7
HT-29	45,6	6,0

Увеличение цитотоксичности клеток PINK обработкой леналидомидом и помалидомидом

Выделение и очистка РНК. Выделенные или размноженные NK-клетки подвергали выделению РНК с использованием набора RNAQUEOUS®-4PCR (Ambion, Кат. #AM1914). Кратко, NK-клетки (0,5-1,5×10⁶ клеток) лизировали в растворе для лизиса с гуанидинием. Затем лизат образца смешивали с раствором этанола и наносили на фильтр на основе силикагеля, который избирательно и количественно связывает мРНК и более крупные рибосомальные РНК; очень малые РНК, такие как тРНК и 5S рибосомальная РНК не связываются количественно. Затем фильтр промывали для удаления ДНК, белка и других загрязнений, и РНК элюировали в свободной от нуклеазы воде, содержащей следовое количество ЭДТА для хелатирования тяжелых металлов. Фильтр из силикагеля устанавливали в небольшой картридж, вставляемый в свободные от РНКазы пробирки для микроцентрифугирования, поставляемые с набором. Лизат образца, растворы для промывки и раствор для элюции пропускали через фильтр посредством центрифугирования или вакуумметрического давления. После элюции с фильтра РНК обрабатывали высоко очищенной ДНКазой 1, предоставленной в наборе для удаления следовых количеств ДНК. Наконец, ДНКазу и двухвалентные катионы удаляли с помощью реагента, также предоставленном в наборе. Концентрацию и чистоту выделенной РНК определяли измерением ее оптического поглощения при 260 и 280 нм.

Количественный анализ с детекцией в реальном времени (qRT-PCT). Затем выделенную РНК можно использовать для синтеза кДНК с использованием реагентов для обратной транскрипции TAQMAN® (Applied Biosystems, Кат. #N8080234) с последующим анализом ПЦР с детекцией в реальном времени посредством системы для быстрой ПЦР с детекцией в реальном времени 7900HT с использованием иммунного массива человека (Applied Biosystems, Кат.# 4370573) и массива микроРНК человека (Applied Biosystems, Кат.# 4384792).

Леналидомид и помалидомид представляют собой химические аналоги талидомида с увеличенной противораковой и противовоспалительной активностью. Для исследования, могут ли леналидомид и помалидомид усиливать цитотоксичность клеток PINK, культивируемые ex vivo (сутки 19) PINK-клетки предварительно обрабатывали леналидомидом или помалидомидом в течение 24 часов с последующим совместным культивированием с линией клеток колоректальной карциномы HCT-116 - мишенью. Для обработанных леналидомидом NK-клеток показана цитотоксичность 42,1%, и для обработанных помалидомидом NK-клеток показана цитотоксичность 47,4%, в то время как для контрольных необработанных PINK-клеток показана цитотоксичность только 24,3%.

Анализы количественной ПЦР с детекцией в реальном времени (qRT-PCT) и проточной цитометрией показали, что вызванное помалидомидом усиление цитотоксичности NK-клеток коррелировало с увеличенной экспрессией гена гранзима B (GZMB) (увеличение 60%±1,7%) (Таблица 11) и увеличенным процентным содержанием GZMB-положительных NK-клеток (увеличение 25%). Кроме того, экспрессия GM-CSF была увеличена в обработанных леналидомидом (увеличение 232%±1,6%) и помалидомидом (увеличение 396%±0,3%) PINK-клетках (Таблица 11A, 11B).

Таблица 11A, 11B. Анализ qRT-PCT обработанных леналидомидом и помалидомидом культивированных PINK-клеток по сравнению с необработанными клетками. 11A: Кратность изменения экспрессии гена в обработанных леналидомидом и не обработанных леналидомидом образцах для перечисленных генов. t-критерий для двух выборок используют для определения, являются ли кратности изменения равными в обработанных леналидомидом и не обработанных леналидомидом образцах. 11B: Кратность изменения экспрессии гена в обработанных помалидомидом и не обработанных помалидомидом образцах для 25 перечисленных генов. t-критерий для двух выборок используют для определения, являются ли кратности изменения равными в обработанных и не обработанных образцах.

Таблица 11A.
	Носитель	Леналидомид	Носитель – стандартное отклонение	Леналидомид – стандартное отклонение	значение p
BAX	1	1,39	0,06	0,02	0,05
CCL5	1	1,24	0,11	0,07	0,04
CCR5	1	0,9	0,07	0,08	0,02
CD68	1	4,04	0,05	0,13	0,01
CD8A	1	1,3	0,01	0,02	0,02
CSF2	1	2,32	0,14	0,02	0,02
FAS	1	1,11	0,02	0,04	0,04
GUSB	1	1,13	0,04	0,07	0,05
IL2RA	1	1,26	0,03	0,01	0,03
TNFRSF18	1	0,7	0,1	0,16	0,04
BAX - BCL2-связанный белок X CCL5 - лиганд хемокина (с C-C мотивом) 5 CCR5 - рецептор хемокина (с C-C мотивом) 5 CSF2 - колониестимулирующий фактор 2 (гранулоцитарно-макрофагальный) FAS – суперсемейство рецепторов TNF, член 6 GUSB – β-глюкуронидаза IL2RA – α-рецептор интерлейкина 2 TNFRSF18 – суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, член 18

