RU2642588C1 - Immunochromatographic test system for pathogenic helicobacter pylori strains detection - Google Patents
Immunochromatographic test system for pathogenic helicobacter pylori strains detection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2642588C1 RU2642588C1 RU2017108557A RU2017108557A RU2642588C1 RU 2642588 C1 RU2642588 C1 RU 2642588C1 RU 2017108557 A RU2017108557 A RU 2017108557A RU 2017108557 A RU2017108557 A RU 2017108557A RU 2642588 C1 RU2642588 C1 RU 2642588C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane
- pylori
- concentration
- test system
- test
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 9
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 title description 8
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 title description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 34
- 101150114014 cagA gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 208000003433 Gingival Pocket Diseases 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 6
- 201000005562 gingival recession Diseases 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000005888 Periodontal Pocket Diseases 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 2
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000110797 Polygonum persicaria Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 208000017215 gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 208000002064 Dental Plaque Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 description 1
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004283 incisor Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N nitrofural Chemical compound NC(=O)N\N=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 1
- 108010055837 phosphocarrier protein HPr Proteins 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 235000013522 vodka Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области иммунохроматографического анализа и может быть использовано в иммунологии и медицине для выявления Helicobacter pylori в различных биологических материалах.The invention relates to the field of immunochromatographic analysis and can be used in immunology and medicine for the detection of Helicobacter pylori in various biological materials.
Хеликобактериоз является одной из наиболее распространенных инфекций человека. Установлено, что H. pylori в 70-80% случаев является причиной развития хронического гастрита, в 50-60% - язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка, более чем у 90% пациентов вызывает развитие MALT-лимфомы желудка [Ford A.C. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications [Text] / A.C. Ford, A.T. Axon // Helicobacter. 2010.-15 (Suppl. 1). - P. 1-6. Сарсенбаева A.C. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori: учеб. пособие [Текст] / A.C. Сарсенбаева // Челябинск: изд. УМК, 2005. - 35 с].Helicobacteriosis is one of the most common human infections. It has been established that H. pylori causes chronic gastritis in 70-80% of cases, duodenal ulcer and stomach ulcer in 50-60%, causes gastric MALT lymphoma in more than 90% of patients [Ford AC Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications [Text] / AC Ford, AT Axon // Helicobacter. 2010.-15 (Suppl. 1). - P. 1-6. Sarsenbaeva AC Methods for the diagnosis of Helicobacter pylori infection : studies. allowance [Text] / AC Sarsenbayev // Chelyabinsk: ed. UMK, 2005. - 35 s].
Азиатско-Тихоокеанский консенсус по раку желудка рекомендовал стратегию скрининга и лечения H. pylori-инфекции в популяциях населения с высоким риском рака желудка. В России заболеваемость MALT-лимфомой желудка у мужчин составляет 30,4, у женщин - 13,3 человек на 100000 населения (РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2006). Установлено, что инфицирование H. pylori является причиной как минимум 327 тыс. новых случаев рака желудка в год [Сеньчукова М.А. О роли бактерий в этиологии и патогенезе злокачественный новообразований [Текст] / М.А. Сеньчукова, А.А. Стадников // Сибирский онкологический журнал. - 2009. - №2 (32). - С. 79-85].The Asia-Pacific Consensus on Gastric Cancer recommended a screening and treatment strategy for H. pylori infection in populations at high risk for gastric cancer. In Russia, the incidence of gastric MALT lymphoma in men is 30.4, in women - 13.3 people per 100,000 population (Russian N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, 2006). It was established that H. pylori infection is the cause of at least 327 thousand new cases of stomach cancer per year [Senchukova MA On the role of bacteria in the etiology and pathogenesis of malignant neoplasms [Text] / M.A. Senchukova, A.A. Stadnikov // Siberian Oncology Journal. - 2009. - No. 2 (32). - S. 79-85].
Все вышеперечисленное определяет целесообразность внедрения стратегии скрининга и эрадикации Н. pylori. Среди современных методов, применяемых для диагностики инфекционных заболеваний, в том числе диагностики хеликобактериозов, широкое распространение получили иммунохимические тесты.All of the above determines the feasibility of implementing a screening and eradication strategy of H. pylori . Among the modern methods used to diagnose infectious diseases, including the diagnosis of helicobacteriosis, immunochemical tests have become widespread.
В настоящее время на российском рынке существует ряд тест-систем, которые разработаны для обнаружения антител и антигенов H. pylori. Тест-системы, предназначенные для выявления антител к H. pylori в сыворотке крови, доступны, достаточно широко распространены, но с их помощью нельзя оценить эрадикацию микроорганизма. О положительном эффекте эрадикационной терапии при их применении можно судить лишь косвенно по снижению титров антител в сыворотке крови пациентов. Примерами таких тест-систем являются «КреативМП-H. pylori» («КреативМедприбор», Россия), «ImmunoComb» («Biogal - Galed Labs», Израиль), «Helicobacter pylori IgA/IgG ИФА - тест-система» («Biohit Oyj», Финляндия). Иммунохроматографические тест-системы для обнаружения антигенов лишены данного недостатка, позволяют получить результаты анализа за 20-25 мин. Однако они предназначены исключительно для качественного определения антигена в биологическом материале (чаще всего - в кале). Примерами таких тест-систем являются «СIТО TEST H. pylori Ag» («Фармаско», Украина), «ImmunoCard STAT HpSA» («Meridian Bioscience», Италия), «Хелико Стик» и «H. pylori тест» («Novamed», Израиль). Среди имеющихся недостатков у вышеперечисленных иммунохроматографических тест-систем следует отметить их направленность на выявление не самого микроорганизма, а фермента уреазы, который, кроме H. pylori, способен вырабатывать другие возбудители инфекционных заболеваний.Currently, there are a number of test systems on the Russian market that are designed to detect H. pylori antibodies and antigens. Test systems designed to detect antibodies to H. pylori in the blood serum are available, quite widespread, but they cannot be used to evaluate the eradication of a microorganism. The positive effect of eradication therapy during their use can only be judged indirectly by the decrease in antibody titers in the blood serum of patients. Examples of such test systems are CreativeMP- H. pylori (CreativeMedpribor, Russia), ImmunoComb (Biogal - Galed Labs, Israel), Helicobacter pylori IgA / IgG ELISA - test system (Biohit Oyj ”, Finland). Immunochromatographic test systems for the detection of antigens are devoid of this drawback, they allow you to get the results of the analysis for 20-25 minutes However, they are intended solely for the qualitative determination of antigen in biological material (most often in feces). Examples of such test systems are CITO TEST H. pylori Ag (Pharmaco, Ukraine), ImmunoCard STAT HpSA (Meridian Bioscience, Italy), Helico Stick and H. pylori Test (Novamed ", Israel). Among the shortcomings of the above immunochromatographic test systems, one should note their focus on the identification of not the microorganism itself, but the urease enzyme, which, in addition to H. pylori , is capable of producing other pathogens of infectious diseases.
