RU2532843C2 - Diagnostic technique for influenza c - Google Patents
Diagnostic technique for influenza c Download PDFInfo
- Publication number
- RU2532843C2 RU2532843C2 RU2012145063/10A RU2012145063A RU2532843C2 RU 2532843 C2 RU2532843 C2 RU 2532843C2 RU 2012145063/10 A RU2012145063/10 A RU 2012145063/10A RU 2012145063 A RU2012145063 A RU 2012145063A RU 2532843 C2 RU2532843 C2 RU 2532843C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- influenza
- virus
- viruses
- sugawara
- hongo
- Prior art date
Links
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 title description 7
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 34
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 claims description 25
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 abstract description 98
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 21
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 13
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 12
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 101710169453 Hemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein Proteins 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 241001500343 Influenzavirus C Species 0.000 description 7
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике гриппа С, и может быть использовано для выявления РНК вируса гриппа С в биологических образцах.The present invention relates to medicine, in particular to the diagnosis of influenza C, and can be used to detect RNA of influenza C virus in biological samples.
Уровень техникиState of the art
В настоящее время проводятся интенсивные исследования вирусов гриппа, в том числе вируса гриппа С, вызывающего разнообразные заболевания верхних и нижних дыхательных путей как человека, так и животных. Несмотря на полученные данные о генетике, эволюции, распространении в популяциях человека и животных, сведения об эпидемиологии вируса гриппа С остаются недостаточными. В частности, информации о случаях заболевания, вызванных этим вирусом в России у человека, практически не имеется, также она полностью отсутствует для животных. Отчасти это связано с тем, что для проведения подобных работ используются методики, сложные для исполнения или недостаточно хорошо и быстро выявляющие возбудителя. В связи с этим является актуальной разработка эффективных методов тестирования биологических образцов и мониторинг состояния популяций как людей, так и животных на предмет выявления в них вируса гриппа С.Intensive studies of influenza viruses, including influenza C virus, which causes a variety of diseases of the upper and lower respiratory tracts of both humans and animals, are currently underway. Despite the data on genetics, evolution, distribution in human and animal populations, information on the epidemiology of influenza C virus remains insufficient. In particular, information on cases of the disease caused by this virus in Russia in humans is practically not available, and it is also completely absent for animals. This is partly due to the fact that, for carrying out such work, techniques are used that are difficult to perform or that are not good enough and quickly detecting the pathogen. In this regard, it is urgent to develop effective methods for testing biological samples and monitor the status of populations of both humans and animals for the detection of influenza C virus.
Высокая скорость эволюции вирусов гриппа наряду с их быстрым распространением по всему миру и способностью образовывать реассортанты создают предпосылки для возникновения новых антигенных вариантов и связанных с этим новых вспышек заболевания. Поэтому крайне важным и существенным этапом является раннее распознавание случаев инфицирования, в частности, вируса гриппа С. В связи с этим весьма востребованными являются средства быстрой и надежной диагностики данного возбудителя. Представляется также важным получить возможность осуществлять типирование и идентификацию конкретной разновидности вируса, поскольку это является основой для поиска генетических изменений, являющихся маркерами высокой вирулентности, что может быть связано с тяжестью течения заболевания. Необходимо разработать тест-системы, с помощью которых можно будет проводить постоянный мониторинг в популяциях как человека, так и животных (в хозяйствах, занимающихся разведением свиней, а также в ветеринарных клиниках у собак), с целью детекции возбудителя и выявления новых генетических изменений в геноме этого быстро видоизменяющегося вируса.The high rate of evolution of influenza viruses along with their rapid spread around the world and the ability to form reassortants create the prerequisites for the emergence of new antigenic variants and the associated new outbreaks of the disease. Therefore, an extremely important and essential step is the early recognition of cases of infection, in particular, the influenza C virus. In this regard, means of quick and reliable diagnosis of this pathogen are very popular. It is also important to be able to type and identify a specific type of virus, since this is the basis for the search for genetic changes that are markers of high virulence, which may be associated with the severity of the disease. It is necessary to develop test systems with which it will be possible to conduct continuous monitoring in populations of both humans and animals (in pig breeding farms, as well as in veterinary clinics in dogs), in order to detect the pathogen and identify new genetic changes in the genome this rapidly changing virus.
До настоящего времени не были разработаны экспресс тест-системы, основанные на использовании метода ПЦР в режиме реального времени, пригодные для идентификации вируса гриппа С. Подобные разработки имеются только для гриппов А и В. Проведение такого рода исследований и разработка основанных на них методик соответствует современному уровню мировых стандартов.To date, express test systems based on the real-time PCR method suitable for the identification of influenza C virus have not been developed. Such developments are available only for influenza A and B. Such studies and the development of methods based on them are in line with modern level of world standards.
Предварительные исследования, проведенные в столице Российской Федерации, показали, что в отдельные периоды года вирус гриппа С с достаточно высокой частотой (до 18%) выявлялся у больных с симптомами ОРЗ. Таким образом, создание способа быстрой идентификации данного возбудителя может представлять собой существенную помощь для медиков, поскольку разрабатываемый набор реагентов на основе ПЦР в режиме реального времени может применяться в медицинских учреждениях и ветеринарных клиниках для идентификации вируса гриппа С у пациентов с симптомами ОРВИ, бронхитов и пневмоний и для мониторинга распространения данного гриппа в хозяйствах, занимающихся разведением свиней, а также в ветеринарных клиниках у собак.Preliminary studies conducted in the capital of the Russian Federation showed that in certain periods of the year, influenza C virus was detected with a rather high frequency (up to 18%) in patients with symptoms of acute respiratory infections. Thus, the creation of a method for the rapid identification of this pathogen can be a significant help for physicians, since the developed set of reagents based on real-time PCR can be used in medical institutions and veterinary clinics to identify the influenza C virus in patients with symptoms of acute respiratory viral infections, bronchitis and pneumonia. and to monitor the spread of this flu in pig breeding farms, as well as in veterinary clinics in dogs.
Известно, что РНК вирусы быстро эволюционируют, что связано с высокой скоростью мутаций, воспроизводства, коротким репликативным периодом и значительным размером популяций [Domingo E, Holland JJ. 1997. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178]. Источником генетического разнообразия в РНК вирусах, помимо мутаций, являются также процессы реассортации и рекомбинации. Первый, реассортация, встречается только в вирусах, чей геном разделен на несколько частей и представляет собой обмен одной или несколькими дискретными частями молекул РНК, на которые сегментирован вирусный геном. Второй, рекомбинация, встречается как среди вирусов с сегментированным, так и несегментированным геномом [Worobey M, Holmes EC. 1999. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J Gen Virol. 80 (Pt 10), 2535-2543]. Четких доказательств существования рекомбинационных процессов в геноме вируса гриппа С получено не было. Анализ типов вариабельности среди последовательностей генов свидетельствует о том, что, скорее всего, эти процессы имеют место быть, однако есть исследования, в которых не было найдено сигналов, свидетельствующих о существовании процессов рекомбинации среди вируса гриппа С [Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza С virus evolution. Virol J. 7, 227]. Причины, вызывающие снижение уровня рекомбинации в минус-нитевых вирусах остаются невыясненными [Chare ER, Gould EA, Holmes EC. 2003. Phylogenetic analysis reveals a low rate of homologous recombination in negative-sense RNA viruses. J Gen Virol. 84, 2691-2703; Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza С virus evolution. Virol J. 7, 227]. В любом случае, с учетом данных, полученных при исследовании вирусов грипп А и В, можно утверждать, что гомологичная рекомбинация оказывает минимальный эффект на эволюцию вирусов гриппа.RNA viruses are known to evolve rapidly, which is associated with a high rate of mutations, reproduction, a short replicative period, and a significant population size [Domingo E, Holland JJ. 1997. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178]. The source of genetic diversity in RNA viruses, in addition to mutations, are also reassortment and recombination processes. The first, reassortment, is found only in viruses whose genome is divided into several parts and represents the exchange of one or more discrete parts of RNA molecules into which the viral genome is segmented. The second, recombination, is found among viruses with a segmented and non-segmented genome [Worobey M, Holmes EC. 1999. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J Gen Virol. 80 (Pt 10), 2535-2543]. Clear evidence of the existence of recombination processes in the genome of influenza C virus has not been obtained. An analysis of the types of variability among gene sequences indicates that these processes are most likely to occur, however, there are studies in which no signals have been found indicating the existence of recombination processes among influenza C virus [Han GZ, Boni MF, Li SS . 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza C virus evolution. Virol J. 7,227]. The reasons for the decrease in the level of recombination in negative strand viruses remain unclear [Chare ER, Gould EA, Holmes EC. 2003. Phylogenetic analysis reveals a low rate of homologous recombination in negative-sense RNA viruses. J Gen Virol. 84, 2691-2703; Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza C virus evolution. Virol J. 7,227]. In any case, taking into account the data obtained in the study of influenza A and B viruses, it can be argued that homologous recombination has a minimal effect on the evolution of influenza viruses.