Таблица 11B.
	Носитель	Помалидомид	Носитель – стандартное отклонение	Помалидомид – стандартное отклонение	значение p
ACTB	1	0,77	0,01	0	0,01
BAX	1	2,23	0,06	0	0,01
CCL2	1	5,46	0,01	0,37	0,02
CCL3	1	2,2	0,04	0,16	0,02
CCL5	1	1,78	0,11	0,04	0,02
CCR5	1	0,68	0,07	0	0,05
CD68	1	8,74	0,05	0,19	0
CD80	1	1,59	0,13	0,19	0,02
CD8A	1	2,39	0,01	0,08	0,01
CSF1	1	1,41	0,07	0,05	0,01
CSF2	1	3,96	0,14	0	0,01
ECE1	1	1,56	0,06	0,12	0,02
FAS	1	1,34	0,02	0,03	0,01
GNLY	1,01	1,96	0,18	0,02	0,05
GUSB	1	1,76	0,04	0,01	0,01
GZMB	1	1,59	0,06	0,02	0,03
IL10	1,02	1,52	0,31	0,22	0,04
IL1A	1,01	2,61	0,19	0,12	0,01
IL2RA	1	1,58	0,03	0,06	0,01
IL8	1	1,62	0,04	0,06	0,04
LTA	1	2,88	0,02	0,21	0,02
PRF1	1	1,17	0,07	0,1	0,05
PTGS2	1	1,68	0,01	0,05	0,02
SK1	1	1,96	0,04	0,02	0,01
TBX21	1,01	2,05	0,14	0,2	0,01
ACTB - β-актин BAX - BCL2-связанный белок X CCL2 - лиганд хемокина (с C-C мотивом) 2 CCL3 - лиганд хемокина (с C-C мотивом) 3 CCL5 - лиганд хемокина (с C-C мотивом) 5 CCR5 - рецептор хемокина (с C-C мотивом) 5 CSF1 - колониестимулирующий фактор 1 (макрофагальный) CSF2 - колониестимулирующий фактор 2 (гранулоцитарно-макрофагальный) ECE1 - превращающий эндотелин фермент 1 FAS - суперсемейство рецепторов TNF, член 6 GNLY - гранулизин GUSB - глюкуронидаза-β GZMB - гранзим B (гранзим 2, связанная с цитотоксическими T-лимфоцитами серинэстераза 1) IL1A – α-интерлейкин 1 IL2RA - α-рецептор интерлейкина 2 IL8 - интерлейкин 8 IL10 - интерлейкин 10 LTA - лимфотоксин α (суперсемейство TNF, член 1) PRF1 - перфорин 1 (порообразующий белок) PTGS2 - простагландин-эндопероксид-синтаза 2 (простагландин G/H-синтаза и циклооксигеназа) SKI – гомолог вирусного онкогена v-ski саркомы (птичий) TBX21 - T-бокс 21

В отдельном эксперименте секрецию перфорина и гранзима B из обработанных помалидомидом или леналидомидом культивированных 21 сутки NK-клеток плаценты оценивали посредством ELISA. Секреция обоих ферментов из обработанных IMiD культивированных 21 сутки NK-клеток являлась значительно увеличенной по сравнению с обработанных носителем клетками, что позволяет предполагать, что IMiD значительно увеличивали цитолитическую активность культивированных NK-клеток посредством увеличения продукции перфорина и гранзима B. Конкретно, для обработанных помалидомидом NK-клеток показано увеличение секреции перфорина на 121% и увеличение секреции гранзима B на 69%, и для обработанных леналидомидом NK-клеток показано увеличение секреции перфорина на 86% и увеличение секреции гранзима B на 113% по сравнению с контролем.

В другом отдельном эксперименте оценивали эффект помалидомида и леналидомида на экспрессию цитокинов NK-клетками плаценты. Секрецию GM-CSF и TNF-α оценивали посредством Luminex с использованием набора антител Five-Plex. Секреция GM-CSF и TNF-α из обработанных культивированных NK-клеток являлась значительно увеличенной по сравнению с обработанных носителем клетками, указывая на то, что помалидомид и леналидомид значительно увеличивали цитолитическую активность культивированных NK-клеток посредством увеличения продукции GM-CSF и TNF-α. Конкретно, для обработанных помалидомидом NK-клеток показано увеличение секреции GM-CSF на 357% и увеличение секреции TNF-α на 147%; и для обработанных леналидомидом NK-клеток показано увеличение секреции GM-CSF на 166% и увеличение секреции TNF-α на 76% по сравнению с контролем.

Цитотоксичность комбинированных естественных киллерных клеток

В отдельном анализе цитотоксичности культивированные NK-клетки, происходящие из пуповинной крови и перфузата плаценты от совпадающего донора, являлись эффекторными клетками, в то время как клетки опухолей являлись клетками-мишенями. Клетки опухолей метили PKH26 (Sigma-Aldrich Каталожный # PKH26-GL) (см., например, Lee-MacAry et al., J. Immunol. Meth. 252(l-2):83-92 (2001)), который встраивается в плазматическую мембрану клетки благодаря его липофильному алифатическому остатку, затем помещали в 96-луночные круглодонные культуральные планшеты и инкубировали с культивированными NK-клетками в различных соотношениях эффектор-мишень (E:T) в 200 мкл RPMI 1640, дополненной 10% FBS. Культуры инкубировали в течение 4 час при 37°C в 5% CO₂. После инкубации клетки собирали и TO-PRO-3 (Invitrogen Catalog # T3605), не проникающий через мембрану краситель для ДНК, добавляли к культурам до конечной концентрации 1 мкМ с последующим анализом FACS с использованием BD FACSCanto. Цитотоксичность выражали как процент мертвых клеток (PKH26⁺TO-PRO-3⁺) среди общих PKH26⁺ клеток опухолей - мишеней.

В этом анализе цитотоксичности клетки хронической миелоидной лимфомы человека (CML) K562 метили PKH26, который встраивается в плазматическую мембрану клетки, и помещали в 96-луночные круглодонные культуральные планшеты. NK-клетки плаценты (комбинация) или периферической крови, культивированные в течение 21 суток, смешивали с клетками K562 в соотношениях эффектор-мишень (E:T) 10:1, 5:1, 2,5:1 и 1,25:1 в RPMI 1640, дополненной 10% об./об. FBS. После времени инкубации 4 часа, клетки собирали, и TO-PRO-3 добавляли к культурам клеток с последующей проточной цитометрией по присутствию PKH26 и TO-PRO-3. Цитотоксичность выражали как процент PKH26⁺TO-PRO-3⁺ мертвых клеток среди общих PKH26⁺ клеток опухолей - мишеней. Как для NK-клеток плаценты, так и для NK-клеток периферической крови показали существенную токсичность по отношению к клеткам K562 при всех тестированных соотношениях E:T (ФИГ. 4). Значительно более высокую токсичность по отношению к клеткам K562 для NK-клеток плаценты по сравнению с NK-клетками периферической крови наблюдали при двух соотношениях E:T, 10:1 и 5:1 (ФИГ. 4).