Наличие вышеуказанных недостатков у существующих иммунохроматографических тест-систем, отсутствие на рынке отечественного аналога, содержащего специфические иммунохимические компоненты российского производства, способного выявлять антигены патогенности H. pylori, обусловливают актуальность разработки иммунохроматографической тест-системы для диагностики хеликобактериоза.The presence of the aforementioned shortcomings in existing immunochromatographic test systems, the lack of a domestic analogue on the market containing specific immunochemical components of Russian production, capable of detecting H. pylori pathogenicity antigens, makes the development of an immunochromatographic test system for the diagnosis of helicobacteriosis urgent.
Наиболее близкой к заявленной является иммунохроматографическая тест-система для детекциии антигенов Helicobacter pylori [Бызова Н.А. Разработка иммунохроматографической тест-системы для детекции антигенов Helicobacter pylori [Текст] / Н.А. Бызова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. - 2015. - Т. 51, №5. - С. 520-530]. Основными специфическими иммунохимическими компонентами указанной иммунохроматографической тест-системы являются моноклональные антитела (МкАТ) к H. pylori, клон ABHPY-0404 («Arista Biologicals», США) с наночастицами коллоидного золота (НчКЗ) размером 30 нм в конъюгате и МкАТ к H. pylori, клон НР-939 (Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения), сорбированные на нитроцеллюлозной мембране в тестовой зоне.Closest to the claimed is an immunochromatographic test system for the detection and antigens of Helicobacter pylori [N. Byzova. Development of an immunochromatographic test system for the detection of Helicobacter pylori antigens [Text] / N.A. Byzova [et al.] // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2015. - T. 51, No. 5. - S. 520-530]. The main specific immunochemical components of the indicated immunochromatographic test system are monoclonal antibodies (MKAT) to H. pylori , clone ABHPY-0404 (Arista Biologicals, USA) with colloidal gold nanoparticles (NCP) of 30 nm in the conjugate and MKAT to H. pylori , clone HP-939 (All-Russian Scientific Center for Molecular Diagnostics and Treatment), adsorbed on a nitrocellulose membrane in the test zone.
Общим с данной тест-системой является природа маркера - НчКЗ диаметром 30 нм. Однако использование МкАТ зарубежной фирмы в конъюгате затрудняет разработку тест-системы из-за сложностей поставки импортных реагентов, а также повышает затраты на производство. Кроме этого, отсутствуют сведения о специфичности используемых для разработки тест-системы моноклональных антител - получены они к антигенам клеточной стенки либо к антигенам патогенности. Разработанная авторами для детекции антигенов H. pylori в кале иммунохроматографическая тест-система протестирована лишь со стандартными очищенными растворами коммерческих антигенов AGHPY-0100, AGHPY-0103 и AGHPY-0104 H. pylori («Arista Biologicals», США). Не определена чувствительность разработанной тест-системы при ее использовании для детекции микроорганизма непосредственно в кале пациентов, страдающих хеликобактериозом, не проведено сопоставление этих данных с результатами тестирования при использовании стандартных очищенных растворов коммерческих антигенов. Авторы протестировали разработанную тест-систему лишь с суспензией кала здорового человека, в который был добавлен один из антигенов AGHPY-0404, ранее не упомянутый в самой работе на этапах анализа чувствительности разрабатываемой тест-системы.Common with this test system is the nature of the marker - NchKZ with a diameter of 30 nm. However, the use of MKAT of a foreign company in the conjugate complicates the development of a test system due to the difficulties in the supply of imported reagents, and also increases production costs. In addition, there is no information on the specificity of the monoclonal antibodies used to develop the test system — they were obtained against cell wall antigens or pathogenicity antigens. The immunochromatographic test system developed by the authors for the detection of H. pylori antigens in feces was tested only with standard purified solutions of commercial antigens AGHPY-0100, AGHPY-0103 and AGHPY-0104 H. pylori (Arista Biologicals, USA). The sensitivity of the developed test system when using it to detect a microorganism directly in the feces of patients with helicobacteriosis was not determined, and these data were not compared with the test results using standard purified solutions of commercial antigens. The authors tested the developed test system only with a stool suspension of a healthy person, in which one of the antigens AGHPY-0404 was added, which was not previously mentioned in the work itself at the stages of sensitivity analysis of the developed test system.
В связи с этим предлагается иммунохроматографическая тест-система для детекции белка патогенности cagA H. pylori, в состав которой включены специфические иммунохимические компоненты отечественного производства (МкАТ к cagA H. pylori, клоны НР-1811 и НР-387, антивидовые антитела козы против иммуноглобулинов мыши производства отечественной фирмы «Биалекса», Россия).In this regard, an immunochromatographic test system for detecting the pathogenicity protein of H. pylori cagA is proposed, which includes specific immunochemical components of domestic production (MKAT for H. pylori cagA, clones HP-1811 and HP-387, anti-species goats anti-mouse immunoglobulins production of the domestic company "Bialexa", Russia).
Целью изобретения является разработка иммунохроматографической тест-системы, пригодной для тестирования различных биологических материалов (культур микроорганизма, кала, содержимого зубодесневых карманов) на наличие белка cagA H. pylori.The aim of the invention is to develop an immunochromatographic test system suitable for testing various biological materials (cultures of a microorganism, feces, contents of gum pockets) for the presence of H. pylori cagA protein.