Существует устойчивое мнение, что в природе одновременно имеется несколько коциркулирующих штаммов вируса гриппа С, что является основой для появления реассортантов [Ohyama S, Adachi К, Sugawara К, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1992. Antigenic and genetic analyses of eight influenza С strains isolated in various areas of Japan during 1985-9. Epidemiol Infect. 108, 353-365; Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940]. Примеры коциркуляции штаммов этого вируса приведены в работах [Kawamura H, Tashiro M, Kitame F, Homma M, Nakamura К. 1986. Genetic variation among human strains of influenza С virus isolated in Japan. Virus Res. 4, 275-288; Matsuzaki Y, Muraki Y, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Katsushima N, Numazaki Y, Nakamura K. 1994. Cocirculation of two distinct groups of influenza С virus in Yamagata City, Japan. Virology. 202, 796-802; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881]. Показано, что реассортаты между различными штаммами вируса гриппа С с высокой частотой образуются в условиях in vitro [Peng G, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1994. Genetic reassortment of influenza С viruses in man. J Gen Virol. 75 (Pt 12), 3619-3622], ряд наблюдений позволяет утверждать, что реассортанты между различными типами вируса гриппа С часто встречаются в природе [Peng G, Hongo S, Kimura H, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Numazaki Y, Suzuki H, Nakamura K. 1996. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza С virus strains in nature. J. Gen. Virol. 77, 1489-1492; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881; Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza С virus evolution. Virol J. 7, 227]. Были получены доказательства того, что ряд штаммов являются натуральными природными реассортантами [Peng G, Hongo S, Muraki Y, Sugawara К, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1994. Genetic reassortment of influenza С viruses in man. J Gen Virol. 75 (Pt 12), 3619-3622; Peng G, Hongo S, Kimura H, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Numazaki Y, Suzuki H, Nakamura K. 1996. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza С virus strains in nature. J. Gen. Virol. 77, 1489-1492; Tada Y, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1997. Evolutionary analysis of influenza С virus M genes. Virus Genes. 15, 53-59; Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimwa H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881]. Хотя вирусы гриппов А, В и С имеют общих предков, реассортанты между этими вирусами не наблюдаются. Однако искусственным путем были получены вирусы гриппа А, в которых экспрессируется гликопротеин вируса гриппа С HEF взамен собственных НА и NA [Gao Q, Brydon EW, Palese P. 2008. A seven-segmented influenza A virus expressing the influenza С virus glycoprotein HEF. J Virol. 82, 6419-6426].There is a strong belief that in nature there are several co-circulating strains of the influenza C virus, which is the basis for the appearance of reassortants [Ohyama S, Adachi K, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1992. Antigenic and genetic analyses of eight influenza C strains isolated in various areas of Japan during 1985-9. Epidemiol Infect. 108, 353-365; Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza C virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940]. Examples of co-circulation of strains of this virus are given in [Kawamura H, Tashiro M, Kitame F, Homma M, Nakamura K. 1986. Genetic variation among human strains of influenza C virus isolated in Japan. Virus Res. 4, 275-288; Matsuzaki Y, Muraki Y, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Katsushima N, Numazaki Y, Nakamura K. 1994. Cocirculation of two distinct groups of influenza C virus in Yamagata City, Japan. Virology. 202, 796-802; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza C viruses. Virol. 871-881]. It has been shown that reassortates between different strains of influenza C virus with high frequency are formed in vitro [Peng G, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1994. Genetic reassortment of influenza C viruses in man . J Gen Virol. 75 (Pt 12), 3619-3622], a number of observations suggest that reassortants between different types of influenza C virus are often found in nature [Peng G, Hongo S, Kimura H, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Numazaki Y, Suzuki H, Nakamura K. 1996. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza C virus strains in nature. J. Gen. Virol. 77, 1489-1492; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza C viruses. Virol. 871-881; Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza C virus evolution. Virol J. 7,227]. Evidence has been obtained that a number of strains are natural natural reassortants [Peng G, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1994. Genetic reassortment of influenza C viruses in man. J Gen Virol. 75 (Pt 12), 3619-3622; Peng G, Hongo S, Kimura H, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Numazaki Y, Suzuki H, Nakamura K. 1996. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza C virus strains in nature. J. Gen. Virol. 77, 1489-1492; Tada Y, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1997. Evolutionary analysis of influenza C virus M genes. Virus Genes. 15, 53-59; Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza C virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza C viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimwa H. 2003. Frequent reassortment among influenza C viruses. Virol. 871-881]. Although influenza A, B, and C viruses share common ancestors, reassortants between these viruses are not observed. However, influenza A viruses were artificially produced in which the influenza C glycoprotein HEF is expressed in place of its own HA and NA [Gao Q, Brydon EW, Palese P. 2008. A seven-segmented influenza A virus expressing the influenza C virus glycoprotein HEF. J Virol. 82, 6419-6426].
Проводились работы по филогении генов вируса гриппа С. В настоящее время на основании сравнения последовательностей генов HEF выделяют 6 генетических или антигенных групп (линий) вируса гриппа С [Muraki Y, Hongo S, Sugawara К, Kitame F, Nakamura К. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza С virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881].Work has been done on the phylogeny of influenza C virus genes. Currently, based on a comparison of HEF gene sequences, 6 genetic or antigenic groups (lines) of influenza C virus are isolated [Muraki Y, Hongo S, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza C virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza C viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza C viruses. Virol. 871-881].
Секвенирование с последующим филогенетическим анализом последовательностей М также показало эволюцию вирусов в три независимых линии [Tada Y, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1997. Evolutionary analysis of influenza С virus M genes. Virus Genes. 15, 53-59]. Для генов РВ2, PB1, Р3 и NP было выделено от трех-четырех до пяти-шести независимых линий [Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881]. Филогенетический анализ генов NS показал, что эти гены подразделяются на две достаточно близкие группы А и В [Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940].Sequencing followed by phylogenetic analysis of M sequences also showed the evolution of viruses in three independent lines [Tada Y, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1997. Evolutionary analysis of influenza C virus M genes. Virus Genes. 15, 53-59]. Three to four to five to six independent lines were identified for the PB2, PB1, P3, and NP genes [Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza C virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza C viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza C viruses. Virol. 871-881]. Phylogenetic analysis of NS genes showed that these genes are divided into two fairly close groups A and B [Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza C virus nonstructural ( NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940].