6.4. Пример 4: Цитотоксичность перфузата плаценты человека по отношению к клеткам опухолей

В этом примере показано, что клетки перфузата плаценты человека являются цитотоксическими по отношению к клеткам опухолей, и что цитотоксичность общих ядросодержащих клеток из HPP (TNC-HPP) по отношению к KG-1a превышала цитотоксичность TNC из совпадающей UCB. Общие ядросодержащие клетки из HPP или пуповинной крови (UCB) смешивали с клетками KG-1a в соотношениях 1:1, 5:1, 10:1, 20:1 или 100:1. После инкубации 24 час или 48 час клетки собирали и анализировали по присутствию CFSE посредством анализа FACS (BD FACSCanto, BD Bioscience). Клетки опухолей, культивированные отдельно, использовали в качестве контроля. Цитотоксичность определяли как: (1-CFSE_{образца}/CFSE_{контроля})*100%. Значительную цитотоксичность показали при соотношении 100:1. См. ФИГ. 5.

В отдельном эксперименте цитотоксичность общих ядросодержащих клеток из HPP сравнивали с цитотоксичностью общих ядросодержащих клеток из пуповинной крови. Совпадающие TNC-HPP или UCB смешивали с клетками KG-1a в соотношениях 0,78:1, 1,56:1, 3,12:1, 6,25:1, 12,5:1, 25:1, 50:1 или 100:1. Для TNC-HPP показали значительно более высокую цитотоксичность при всех соотношениях по сравнению с цитотоксичностью UCB. См. ФИГ. 6.

В другом эксперименте за 24 часа до инкубации с клетками KG-1a, TNC-HPP стимулировали 100 Ед./мл или 1000 Ед./мл IL-2, в то время как HPP, культивированные со средой RPMI, использовали в качестве контроля. При соотношении 6,25 NK-клеток на клетку KG-1a и выше, IL-2, по-видимому, увеличивал цитотоксичность TNC-HPP. См. ФИГ. 7.

Эксперименты повторяли с использованием более широкого массива типов клеток опухолей, как показано в таблице 12, с использованием 5×10⁵ клеток HPP и 1×10⁴ клеток опухолей.

Таблица 12. Типы клеток опухолей, тестированных по цитотоксическому эффекту на перфузат плаценты
HCC2218	Первичная карцинома протоков человека
CCRF-CEM	Лейкоз человека
J.RT3-T3.5	Острый T-клеточный лейкоз человека
K562	Хроническая миелоидная лимфома человека (CML)
KG-1	Острый миелогенный лейкоз человека
KG-1a	Острый миелогенный лейкоз человека (AML)
KU812	Лейкоз человека (CML)
NCI-H1417	Карцинома легкого человека
SNU-CI	Аденокарцинома толстой кишки человека
U-937	Гистиоцитарная лимфома человека
WERI-RB-1	Ретинобластома человека
HCT-116	Колоректальная карцинома человека
HT-29	Колоректальная аденокарцинома человека
U266	Миелома человека

При совместном культивировании клеток HPP и клеток опухолей в течение 24 часов или 48 часов в соотношении 50:1, для клеток HPP показали значительную токсичность по отношению к клеткам опухолей. Для обоих периодов времени совместное культивирование приводило к гибели более 50% клеток опухолей. См. ФИГ. 8A и 8B.

6.5. Пример 5: Продукция цитокинов клетками перфузата плаценты человека во время контакта с клетками опухолей

Для определения первичного механизма действия, ответственного за опосредование сильных антилейкемических эффектов клеток HPP, профиль высвобождения цитокинов клетками HPP, совместно культивированными с линиями клеток опухоли, анализировали и сравнивали с профилем высвобождения цитокинов клетками UCB, в различных временных точках, посредством мультиплексного анализа Luminex.

Супернатанты, собранные после инкубации, подвергали анализу Luminex для определения концентраций IFN-γ, TNF-α и GM-CSF (Кат.# HCYTO-60K-03, Millipore). Эти три цитокина связаны с цитотоксичностью NK. (См., например, Imai et al., Blood 2005. 106(l):376-83.). Проводили также количественную ОТ-ПЦР для исследования экспрессии IFN-γ, TNF-α и GM-CSF с использованием аппарата и праймеров Applied Biosystems FAST 7900HT. Условия культивирования являлись такими же, как для анализов цитотоксичности при совместном культивировании, описанных выше. Концентрации цитокинов определяли с использованием анализа Luminex.

Определили, что секреция IFN-γ, TNF-α и GM-CSF из клеток HPP, культивированных совместно с клетками опухолей, значительно превышала секрецию из клеток UCB. В одном эксперименте клетки HPP смешивали с клетками KG-1a в соотношениях 0,78:1, 1,56:1, 3,12:1, 6,25:1, 12,5:1, 25:1, 50:1 или 100:1, в присутствии или в отсутствие 100 Ед. IL-2. Для TNC-HPP показали значительно увеличенную продукцию IFN-γ в присутствии IL-2 по сравнению с отсутствием IL-2. Определили, что уровни IFN-γ через 24 час увеличивались приблизительно в 5-26 раз (медиана: 16 раз); через 48 час приблизительно 3~65 раз (медиана: 27 раз), что согласуется с результатами исследования цитотоксичности. См. ФИГ. 9.