Поставленная цель достигается путем создания мультимембранного композита, состоящего из нитроцеллюлозной мембраны, на поверхность которой наклеены мембрана с иммобилизованным конъюгатом моноклональных антител, клон НР-387 («Биалекса», Россия), в концентрации 20 мкг⋅см-3 с наночастицами колодного золота со средним диаметром 30 нм, и нанесены в поперечном направлении моноклональные антитела, клон HP-1811 («Биалеса», Россия) в тестовой и антивидовые антитела козы против Ig мыши («Биалекса», Россия) - в контрольной зонах мембраны для образца и адсорбирующей мембраны.This goal is achieved by creating a multi-membrane composite consisting of a nitrocellulose membrane, on the surface of which a membrane with an immobilized conjugate of monoclonal antibodies, clone НР-387 (Bialexa, Russia), is glued at a concentration of 20 μgcm -3 with medium gold nanoparticles with medium with a diameter of 30 nm, and monoclonal antibodies were applied in the transverse direction, clone HP-1811 (Bialesa, Russia) in the test and antispecies goat antibodies against mouse Ig (Bialexa, Russia) in the control zones of the membrane for the sample and biruyuschey membrane.
Работа по созданию иммунохроматографической тест-системы включает несколько этапов, среди которых выделяют получение конъюгата коллоидного золота с МкАТ, нанесение конъюгата на мембрану, нанесенияе МкАТ в тестовую и контрольную зоны, сборку тест-системы, а также тестирование разработанного образца с различными видами биологических материалов (музейными культурами H. pylori, калом и содержимым зубодесневых карманов лиц, имеющих в анамнезе язву желудка либо двенадцатиперстной кишки) на предмет обнаружения в нем белка cagA H. pylori.The work on creating an immunochromatographic test system involves several stages, among which are the preparation of a colloidal gold conjugate with MKAT, applying the conjugate to the membrane, applying MKAT to the test and control zones, assembling the test system, and testing the developed sample with various types of biological materials ( museum cultures of H. pylori , feces and contents of the periodontal pockets of persons with a history of gastric or duodenal ulcer) for the detection of H. pylori cagA protein in it.
В работе использовали моноклональные антитела к белку cagA H. pylori, клоны НР-1811 и НР-387 («Биалекса», Россия); антивидовые антитела козы против IgG мыши («Биалекса», Россия); золотохлористоводородную кислоту HAuCl4⋅3H2O («Sigma», США); дистиллированную воду (ГОСТ 6709-72); деионизированнную воду (ГОСТ 11.029.003-80); соляную кислоту (ГОСТ 3118-77); азотную кислоту (ГОСТ 4461-77); цитрат натрия 5,5-водный («Реахим», Россия); хлорид натрия («Реахим», Россия); карбонат калия («Реахим», Россия); гидрокарбонат натрия («Реахим», Россия); дигидрофосфат калия («Рап-геас», Испания); гидрофосфат натрия («Sciphos», Китай); трис(гидроксиметил)аминометан («Sigma», США); трис гидрохлорид («Panreac», Испания); полиэтиленгликоль 40000 («Sigma», США); бычий сывороточный альбумин («Диа-М», Германия); Tween-20 («AppliChem», Германия); сахарозу («Реахим», Россия).We used monoclonal antibodies to the H. pylori cagA protein, HP-1811 and HP-387 clones (Bialexa, Russia); goat anti-species antibodies against mouse IgG (Bialexa, Russia); hydrochloric acid HAuCl 4 ⋅ 3H 2 O (Sigma, USA); distilled water (GOST 6709-72); deionized water (GOST 11.029.003-80); hydrochloric acid (GOST 3118-77); nitric acid (GOST 4461-77); 5.5-aqueous sodium citrate (Reahim, Russia); sodium chloride (Reahim, Russia); potassium carbonate (Reahim, Russia); sodium bicarbonate (Reahim, Russia); potassium dihydrogen phosphate (Rap Geas, Spain); sodium hydrogen phosphate (Sciphos, China); Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Sigma, USA); Tris hydrochloride (Panreac, Spain); polyethylene glycol 40,000 (Sigma, USA); bovine serum albumin (Dia-M, Germany); Tween-20 ("AppliChem", Germany); sucrose (Reahim, Russia).
В состав мультимембранного комплекса вошли мембраны фирмы «MDI», Индия.The membrane structure included MDI membranes, India.
Наименование и характеристика элементов мультимембранного композита иммунохроматографической тест-системы представлены в таблице 1.The name and characterization of the elements of the multi-membrane composite immunochromatographic test system are presented in table 1.
Всю лабораторную посуду, предназначенную для работы, предварительно обрабатывали «царской водкой» (смесь концентрированных кислот соляной и азотной в соотношении 3:1) в течение 5 мин с последующим промыванием посуды двукратно в дистиллированной и двукратно - в деионизированной воде, сушкой на воздухе и обработкой в сухожаровом шкафу всех флаконов (колб и др.) с закрытыми фольгой горлышками. Режим обработки в сухожаровом шкафу: 180°C, 60 мин.All laboratory glassware intended for work was pretreated with “royal vodka” (a mixture of concentrated hydrochloric and nitric acids in a ratio of 3: 1) for 5 minutes, followed by washing the glassware twice in distilled and twice-in deionized water, air drying and processing in a dry heat cabinet of all bottles (flasks, etc.) with necks closed with foil. Processing mode in a dry oven: 180 ° C, 60 min.
Все растворы готовили на деионизированной воде. Для получения деионизированной воды применяли систему UF Arium 611 UF («Sartorius», Германия).All solutions were prepared in deionized water. To obtain deionized water, the UF Arium 611 UF system (Sartorius, Germany) was used.
Для взвешивания реагентов использовали весы электронные аналитические Adventurer («OHAUS», США).For weighing reagents, we used Adventurer electronic analytical balances (OHAUS, USA).
