RU2537266C1 - Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s - Google Patents
Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s Download PDFInfo
- Publication number
- RU2537266C1 RU2537266C1 RU2014104463/10A RU2014104463A RU2537266C1 RU 2537266 C1 RU2537266 C1 RU 2537266C1 RU 2014104463/10 A RU2014104463/10 A RU 2014104463/10A RU 2014104463 A RU2014104463 A RU 2014104463A RU 2537266 C1 RU2537266 C1 RU 2537266C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- intended
- cells
- dna sequences
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title abstract description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 8
- 102000009270 Tumour necrosis factor alpha Human genes 0.000 title 1
- 108050000101 Tumour necrosis factor alpha Proteins 0.000 title 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims description 13
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 9
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 244000000009 viral human pathogen Species 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии, в частности к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии. Изобретение представляет собой оптимизированные последовательности ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепь моноклонального антитела, предназначенные для синтеза антитела в рекомбинантных CHO-S клетках, и способ получения данного антитела в указанных клетках. Изобретение позволяет максимизировать продуктивность клеток и оптимизировать пострансляционные модификаций антитела, в частности гликозилирования тяжелых цепей антитела. В результате проделанной работы были разработаны несколько условий, позволяющих получать моноклональное антитело с высокой продуктивностью. 3 н. п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.
Description
Изобретение относится к фармацевтической субстанции терапевтического моноклонального антитела, нейтрализующего активность ФНО-α человека. Представлены оптимизированная последовательность ДНК, способ биосинтеза антитела на основе рекомбинантной клеточной линии CHO-S с описанием важных параметров конечного продукта. Изобретение может быть использовано для создания фармацевтического препарата, применяемого при аутоиммунных заболеваниях, в частности ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита и др.
Антитела (иммуноглобулины) - класс биологических молекул, синтезируемых В-лимфоцитами иммунной системы. Они обладают свойством высокоспецифично связываться с чужеродными объектами, тем самым нейтрализуя и индуцируя их уничтожение клетками-киллерами. С развитием гибридомных клеточных технологий и молекулярно-биологических методов появилась возможность искусственно создавать и производить антитела, специфичные только к заданной молекулярной мишени (моноклональные антитела). В настоящее время это свойство моноклональных антител активно используется для лечения различных онкологических и аутоимунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания, среди которых доминирует ревматоидный артрит, представляет собой тяжелую социальную и экономическую проблему. Золотым стандартом лечения ревматоидного артрита является использование рекомбинантных препаратов на основе моноклональных антител к фактору некроза опухоли (ФНО). Блокирование моноклональными антителами связывания ФНО с иммунокомпетентными клетками обеспечивает противовоспалительный эффект таких лекарств и стойкую ремиссию у больных.
С целью промышленной продукции белков, имеющих фармацевтическое значение, в частности моноклональных антител, широко используются клетки СНО. Важным свойством клеток СНО для использования в клеточной биотехнологии является их широкая приспособляемость к разнообразным условиям культивирования и высокая генетическая пластичность, что позволяет с относительной легкостью проводить с данными клетками различные генетические манипуляции. Кроме того, эти клетки способны к росту при очень высокой клеточной плотности в больших крупногабаритных ферментерах объемом до 10 тыс. литров. Более того, клетки СНО соответствуют принципам биологической безопасности, поскольку подавляющее большинство патогенных вирусов человека, включая вирусы иммунодефицита, полиомиелита, гриппа и герпеса, неспособно в них размножаться.
Вышеупомянутые качества сделали клетки СНО главной клеточной культурой в мировой биотехнологии. В настоящее время около 70% рекомбинантных фармацевтических биопрепаратов производится именно на основе клеток СНО.
Уже существующий на рынке препарат на основе моноклонального антитела к ФНО-α человека моноклональное антитело (Ремикейд®) до сих производится в клеточной линии мышиной меланомы SP2/0, разработанной около 20 лет назад, в то время как разработанный штамм-продуцент моноклонального антитела к ФНО-α человека производится в CHO-S клетках, являющихся на сегодня «золотым стандартом» по соотношению эффективности и безопасности в производстве биофармацевтических препаратов, и позволяет минимизировать риски загрязнения продукта эндогенными вирусами и белками клетки-продуцента в процессе производства. Очевидно, переход на принципиально новую клеточную систему экспрессии требует создания и отработки каждой стадии нового технологического процесса - от культивирования до стадий финальной очистки и получения ГЛФ.