В другом эксперименте за 24 часа до инкубации с клетками KG-1a, TNC-HPP стимулировали 100 Ед./мл или 1000 Ед./мл IL-2, то время как HPP, культивированные со средой RPMI, использовали в качестве контроля. HPP или совпадающие клетки UCB инкубировали 24 час с IL-2 или без, перед совместным культивированием с клетками KG-1a. Секреция IFN-γ являлась наиболее увеличенной в клетках HPP, культивированных совместно с клетками K562 и KG-1a 48 час. Когда клетки HPP обрабатывали 100 Ед./мл IL-2, цитотоксичность клеток HPP по отношению к KG-1a через 24 час и 48 час являлась увеличенной. Уровень секреции IFN-γ в клетках HPP превышал уровень в совпадающих клетках UCB после обработки IL-2. Более высокую экспрессию IFN-γ подтверждали анализом ОТ-ПЦР клеток из совпадающих HPP и UCB. Эти результаты показывают, что клетки HPP обладают более высокой антилейкемической активностью по сравнению с клетками UCB, и эта более высокая активность связана со значительным увеличением продукции IFN-γ.

Продукцию IFN-γ в клетках HPP и в клетках пуповинной крови, во время культивирования совместно с панелью линий клеток опухолей анализировали с использованием линий клеток опухолей, перечисленных в таблице 1, выше. Клетки HPP и клетки опухолей культивировали совместно в течение 24 часов или 48 часов в соотношении 50:1, с использованием 10⁴ клеток опухолей и 5×10⁵ клеток HPP. Для линий клеток CCRF-CEM, J.RT3-T3.5, K562, KG1, KG-1a, KU812, NC1-H1417, U-937 и WER1-RB-1 увеличение продукции IFN-γ в клетках HPP через 24 часа совместного культивирования превышало увеличение продукции IFN-γ в клетках пуповинной крови, культивированных совместно с этими линиями клеток в течение такого же времени. См. ФИГ. 10A. Через 48 часов совместного культивирования увеличение продукции IFN-γ в клетках HPP превышало увеличение продукции IFN-γ в клетках пуповинной крови для всех линий клеток опухолей. Смотри ФИГ. 10B. Из линий клеток опухолей, клетки K562 индуцировали наибольшее увеличение продукции IFN-γ в клетках HPP как через 24 часа, так и через 48 часов. Сходные результаты наблюдали для TNF-α и GM-CSF.

Анализ клеточного цикла показал, что процент KG-1a в S-фазе уменьшался на 30% при совместном культивировании с HPP по сравнению с клетками KG-1a, культивированными отдельно. Дальнейшие эксперименты по совместному культивированию, проводимые с использованием различных обогащенных фракций HPP, показали, что антилейкемическая активность HPP в значительной степени объяснялась высокой концентрацией уникальных незрелых естественных киллерных клеток, характеризующихся высокой экспрессией CD56⁺, отсутствием экспрессии CD16.

6.6. Пример 6: Супрессия пролиферации клеток опухолей in vivo посредством клеток перфузата плаценты человека

6.6.1. Материалы и методы

В этом примере показана эффективность перфузата плаценты человека in vivo против клеток опухолей с использованием модели ксенотрансплантата опухоли на мышах NOD/SCID.

Культивирование клеток KG-1. Клетки KG-1 поддерживали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, дополненной 20% эмбриональной бычьей сывороткой (среда для роста) при 37°C при 95% воздуха/5% CO₂ и 100% влажности. Среду в культуре меняли каждые вторые сутки, и клетки пассировали раз в неделю. Клетки KG-1 растили в виде суспензий. Таким образом, для смены среды или пассажа клеток суспензии клеток собирали в пробирки для центрифугирования и центрифугировали при 2000 об./мин. в течение 10 мин в роторе SORVALL® HERAEUS® (no. детали 75006434). Супернатант утилизировали, и соответствующее количество осадка клеток ресуспендировали в среде для роста для продолжения культивирования.

Получение клеток KG-1 для имплантации. Для имплантации клеток мышам, клетки собирали центрифугированием, как описано выше. Осадки клеток собирали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Для определения количества клеток для имплантации мышам, аликвоту суспензии клеток подсчитывали с использованием гемоцитометра. Краситель трипановый синий использовали для исключения нежизнеспособных клеток из суспензии.

Получение клеток HPP для имплантации. Для хранения и размораживания HPP образцы получали замороженными в сухом транспортном контейнере в хорошем состоянии. Единицы хранили в сухом транспортном контейнере до размораживания 7 февраля 2007 г. На сутки размораживания единицы HPP вынимали из низкотемпературной морозильной камеры (по одной) и помещали в пластиковые пакеты с застежкой. Затем пакеты помещали в водяную баню при 37°C с осторожным встряхиванием до размораживания большей части (небольшие замороженные фрагменты оставались в пакетах). Затем пакеты вынимали из водяной бани, единицы извлекали из пакетов с застежкой, и единицы осторожно переворачивали до полного размораживания. Затем единицы помещали в ламинар и внешнюю поверхность пакетов с кровью стерилизовали опрыскиванием 70% этанолом. Пакеты с кровью открывали разрезанием с использованием стерильных ножниц, и клетки переносили стерильной пипеткой в стерильные 50 мл конические пробирки (1 пробирка на каждую единицу HPP; 2 пробирки на каждую единицу UCB). Затем 10 мл буфера для размораживания (2,5% человеческого альбумина, 5% декстран 40) медленно добавляли в каждую пробирку с осторожным перемешиванием (в течение периода 2,2-2,9 минут). Затем каждый пакет для крови промывали 10 мл буфера для размораживания, который затем медленно добавляли в 50 мл коническую пробирку (в течение периода 0,7-1,3 мин).