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Получение наночастиц коллоидного золотаObtaining colloidal gold nanoparticles
НчКЗ размером 30 нм получали цитратным методом Френса [Frens G. // Nat. Phys. Sci. - 1973. - V. 241. - №105. - P. 20-22]. К 49,23 см3 деионизированной воды добавляли 0,058 см 10% раствора золотохлористоводородной кислоты HAuCl4⋅3H2O («Sigma», США), доводили до кипения и при перемешивании добавляли 0,72 см3 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия. Смесь кипятили 20 мин, затем охлаждали и хранили при 4°C. Размеры, дисперсионные свойства, электронную плотность частиц анализировали на электронном трансмиссионном микроскопе JEM-2100 («Jeol», Япония).30 nm NCHs were obtained by the citrate method of Frens [ Frens G. // Nat. Phys. Sci. - 1973. - V. 241. - No. 105. - P. 20-22]. 0.058 cm 10% solution of hydrochloric acid HAuCl 4 ⋅ 3H 2 O (Sigma, USA) was added to 49.23 cm 3 of deionized water, brought to a boil and 0.72
Определение «золотого числа»Definition of the "Golden Number"
Для проведения реакции использовали НчКЗ с диаметром 30 нм и мышиные МкАТ к белку cagA Н. pylori, клон НР-387 с концентрацией белка 8,0 мг⋅см-3. К раствору НчКЗ добавляли 0,1 М карбонат калия до достижения рН 9,0. Разведения антител и собственно определение «золотого числа» проводили на 0,001 М Трис-HCl буфере с pH 9,0. МкАТ НР-387 с исходной концентрацией 8,0 мг⋅см-3 разводили на 0,001 М борате натрия до 200 мкг⋅см-3.For carrying out the reaction, NchCZs with a diameter of 30 nm and mouse MKAT to cagA H protein were used. pylori , clone HP-387 with a protein concentration of 8.0 mg · cm -3 . 0.1 M potassium carbonate was added to the NchCW solution until a pH of 9.0 was reached. Dilution of antibodies and the actual determination of the "golden number" was carried out on 0.001 M Tris-HCl buffer with a pH of 9.0. MKAT NR-387 with an initial concentration of 8.0 mg⋅cm- 3 was diluted with 0.001 M sodium borate to 200 μg⋅cm -3 .
К 0,1 см3 раствора МкАТ НР-387 (с концентрацией от 100 мкг⋅см-3 до 1,5 мкг⋅см-3) добавляли 0,1 см3 раствора НчКЗ, перемешивали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0,011 см3 10%-ного раствора хлорида натрия, перемешивали и через 10 мин измеряли оптическую плотность содержимого при длине волны 630 нм на спектрофотометре СПЕКС СПП-705-4 (ЗАО «Спектроскопические системы», Россия).To 0.1 cm 3 of MKat NR-387 solution (with a concentration of 100 μg ⋅ cm -3 to 1.5 μg ⋅ cm -3 ), 0.1 cm 3 of the NchC3 solution was added, mixed and incubated for 15 min at room temperature. Then, 0.011 cm 3 of a 10% sodium chloride solution was added, mixed, and after 10 min the optical density of the contents was measured at a wavelength of 630 nm on a SPEX SPP-705-4 spectrophotometer (ZAO Spectroscopic Systems, Russia).
Концентрацию антител, используемую при синтезе конъюгатов МкА с НчКЗ, устанавливали на основании флокуляционной кривой, отражающих агрегацию конъюгатов при высокой ионной силе. Была выбрана концентрация антител, на 10-15% превосходящая точки выхода D 630 на плато, как рекомендовано в [Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques [Text] / G.T. Hermanson // Amsterdam: Acad. Press, Elsevier. - 2008. - 900 p.], а именно 20 мкг⋅см-3.The concentration of antibodies used in the synthesis of conjugates of MkA with NchKZ, was established on the basis of a flocculation curve reflecting the aggregation of conjugates at high ionic strength. An antibody concentration of 10-15% higher than the exit points of D 630 per plateau was selected, as recommended in [ Hermanson, GT . Bioconjugate Techniques [Text] / GT Hermanson // Amsterdam: Acad. Press, Elsevier. - 2008. - 900 p.], Namely 20 µg⋅cm -3 .
Приготовление конъюгата НчКЗ и МкАТ НР-387Preparation of conjugate NchKZ and MKAT NR-387
К 0,995 см3 0,025 М Трис-HCL буфера с pH 9,0±0,1 добавляли 0,005 см3 МкАТ НР-387 с концентрацией 8 мг⋅см-3, получали концентрацию антител 40 мкг⋅см-3. К 1,0 см3 МкАТ добавляли 1,0 см3 НчКЗ с pH 9,0±0,1, получали конечную концентрацию МкАТ 20 мкг⋅см-3. Конъюгат в объеме 2,0 см инкубировали 30 мин при комнатной температуре, перемешивая каждые 10 мин на вортексе («Biosan», Латвия). Для стабилизации добавляли профильтрованный 4% раствор ПЭГ 40000 до конечной концентрации 0,25%, инкубировали 15 мин. Конъюгат центрифугировали на центрифуге (Centrifuge 5415 R, «Eppendorf», Германия), используя ускорение 9000 g (13,4 тыс об⋅мин-1) в течение 30 мин при 4°C. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 2,0 см3 стабилизирующего буфера следующего состава: 0,025 М Трис-HCL буфер, содержащий 1% белковый сывороточный альбумин и 1% сахарозу, pH 8,5±0,1. Для отмывки конъюгата от несвязавшихся антител проводили повторное центрифугирование в тех же условиях. Удаляли надосадочную жидкость, полученный осадок ресуспендировали в 0,5 см3 стабилизирующего буфера с добавлением 0,05% Tween 20, pH 8,5±0,1.To a 0.995 cm 3 of a 0.025 M Tris-HCL buffer pH 9.0 ± 0.1 was added 0,005 cm 3 MAb NR-387 with the concentration of 8 mg⋅sm -3, the concentration of antibody obtained mkg⋅sm 40 -3. To 1.0 cm 3 MKat was added 1.0 cm 3 NchK3 with a pH of 9.0 ± 0.1, received a final concentration of MKat 20 µg · cm -3 . The conjugate in a volume of 2.0 cm was incubated for 30 min at room temperature, stirring every 10 min on a vortex (Biosan, Latvia). For stabilization, a filtered 4% PEG 40,000 solution was added to a final concentration of 0.25%, incubated for 15 minutes. The conjugate was centrifuged in a centrifuge (Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Germany) using an acceleration of 9000 g (13.4 thousand rpm -1 ) for 30 min at 4 ° C. The supernatant was removed, the precipitate was resuspended in 2.0 cm 3 stabilizing buffer of the following composition: 0.025 M Tris-HCL buffer containing 1% protein serum albumin and 1% sucrose, pH 8.5 ± 0.1. To wash the conjugate from unbound antibodies, repeated centrifugation was performed under the same conditions. The supernatant was removed, the resulting precipitate was resuspended in 0.5 cm 3 stabilizing buffer with the addition of 0.05% Tween 20, pH 8.5 ± 0.1.