Для эффективной экспрессии требуется оптимизация последовательности ДНК целевого белка. Показано, что на эффективную экспрессию влияют такие факторы, как процент содержания G-пар, вторичная структура РНК, наличие внутренних сигналов сплайсинга, наличие коротких рамок считывания, длинных гомополимерных последовательностей, использование кодонов и пар кодонов с разной степенью встречаемости. Было показано, что для антител оптимизация последовательности ДНК может значительно повысить уровень экспрессии. Таким образом, последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи моноклонального антитела к ФНО, были оптимизированы для получения высокого уровня экспрессии.
Разработка клеточной линии-продуцента моноклонального антитела к ФНО-α человека включала в себя следующие этапы:
- оптимизация последовательностей ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепь антитела (фиг.1);
- создание двух экспрессионных конструкций, кодирующих тяжелую и легкую цепи рекомбинантного моноклонального антитела (фиг.2);
- проведение трансфекции клеток СНО полученными экспрессионными плазмидами;
- отбор клонов и создание клеточного банка штамма-продуцента.
Были сконструированы экспрессионные плазмиды v240 и v241, содержащие кДНК, кодирующие рекомбинантное моноклональное антитело к ФНО-α человека, под контролем цитомегаловирусного промотора. Экспрессионные плазмиды были синтезированы с использованием стандартных молекулярно-биологических методов.
Была проведена трансфекция клеточной линии CHO-S химическим методом. Успешно трансфецированные клетки были отобраны с применением антибиотиков: зеоцин и бластицидин. Для отбора клонов, имеющих максимальную продуктивность по антителу, был использован метод предельных (лимитирующих) разведений с последующей оценкой концентрации моноклонального антитела с помощью ИФА. Отобранные клоны амплифицировали в условиях нормального клеточного роста и создали клеточные банки.
Техническим результатом изобретения является максимизация продуктивности клеток и оптимизация пострансляционных модификаций антитела, в частности гликозилирования тяжелых цепей антитела. В результате проделанной работы были разработаны несколько условий, позволяющие получить моноклональное антитело с высокой продуктивностью и различным гликозилированием тяжелой цепи в зависимости от условий культивирования.
Примеры
В качестве основной среды для культивирования была выбрана среда ActiCHO P CD (GE Healthcare) с добавлением 6 мМ L-глутамин и 0,1% Pluronic F-68. В качестве добавок использованы UMG (300 мМ уридин, 1500 мМ галактоза, 0,6 mM MnCl2), ActiCHO FeedA CD (GE Healthcare) совместно с ActiCHO FeedB CD (GE Healthcare) (в объемном соотношении 10:1, добавляются по отдельности) глюкоза 250 г/л и FunctionMAX Titer Enhancer (Life Technologies). Разработанные схемы культивирования, описывающие порядок внесения различных компонентов, представлены в таблице 1. Клетки культивировали в шейкерных колбах на орбитальном шейкере при ~110 об/мин при 36,5°С, 5% CO2 в инкубаторе. Для культивирования использовали клетки, депонированные во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Н-145.
| Таблица 1 | |||||||||||||
| Схема внесения компонентов при культивировании | |||||||||||||
| Компоненты | День | ||||||||||||
| 0 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |
| ActiCHO Feed-A+B | 1,76% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% | 1,7 6% |
| FM | 3,5% | 3,5% | 3,5% | 3,5% | |||||||||
| UMG | 4х | 4х | 4х | 4х | 4х | 4х | |||||||
Было экспериментально выяснено, что добавление NaCl до концентрации 0,5 М и 1М увеличивает выход целевого антитела после первой стадии аффинной очистки. В качестве аффинного сорбента использовали Mab Select (GE Healthcare). Для оптимизации условий использовали 5 мл сорбента. Перед нанесением образцов колонну уравновешивали 4-5 объемами (относительно объема колонны) буфера Mab 1 (20 mM PhNa, 0,5 М NaCl, pH 7,0). Элюцию с колонны осуществляют 4-5 объемами буфера Mab 2 (100 mM Gly-HCl, pH 3,5). Выход оценивали по количеству белка, измеренным спектрофотометрически, после элюции. Было доказано, что внесение хлорида натрия перед стадией аффинной хроматографии в концентрации 0,5М и 1М увеличивает выход антитела (таблица 2). Было решено добавлять хлорид натрия к культуральной жидкости в концентрации 0,5М непосредственно до стадии фильтрации культуральной жидкости.