Существуют статьи, в которых оценивалась скорость эволюции различных генов вируса гриппа С. Так, скорость эволюции гена гемагглютининэстеразы вируса гриппа С меньше, чем скорость эволюции гена гемагглютинина вируса гриппа А, примерно в 1/9 [Muraki Y, Hongo S, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza С virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679]. Скорость накопления замен в вирусе гриппа В имеет такой же порядок величины, как и для гриппа С [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].There are articles evaluating the evolution rate of various genes of influenza C virus. Thus, the evolution rate of the influenza C hemagglutinin esterase gene is slower than the evolution rate of the influenza A virus hemagglutinin gene by about 1/9 [Muraki Y, Hongo S, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza C virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679]. The rate of substitution accumulation in influenza B virus is of the same order of magnitude as for influenza C [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Наиболее быстро эволюционирующий сегмент генома вируса гриппа С - второй, наиболее медленно - седьмой. Скорость накопления нуклеотидных замен различается примерно в два раза между различными сегментами генома вируса. Во всех семи сегментах генома вируса скорость несинонимичных замен ниже скорости синонимичных, что свидетельствует о действии стабилизирующего отбора, хотя были найдены некоторые доказательства действия положительного отбора в рецептор-связывающем домене гена HEF [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].The fastest evolving segment of the genome of the influenza C virus is the second, most slowly the seventh. The rate of accumulation of nucleotide substitutions varies approximately two times between different segments of the genome of the virus. In all seven segments of the virus genome, the rate of nonsynonymous substitutions is lower than the rate of synonymous ones, which indicates the effect of stabilizing selection, although some evidence has been found of the effect of positive selection in the receptor-binding domain of the HEF gene [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Оценивалась вариабельность генов вируса гриппа С и кодируемых ими белков. Было показано, что четвертый сегмент генома, кодирующий белок HEF, является наиболее вариабельным среди всех. Число нуклеотидных замен на сайт в нем в два раза выше по сравнению наименее вариабельным первым сегментом, кодирующим полимеразу РВ2 [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].The variability of influenza C virus genes and their encoded proteins was evaluated. It was shown that the fourth segment of the genome encoding the HEF protein is the most variable among all. The number of nucleotide substitutions for a site in it is two times higher compared to the least variable first segment encoding PB2 polymerase [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Уставлено время появления в процессе эволюции вируса гриппа С наиболее недавних общих предков современных форм генов гриппа, которое приходится на 1890 год для гена HEF и около 1930-1944 года для большинства других генов (за исключением гена, кодирующего белки NS, время появления наиболее недавнего общего предка которого приходится примерно на 1916 год) [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].The time of appearance of the most recent common ancestors of modern forms of influenza genes during the evolution of the influenza virus C was established, which falls on 1890 for the HEF gene and around 1930-1944 for most other genes (except for the gene encoding NS proteins, the most recent common an ancestor of which occurs around 1916) [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Все вместе приведенные данные показывают, что все семь сегментов генома вируса гриппа С эволюционируют независимо.Taken together, the data show that all seven segments of the genome of the influenza C virus evolve independently.
Среди изолятов вируса гриппа С присутствуют различные антигенные варианты, что было показано с помощью антигенного анализа с помощью HEF-моноклональных антител [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza С virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Sugawara К, Nishimura H, Hongo S, Muraki Y, Kitame F, Nakamura K. 1993. Construction of an antigenic map of the haemagglutinin-esterase protein of influenza С virus. J Gen Virol. 74 (Pt 8), 1661-1666]. Всего на поверхности белка HEF присутствует девять неперекрывающихся или частично перекрывающихся антигенных сайтов (А1-А5 и В1-В4) [Sugawara К, Kitame F, Nishimura H, Nakamura К. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza С virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Sugawara К, Nishimura H, Hongo S, Muraki Y, Kitame F, Nakamura K. 1993. Construction of an antigenic map of the haemagglutinin-esterase protein of influenza С virus. J Gen Virol. 74 (Pt 8), 1661-1666]. Вирусы гриппа С могут существовать продолжительное время (семь-девять лет и более) без изменения специфичности антигена HEF и антигенно значительно более стабильны, нежели вирусы гриппов А и В [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza С virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Ohyama S, Adachi K, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1992. Antigenic and genetic analyses of eight influenza С strains isolated in various areas of Japan during 1985-9. Epidemiol Infect. 108, 353-365; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881].Among the isolates of influenza C virus, various antigenic variants are present, which was shown by antigenic analysis using HEF monoclonal antibodies [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza C virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Sugawara K, Nishimura H, Hongo S, Muraki Y, Kitame F, Nakamura K. 1993. Construction of an antigenic map of the haemagglutinin-esterase protein of influenza C virus. J Gen Virol. 74 (Pt 8), 1661-1666]. In total, nine non-overlapping or partially overlapping antigenic sites (A1-A5 and B1-B4) are present on the surface of the HEF protein [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza C virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Sugawara K, Nishimura H, Hongo S, Muraki Y, Kitame F, Nakamura K. 1993. Construction of an antigenic map of the haemagglutinin-esterase protein of influenza C virus. J Gen Virol. 74 (Pt 8), 1661-1666]. Influenza C viruses can exist for a long time (seven to nine years or more) without changing the specificity of the HEF antigen and are antigenically significantly more stable than the influenza A and B viruses [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza C virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Ohyama S, Adachi K, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1992. Antigenic and genetic analyses of eight influenza C strains isolated in various areas of Japan during 1985-9. Epidemiol Infect. 108, 353-365; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza C viruses. Virol. 871-881].
Также с помощью моноклональных антител было показано, что в белках М и NP имеется, как минимум, по два неперекрывающихся или частично перекрывающихся антигенных сайта, (M-I и M-I) и (NP-I и NP-I), соответственно. По всей вероятности белки NP и М в природе иммунологически более консервативны, чем HEF [Sugawara К, Nishimura H, Hongo S, Kitame F, Nakamura K. 1991. Antigenic characterization of the nucleoprotein and matrix protein of influenza С virus with monoclonal antibodies. J Gen Virol. 72 (Pt 1), 103-109].It was also shown using monoclonal antibodies that proteins M and NP have at least two non-overlapping or partially overlapping antigenic sites, (M-I and M-I) and (NP-I and NP-I), respectively. In all likelihood, NP and M proteins are naturally immunologically more conserved than HEF [Sugawara K, Nishimura H, Hongo S, Kitame F, Nakamura K. 1991. Antigenic characterization of the nucleoprotein and matrix protein of influenza C virus with monoclonal antibodies. J Gen Virol. 72 (Pt 1), 103-109].
Вероятно, геномный состав вируса гриппа С влияет на его способность к распространению в популяции, и некоторые реассортанты имеют эпидемиологические преимущества перед своими родительскими вирусами и начинают циркулировать как превалирующий штамм [Muraki Y, Hongo S. 2010. The molecular virology and reverse genetics of influenza С virus. Jpn J Infect Dis. 63, 157-165].The genomic composition of influenza C virus probably affects its ability to spread in the population, and some reassortants have epidemiological advantages over their parent viruses and begin to circulate as the prevailing strain [Muraki Y, Hongo S. 2010. The molecular virology and reverse genetics of influenza C virus. Jpn J Infect Dis. 63, 157-165].