Раствор конъюгата методом пропитывания наносили на мембраны для конъюгата с плотностью нанесения 30 мкл на 1 см2 и высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 24 ч.The solution of the conjugate was impregnated onto the conjugate membranes with a deposition density of 30 μl per 1 cm 2 and dried in air at room temperature for 24 hours.
Нанесение МкАТ на нитроцеллюлозную мембрануApplication MKAT on nitrocellulose membrane
МкАТ HP-1811 наносили в тестовую зону аналитической мембраны в концентрации 12 мг⋅см-3, антивидовые антитела козы против иммуноглобулинов мыши в концентрации 10 мг⋅см-3. Тест-системы высушивали при комнатной температуре в течение суток.MKAT HP-1811 was applied to the test zone of the analytical membrane at a concentration of 12 mg cm −3 , anti-species goat antibodies against mouse immunoglobulins at a concentration of 10 mg cm −3 . Test systems were dried at room temperature for one day.
Получение иммунохроматографического композитаPreparation of Immunochromatographic Composite
Склеивание тест-систем проводили последовательно: на нитроцеллюлозную мембрану наклеивали мембрану с иммобилизованным конъюгатом, мембрану для образца и мембрану для адсорбента. Затем полученный мультимембранный композит нарезали при помощи резака («Rahmenlos® Katze Geschenk Shirt», США) на отдельные полоски шириной 3,5-4,0 мм.The gluing of the test systems was carried out sequentially: a membrane with an immobilized conjugate, a membrane for the sample, and a membrane for the adsorbent were glued onto the nitrocellulose membrane. Then, the obtained multi-membrane composite was cut using a cutter (Rahmenlos® Katze Geschenk Shirt, USA) into separate strips 3.5–4.0 mm wide.
В результате разработан экспериментальный образец иммунохроматографической тест-системы, состав мультимембранного композита и основные компоненты которого представлены на чертеже, где 1 - мембрана для нанесения образца TYPE-GFB-R4/0,35; 2 - коньюгат НчКЗ с МкАТ НР-387, нанесенный на мембрану PT-R5; 3 - МкАТ HP-1811 в концентрации 12 мг⋅см3; 4 - антивидовые козьи AT против Ig мыши в концентрации 10 мг⋅см3; 5 - адсорбирующая мембрана TYPE-AP045; 6 - нитроцеллюлозная мембрана Т YPE-CNPE-SN12-L2-P25 10μ.As a result, an experimental sample of the immunochromatographic test system was developed, the composition of the multibrane composite and the main components of which are shown in the drawing, where 1 is the membrane for applying the sample TYPE-GFB-R4 / 0.35; 2 - conjugate NchKZ with MKAT NR-387 deposited on a PT-R5 membrane; 3 - MKAT HP-1811 at a concentration of 12 mg · cm 3 ; 4 - anti-species goat AT against mouse Ig at a concentration of 10 mg · cm 3 ; 5 - absorbent membrane TYPE-AP045; 6 - nitrocellulose membrane T YPE-CNPE-SN12-L2-P25 10μ.
Принцип работы заявленной тест-системы, предназначенной для детекции патогенных штаммов H. pylori, заключается в следующем. При наличии целевого антигена (белка cagA H. pylori) в пробе, при нанесении ее в объеме 0,1 см3 на подложку для образца, антиген взаимодействует с конъюгатом МкАТ НР-387 с НчКЗ. В результате образуется окрашенный иммуноком-плекс «антиген-антитело», который движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны, пересекает тестовую полосу и взаимодействует с иммобилизованными на указанной тестовой полосе МкАТ НР-1811, тестовая полоса окрашивается в розовый цвет. Далее несвязавшийся в тестовой полосе конъюгат продолжает движение вдоль хроматографической мембраны и взаимодействует с иммобилизованными в контрольной полосе антивидовыми козьими антителами против иммуноглобулинов мыши. В результате контрольная полоса также окрашивается в розовый цвет. Формирование контрольной полосы является внутренним контролем теста. Если анализ проведен правильно, она должна проявляться всегда, независимо от присутствия антигена в исследуемом образце.The principle of operation of the claimed test system designed to detect pathogenic strains of H. pylori is as follows. In the presence of the target antigen ( H. pylori cagA protein) in the sample, when applied in a volume of 0.1 cm 3 on the substrate for the sample, the antigen interacts with the MKAT HP-387 conjugate with NchKZ. As a result, an antigen-antibody-colored Plex immunocomplex is formed, which moves under the action of capillary forces along the nitrocellulose membrane, crosses the test strip and interacts with the MKAT HP-1811 immobilized on the indicated test strip, and the test strip turns pink. Further, the conjugate unbound in the test strip continues to move along the chromatographic membrane and interacts with goat anti-species antibodies immobilized in the control band against mouse immunoglobulins. As a result, the control strip also turns pink. The formation of the control strip is an internal control of the test. If the analysis is carried out correctly, it should always occur, regardless of the presence of antigen in the test sample.
Результаты определяются визуально в течение 20-25 мин. При положительном результате тестирования появляются две окрашенные полосы - тестовая и контрольная. При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не появилась, результаты теста считаются недействительными.Results are determined visually for 20-25 minutes. If the test result is positive, two colored stripes appear - test and control. With a negative result, only one band appears - the control. If the control strip does not appear, the test results are considered invalid.
Разработанную тест-систему апробировали при тестировании различного биологического материала на предмет наличия белка cagA H. pylori.The developed test system was tested when testing various biological material for the presence of H. pylori cagA protein.