| Таблица 2 | |
| Выход антитела к ФНО-α с MabSelect в зависимости от концентрации хлорида натрия в культуральной жидкости | |
| Концентрация NaCl в культуральной жидкости, М | Емкость сорбента MabSelect, мг/мл |
| 0 | 17,7 |
| 0,5 | 26,28 |
| 1 | 26,3 |
Перед очисткой антитела культуральную жидкость размораживают, добавляют NaCl до конечной концентрации 0,5М и фильтруют. Первую стадию очистки проводят при температуре 2-8°С. Условия очистки такие же, как и описаны выше с учетом большего объема сорбента. В процессе элюции белковый раствор титруют до значений рН 5,5±0,2 раствором 1 М Трис-HCl рН 8,0. Вторую стадию очистки моноклонального антитела проводят на сорбенте Fractogel SO3 (Merck) при температуре 2-8°С. Колонну уравновешивают буфером Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5). Раствор моноклонального антитела разводят уравновешивающим буфером Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5) до значения проводимости не выше 5 mS/cm (кратность разведения 3-4 раза), доводят рН до значения 5,5±0,2 0,25 М уксусной кислотой, наносят на колонну. Колонну промывают 300 мл буфера Frac 1. Элюцию с колонны осуществляют ступенчатым градиентом 20% буфера Frac 2 (20 mM NaAc, 1 М NaCl, рН 5,5) в буфере Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5). Начиная с оптической плотности 10 mAU (UV 280 нм), собирают фракции и анализируют методом ГФ-ВЭЖХ. По результатам анализа объединяют фракции с чистотой 98,5% и выше. Полученный раствор белка фильтруют через насадку фильтрующую на флакон Стеритоп 0,22 мкм. Затем раствор антитела концентрируют, используя мембраны для тангенциальной фильтрации с пределом отсечения 50 кДа, уравновешенную буфером ГЛФ (5 mM натрия гидрофосфат, 1,6 mM натрия дигидрофосфат, 142 mM сахарозы, 0,05% полисорбат-80). Далее раствор подвергается последней стадии - гель-фильтрующей хроматографии на сорбенте Sephadex G25 (GE Healthcare). Процесс проводят при температуре 2-8°С. На колонну, предварительно уравновешенную буфером ГЛФ, наносили раствор моноклонального антитела, элюцию с колонны проводили в буфере ГЛФ объемом. Полученный раствор антитела фильтруют через фильтр на 0,2 мкм и при -20°С.
Выявлен состав стабильной фармацевтической композиции в виде лифилизата, куда входят, мг: разработанное антитело против ФНО-α человека - 100; натрия гидрофосфат дигидрат - 6,1; натрия дигидрофосфат моногидрат - 2,2; сахароза - 500 и полисорбат - 80-0,5. Для получения данной композиции были использованы следующие условия сушки:
Замораживание - 2 часа при -30 - -40°С,
Сублимация при -20°С, 6 часа, 70-110 мТорр,
Ступенчатый переход на десорбцию - от -20 до +25°С в течение 2 часов при 70-110 мТорр,
Десорбция при +25°С, 5 часов, 70-110 мТорр.
Для оценки биологической активности были проведены in vitro и in vivo исследования. В частности, был проведен ряд исследований для комплексной оценки связывания антитела с антигеном: методом ИФА было изучено связывание с человеческим ФНО-α в растворимой мономерной и тримерной формах, методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток было изучено связывание с трансмембранным нерастворимым ФНО-α на поверхности клеток и, более того, с помощью метода поверхностного плазменного резонанса были определены константы диссоциации (для комплекса антитела с мономерной и тримерной формой ФНО-α). Для оценки биологической активности было проведено исследование нейтрализующей активности по отношению к WEHI-164. Результаты представлены в таблице 3. Данные подтверждают наличие биологической активности полученного антитела in vitro.
