RU2528247C2 - Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления - Google Patents
Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2528247C2 RU2528247C2 RU2013120607/10A RU2013120607A RU2528247C2 RU 2528247 C2 RU2528247 C2 RU 2528247C2 RU 2013120607/10 A RU2013120607/10 A RU 2013120607/10A RU 2013120607 A RU2013120607 A RU 2013120607A RU 2528247 C2 RU2528247 C2 RU 2528247C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- genes
- doxorubicin
- expression
- nci
- Prior art date
Links
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 title claims abstract description 81
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 101000876529 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-1 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102100030943 Glutathione S-transferase P Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101001014059 Homo sapiens Metallothionein-2 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102100031347 Metallothionein-2 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 102100035186 DNA excision repair protein ERCC-1 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 101000818390 Homo sapiens Ferritin light chain Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000969812 Homo sapiens Multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101001074727 Homo sapiens Ribonucleoside-diphosphate reductase large subunit Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100036320 Ribonucleoside-diphosphate reductase large subunit Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102100021062 Ferritin light chain Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 35
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 33
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 29
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 102100021339 Multidrug resistance-associated protein 1 Human genes 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 4
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000964898 Homo sapiens 14-3-3 protein zeta/delta Proteins 0.000 claims description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 3
- 101000775102 Homo sapiens Transcriptional coactivator YAP1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031873 Transcriptional coactivator YAP1 Human genes 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 239000000686 essence Substances 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 84
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 22
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 8
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 4
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 4
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091029845 Aminoallyl nucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 3
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012232 AGPC extraction Methods 0.000 description 2
- 102100028186 ATP-binding cassette sub-family C member 5 Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 2
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100040685 14-3-3 protein zeta/delta Human genes 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710150022 ATP-binding cassette sub-family C member 5 Proteins 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 102100027265 Aldo-keto reductase family 1 member B1 Human genes 0.000 description 1
- 102100036440 Amyloid-beta A4 precursor protein-binding family A member 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710093619 Amyloid-beta A4 precursor protein-binding family A member 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100022595 Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Human genes 0.000 description 1
- 102100021122 DNA damage-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000986622 Homo sapiens ATP-binding cassette sub-family C member 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000836540 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member B1 Proteins 0.000 description 1
- 101000823298 Homo sapiens Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Proteins 0.000 description 1
- 101001041466 Homo sapiens DNA damage-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010026664 MutL Protein Homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150026222 TUBB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009104 chemotherapy regimen Methods 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150008380 gstp1 gene Proteins 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000985 reactive dye Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа. Способ основан на сравнении уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в исследуемых клетках с уровнями экспрессии указанных генов в контрольных клетках NCI-H322. Способ включает гибридизацию флуоресцентно меченых препаратов нуклеиновых кислот, приготовленных из клеток или тканей человека, с массивом данных олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на твердой подложке. Отмывают подложку от неспецифически связавшихся препаратов. Сканируют подложку лазерным сканером и анализируют полученное изображение. При повышенной экспрессии генов ERCC1, МТ2А, RRM1 и TUBB3 и пониженной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к клеткам NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≥0,54 мкМ, и клетки относят к устойчивым. При пониженной экспрессии генов ERCC1, МТ2А, RRM1 и TUBB3 и повышенной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к клеткам NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≤0,073 мкМ, и клетки относят к чувствительным. Предложенное изобретение позволяет определять чувствительность клеток рака легкого к доксорубицину с высокой точностью. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области молекулярной медицины, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к определению лекарственной устойчивости клеток и опухолей, к способам обнаружения специфических РНК-мишеней и биологическим микрочипам.
Рак легкого (РЛ) занимает одно из первых мест в мире по заболеваемости и смертности среди всех онкологических заболеваний. В ряде регионов России смертность от РЛ превышает самые высокие мировые показатели, местами достигая 44 случаев у женщин и 81 у мужчин на 100000 населения в год [Мукерия, А.Ф., Заридзе Д.Г., Эпидемиология и профилактика рака легкого. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2010. 21 (3):3-13]. К основным способам лечения рака наряду с хирургическими и лучевыми способами относится химиотерапия. Известно, что клетки опухоли часто проявляют устойчивость к лекарственным препаратам (например, к доксорубицину), что препятствует эффективному лечению. Поэтому актуальной задачей современной экспериментальной онкологии является создание новых молекулярно-биологических тестов, которые позволяли бы изучать отдельные механизмы хеморезистентности опухолевой клетки и на этой основе разрабатывать оптимальные режимы химиотерапии для больных раковыми заболеваниями и, в частности, рака легкого. Существуют данные о корреляции устойчивости рака легкого к доксорубицину с уровнем экспрессии (количеством мРНК) ряда генов [Dan, S., M. Shirakawa, Y. Mukai, et al., Identification of candidate predictive markers of anticancer drug sensitivity using a panel of human cancer cell lines. Cancer Sci, 2003. 94(12):1074-82, Dan, S., T. Tsunoda, O. Kitahara, et al., An integrated database of chemosensitivity to 55 anticancer drugs and gene expression profiles of 39 human cancer cell lines. Cancer Res, 2002. 62 (4): 1139-47, Кашкин, К.Н., Е.А. Мусаткина, А.В. Комельков, et al. Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легких человека. Доклады Академии Наук, 2010. 430(3):412-415]. Одним из наиболее употребимых способов определения уровней экспрессии генов являются способы, основанные на микрочипах - твердых подложках, на которых в определенном порядке ковалентно иммобилизованы фрагменты ДНК или химически синтезированные олигонуклеотиды. Настоящее изобретение представляет собой способ оценки чувствительности к доксорубицину (IC50, или концентрации 50%-ного ингибирования роста) для клеток рака легкого на основании уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3, определяемых с помощью гибридизации флуоресцентно-меченных препаратов нуклеиновых кислот, комплементарных поли(A)-содержащей фракции РНК, выделенных из клеток, с иммобилизованными на твердой подложке олигонуклеотидами (олигонуклеотидными зондами), комплементарными мРНК указанных генов, а также набор олигонуклеотидов для осуществления данного способа.