На первом этапе для оценки специфичности и чувствительности анализа с помощью тест-системы исследовали культуры H. pylori, находящиеся в музейной коллекции культур кафедры микробиологии ФГБОУ ВО «Вятского государственного университета». Данные культуры были выделены из биологических материалов лиц, имеющих в анамнезе гастрит и язвенную болезнь желудка (содержимое зубодесневых карманов и биоптаты слизистой оболочки желудка). Принадлежность культур к H. pylori подтверждена бактериологическим методом, биохимическими тестами, методами молекулярной диагностики при использовании коммерческих тест-систем для постановки ПЦР («Хеликопол VA», «Хеликопол СА», «Хеликопол IA», «Хеликопол ВА» (Россия), «ДНК-технологии», Россия), методом иммунохроматографии при использовании коммерческой тест-системы («NovaMed», Израиль).At the first stage, to assess the specificity and sensitivity of the analysis, H. pylori cultures, located in the museum culture collection of the Department of Microbiology of FSBEI HE “Vyatka State University”, were studied using a test system. These cultures were isolated from the biological materials of individuals with a history of gastritis and gastric ulcer (contents of periodontal pockets and biopsy specimens of the gastric mucosa). The belonging of cultures to H. pylori is confirmed by the bacteriological method, biochemical tests, molecular diagnostic methods using commercial test systems for PCR (Helicopol VA, Helicopol SA, Helicopol IA, Helicopol VA (Russia), “ DNA technologies ”, Russia), by immunochromatography using a commercial test system (“ NovaMed ”, Israel).
На втором этапе оценивали возможность использования тест-системы для исследования биологических материалов (кала и содержимого зубодесневых карманов), взятых от серопозитивных по отношению к H. pylori доноров.At the second stage, the possibility of using a test system for the study of biological materials (feces and contents of the gingival pockets) taken from seropositive donors for H. pylori was assessed.
Пример 1. Тестирование культур H. pylori Example 1. Testing cultures of H. pylori
Культуру H. pylori выращивали на селективной питательной среде - колумбийском кровяном агаре с антибиотиками амфотерицином (300 мкг⋅л-1) и ванкомицином (300 мкг⋅л-1) в анаэростате при температуре 37°C в течение 3-5 суток. Проводили микробиологическую, биохимическую, молекулярно-генетическую, иммунохроматографическую идентификацию выращенной культуры H. pylori [Кудрявцева Л.В. Биологические свойства Helicobacter pylori [Текст] / Альманах клинической медицины. - 2006. - Т. XIV. - С. 39-46]. Делали смыв культуры с чашки Петри стерильным раствором хлорида натрия, центрифугировали при 2000 об⋅мин-1 в течение 10 мин для осаждения клеток и очистки смыва от остатков питательной среды, осадок ресуспендировали в буфере разгона (0,025 М K/Na ФСБ с 0,15 М NaCl и 0,05% Tween-20, pH 7,5±0,1).The H. pylori culture was grown on a selective nutrient medium - Colombian blood agar with antibiotics amphotericin (300 μg⋅ -1 ) and vancomycin (300 μg⋅ -1 ) in anaerostat at a temperature of 37 ° C for 3-5 days. Conducted microbiological, biochemical, molecular genetic, immunochromatographic identification of the grown culture of H. pylori [Kudryavtseva L.V. Biological properties of Helicobacter pylori [Text] / Clinical medicine almanac. - 2006. - T. XIV. - S. 39-46]. The culture was washed off from the Petri dish with a sterile sodium chloride solution, centrifuged at 2000 rpm -1 for 10 min to pellet the cells and clean the washout from the residual nutrient medium, the sediment was resuspended in acceleration buffer (0.025 M K / Na FSB with 0.15 M NaCl and 0.05% Tween-20, pH 7.5 ± 0.1).
В качестве отрицательного контроля использовали буфер разгона. Для первичной оценки специфичности разработанной тест-системы использовали культуру P. vulgaris. Данный микроорганизм также является этиологическим агентом заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также присутствует в кишечнике здорового человека и многих животных.The acceleration buffer was used as a negative control. For an initial assessment of the specificity of the developed test system, P. vulgaris culture was used. This microorganism is also an etiological agent of diseases of the gastrointestinal tract, and is also present in the intestines of a healthy person and many animals.
По результатам тестирования выявлено, что тест-система обладает чувствительностью к H. pylori, о чем свидетельствует появление розовой полосы в аналитической зоне. Появление розовой полосы в контрольной зоне указывало на корректность проведенного анализа. При тестировании гетерогенной культуры P. vulgaris окрашивания аналитической зоны не наблюдалось.According to the test results, it was revealed that the test system is sensitive to H. pylori , as evidenced by the appearance of a pink band in the analytical zone. The appearance of a pink band in the control zone indicated the correctness of the analysis. When testing a heterogeneous culture of P. vulgaris, staining of the analytical zone was not observed.
Пример 2. Анализ кала на наличие антигена cagA H. pylori Example 2. Analysis of feces for the presence of H. pylori cagA antigen
На первом этапе у 20 добровольцев отбирали кровь из локтевой вены для получения сыворотки крови, которую тестировали на наличие антител к белку cagA H. pylori с помощью коммерческого набора для ДОТ-анализа «Хелико-экспресс» («ВЕКТОР-БЕСТ», Россия). По результатам исследования были выбраны 5 серопозитивых доноров, у которых на втором этапе исследования в стерильные пробирки-капельницы с 1 мл стерильного буфера (0,025 М K/Na ФСБ с 0,15 М NaCl и 0,05% Tween-20, pH 7,5±0,1) были отобраны образцы кала в количестве 250-300 мг. Анализ с использованием иммунохроматографических тест-систем проводили при комнатной температуре. На мембрану для образца наносили 0,1 см3 исследуемой пробы. В качестве контроля использовали буфер разгона.At the first stage, blood was taken from the ulnar vein of 20 volunteers to obtain blood serum, which was tested for the presence of antibodies to the H. pylori cagA protein using the Helico-Express commercial kit for DOT analysis (VECTOR-BEST, Russia). Based on the results of the study, 5 seropositive donors were selected for whom, in the second stage of the study, sterile dropper tubes with 1 ml of sterile buffer (0.025 M K / Na FSB with 0.15 M NaCl and 0.05% Tween-20,
По результатам тестирования в двух из пяти исследованных образцов обнаружен белок cagA H. pylori, о чем свидетельствовало появление розовой полосы в аналитической зоне, а окрашивание контрольной зоны подтверждало корректность проведенного анализа.According to the test results, cagA protein H. pylori was found in two of the five samples studied, as evidenced by the appearance of a pink band in the analytical zone, and the staining of the control zone confirmed the correctness of the analysis.