Вирусы гриппа С способны распространяться по всему миру [Muraki Y, Hongo S, Sugawara К, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza С virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429].Influenza C viruses can spread worldwide [Muraki Y, Hongo S, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza C virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza C viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429].
Помимо человека, вирус гриппа С может инфицировать свиней и собак [Muraki Y, Hongo S. 2010. The molecular virology and reverse genetics of influenza С virus. Jpn J Infect Dis. 63, 157-165]. В 1981-1982 годах кодируемые вирусом белки и геномы вируса гриппа С были изолированы из китайских свиней. Путем картирования геномных последовательностей было показано, что они были весьма похожи, хотя и не идентичны последовательностям шаммов вируса гриппа С, выделенных из человека [Elliott RM, Yuanji G, Desselberger U. 1985. Protein and nucleic acid analyses of influenza С viruses isolated from pigs and man. Vaccine. 3, 182-188]. В исследовании, оценивающем наличие антител против вируса гриппа С в сыворотках из крови 2000 свиней, собранных в Англии, было продемонстрировано, что 9,9% образцов были серопозитивны [Brown IH, Harris PA, Alexander DJ. 1995. Serological studies of influenza viruses in pigs in Great Britain 1991-2. Epidemiol Infect. 114, 511-520]. Для сравнения, серопозитивность сывороток свиней, собранных в Китае и Японии составляла 1-8% (образцы собирались каждый месяц в течение года) и 19% соответственно [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza С virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182; Yamaoka M, Hotta H, Itoh M, Homma M. 1991. Prevalence of antibody to influenza С virus among pigs in Hyogo Prefecture, Japan. Gen. Virol. 72, 711-714]. Эти результаты показывают, что вирус гриппа С широко распространен в популяциях свиней.In addition to humans, influenza C virus can infect pigs and dogs [Muraki Y, Hongo S. 2010. The molecular virology and reverse genetics of influenza C virus. Jpn J Infect Dis. 63, 157-165]. In 1981-1982, the virus-encoded proteins and genomes of the influenza C virus were isolated from Chinese pigs. By mapping genomic sequences, they were shown to be very similar, although not identical, to the sequences of influenza C virus shamma isolated from humans [Elliott RM, Yuanji G, Desselberger U. 1985. Protein and nucleic acid analyses of influenza C viruses isolated from pigs and man.
Эксперименты на свиньях продемонстрировали, что эти животные могут быть искусственным образом инфицированы вирусом гриппа С и что вирус может естественным путем передаваться от свиньи к свинье. Также были получены результаты, свидетельствующие о том, что в организме свиней вирус может находиться в персистентном состоянии. Об этом свидетельствовал тот факт, что животные, искусственно зараженные вирусом гриппа С, через 25 дней после прививки представляли собой инфекционную опасность для других свиней, вызывая у последних повышение уровня соответствующих антител [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182].Pig experiments have shown that these animals can be artificially infected with influenza C virus and that the virus can naturally be transmitted from pig to pig. Results were also obtained indicating that the virus may be in a persistent state in pigs. This was evidenced by the fact that animals artificially infected with influenza C virus, 25 days after vaccination, posed an infectious danger to other pigs, causing the latter to increase the level of the corresponding antibodies [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM . 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza C virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182].
Показано, что искусственным образом привнесенный вирус гриппа С вызывает симптомы заболевания (выделения из носа, отек век, выделение слез и слизи из глаз) у собак. [Ohwada К, Kitame F, Homma M. 1986. Experimental infections of dogs with type С influenza virus. Microbiol Immunol. 30, 451-460]. Надо отметить, что в генетическом банке на настоящий момент не существует ни одной нуклеотидной последовательности, относящейся к изоляту гриппа С, полученному от собак.It has been shown that artificially introduced influenza C virus causes symptoms of the disease (discharge from the nose, swelling of the eyelids, secretion of tears and mucus from the eyes) in dogs. [Ohwada K, Kitame F, Homma M. 1986. Experimental infections of dogs with type C influenza virus. Microbiol Immunol. 30, 451-460]. It should be noted that in the genetic bank at the moment there is not a single nucleotide sequence related to the influenza C isolate obtained from dogs.
Вирус гриппа С обладает способностью к преодолению межвидовых барьеров. Во-первых, известен тот факт, что штаммы вируса, выделенные из человека, способны размножаться в организме свиньи, инфицированной искусственным путем [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza С virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182]. Во-вторых, имеются другие данные свидетельствующие о межвидовой передаче этого вируса между людьми и свиньями естественным путем, а именно: сравнение полных или частичных нуклеотидных последовательностей всех семи сегментов генома штаммов, изолированных в Японии в 1991-1993 годах, с полученными из человека и свиньи в 1980-1989 годах, показало, что по крайней мере один штамм имел большее сходство с вирусами изолированными из свиней в Китае, чем с изолятами, полученными из человека.Influenza C virus has the ability to overcome interspecific barriers. Firstly, it is known that strains of the virus isolated from humans can multiply in the body of a pig infected artificially [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza C virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182]. Secondly, there is other evidence of interspecific transmission of this virus between humans and pigs in a natural way, namely: a comparison of the full or partial nucleotide sequences of all seven segments of the genome of strains isolated in Japan in 1991-1993 with those obtained from humans and pigs in 1980-1989, showed that at least one strain was more similar to viruses isolated from pigs in China than to isolates derived from humans.
Эксперименты на животных демонстрируют связь между различной активностью вируса и сезоном. Так, успешность выявления вируса гриппа С на протяжении года в группах свиней со скотобойни различалась в зависимости от месяца, в который производили забор образцов [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182].Animal experiments demonstrate the relationship between different virus activity and season. Thus, the success of the detection of influenza C virus throughout the year in groups of pigs from a slaughterhouse varied depending on the month in which samples were taken [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza C virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182].
Информация о распространении вируса гриппа С в популяциях как человека, так и животных достаточно ограничена и часто представлена работами, выполненными на национальных языках, что сильно затрудняет их осмысление.Information on the spread of the influenza C virus in populations of both humans and animals is quite limited and is often presented by works performed in national languages, which makes their understanding difficult.
В работе Takao с соавторами было показано, что частота встречаемости вируса гриппа С в период с ноября 1999 по март 2000 года в японской префектуре Хирошима составила 0,2%, поскольку была выявлена только в 8 случаях из 667 образцов, полученных от пациентов с острым респираторным заболеванием [Takao S, Matsuzaki Y, Shimazu Y, Fukuda S, Noda M, Tokumoto S. 2000. Isolation of influenza С virus during the 1999/2000-influenza season in Hiroshima Prefecture, Japan. Jpn J Infect Dis. 53, 173-174].Takao et al. Showed that the incidence rate of influenza C virus from November 1999 to March 2000 in Hiroshima Japanese Prefecture was 0.2%, since only 8 cases out of 667 samples from patients with acute respiratory infections were detected disease [Takao S, Matsuzaki Y, Shimazu Y, Fukuda S, Noda M, Tokumoto S. 2000. Isolation of influenza C virus during the 1999/2000-influenza season in Hiroshima Prefecture, Japan. Jpn J Infect Dis. 53, 173-174].