| Таблица 3 | ||
| Результаты оценки биологической активности in vitro моноклонального антитела к ФНО-α человека | ||
| Исследование | Значение | Стандартное отклонение |
| Связывание с растворимым ФНО-а человека в мономерной форме, ЕС50 (нМ) | 0.1335 | 0.0262 |
| Связывание с растворимым ФНО-а человека в гомотримерной форме, ЕС50 (нМ) | 0.0251 | 0.0037 |
| Связывание с трансмембранным ФНО-а человека, ЕС50 (нМ) | 5.632 | 0.5928 |
| Нейтрализующая активность по отношению к клеткам WEHI-164, ЕС50 (нМ) | 0.4854 | 0.0888 |
Эффективность разработанного моноклонального антитела к ФНО-α человека была доказана in vivo на трансгенных мышах Tg197 с гиперэкспрессией ФНО-α человека, приводящей к развитию полиартрита, начиная с 3-4-й недели жизни животного. Была проведена оценка терапевтической эффективности разработанного антитела в предотвращении проявления симптомов артрита у генетически модифицированных мышей Tg197. Для проведения данного исследования мыши (12 мышей в каждой группе, равное количество самцов и самок) получали исследуемое антитело болюсно, однократно (в дозировках 10 мг/кг и 30 мг/кг), внутрибрюшинно на четвертой неделе жизни после появления проявлений артрита, но до развития данных проявлений, а затем проводили оценку состояния данных мышей в возрасте более 5 недель до достижения 9-й недели жизни. Как показали результаты исследования, лечение исследуемым препаратом при дозировке 10 мг/кг оказывало подавляющее действие на развитие проявления полиартрита, однако не обеспечивало полную защиту от развития данного заболевания. В случае дозировки 30 мг/кг исследуемый препарат оказывал подавляющее действие на развитие проявления полиартрита и сохранял их статистически единообразными по сравнению с мышами в возрасте 3 недель из контрольной группы, не получавших препарат. В таблицах 4-6 приведены данные исследования эффективности разрабатываемого препарата на мышах Tg197.
| Таблица 4 | ||||||
| Средняя масса тела в группе | ||||||
| Средняя масса тела (г) | Неделя 4 | Неделя 5 | Неделя 6 | Неделя 7 | Неделя 8 | Неделя 9 |
| Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат | 10,93 | - | - | - | - | - |
| G1-PRM-002 10 мг/кг | 12,24 | 15,28 | 16,62 | 17,36 | 18,02 | 18,88 |
| G2-PRM-002 30 мг/кг | 12,27 | 15,75 | 17,51 | 18,21 | 19,78 | 20,86 |
| G3-физиологический | 12,26 | 14,34 | 15,23 | 15,58 | 15,71 | 16,40 |
| Таблица 5 | ||||||
| Средняя оценка артрита, in-vivo | ||||||
| Средняя оценка артрита в условиях in-vivo | Неделя 4 | Неделя 5 | Неделя 6 | Неделя 7 | Неделя 8 | Неделя 9 |
| Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат | 0,38 | - | - | - | - | - |
| G1-PRM-002 10 мг/кг | 0,40 | 0,43 | 0,66 | 0,71 | 0,82 | 0,91 |
| G2-PRM-002 30 мг/кг | 0,38 | 0,28 | 0,36 | 0,32 | 0,35 | 0,45 |
| G3-физиологический раствор | 0,29 | 0,70 | 0,88 | 0,99 | 1,27 | 1,25 |
| Таблица 6 | ||
| Средняя гистопатологическая оценка уровня развития артрита, ех-vivo | ||
| Средняя гистопатологическая оценка уровня развития артрита | Неделя 4 | Неделя 9 |
| Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат | 1,50 | - |
| G1-PRM-002 10 мг/кг | - | 2,83 |
| G2-PRM-002 30 мг/кг | - | 1,42 |
| G3-физиологический раствор | - | 3,27 |
Claims (3)
1. ДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела, связывающего человеческий ФНО-α, представленная SEQ ID:1 и предназначенная для синтеза данного антитела в рекомбинантных CHO-S клетках.
2. ДНК, кодирующая легкую цепь антитела, связывающего человеческий ФНО-α, представленная SEQ ID:2 и предназначенная для синтеза данного антитела в рекомбинантных CHO-S клетках.