Образцы кала соответствующих добровольцев были посеяны на селективную питательную среду - колумбийский кровяной агар с антибиотиками. Выросшие культуры H. pylori протестированы микробиологическим, биохимическим, молекулярно-генетическим методами при использовании коммерческих тест-систем для постановки ПЦР («Хеликопол VA», «Хеликопол СА», «Хеликопол IA», «Хеликопол ВА» (Россия), «ДНК-технологии», Россия), методом иммунохроматографии при использовании коммерческой тест-системы («NovaMed», Израиль). Результаты исследования показали 100% сопоставимость с данными анализа, полученными при использовании разработанной имунохроматографической тест-системы.Fecal samples from the respective volunteers were seeded on a selective nutrient medium - Colombian blood agar with antibiotics. The grown cultures of H. pylori were tested by microbiological, biochemical, molecular genetic methods using commercial test systems for PCR (Helicopol VA, Helicopol SA, Helicopol IA, Helicopol VA (Russia), DNA- Technologies ”, Russia), by immunochromatography using a commercial test system (“ NovaMed ”, Israel). The results of the study showed 100% compatibility with the analysis data obtained using the developed immunochromatographic test system.
Пример 3. Анализ содержимого зубодесневых карманов на наличие антигена cagA H. pylori Example 3. Analysis of the contents of the periodontal pockets for the presence of antigen cagA H. pylori
Ротовая полость является входными воротами H. pylori-инфекции. В ротовой полости инфицированных людей возбудитель обнаруживается в слюне, на слизистой оболочке, на дентальных бляшках, в зубном налете, в зубодесневых. В последних создаются микроаэрофильные условия, благоприятные для H. pylori [Угольник Т.С. Сравнительный анализ выявления Helicobacter pylori в ротовой полости с помощью тест-зонда и полимеразной цепной реакции [Текст] / Т.С. Угольник // Медицинские новости. - 2006. - Т. 1, №8. - С. 90-92. Чобанов Р.Э. Парадонтальные карманы как биотопы накопления и жизнедеятельности Helicobacter pylori [Текст] / Р.Э. Чобанов, Р.M. Мамедов // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - №7. Булкина Н.В. Патогенетическая взаимосвязь и взаимовлияние воспалительных заболеваний пародонта с патологией сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта [Текст] / Н.В. Булкина // Клиническая стоматология. - 2010. - №2. - С. 12-15]. В связи с этим представляется целесообразным проверка содержимого зубодесневых карманов на предмет наличия белка cagA H. pylori с целью подтверждения эффекта полной эрадикации и предупреждения возможности реинфицирования.The oral cavity is the entrance gate of H. pylori infection. In the oral cavity of infected people, the pathogen is found in saliva, on the mucous membrane, on dental plaques, in plaque, in the periodontal. In the latter, microaerophilic conditions favorable for H. pylori are created [Ugolnik TS Comparative analysis of the detection of Helicobacter pylori in the oral cavity using a test probe and polymerase chain reaction [Text] / TS. Ugolnik // Medical news. - 2006. - T. 1, No. 8. - S. 90-92. Chobanov R.E. Periodontal pockets as biotopes of accumulation and vital activity of Helicobacter pylori [Text] / R.E. Chobanov, R.M. Mamedov // Siberian Medical Journal. - 2008. - No. 7. Bulkina N.V. Pathogenetic relationship and mutual influence of inflammatory periodontal diseases with pathology of the cardiovascular system and gastrointestinal tract [Text] / N.V. Bulkina // Clinical Dentistry. - 2010. - No. 2. - S. 12-15]. In this regard, it seems appropriate to check the contents of the gingival pockets for the presence of the cagA protein of H. pylori in order to confirm the effect of complete eradication and prevent the possibility of reinfection.
Перед забором материала каждый пациент проводил дезинфекцию полости рта, трижды обрабатывая полость рта методом полоскания раствором фурацилина. Забор биологического материала из зубодесневых карманов маляров и резцов осуществлялся стерильными штифтами, представляющими собой зубочистки с ватными концами, отобранный материал ресунпендировали в 1,5 см3 буфера разгона, полученную суспензию центрифугировали при 2000 об⋅мин-1 в течение 20 мин для осаждения биологического материала, а затем полученный осадок ресуспендировали в 0,15 см3 буфера разгона.Before taking the material, each patient disinfected the oral cavity, treating the oral cavity three times with rinsing with a solution of furatsilin. Biological material was taken from the gingival pockets of painters and incisors using sterile pins representing toothpicks with cotton ends, the selected material was resuspended in 1.5 cm 3 of acceleration buffer, the resulting suspension was centrifuged at 2000 rpm -1 for 20 min to precipitate the biological material and then the resulting precipitate was resuspended in 0.15 cm 3 acceleration buffer.
Образцы биологического материала зубодесневых карманов соответствующих добровольцев были посеяны на селективную питательную среду - колумбийский кровяной агар с антибиотиками. Выросшие культуры H. pylori протестированы микробиологическим, биохимическим, молекулярно-генетическим методами при использовании коммерческих тест-систем для постановки ПЦР («Хеликопол VA», «Хеликопол СА», «Хеликопол IA», «Хеликопол ВА» (Россия), «ДНК-технологии», Россия), методом иммуно-хроматографии при использовании коммерческой тест-системы («NovaMed», Израиль).Samples of the biological material of the gingival pockets of the respective volunteers were seeded on a selective nutrient medium - Colombian blood agar with antibiotics. The grown cultures of H. pylori were tested by microbiological, biochemical, molecular genetic methods using commercial test systems for PCR (Helicopol VA, Helicopol SA, Helicopol IA, Helicopol VA (Russia), DNA- Technologies ”, Russia), by immuno-chromatography using a commercial test system (“ NovaMed ”, Israel).
По результатам исследования пяти образцов содержимого зубодесневых карманов положительная реакция выявлена всеми указанными методами в двух случаях у добровольцев, у которых положительный результат был получен при тестировании кала.According to the results of a study of five samples of the contents of the gingival pockets, a positive reaction was detected by all these methods in two cases in volunteers in whom a positive result was obtained when testing feces.