Изучение вируса гриппа С у детей младше пятнадцати лет с симптомами острого респираторного заболевания проводилась в японском городе Ямагато в течение трехлетнего периода с января 1996 по декабрь 1998 года. Было изучено свыше 10000 образцов, вирусы изолировались в культуре, тестировались методом ингибирования гемагглютинации с моноклональными антителами, после чего геномы некоторых штаммов были секвенированы. Было выявлено 33 различных штамма вируса гриппа С, причем 20 штаммов выявились в течение короткого периода с мая по август 1996 (из них 16 в период 24 дней с 3 по 27 июня), еще 13 штаммов были выделены в марте-июне 1998. При этом в 1997 году не было выявлено ни одного случая заболевания, вызванного вирусом гриппа С, несмотря на то, что в этом году было изучено 3550 образцов. Частота выявления вируса в июне 1996 и апреле 1998 годов достигала 4,9 и 2,8% соответственно, хотя среднегодовая встречаемость за три года была низка (0,3%) [Matsuzaki Y, Sugawara К, Mizuta К, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429].A study of the influenza C virus in children under the age of fifteen with symptoms of acute respiratory illness was conducted in the Japanese city of Yamagato for a three-year period from January 1996 to December 1998. More than 10,000 samples were studied, viruses were isolated in culture, tested by hemagglutination inhibition with monoclonal antibodies, after which the genomes of some strains were sequenced. 33 different strains of the influenza C virus were detected, with 20 strains detected over a short period from May to August 1996 (16 of them in 24 days from 3 to 27 June), and 13 more strains were isolated in March-June 1998. in 1997, not a single case of the disease caused by the influenza C virus was detected, despite the fact that 3550 samples were studied this year. The virus detection rate in June 1996 and April 1998 reached 4.9 and 2.8%, respectively, although the average annual incidence over three years was low (0.3%) [Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y , Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza C viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429].
Исследования гриппа С проводились также в Японии с января по июль 2004 года на материале из 11 различных префектур. Вирусы изолировались в культуре, с последующим тестированием с помощью ингибирования гемагглютинации либо с применением РТ-ПЦР. Частота встречаемости вируса составила 1,4-2,5%, при этом сравнение с предыдущими исследованиями показали, что это была самая высокая частота встречаемости за период в 14 лет. Максимальные временные пики заболевания различались в зависимости от префектуры и в зависимости от использованного метода исследования - они наблюдались в одной префектуре в марте, в нескольких других в январе-феврале, еще в одном случае в феврале и мае. В целом авторы делают вывод о том, что вирус гриппа С циркулирует в Японии на протяжении всего изученного полугодового периода [Matsuzaki Y, Abiko С, Mizuta К, Sugawara К, Takashita E, Muraki Y, Suzuki H, Mikawa M, Shimada S, Sato K, Kuzuya M, Takao S, Wakatsuki K, Itagaki T, Hongo S, Nishimura H. 2007. A nationwide epidemic of influenza С virus infection in Japan in 2004. J Clin Microbiol. 45, 783-788].Flu studies have also been conducted in Japan from January to July 2004, using material from 11 different prefectures. Viruses were isolated in culture, followed by testing using hemagglutination inhibition or using RT-PCR. The frequency of the virus was 1.4–2.5%, while comparison with previous studies showed that it was the highest frequency of occurrence over a period of 14 years. The maximum temporary peaks of the disease differed depending on the prefecture and depending on the research method used - they were observed in one prefecture in March, in several others in January-February, in another case in February and May. In general, the authors conclude that the influenza C virus circulates in Japan throughout the studied six-month period [Matsuzaki Y, Abiko C, Mizuta K, Sugawara K, Takashita E, Muraki Y, Suzuki H, Mikawa M, Shimada S, Sato K, Kuzuya M, Takao S, Wakatsuki K, Itagaki T, Hongo S, Nishimura H. 2007. A nationwide epidemic of influenza C virus infection in Japan in 2004. J Clin Microbiol. 45, 783-788].
В России была проведена работа с использованием данных, собранных в периоды с сентября по июнь в 2005-2009 годах и весной 2010 в г.Москве. Детектирование вируса в образцах проводилась с помощью ПЦР в режиме реального времени. Выборку составили 1868 детей (в возрасте преимущественно от 1 месяца до 5 лет) и 31 взрослый (25-60 лет) с симптомами ОРЗ. Контрольная группа был сформирована из 106 образцов от детей без признаков ОРЗ. Показано, что с наибольшей частотой (8,3-18,2%) вирус гриппа С выявлялся у больных в сентябре 2005, январе-феврале 2006 и в апреле и октябре 2008 года. Среднегодовая частота выявления вируса составила 1-5%. В контрольной группе РНК вируса гриппа С была обнаружена только в одном образце (0,9%) в октябре месяце, что совпадает с периодом повышения частоты обнаружения данного вируса у больных детей [Кудрявцева АВ. 2010. Изучение циркуляции вируса гриппа С у больных ОРЗ в г.Москве. Молекулярная диагностика. 4, 184-186].In Russia, work was carried out using data collected during the periods from September to June in 2005-2009 and in the spring of 2010 in Moscow. Virus detection in samples was carried out using real-time PCR. The sample consisted of 1868 children (aged mainly from 1 month to 5 years) and 31 adults (25-60 years) with symptoms of acute respiratory infections. The control group was formed of 106 samples from children without signs of acute respiratory infections. It was shown that with the highest frequency (8.3-18.2%), the influenza C virus was detected in patients in September 2005, January-February 2006 and in April and October 2008. The average annual virus detection rate was 1-5%. In the control group, the RNA of influenza C virus was detected in only one sample (0.9%) in the month of October, which coincides with the period of increased detection of this virus in sick children [Kudryavtseva AV. 2010. The study of influenza C virus circulation in patients with acute respiratory infections in Moscow. Molecular Diagnostics. 4, 184-186].
Интенсивные миграционные потоки в мировом пространстве в сочетании с активным эволюционным процессом в популяции вирусов гриппа создают предпосылки для возникновения новых антигенных вариантов и их быстрого глобального распространения. Поэтому крайне важным и существенным этапом является раннее распознавание случаев инфицирования. В связи с этим крайне востребованы средства быстрой диагностики гриппа с возможностью типирования и идентификации данной разновидности вируса. Особое значение имеет выявление различных генетических групп вирусов гриппа, в частности вируса гриппа С, поиск генетических изменений, являющихся маркерами высокой вирулентности, а также постоянный мониторинг с целью выявления новых генетических изменений в геноме этого быстро видоизменяющегося вируса. Усиление эпиднадзора за гриппом С как потенциально опасным заболеванием, способным вызывать пневмонии у человека и периодические подъемы заболеваемости, особенно в закрытых учреждениях, а также заболевания свиней, особенно в пределах одного хозяйства, становится все более актуальным.Intensive migration flows in the global space, combined with an active evolutionary process in the influenza virus population, create the prerequisites for the emergence of new antigenic variants and their rapid global spread. Therefore, an extremely important and essential step is the early recognition of cases of infection. In this regard, means of rapid diagnosis of influenza with the possibility of typing and identification of this type of virus are extremely popular. Of particular importance is the identification of various genetic groups of influenza viruses, in particular influenza C virus, the search for genetic changes that are markers of high virulence, as well as continuous monitoring to identify new genetic changes in the genome of this rapidly changing virus. Strengthening the surveillance of influenza C as a potentially dangerous disease that can cause pneumonia in humans and periodic increases in incidence, especially in closed institutions, as well as diseases of pigs, especially within the same household, is becoming increasingly important.