После размораживания каждую единицу сохраняли на влажном льду до центрифугирования. Все пробирки центрифугировали в течение 10 мин (440×g при 10°C), супернатанты отсасывали с использованием стерильных пипеток, и осадки осторожно разбивали встряхиванием пробирки. 1-мл аликвоту носителя (PBS + 1% эмбриональная телячья сыворотка) добавляли в одну из пробирок, и содержимое пробирки перемешивали осторожным поворачиванием. С использованием 2-мл пипетки содержимое переносили во вторую пробирку и затем в третью пробирку, и затем в четвертую пробирку. Опустошенные пробирки промывали 0,2 мл буфера для разведения.

Для подсчета клеток аликвоту 25 мкл переносили в 15 мл коническую пробирку, содержащую 975 мкл носителя, на льду. Затем эритроциты лизировали добавлением 4 мл ледяного реагента для лизиса с хлоридом аммония и инкубировали на льду в течение 10 мин. После инкубации 5 мл холодного PBS добавляли в каждую пробирку, и пробирки центрифугировали (10 мин, 400×g, 10°C). После лизиса RBC клетки подсчитывали посредством гемоцитометра, с использованием трипанового синего для оценки жизнеспособности. Результаты подсчета корректировали по разведению и затем делили на коэффициент лизиса (0,46) для оценки количества клеток, присутствующих до лизиса RBC.

Для получения дозы HPP, после подсчета клетки HPP разводили до 1×10⁸ клеток/мл добавлением носителя. Затем клетки HPP сохраняли на льду до заполнения шприцев. Время задержки между размораживанием первой единицы и завершением получения дозы составляло менее 3 часов.

До наполнения шприцев аликвоту 50 мкл дозируемого материала оставляли для верификации после дозирования посредством подсчета, как описано выше. После дозирования оставшийся материал оценивали для верификации дозы.

План исследования. На сутки 1 двадцати четырем самцам мышей NOD/SCID (Jackson Laboratories) имплантировали 5 миллионов жизнеспособных клеток KG-1 S/C в область бока. Мышей делили так, что от четырех до пяти мышей содержали в системе клеток с микроизоляцией с подстилкой из древесной стружки. Стерилизованный корм для грызунов и воду предоставляли по желанию. У мышей дважды в неделю тщательно мониторировали рост опухоли. Первую поддающуюся измерению опухоль наблюдали на сутки 25. Затем массу тела регистрировали раз в неделю и измерения опухоли с помощью штангенциркуля регистрировали дважды в неделю. На сутки 52 после имплантации животных случайным образом разделяли на три отдельные группы, где средние размеры опухолей лежали в диапазоне приблизительно 300-350 мм³. Смотри таблицу 13, ниже. Первая группа состояла из четырех контрольных мышей со средним объемом опухолей 312 мм³. Двум из этих мышей имплантировали внутривенно (IV), и двум – внутрь опухоли (IT) 200 мкл и 50 мкл раствора носителя, соответственно. Вторая группа со средним объемом опухолей 345 мм³ состояла из четырех мышей с имплантированными внутривенно 200 мкл клеток HPP на мышь (2×10⁷ клеток). Последняя группа, с имплантацией IT 50 мкл клеток HPP на мышь, также состояла из четырех мышей со средним объемом опухолей 332 мм³.

Таблица 13. Экспериментальные группы для эксперимента по супрессии опухолей in vivo.
# животного	Группа обработки HPP	Объем опухоли на сутки имплантации HPP
Группа 1 (Контроль)
1	IV 1	457
2	IT 2	429
3	IT 3	214
4	IV 4	147
	Среднее:	312
Группа 2 (IV имплантация клеток)
5	2	466
6	2	209
7	3	217
8	4	487
	Среднее:	345
Группа 3 (IT имплантация клеток)
9	1	491
10	2	256
11	3	296
12	4	285
	Среднее:	332
IV - имплантация 200 мкл; IT - имплантация 50 мкл

На сутки 66, через 14 суток после имплантации клеток HPP, исследование прекратили из-за больших объемов опухолей.

6.6.2. Результаты

Объемы опухолей (TV) измеряли до суток 66 (сутки 14 после имплантации клеток HPP), когда TV контрольной группы достиг среднего 2921 мм³. Группа обработки IV на окончание исследования обладала средним TV 2076 мм³, и группа IT обладала TV 2705 мм³. Что касается % увеличения TV после обработки, в группе IT показали умеренное 20% ингибирование, в то время как в группе IV показали более, чем 35% ингибирование роста опухолей по сравнению с контрольной группой. Ингибирование в группе IT поддавалось наблюдению. Смотри ФИГ. 11.

6.7. Пример 7: Супрессия пролиферации клеток опухолей in vivo культивированными NK-клетками плаценты

6.7.1. Материалы и методы

В этом примере показана эффективность культивированных 21 сутки NK-клеток плаценты (PINK) in vivo против клеток опухолей с использованием модели ксенотрансплантата опухоли на мышах NOD/SCID.

Культивирование клеток KG-1. Клетки KG-1 (линия миелоидных клеток человека) поддерживали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, дополненной 20% эмбриональной бычьей сывороткой (среда для роста) при 37°C при 95% воздуха/5% CO₂ и 100% влажности. Среду в культуре меняли каждые вторые сутки, и клетки пассировали раз в неделю. Клетки KG-1 растили в виде суспензий. Таким образом, для смены среды или пассажа клеток суспензии клеток собирали в пробирки для центрифугирования и центрифугировали при 2000 об./мин. в течение 10 мин в роторе SORVALL® HERAEUS® (no. детали 75006434). Супернатант утилизировали, и соответствующее количество осадка клеток ресуспендировали в среде для роста для продолжения культивирования.

Получение клеток KG-1 для имплантации. Для имплантации клеток мышам, клетки собирали центрифугированием, как описано выше. Осадки клеток собирали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Для определения количества клеток для имплантации мышам, аликвоту суспензии клеток подсчитывали с использованием гемоцитометра. Краситель трипановый синий использовали для определения жизнеспособности.

