RU2535063C1

RU2535063C1 - KIT OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR IDENTIFYING SPECIES OF COTTON WEED (Filaginella uliginosa (L) Opiz)

Info

Publication number: RU2535063C1
Application number: RU2013125172/15A
Authority: RU
Inventors: Максим Геннадьевич Куцев; Ольга Васильевна Уварова; Татьяна Александровна Синицина
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2014-12-10

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: invention refers to molecular genetics, genetic classification and pharmacognosy and aims at identifying a species of cotton weed (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). What is presented is a kit of synthetic oligonucleotides for PCR with ITS2 fragment of a nuclear DNA comprising upstream and downstream primers and a degradable probe.

EFFECT: kit possesses high sensitivity and specificity, and enables fast and reliable identification of a medicinal herb.

1 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). Изобретение может быть использовано для выявления видовой принадлежности данного растения; в ходе проведения скрининга растительного сырья, для контроля на соответствие состава, декларированного производителем.The invention relates to the field of molecular genetics, genosystematics and pharmacognosy. The use of a set of synthetic oligonucleotides allows one to reliably identify the species belonging to a medicinal plant - marsh cinnamon (Filaginella uliginosa (L.) Opiz). The invention can be used to identify the species of this plant; during the screening of plant materials, to control the compliance of the composition declared by the manufacturer.

Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида растений в образце в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени, и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля. При проведении анализа методов детекции продукта полимеразной цепной реакции выбран метод на основе разрушаемого зонда, так как он относится к специфичным методам детекции, возможно свободное использование без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).Among a large number of genetic diagnostic methods in order to identify the presence of DNA of a plant species of interest in a sample, the PCR format with real-time detection based on a destructible probe was adopted as the basis of our invention. Real-time PCR has an advantage over conventional PCR identification systems - there is no need for further analysis, which minimizes the risk of contamination in the laboratory. Hypersensitivity and the absence of a false positive result with non-specific annealing of primers are also characteristic. In addition, it should be noted that virtually all molecular genetic diagnostic laboratories are equipped with the equipment necessary for real-time PCR and the widespread use of the method in clinical diagnostics and state control bodies. When analyzing the methods for detecting the product of the polymerase chain reaction, a method based on a destructible probe was chosen, since it relates to specific detection methods, free use is possible without violating copyright and related rights (initially, the system of destructible probe was proposed in 1991, with all patents for this moment ended their action).

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей ядерной ДНК растений. В качестве видоспецифичных участков нами используется ITS2 фрагмент ядерной ДНК (internal transcribed spacer 2), обладающий большой копийностью в геноме [Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434] и используемый в проектировании системы ДНК-баркодинга. В этом регионе показана высокая вариабельность и потенциальная применимость в качестве маркерного участка [Stoeckle, М. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53, 2-3].The technical result of the claimed invention is the development of primers and destructible probes based on data of species-specific nucleotide sequences of plant nuclear DNA. As species-specific sites, we use the ITS2 fragment of nuclear DNA (internal transcribed spacer 2), which has a high copy number in the genome [Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434] and used in the design of a DNA barcoding system. This region shows high variability and potential applicability as a marker site [Stoeckle, M. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53, 2-3].

Прототип - рассмотрим идентификацию лекарственных растений с использованием фрагмента ITS2, амплифицированного специфичными праймерами [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers//Planta Med. 2007, Oct; 73(13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. В прототипе используются специфичные наборы праймеров BEL-1/BEL-3 и BEL-2/BEL-3 для амплификации ITS2 участка рДНК 55 лекарственных растений.Prototype - consider the identification of medicinal plants using the ITS2 fragment amplified with specific primers [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers // Planta Med. 2007, Oct; 73 (13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. The prototype uses specific sets of primers BEL-1 / BEL-3 and BEL-2 / BEL-3 to amplify the ITS2 region of the 55 rDNA of 55 medicinal plants.

Принципиальные отличия прототипа от заявленного изобретения следующие: идентифицируется лекарственное растение с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров, отличных от заявленных. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, для идентификации данного растения используют специфичные прямой, обратный праймеры и разрушаемый зонд.The fundamental differences of the prototype from the claimed invention are as follows: a medicinal plant with nucleotide sequences of specific primers other than those declared is identified. A set of synthetic oligonucleotides for identifying the species of a medicinal plant - bog dried marsh (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), including a polymerase chain reaction with a fragment of ITS2 nuclear DNA, specific direct, reverse primers and a destructible probe are used to identify this plant.