Изучение изменчивости геномов вирусов является важной фундаментальной проблемой. Прежде всего, это связано с тем, что иммунная система организма часто не распознает новые формы вируса гриппа С, благодаря постоянному формированию новых антигенных вариантов. Известно, что почти у половины привитых добровольцев развиваются симптомы заболевания, несмотря на высокий уровень серопозитивности популяции [Joosting AC, Head В, Bynoe ML, Tyrrell DA. 1968. Production of common colds in human volunteers by influenza С virus. Br Med J. 4, 153-154; Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199]. Кроме того, важной проблемой является изучение конкретных генетических изменений, которые могут быть маркерами высокой вирулентности и связаны с тяжестью течения заболевания [Кудрявцева АВ. 2010. Изучение циркуляции вируса гриппа С у больных ОРЗ в г.Москве. Молекулярная диагностика. 4, 184-186].Studying the variability of viral genomes is an important fundamental problem. First of all, this is due to the fact that the body’s immune system often does not recognize new forms of the influenza C virus, due to the constant formation of new antigenic variants. It is known that almost half of vaccinated volunteers develop symptoms of the disease, despite the high level of seropositivity of the population [Joosting AC, Head B, Bynoe ML, Tyrrell DA. 1968. Production of common colds in human volunteers by influenza C virus. Br Med J. 4, 153-154; Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199]. In addition, an important problem is the study of specific genetic changes, which may be markers of high virulence and are associated with the severity of the disease [Kudryavtseva AV. 2010. The study of influenza C virus circulation in patients with acute respiratory infections in Moscow. Molecular Diagnostics. 4, 184-186].
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Нами проанализированы нуклеотидные последовательности, представленные в базах данных, в частности NCBI Influenza Virus Resource [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/] [Bao Y, Bolotov P, Demovoy D, Kiryutin B, Zaslavsky L, Tatusova T, Ostell J, Lipman D. 2008. The influenza virus resource at the National Center for Biotechnology Information. J Virol. 82, 596-601], с целью выбора участков сегментов генома, являющихся наиболее консервативными в различных генетических группах вируса гриппа С.We analyzed the nucleotide sequences presented in the databases, in particular, the NCBI Influenza Virus Resource [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/] [Bao Y, Bolotov P, Demovoy D, Kiryutin B, Zaslavsky L, Tatusova T, Ostell J, Lipman D. 2008. The influenza virus resource at the National Center for Biotechnology Information. J Virol. 82, 596-601], with the aim of selecting plots of genome segments that are the most conservative in various genetic groups of influenza C.
В результате было установлено, что такими участками являются ген М (кодирующий белок матрикса) и ген NP (кодирующий нуклеопротеин).As a result, it was found that such sites are the M gene (encoding matrix protein) and the NP gene (encoding nucleoprotein).
Ген М является консервативным для вируса гриппа С, и в то же время существенно отличаются от гомологичных генов вирусов гриппа А и В. К последовательностям гена М были разработаны диагностические олигонуклеотидные праймеры (прямой праймер: 5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3'; обратный праймер: 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3') и зонд (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и проведено их тестирование.Gene M is conservative for influenza C virus, and at the same time differs significantly from homologous genes for influenza A and B. Diagnostic oligonucleotide primers have been developed for M gene sequences (forward primer: 5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3 '; reverse primer: 5 '-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3') and probe (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3 ') and tested.
На концах зонда InfC находятся флуорофор и гаситель флуоресценции, в растворе зонд образует шпильку, флуорофор и гаситель сближены и уровень флуоресценции очень низок. При гибридизации зонда со специфичным продуктом реакции зонд разворачивается, что приводит к разобщению флуорофора и гасителя и существенному повышению уровня флуоресценции, которое фиксируется детектирующим амплификатором.At the ends of the InfC probe, there is a fluorophore and a fluorescence quencher, the probe forms a hairpin in the solution, the fluorophore and quencher are close and the fluorescence level is very low. Upon hybridization of the probe with a specific reaction product, the probe unfolds, which leads to the separation of the fluorophore and quencher and a significant increase in the level of fluorescence, which is detected by a detecting amplifier.
Разработана методика, включающая проведение этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке, позволяющая выявлять РНК вируса гриппа С в биологических образцах, представляющих собой мазки из носоглотки человека и животных. Мазки получали, собирая клетки эпителия с помощью специальных зондов, стремясь свести к минимуму количество слизистых выделений. Зонды помещали в пробирки, содержащие транспортную среду для стабилизации РНК производства компании Амплисенс. Показано, что хранение мазка возможно в течение суток при температуре +4°С, более длительное хранение возможно при -20°С, архивы рекомендуется хранить при -70°С.A technique has been developed that includes the steps of reverse transcription and amplification in one test tube, which allows the detection of influenza C RNA in biological samples, which are swabs from the nasopharynx of humans and animals. Smears were obtained by collecting epithelial cells using special probes, trying to minimize the number of mucous secretions. The probes were placed in tubes containing a transport medium to stabilize Amplisens RNA. It was shown that smear storage is possible during the day at a temperature of + 4 ° C, longer storage is possible at -20 ° C, archives are recommended to be stored at -70 ° C.
Выделение РНК из собранных образцов проводили с использованием набора РИБО-ПРЕП производства компании Амплисенс. Приготовление реакционной смеси для ОТ/ПЦР проводили, используя реактивы компании Амплисенс и разработанные праймеры и зонд (табл.1).RNA isolation from the collected samples was performed using the RIBO-PREP kit manufactured by Amplisens. The reaction mixture for RT / PCR was prepared using Amplisens reagents and designed primers and probe (Table 1).
Анализ результатов поводили с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Разработанная программа амплификации представлена в таблице 2.The analysis of the results was carried out using the software of the used device for PCR with detection in real time. The developed amplification program is presented in table 2.
Анализировали кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам: JOE/HEX/Су3 (регистрация сигнала, свидетельствующего о накоплении продукта амплификации фрагмента РНК Influenza virus С) и FAM (регистрация сигнала, свидетельствующего о накоплении продукта амплификации кДНК внутреннего контрольного образца STI-88-rec).The fluorescence signal accumulation curves were analyzed in two channels: JOE / HEX / Cy3 (recording a signal indicating the accumulation of the amplification product of the Influenza virus C RNA fragment) and FAM (recording a signal indicating the accumulation of the amplification product of the cDNA amplification of the internal control sample STI-88-rec) .
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1. Процент больных гриппом С от общего числа больных.Figure 1. The percentage of patients with influenza C from the total number of patients
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1. Методика для выявления РНК вируса гриппа С в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекциейExample 1. The method for detecting RNA of influenza C virus in the clinical material by polymerase chain reaction (PCR) with hybridization-fluorescence detection
1.1. В исследованиях используют мазки, полученные из носоглотки человека или животного. Необходимо тщательно провести по стенке слизистой, чтобы максимально увеличить количество клеток эпителия в образце при минимальном количестве слизистых выделений. Используются стандартные зонды для мазков, которые помещаются в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл транспортной среды, например транспортной среды для стабилизации РНК производства компании Амплисенс. Хранение мазка возможно в течение суток при температуре +4°С, более длительное хранение возможно при -20°С, архивы рекомендуется хранить при -70°С.1.1. In studies, smears obtained from the nasopharynx of a human or animal are used. It is necessary to carefully conduct along the wall of the mucosa in order to maximize the number of epithelial cells in the sample with a minimum number of mucous secretions. Standard smear probes are used which are placed in a 1.5 ml tube containing 500 μl of transport medium, for example, transport medium to stabilize Amplisens RNA. Storage of the smear is possible during the day at a temperature of + 4 ° C, longer storage is possible at -20 ° C, archives are recommended to be stored at -70 ° C.
1.2. Выделение РНК с использованием набора РИБО-ПРЕП производства компании Амплисенс.1.2. RNA isolation using the RIBO-PREP kit manufactured by Amplisens.
1.2.1. Раствор для лизиса прогреть при температуре 65°С до полного растворения кристаллов.1.2.1. Warm the lysis solution at a temperature of 65 ° C until the crystals are completely dissolved.