Получение NK-клеток для имплантации. На сутки размораживания NK-клетки после криоконсервации в криопробирках вынимали из низкотемпературной морозильной камеры и немедленно помещали в пластиковый пакет с застежкой. Затем пластиковый пакет с застежкой, содержащий криопробирки, погружали в водяную баню, предварительно установленную на 37°C, с встряхиванием до размораживания большей части замороженных клеток. Затем пакет с застежкой вынимали из водяной бани, очищали 70% этанолом и переносили в ламинар. NK-клетки переносили из криопробирок в 50 мл коническую пробирку с помощью пипетки. Затем 10 объемов буфера для разведения (Plasmalyte A + 2,5% HSA) добавляли к NK-клеткам. Пробирки центрифугировали при 1500 об./мин. (475 г) в течение 8 минут, и супернатант удаляли. Затем осадки клеток ресуспендировали в буфере для разведения (Plasmalyte A + 2,5% HSA) (Как правило, объем буфера для разведения = 1 мл×количество размороженных пробирок; Например, если объединяли клетки из 4 пробирок, тогда добавляли 4 мл буфера для разведения). Подсчет клеток проводили с использованием гемоцитометра, и трипановый синий использовали для оценки жизнеспособности клеток.

После подсчета NK-клетки разводили до желательных концентраций (Таблица 14) буфером для разведения. Затем NK-клетки сохраняли на льду до заполнения шприцев. Время задержки между размораживанием первой единицы и завершением получения дозы составляло менее 3 часов. До наполнения шприцев аликвоту 50 мкл дозируемого материала оставляли для верификации после дозирования посредством подсчета, как описано выше. После дозирования оставшийся материал оценивали для верификации дозы.

План исследования. На сутки 1 70 самцам мышей NOD/SCID (Jackson Laboratories) имплантировали 5 миллионов жизнеспособных клеток KG-1 подкожно в область бока. Мышей делили так, что от четырех до пяти мышей содержали в системе клеток с микроизоляцией с подстилкой из древесной стружки. Стерилизованный корм для грызунов и воду предоставляли по желанию. У мышей дважды в неделю тщательно мониторировали рост опухоли. После наблюдения первой поддающейся измерению опухоли массу тела регистрировали раз в неделю и измерения опухоли с помощью штангенциркуля регистрировали дважды в неделю. Когда объемы опухолей достигали 80-100 мм³, мышей случайным образом разделяли на 8 групп с использованием только мышей с объемами опухолей, наиболее близкими к среднему значению. Мышей со слишком большим или слишком малым объемом опухолей исключали из исследования. Обработку NK-клетками начинали через сутки после случайного распределения. Способы дозирования представляют собой внутривенную (i.v.) инъекцию или инъекцию внутрь опухоли (IT), как описано в таблице 1. Через 21 сутки после введения NK-клеток исследование прекратили.

Таблица 14. План исследования
Группа	# мышей	Обработка	Доза и способ дозирования	Объем дозирования
1	8	Контроль	Носитель
2	6	NK без размножения	2,0×106	0,3 мл
3	8	NK-клетки (Донор 1)	2,0×106 (i.v.)	0,3 мл
4	8	NK-клетки (Донор 1)	6,0×106 (i.v.)	0,3 мл
5	8	NK-клетки (Донор 1)	2,0×106 (IT)	0,05 мл
6	8	NK-клетки (Донор 2)	2,0×106 (i.v.)	0,3 мл
7	8	NK-клетки (Донор 2)	6,0×106 (i.v.)	0,3 мл
8	8	NK-клетки (Донор 2)	2,0×106 (IT)	0,05 мл

Результаты: Объемы опухолей (TV) измеряли дважды в неделю до суток 21 после введения NK-клеток (Таблица 15). С использованием NK-клеток, полученных от донора 1, для группы с высокой IV дозой показали значительную супрессию опухолей на сутки 6 после введения NK-клеток. Для группы с высокой IV дозой и для IT группы показали значительную супрессию опухолей на сутки 13 и на сутки 21 после введения NK-клеток. С использованием NK-клеток, полученных от донора 2, для группы с высокой IV дозой и для IT группы показали значительную супрессию опухолей, начиная на сутки 6 и сутки 13 после введения NK-клеток. Для всех трех групп обработки показали значительную супрессию опухолей на сутки 21 после введения NK-клеток.

6.8. Пример 8: Супрессия пролиферации клеток CML in vivo культивированными NK-клетками плаценты

В примере показан эффект культивированных 21 сутки NK-клеток плаценты на рост ксенотрансплантатов лейкоза человека K562 в мышах NOD/SCID.

Культивирование клеток. Клетки K562, линию клеток хронического миелогенного лейкоза, поддерживали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMDM), дополненной 20% эмбриональной бычьей сывороткой. Клетки культивировали при 37°C при 95% воздуха/5% CO₂ и 100% влажности. Среду в культуре меняли каждые вторые сутки, и клетки пассировали раз в неделю. Эту линию клеток растили в виде суспензий. Таким образом, для смены среды или пассажа клеток суспензии клеток собирали в пробирки для центрифугирования и центрифугировали при 2000 об./мин. в течение 5 мин. Супернатант утилизировали, и соответствующее количество осадка клеток ресуспендировали в подходящей среде для продолжения культивирования.

Получение клеток K562 для имплантации. Для имплантации клеток мышам, клетки собирали центрифугированием, как описано выше. Осадки клеток собирали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS). Для определения количества клеток для имплантации мышам, аликвоту суспензии клеток подсчитывали с использованием гемоцитометра, и краситель трипановый синий использовали для определения количества жизнеспособных клеток в суспензия. Собранные клетки один раз промывали PBS и ресуспендировали в бессывороточной среде при плотности 5×10⁶ клеток/100 мкл.

Получение NK-клеток для дозированного введения. Использовали две линии NK-клеток, характеристики которых описаны в таблице 16.