Таким образом, результаты исследования биологических материалов (образцов кала, содержимого зубодесневых карманов) показали, что только двое из пяти серопозитивных пациентов, у которых выявлено наличие патогенных штаммов H.pylori, нуждаются в назначении эрадикационной терапии, трое же имели в анамнезе хеликобактериоз и на момент обследования не являлись носителями хеликобактериоза.Thus, the results of the study of biological materials (feces samples, contents of the gingival pockets) showed that only two out of five seropositive patients who revealed the presence of pathogenic H. pylori strains needed eradication therapy, while three had a history of helicobacteriosis at the time the examinations were not carriers of helicobacteriosis.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017108557A RU2642588C1 (en) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | Immunochromatographic test system for pathogenic helicobacter pylori strains detection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017108557A RU2642588C1 (en) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | Immunochromatographic test system for pathogenic helicobacter pylori strains detection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2642588C1 true RU2642588C1 (en) | 2018-01-25 |
Family
ID=61023752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017108557A RU2642588C1 (en) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | Immunochromatographic test system for pathogenic helicobacter pylori strains detection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2642588C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2733260C1 (en) * | 2020-03-11 | 2020-09-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" | Method for increasing sensitivity of immunochromatographic test systems with silver lactate and hydroquinone |
| RU202193U1 (en) * | 2020-06-09 | 2021-02-05 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | A device for immunochromatographic highly sensitive and out-of-laboratory detection of the phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganensis, based on an increase in the intensity of the recorded colorimetric signal due to the catalytic properties of the nanomarker |
| CN113201457A (en) * | 2021-04-22 | 2021-08-03 | 成都亿妙生物科技有限公司 | Pretreatment method for culture and detection of helicobacter pylori |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2196993C1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-01-20 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера | Method of serum diagnosis of infection helicobacter pylori by immunoenzyme analysis |
| CN1847854A (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-18 | 兰州大学 | Immunocolloidal gold test paper for detecting Helicobacter pylori antigen and preparation method thereof |
| CN102393460A (en) * | 2011-08-22 | 2012-03-28 | 万积成 | Rapid detection device for helicobacter pylori |
| RU2572717C1 (en) * | 2014-10-06 | 2016-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Immune diagnostic technique for diseases caused by helicobacter pylori infection |
-
2017
- 2017-03-14 RU RU2017108557A patent/RU2642588C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2196993C1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-01-20 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера | Method of serum diagnosis of infection helicobacter pylori by immunoenzyme analysis |
| CN1847854A (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-18 | 兰州大学 | Immunocolloidal gold test paper for detecting Helicobacter pylori antigen and preparation method thereof |
| CN102393460A (en) * | 2011-08-22 | 2012-03-28 | 万积成 | Rapid detection device for helicobacter pylori |
| RU2572717C1 (en) * | 2014-10-06 | 2016-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) | Immune diagnostic technique for diseases caused by helicobacter pylori infection |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Л.В.КУДРЯВЦЕВА и др. Helicobacter pylory - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей), М., 2004, 41 с. * |
| Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: Тезисы XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2013, с. 289-287. * |
| Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: Тезисы XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2013, с. 289-287. Л.В.КУДРЯВЦЕВА и др. Helicobacter pylory - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей), М., 2004, 41 с. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2733260C1 (en) * | 2020-03-11 | 2020-09-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" | Method for increasing sensitivity of immunochromatographic test systems with silver lactate and hydroquinone |
| RU202193U1 (en) * | 2020-06-09 | 2021-02-05 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | A device for immunochromatographic highly sensitive and out-of-laboratory detection of the phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganensis, based on an increase in the intensity of the recorded colorimetric signal due to the catalytic properties of the nanomarker |
| CN113201457A (en) * | 2021-04-22 | 2021-08-03 | 成都亿妙生物科技有限公司 | Pretreatment method for culture and detection of helicobacter pylori |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3969722B2 (en) | Candida detection | |
| CN103278635B (en) | Animal brucellosis competitive ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) antibody detection kit | |
| CN105067812A (en) | Bovine brucella indirect ELISA antibody detection kit | |
| US20100273177A1 (en) | Methods and Devices for Testing Saliva | |
| CN105137073A (en) | Bovine Brucella colloidal gold antibody detection test paper strip | |
| RU2642588C1 (en) | Immunochromatographic test system for pathogenic helicobacter pylori strains detection | |
| CN106771182A (en) | Brucella abortus IgM subclass antibodies indirect ELISA testing kits | |
| CN106596958B (en) | Brucellosis CF-ELISA antibody assay kits | |
| Mouton et al. | Evaluation of Fluoretec-M for detection of oral strains of Bacteroides asaccharolyticus and Bacteroides melaninogenicus | |
| JP4268358B2 (en) | Antibody and immunological assay | |
| CN105158463A (en) | Colloidal gold test paper bar for antibody detection of sheep Brucella | |
| Fruit et al. | Expression of an epitope by surface glycoproteins of Candida albicans. Variability among species, strains and yeast cells of the genus Candida | |
| Meabed et al. | Prevalence of Entamoeba gingivalis and Trichomonas tenax among Patients suffering from Chronic Systemic Diseases in Egypt | |
| JPH04355339A (en) | Trace specimem sampling device | |
| JP2004301537A (en) | Method for detecting canine distemper antigen | |
| RU2144190C1 (en) | Method of diagnosis of staphylococcus infection | |
| RU2429484C2 (en) | Instant diagnostic technique for rotavirus infection in materials of upper respiratory airways fluorescent dry immunoglobulin for implementation thereof | |
| RU2345365C1 (en) | Method for differential diagnostics of yersiniosis and respective diagnostic kit | |
| Alasel et al. | A new platform for serological analysis based on porous 3-dimensional polyethylene sinter bodies | |
| Fraser et al. | Mycoplasmas in cell cultures from rheumatoid synovial membranes | |
| KR101341994B1 (en) | A method of manufacturing antigen slide for indirect immunofluorescence antibody assay against Legionella species and a micro-multivalent antigen slide for simultaneous detection of antibodies manufactured by using the same | |
| EP2205735B1 (en) | Immunological tests for the presence of bacteria which make use of antibodies obtained using a specific method | |
| JP2012239438A (en) | Method for preparation of bartonella henselae antigen and prepared bartonella henselae antigen prepared thereby | |
| RU2441666C1 (en) | Complex antigen of measles virus used as a component of immunoenzymometric test system for diagnostics of antibodies to measles virus | |
| Parwez et al. | Comparative Analysis of Laboratory Diagnosis of Leptospirosis |