1.2.2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный и положительный контроли выделения). Внести в каждую пробирку по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО, STI-88-rec). Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для лизиса. Промаркировать пробирки.1.2.2. Select the required number of 1.5 ml disposable tubes with tight-fitting lids (including negative and positive release controls). Pipette 10 µl of the internal control sample into each tube (EKR, STI-88-rec). Add 300 μl of lysis solution to the tubes. Label the tubes.
1.2.3. В пробирки с раствором для лизиса и ВКО внести по 100 мкл подготовленных проб, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл отрицательный контрольный образец (ОКО). В пробирку положительного контроля выделения внести 90 мкл ОКО и 10 мкл положительный контрольный образец (ПКО).1.2.3. Pipette 100 μl of prepared samples into test tubes with a lysis solution and CTP using tips with an aerosol barrier. Add 100 µl of the negative control sample (OKO) to the negative selection control tube. Pipette 90 µl of DCE and 10 µl of a positive control sample (PEC) into the positive control test tube.
1.2.4. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65°С в термостате.1.2.4. Mix the contents of the tubes thoroughly on a vortex and warm for 5 minutes at 65 ° C in a thermostat.
1.2.5. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.1.2.5. Add 400 μl of precipitation solution to the tubes, mix on a vortex.
1.2.6. Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин.1.2.6. Centrifuge the tubes in a microcentrifuge for 5 min at 13 thousand rpm.
1.2.7. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.1.2.7. Carefully collect the supernatant without touching the sediment using a vacuum aspirator and a separate 200 µl tip for each sample.
1.2.8. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.1.2.8. Add 500
1.2.9. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.1.2.9. Centrifuge at 13 thousand rpm for 1-2 minutes in a microcentrifuge.
1.2.10. Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.1.2.10. Carefully, without capturing the sediment, take out the supernatant using a vacuum aspirator and a separate tip of 10 μl for each sample.
1.2.11. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.1.2.11. Add 200 μl of washing solution 4 to the tubes, close the lids tightly and carefully wash the pellet by turning the tubes 3-5 times.
1.2.12. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.1.2.12. Centrifuge at 13 thousand rpm for 1-2 minutes in a microcentrifuge.
1.2.13. Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.1.2.13. Carefully, without capturing the sediment, take out the supernatant using a vacuum aspirator and a separate tip of 10 μl for each sample.
1.2.14. Поместить пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).1.2.14. Place the tubes in a thermostat at a temperature of 65 ° C for 5 minutes to dry the pellet (the tubes should be open).
1.2.15. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.1.2.15. Add 50 μl of RNA buffer to the tubes. Stir on the vortex. Place in a thermostat at 65 ° C for 5 minutes, periodically shaking on a vortex.
1.2.16. Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную РНК.1.2.16. Centrifuge the tubes at 13 thousand rpm for 1 min in a microcentrifuge. The supernatant contains purified RNA.
1.3. Проведение этапа обратной транскрипции/ПЦР.1.3. Carrying out the stage of reverse transcription / PCR.
1.3.1. Смешать компоненты реакционной смеси в соотношении, указанном в табл.1, непосредственно перед проведением анализа. Смешивать реагенты из расчета на необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и контрольных образцов.1.3.1. Mix the components of the reaction mixture in the ratio indicated in table 1, immediately before the analysis. Mix reagents based on the required number of reactions, including testing the test and control samples.
1.3.2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации исследуемых и контрольных образцов РНК. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной реакционной смеси.1.3.2. Select the required number of tubes for amplification of the studied and control RNA samples. Pipette 15 µl of the prepared reaction mixture into each tube.
1.3.3. В пробирки с реакционной смесью добавить по 10 мкл РНК-проб, выделенных из клинических или контрольных образцов.1.3.3. Add 10 μl of RNA samples isolated from clinical or control samples to test tubes with the reaction mixture.
1.3.4. Поставить контрольные реакции:1.3.4. Put control reactions:
- отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл РНК-буфера,- negative control PCR (K-) - add to the tube 10 μl of RNA buffer,
- положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК,- positive control PCR (K +) - add to the tube 10 μl PKO cDNA,
- Influenza virus С,- Influenza virus C,
- положительный контроль ПЦР ВКО (ВК+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО STI-88-rec,- positive control PCR EKR (VK +) - add to the tube 10 μl PKO STI-88-rec,
- отрицательный контроль экстракции (выделения) (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО,- negative control of extraction (isolation) (B-) - add 10 μl of the sample extracted from the OKO to the tube,
- положительный контроль экстракции (выделения) (В+) - внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ПКО Influenza virus С (вируса гриппа С).- a positive control of extraction (isolation) (B +) - add 10 μl of the sample extracted from the Influenza virus C PKO (influenza C virus) to the tube.
1.3.5. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени» для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала (табл.2) Детекция флуоресцентного сигнала назначается по каналам для флуорофоров FAM и JOE.1.3.5. Program the amplifier with a real-time detection system to run the corresponding amplification and detection program for the fluorescent signal (Table 2). The detection of the fluorescent signal is assigned through the channels for the FAM and JOE fluorophores.
1.3.6. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.1.3.6. Install tubes in the cells of the reaction module of the device.
1.3.7. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.1.3.7. Run the amplification program with the detection of the fluorescent signal.
1.3.8. По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.1.3.8. Upon completion of the program, proceed with the analysis and interpretation of the results.
1.4. Анализ и интерпретация результатов ПЦР в режиме «реального времени».1.4. Analysis and interpretation of PCR results in "real time" mode.
1.4.1. Анализ результатов поводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:1.4.1. The analysis of the results is carried out using the software used for PCR with detection in real time. Analyze the accumulation curves of the fluorescent signal in two channels:
- по каналу для флуорофора IOE/НЕХ/Су3 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента РНК Influenza virus С,- a signal is recorded through the channel for the IOE / HEX / Su3 fluorophore, indicating the accumulation of the amplification product of the Influenza virus C RNA fragment,
- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации кДНК ВКО STI-88-rec.- a signal is recorded on the channel for the FAM fluorophore, indicating the accumulation of the amplification product of the cDNA of EKR STI-88-rec.
1.4.2. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов. Принцип интерпретации результатов:1.4.2. The results are interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which determines the presence (or absence) of the value of the threshold cycle “Ct” for the given DNA sample in the corresponding column in the results table. The principle of interpretation of the results:
- РНК Influenza virus С обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора JOE/Yellow/HEX/Су3 определено значение порогового цикла Ct, не превышающее значение 0,1. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.- RNA Influenza virus C was detected if for this sample in the channel table for the fluorophore JOE / Yellow / HEX / Cy3 a threshold cycle value Ct was determined that did not exceed 0.1. In this case, the fluorescence curve of this sample should cross the threshold line at the site of a characteristic exponential rise in fluorescence.
- РНК Influenza virus С не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора JOE/Yellow/HEX/Су3 не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green определено значение порогового цикла Ct, не превышающее значение 0,1.- Influenza virus C RNA was not detected if for the sample in the channel table for the JOE / Yellow / HEX / Cy3 fluorophore the threshold cycle Ct value is not defined (missing) (the fluorescence curve does not cross the threshold line), and in the channel table in the results table For the FAM / Green fluorophore, the threshold cycle Ct value is determined that does not exceed 0.1.
- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу для флуорофора JOE/Yellow/HEX/Су3, и по каналу для флуорофора FAM/Green значение Ct также не определено (отсутствует) или превышает значение 0,1. В этом случае требуется повторно провести исследование соответствующего клинического образца начиная с этапа выделения.- The analysis result is invalid if the threshold cycle Ct value for the JOE / Yellow / HEX / Cy3 fluorophore channel and for the FAM / Green fluorophore channel Ct value is also not determined (missing) or exceeds 0 ,one. In this case, it is required to re-examine the corresponding clinical sample starting from the isolation step.
Представленное выше подробное описание методики предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.The above detailed description of the method is intended solely to more fully understand the essence of the claimed invention, but not to limit it. It will be clear to a person skilled in the art that various changes can be made, which, however, will correspond to the nature and scope of the present invention, which are determined by the appended claims.
Пример 2. С помощью разработанного диагностического набора проведен анализ накопленной коллекции образцов. Проанализировано 1805 образцов, полученных с сентября 2005-го года по ноябрь 2009-го включительно. Кроме гриппа С в исследуемых образцах диагностировали также гриппы А и В. Рассчитан процент больных гриппами А, В и С от общего числа больных в каждом месяце, результат представлен на фиг.1.Example 2. Using the developed diagnostic kit the analysis of the accumulated collection of samples. 1805 samples obtained from September 2005 to November 2009 inclusive were analyzed. In addition to influenza C, the studied samples were also diagnosed with influenza A and B. The percentage of patients with influenza A, B and C of the total number of patients in each month was calculated, the result is shown in Fig. 1.
Как видно из фиг.1, наименьшая частота заболеваний вирусами гриппа А, В и С приходится на летне-осенний период, а наибольшая - на зимне-весенний. Частота заболеваний в зимне-весенний период достоверно выше, чем в летне-осенний (Р<0,05, здесь и далее в этом разделе для определения статистической достоверности данных использовались точный тест Фишера и критерий χ2). Наиболее часто встречающимся из диагностируемых является грипп А (Р<0,05), а наиболее редко грипп В (Р<0,05). Частоты встречаемости для гриппов А, В и С относятся как 4:1:2 соответственно. Для гриппа С характерны более резкие пики заболеваемости, по сравнению с гриппами А и В, для которых периоды роста, пика и спада числа заболевших растянуты на несколько месяцев.As can be seen from figure 1, the lowest frequency of diseases with influenza viruses A, B and C falls on the summer-autumn period, and the greatest - on the winter-spring. The frequency of diseases in the winter-spring period is significantly higher than in the summer-autumn period (P <0.05, hereinafter, in this section, the Fisher exact test and χ 2 criterion were used to determine the statistical reliability of the data). The most common of those diagnosed is influenza A (P <0.05), and most rarely, influenza B (P <0.05). Occurrence rates for influenza A, B and C are 4: 1: 2, respectively. Influenza C is characterized by sharper incidence peaks compared with influenza A and B, for which periods of growth, peak and decline in the number of cases are extended by several months.
Как видно из полученных данных, число болевших гриппом С составляет значительную часть от общего числа и почти 30% от болевших гриппами А, В и С вместе взятыми. Для гриппа С пики заболеваемости приходятся на те же периоды, что и для гриппов А и В, однако сами пики значительно уже.As can be seen from the data obtained, the number of people with influenza C is a significant part of the total number and almost 30% of those with influenza A, B and C combined. For influenza C, the incidence peaks occur during the same periods as for influenza A and B, but the peaks themselves are significantly narrower.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012145063/10A RU2532843C2 (en) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | Diagnostic technique for influenza c |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012145063/10A RU2532843C2 (en) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | Diagnostic technique for influenza c |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012145063A RU2012145063A (en) | 2014-04-27 |
| RU2532843C2 true RU2532843C2 (en) | 2014-11-10 |
Family
ID=50515318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012145063/10A RU2532843C2 (en) | 2012-10-24 | 2012-10-24 | Diagnostic technique for influenza c |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2532843C2 (en) |
-
2012
- 2012-10-24 RU RU2012145063/10A patent/RU2532843C2/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Maija Hirsila et al., Detection by Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction of Influenza C in Nasopharyngeal Secretions of Adults with a Common Cold, The Journal of Infectious Diseases, 2001, Vol.183, p.p.1269-72. Kamel A. Abd-Elsalam, Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design, African Journal of Biotechnology, May 2003, Vol. 2, No.5, pp. 91-95. Yiming Bao et al., The Influenza Virus Resource at the National Center for Biotechnology Information, JOURNAL OF VIROLOGY, Jan. 2008, Vol. 82, No. 2, p. 596–601. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012145063A (en) | 2014-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Belák | Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects: A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine | |
| Hamers et al. | Diversity among bovine pestiviruses | |
| CN110699489B (en) | Real-time fluorescence PCR detection primer probe set, kit and method for African swine fever virus CD2V gene | |
| CN110777220A (en) | A primer set, probe, RPA test strip kit, and identification method | |
| Humberd et al. | Detection of infectious laryngotracheitis virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by nested polymerase chain reaction | |
| CN104181297B (en) | A kind of ELISA kit detecting sheep Pseudorabies virus antibody | |
| Ayaz Kök et al. | Diagnosis of ruminant viral diseases with loop-mediated isothermal amplification | |
| CN108504782A (en) | Primer combination for 4 boar infectious disease viruses of synchronous detection and detection kit | |
| CN101575649B (en) | Rapid Detection Technology of H9 Avian Influenza Virus | |
| CN101724712B (en) | Animal insect-borne disease multiple RT-PCR identification detection reagent, preparation method and application | |
| CN103131797B (en) | A kind of bocavirus real-time fluorescence PCR detection reagent kit and application thereof | |
| CN116064417A (en) | Cat panleukopenia virus strain and application thereof | |
| RU2532843C2 (en) | Diagnostic technique for influenza c | |
| Nahed et al. | Pathogenicity of H5N8 avian influenza virus in chickens and in duck breeds and the role of MX1 and IFN-α in infection outcome and transmission to contact birds | |
| CN101423874B (en) | Foot-and-mouth disease virus multiple RT-PCR detection kit, preparation method thereof and application | |
| Shabbir et al. | Comparative evaluation of clinical samples from naturally infected dogs for early detection of canine distemper virus | |
| JP6257529B2 (en) | Influenza C virus and vaccine | |
| CN104975077B (en) | Pig source eperythrozoon fluorescent quantificationally PCR detecting kit and its application | |
| Zahran et al. | Comparison of reverse transcription-PCR and viral culture for detection of respiratory syncytial virus in young children: relation to epidemiological and clinical findings | |
| RU2821895C1 (en) | Method for indirect determination of concentration of ribonucleoprotein of industrial strain "rich" of coronavirus infection agent in raw material for cultural vaccines according to quantitative assessment cycle for amplicons of target region of m-gene of coronavirus | |
| RU2812441C1 (en) | METHOD OF INDIRECTLY DETERMINING TITER OF INFECTIOUS ACTIVITY OF CANINE INFECTIOUS HEPATITIS VIRUS GENOTYPE CAV-1 IN RAW MATERIALS FOR CULTURED VACCINES USING REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION USING QUANTITATIVE ASSESSMENT CYCLE Cq | |
| CN106435022A (en) | A type and O type foot and mouth disease virus specific primer and kit | |
| RU2822162C1 (en) | Method for genotyping feline calicivirus isolates and strains by phylogenetic analysis using original oligonucleotide primers for highly variable region of orf2-orf3 genes | |
| CN111826468A (en) | Primer probe set and kit for one-step detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus type 1 | |
| CN113699219B (en) | Nested PCR (polymerase chain reaction) primer group for simultaneously detecting mycoplasma hyopneumoniae and chlamydia suis and application thereof |