Таблица 16. Описание NK-клеток
ID No. NK-клеток	Жизнеспособность	% CD56+CD3-	% CD56+CD3+	Цитотоксичность in vitro против K562
1	82%	89,3	4,7	70%
2	85%	38,6	39,6	46%

На сутки размораживания NK-клетки после криоконсервации размораживали и подсчитывали. После подсчета NK-клетки разводили до желательных концентраций (Таблица 17):

Таблица 17. План исследования для исследования ксенотрансплантата K562; клетки вводили внутривенно (i.v.) или внутрь опухоли (IT)
Группа	# мышей	Обработка	Доза и способ дозирования	Объем дозирования
1	16	Plasmalyte A	i.v.	0,3 мл
2	8	NK-клетки ID No. 1	6,0×106	0,3 мл
3	8	NK-клетки ID No. 1	2,0×106 (IT)	0,05 мл
4	16	NK-клетки ID No. 2	2,0×106 (i.v.)	0,3 мл
5	8	NK-клетки ID No. 2	6,0×106 (i.v.)	0,3 мл
6	8	NK-клетки ID No.	2,0×106 (IT)	0,05 мл

Затем NK-клетки сохраняли на льду до заполнения шприцев.

Способ анализа. Для начала исследования 5×10⁶ жизнеспособных клеток K562, суспендированных в 100 мкл бессывороточной среде, подкожно имплантировали голым мышам в область правого бока. Клетки K562 имплантировали ста мышам. У животных наблюдали рост опухоли ежесуточно после имплантации клеток. Когда объемы опухолей достигали 80-100 мм³, мышей случайным образом разделяли на 8 групп с использованием только мышей с объемами опухолей, наиболее близкими к среднему значению. Мышей со слишком большим или слишком малым объемом опухолей исключали из исследования. Обработку NK-клетками начинали через сутки после случайного распределения, и мышам вводили только одну однократную дозу NK-клеток. Объемы опухолей измеряли с использованием формулы V=L×W×H×π/6, где L и W представляют собой более длинный и более короткий диаметры опухоли, и H представляет собой высоту опухоли. На протяжении всего исследования объемы опухолей измеряли дважды в неделю, а массу тела – раз в неделю. У животных наблюдали возможный токсический эффект от обработки NK-клетками. Внеплановое умерщвление проводили, когда объем опухоли превышал 1500 мм³ или потеря исходной массы тела превышала 20%, или происходило изъязвление опухоли, или у мышей начиналась агония. В конце эксперимента проводили статистический анализ скорости роста опухолей в контрольной группе по сравнению с каждой группой обработки. Ткани основных органов собирали в конце исследования.

Результаты. Скорости роста лейкозных опухолей K562 являлась значительно уменьшенной посредством NK-клеток ID No. 1 при уровне внутривенной дозы 6 миллионов или при уровне внутриопухолевой дозы 2 миллиона, ингибирующих рост опухолей K562. Эффект ингибирования роста являлся статистически значимым при введении внутрь опухоли (P < 0,05 по t-критерию Стьюдента). Опухоли во всех 3 группах, обработанных NK-клетками 091008, значимо не уменьшались.

В ходе исследования, 3 из 10 опухолей полностью регрессировали до нуля через 13 суток обработки. Кроме того, на протяжении всего исследования все животные оставались здоровыми и активными, и ни у одной из мышей в каждой группе не было потери массы тела, что указывает на то, что введение NK-клеток, само по себе, не приводило к заболеваемости и являлось в основном безопасным.

Эквиваленты:

Объем настоящего изобретения не является ограниченным конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным, очевидны специалистам в данной области по вышеизложенному описанию и сопровождающим фигурам. Подразумевают, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Содержание всех процитированных в настоящем документе ссылок приведено в настоящем документе в качестве ссылок полностью и для всех целей в той же степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что содержание каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки, предназначено для включения полностью для всех целей. Цитирование любой публикации выполнено по ее содержанию до даты подачи заявки и его не следует рассматривать как признание того, что настоящее изобретение неправомерно противопоставлено такой публикации на основании предшествующего изобретения.

Claims (67)

1. Способ лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, предусматривающий

введение указанному индивидууму выделенных естественных киллерных клеток, содержащих выделенные CD56⁺CD16^-CD3^- естественные киллерные клетки, происходящие из плаценты,

где указанная злокачественная опухоль представляет собой острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый мегакариобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз предшественников В-клеток, острый лимфобластный лейкоз предшественников Т-клеток, лейкоз Беркитта (лимфому Беркитта), острый бифенотипический лейкоз, хронический моноцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)/мелколимфоцитарную лимфому, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточную лимфому, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазматическую лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, лимфому маргинальной зоны селезенки, плазмацитому, болезнь накопления моноклональных иммуноглобулинов или заболевание тяжелых цепей, экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (MALT лимфому), нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (NMZL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную В-крупноклеточную лимфому, медиастинальную (тимическую) В-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, Т-клеточный крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз, агрессивный NK-клеточный лейкоз, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому назального типа, Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, печеночно-селезеночную Т-клеточную лимфому, бластную NK-клеточную лимфому, фунгоидный микоз (синдром Сезари), первичное кожное лимфопролиферативное нарушение CD30-положительных Т-клеток, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфоматоидный папулез, ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, неспецифическую периферическую Т-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфому Ходжкина, нодулярную лимфому Ходжкина с лимфоидным преобладанием, ретинобластому или колоректальную карциному.

2. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий введение указанному индивидууму эффективного количества леналидомида, помалидомида или талидомида.

3. Способ по п. 1, где указанные выделенные естественные киллерные клетки приводят в контакт с помалидомидом, леналидомидом или талидомидом до указанного введения.

4. Способ по п. 1, где указанные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты.

5. Способ по п. 1, где указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты, и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови.