3. Способ получения моноклонального антитела, связывающего человеческий ФНО-α, включающий введение ДНК по пп.1 и 2 в рекомбинантные CHO-S клетки, их культивирование и последующую очистку антитела к ФНО-α.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014104463/10A RU2537266C1 (ru) | 2014-02-10 | 2014-02-10 | Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014104463/10A RU2537266C1 (ru) | 2014-02-10 | 2014-02-10 | Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2537266C1 true RU2537266C1 (ru) | 2014-12-27 |
Family
ID=53287643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014104463/10A RU2537266C1 (ru) | 2014-02-10 | 2014-02-10 | Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2537266C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008144753A3 (en) * | 2007-05-21 | 2009-01-29 | Alder Biopharmaceuticals Inc | Antibodies to tnf alpha and use thereof |
| RU2416645C2 (ru) * | 2009-05-04 | 2011-04-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Промоген-МАТ" | Одноцепочечное антитело, связывающее фактор некроза опухоли альфа, днк, плазмидная днк и способ получения одноцепочечного антитела |
-
2014
- 2014-02-10 RU RU2014104463/10A patent/RU2537266C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008144753A3 (en) * | 2007-05-21 | 2009-01-29 | Alder Biopharmaceuticals Inc | Antibodies to tnf alpha and use thereof |
| RU2416645C2 (ru) * | 2009-05-04 | 2011-04-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Промоген-МАТ" | Одноцепочечное антитело, связывающее фактор некроза опухоли альфа, днк, плазмидная днк и способ получения одноцепочечного антитела |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2023201588B2 (en) | Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same | |
| JP6055615B2 (ja) | Ｄａｃｈｙｐ組成物および方法 | |
| EP2540743B1 (en) | Fully human anti-tnf-alpha monoclonal antibody, preparation method and use thereof | |
| JP2017532014A (ja) | 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体 | |
| CN114375307B (zh) | 产生抗α4β7抗体的方法 | |
| CN106795548A (zh) | 在相同的真核细胞产生宿主中发现和产生条件活性生物蛋白 | |
| CN113912728B (zh) | 降低抗人白介素-33单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法 | |
| US20160340422A1 (en) | Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof | |
| CN114014929A (zh) | 一种抗人白介素-33单克隆抗体浓缩溶液的制备方法 | |
| CN114028562B (zh) | 包含抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)单克隆抗体的液体制剂 | |
| CN113842457B (zh) | 包含抗人白介素-33单克隆抗体的液体制剂 | |
| RU2537266C1 (ru) | Оптимизированные последовательности днк, кодирующие легкую и тяжелую цепи моноклонального антитела, связывающего фактор некроза опухоли альфа, предназначенные для биосинтеза антитела, способ получения антитела посредством рекомбинантной клеточной линии cho-s | |
| CN104911195A (zh) | 一种修饰的抗狂犬病病毒HEP-Flury株M蛋白及其单克隆抗体的制备和应用 | |
| CN105504057A (zh) | 抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用 | |
| WO2011085574A1 (zh) | 全人TNFα单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| WO2022041390A1 (zh) | 包含高浓度抗人白介素23单克隆抗体的低粘度液体制剂及其制备方法 | |
| EP4635988A1 (en) | Bispecific fusion protein targeting tnf-? and il-17a, and use thereof | |
| WO2023077685A1 (zh) | 包含抗人白介素-33单克隆抗体的浓缩溶液的制备方法及液体制剂 | |
| CN120641443A (zh) | 特异性结合tnf-样配体1a（tl1a）的单克隆抗体或其抗原结合片段及其用途 | |
| WO2012009977A1 (zh) | 全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体 | |
| Borges | 6.1 Approved treatments 6.1. 1 Efficacy | |
| BR122024024316A2 (pt) | Métodos para produzir uma seringa pré-cheia, para preparação de uma seringa pré-cheia compreendendo aflibercepte e para preparação de uma seringa autoinjetora pré-cheia compreendendo aflibercepte | |
| WO2016103139A1 (en) | Method for reduction of aggregates | |
| WO2023094507A1 (en) | Improved ace2 fusion proteins | |
| CN119264256A (zh) | 一种单克隆抗体的纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20161115 |
|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -QB4A- IN JOURNAL: 33-2016 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20161115 Effective date: 20171003 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181023 Effective date: 20181023 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190211 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20191105 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181023 Effective date: 20210726 |