Работа над созданием праймеров строится следующим образом. 1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов растений либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности растений выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.Work on the creation of primers is constructed as follows. 1) Using open and commercial databases of nucleotide sequences of various plant species or as a result of independent determination of the nucleotide sequence of plants, a portion of the genome that is found in all species is selected.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для растений участков.2) Based on the selected region of the genome, using the special software or manually selects the sequence of oligonucleotides used for the PCR reaction (2 primers and probe). At this stage, the work consists in creating the alignment of many sequences and selecting a portion of the sequence where differences are present to create forward, reverse primers and probe. Alignment of genomic sequences means comparing the sequences of many species with each other, searching for sites homologous to plants.

3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.3) The manufacture of primers and probe is made on automatic synthesizers.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.4) Using practical experiments, the suitability of the selected sequences for specific purposes is proved.

Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности ITS2 на основании данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland Р М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.//Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 August 15; 88(16): 7276-7280).Analysis of the nucleotide polymorphism of the ITS2 sequence based on the NCBI data (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and de novo sequenced sequences of species that are not located in the genebank allows us to use these sequences as the basis for creating primers. For the detection of the accumulation of the PCR product during the reaction, a destructible probe technology is used (Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3 'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase .//Proc Natl Acad Sci US A. 1991 August 15; 88 (16): 7276-7280).

В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя - BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей и это не является предметом охраны авторских прав).For example, FAM is used as a fluorescent label, BHQ1 as a quencher (other combinations of fluorophores and quenchers are possible and this is not subject to copyright).

Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) не известны.Similar kits, reaction mixtures, primers for amplification and identification of the species of bogwort (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) are not known.

Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.The progress using a set of synthetic oligonucleotides for amplification consists of the following steps.

Пример:Example:

1) Растительный материал перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из растительного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.1) Plant material before PCR using the inventive kit is carried out through a sample preparation procedure using the Diamont DNA kit, in accordance with the manufacturer's instructions; during this procedure, DNA is extracted from the plant material, which in turn is used for PCR.

2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 3 мин; 40 циклов: 95°С - 10 сек, 58°С - 30 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь, конечным объемом 25 мкл, содержит: 14,1 мкл Н₂O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgC₁₂; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции, рис.1.2) The polymerase chain reaction is carried out on a CFX96 thermocycler (Bio-Rad, USA). Amplification is carried out according to the following program: 1 cycle: 95 ° C - 3 min; 40 cycles: 95 ° С - 10 sec, 58 ° С - 30 sec (at this stage, the fluorescence level is scanned). The incubation mixture, with a final volume of 25 μl, contains: 14.1 μl of H ₂ O; 2 μl of DNA; 2.5 μl of 10X buffer; 2.5 μl 25 mM MgC ₁₂ ; 1 μl of 10 mm each primer; 0.5 μl of probe; 1.2 μl of 20 mM dNTPs; 0.2 μl of Taq polymerase. The amplification result is determined by the increase in the fluorescence level, Fig. 1.

Для выявления сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-СAACGGATATCTCGGCTCАС-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GTACGACTCAAGACGCACAA-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3'-(гаситель).To identify swamp dried marsh (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), a DNA sequence with the following nucleotide composition is used as a direct primer: 5'-SAACGGATATCTCGGCTCAC-3 ', a DNA sequence with the following nucleotide composition: 5'-GTACGACTCAAGACGCACA- is used as a reverse primer 3 ', a DNA sequence with the following nucleotide composition is used as a probe to be destroyed: (fluorescent label) -5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3' - (quencher).

Гаситель располагается на 5'-конце, а флуоресцентная метка на 3'-конце разрушаемых зондов.The quencher is located at the 5'-end, and the fluorescent label at the 3'-end of the destroyed probes.

Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - сушеницы болотной (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) методом полимеразной цепной реакцией с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренного лекарственного растения.A set of synthetic oligonucleotides has been developed for identifying the species of a medicinal plant - bog dried marsh (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) by polymerase chain reaction with real-time detection. The set has high sensitivity and specificity, allows you to quickly and reliably identify the considered medicinal plants.

Claims

A set of synthetic oligonucleotides for identifying the species of bogwort (Filaginella uliginosa (L.) Opiz), including a polymerase chain reaction with a fragment of ITS2 nuclear DNA, characterized in that species-specific sites are used to identify the direct, reverse primers and destructible probe, where as a direct primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition: 5'-CAACGGATATCTCGGCTCAC-3 '; reverse primer is a DNA sequence with the following nucleotide composition: 5'-GTACGACTC AAGACGC ASAA-3 '; destructible probe is a DNA sequence with the following nucleotide composition: (fluorescent label) -5'-CCGTGAACC ATCGAGTTTTT-3 '- (quencher).