6. Способ по п. 5, где указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

7. Способ по п. 2, где указанные естественные киллерные клетки приводят в контакт с указанным помалидомидом, леналидомидом или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима В или мРНК, кодирующей гранзим В, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанными помалидомидом, леналидомидом или талидомидом.

8. Способ по п. 5, где указанные комбинированные естественные киллерные клетки содержат:

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD16^- естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺2B4⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; или

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD94⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

9. Способ по п. 1, где указанные естественные киллерные клетки не культивируют перед указанным введением.

10. Способ лечения индивидуума, страдающего вирусной инфекцией, предусматривающий введение указанному индивидууму выделенных естественных киллерных клеток, содержащих выделенные CD56⁺CD16^-CD3^- естественные киллерные клетки, происходящие из плаценты.

11. Способ по п. 10, дополнительно предусматривающий введение указанному индивидууму эффективного количества леналидомида, помалидомида или талидомида.

12. Способ по п. 10, где указанные выделенные естественные киллерные клетки приводят в контакт с помалидомидом, леналидомидом или талидомидом перед указанным введением.

13. Способ по п. 10, где указанные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты.

14. Способ по п. 10, где указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты, и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови.

15. Способ по п. 14, где указанную пуповинную кровь выделяют из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

16. Способ по п. 11, где указанные естественные киллерные клетки приводят в контакт с указанными помалидомидом, леналидомидом или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима В или мРНК, кодирующей гранзим В, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанными помалидомидом, леналидомидом или талидомидом.

17. Способ по п. 14, где указанные комбинированные естественные киллерные клетки содержат:

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD16^- естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺2B4⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; или

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD94⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

18. Способ по п. 10, где указанные естественные киллерные клетки не культивируют перед указанным введением.

19. Применение выделенных естественных киллерных клеток, содержащих выделенные CD56⁺CD16^-CD3^- естественные киллерные клетки, происходящие из плаценты, для получения композиции для лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью,

где указанная злокачественная опухоль представляет собой острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый мегакариобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз предшественников В-клеток, острый лимфобластный лейкоз предшественников Т-клеток, лейкоз Беркитта (лимфому Беркитта), острый бифенотипический лейкоз, хронический моноцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)/мелколимфоцитарную лимфому, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточную лимфому, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазматическую лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, лимфому маргинальной зоны селезенки, плазмацитому, болезнь накопления моноклональных иммуноглобулинов или заболевание тяжелых цепей, экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (MALT лимфому), нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (NMZL), фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную В-крупноклеточную лимфому, медиастинальную (тимическую) В-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, Т-клеточный крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз, агрессивный NK-клеточный лейкоз, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому назального типа, Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, печеночно-селезеночную Т-клеточную лимфому, бластную NK-клеточную лимфому, фунгоидный микоз (синдром Сезари), первичное кожное лимфопролиферативное нарушение CD30-положительных Т-клеток, первичную кожную анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфоматоидный папулез, ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому, неспецифическую периферическую Т-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфому Ходжкина, нодулярную лимфому Ходжкина с лимфоидным преобладанием, ретинобластому или колоректальную карциному.

20. Применение по п. 19, где указанную композицию получают для введения вместе с эффективным количеством леналидомида, помалидомида или талидомида.

21. Применение по п. 19, где указанные выделенные естественные киллерные клетки приводят в контакт с помалидомидом, леналидомидом или талидомидом.

22. Применение по п. 19, где указанные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты.

23. Применение по п. 19, где указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты, и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови.

24. Применение по п. 23, где указанная пуповинная кровь выделена из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

25. Применение по п. 20, где указанные естественные киллерные клетки приводят в контакт с указанным помалидомидом, леналидомидом или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима В или мРНК, кодирующей гранзим В, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанными помалидомидом, леналидомидом или талидомидом.

26. Применение по п. 23, где указанные комбинированные естественные киллерные клетки содержат:

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD16^- естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺2B4⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; или

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD94⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

27. Применение по п. 19, где указанные естественные киллерные клетки не культивируют.

28. Применение выделенных естественных киллерных клеток, содержащих выделенные CD56⁺CD16^-CD3^- естественные киллерные клетки, происходящие из плаценты, для получения композиции для лечения индивидуума, страдающего вирусной инфекцией.

29. Применение по п. 28, где указанную композицию получают для введения вместе с эффективным количеством леналидомида, помалидомида или талидомида.

30. Применение по п. 28, где указанные выделенные естественные киллерные клетки приводят в контакт с помалидомидом, леналидомидом или талидомидом.

31. Применение по п. 28, где указанные естественные киллерные клетки содержат естественные киллерные клетки, полученные не из перфузата плаценты.

32. Применение по п. 28, где указанные естественные киллерные клетки представляют собой комбинированные естественные киллерные клетки, содержащие естественные киллерные клетки, выделенные из перфузата плаценты, и естественные киллерные клетки, выделенные из пуповинной крови.

33. Применение по п. 32, где указанную пуповинную кровь выделяют из плаценты, из которой получен указанный перфузат плаценты.

34. Применение по п. 29, где указанные естественные киллерные клетки приводят в контакт с указанными помалидомидом, леналидомидом или талидомидом в количестве и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы указанные естественные киллерные клетки экспрессировали поддающееся детекции большее количество гранзима В или мРНК, кодирующей гранзим В, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток, не приведенных в контакт с указанными помалидомидом, леналидомидом или талидомидом.

35. Применение по п. 32, где указанные комбинированные естественные киллерные клетки содержат:

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD16^- естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺CD16⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺KIR2DL2/L3⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции меньшее количество CD3^-CD56⁺NKp46⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺NKp30⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови;

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺2B4⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови; или

поддающееся детекции большее количество CD3^-CD56⁺CD94⁺ естественных киллерных клеток, чем эквивалентное количество естественных киллерных клеток из периферической крови.

36. Применение по п. 28, где указанные естественные киллерные клетки не культивируют.

Images