Уровень техники
Известен способ прямого определения чувствительности клеток к цитостатикам способом МТТ [Alley, M.C., D.A. Scudiero, A. Monks, et al., Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res, 1988. 48(3):589-601], в котором чувствительность клеток определяют по дозе цитостатика, при которой в живых остается 50% клеток в культуре (IC50). Для использования этого способа необходимо специальное оборудование (стерильные боксы, одноразовые стерильные планшеты и матрасы, оборудование для стерилизации многоразовых инструментов, CO2-инкубаторы, микроскопы, культуральные среды и другое) для культивирования эукариотических клеток. Такое оборудование есть не в каждой лаборатории.
Известно, что чувствительность клеток к доксорубицину коррелирует с уровнем экспрессии (количеством мРНК) целого ряда генов. В частности, были показаны корреляции для генов АВСС1, AKR1B1, DDB2, ERCC1, FTL, MLH1 [Dan, S., M. Shirakawa, Y. Mukai, et al., Identification of candidate predictive markers of anticancer drug sensitivity using a panel of human cancer cell lines. Cancer Sci, 2003. 94(12):1074-82, Dan, S., Т. Tsunoda, O. Kitahara, et al., An integrated database of chemosensitivity to 55 anticancer drugs and gene expression profiles of 39 human cancer cell lines. Cancer Res, 2002. 62(4):1139-47] [Gyorffy, В., Р. Surowiak, О. Kiesslich, et al., Gene expression profiling of 30 cancer cell lines predicts resistance towards 11 anticancer drugs at clinically achieved concentrations. Int J Cancer, 2006. 118(7):1699-712]. Однако в литературе не описаны способы расчета показателя IC50 доксорубицина в зависимости от уровня экспрессии генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3. В настоящее время для определения количества мРНК в клетках используют ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и гибридизацию на микрочипах.
Известен способ определения экспрессии генов полимеразной цепной реакцией в реальном времени, сопряженной с обратной транскрипцией (ПЦР-РВ), в котором уровень экспрессии генов определяют по изменению флуоресценции в ходе накопления продукта реакции [Livak, K.J., S.J. Flood, J. Marmaro, et al., Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl, 1995. 4(6):357-62]. В зависимости от разновидности способа ПЦР-РВ (SYBR Green® I, TaqMan®, молекулярные биконсы, «скорпионные» пробы и др), в нем используется два или более олигонуклеотидов с определенной структурой на каждый ген [Vanguilder, H.D., K.E. Vrana and W.M. Freeman, Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. Biotechniques, 2008. 44(5):619-26]. С помощью ПЦР-РВ показана корреляция чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину с уровнями экспрессии отдельных генов [Kawabata, S., M. Oka, H. Soda, et al., Expression and functional analyses of breast cancer resistance protein in lung cancer. Clin Cancer Res, 2003. 9(8):3052-7, Yoshida, M., T. Suzuki, T. Komiya, et al., Induction of MRP5 and SMRP mRNA by adriamycin exposure and its overexpression in human lung cancer cells resistant to adriamycin. Int J Cancer, 2001. 94(3):432-7]. Общим существенным недостатком способов на основе ПЦР-РВ по сравнению с ДНК-микрочипами является ограниченная мультиплексность, то есть количество генов, тестируемых в одной реакции. Кроме того, для определения экспрессии одного гена требуется два или более специфических олигонуклеотида в зависимости от варианта ПЦР-РВ. Новые способы ПЦР-РВ, основанные на молекулярных биконсах и «скорпионных» пробах, требуют значительно более изощренного дизайна олигонуклеотидных проб и менее распространены.
Известен способ прогноза чувствительности клеток к цитостатикам на основе уровней экспрессии различных генов, определяемых с помощью полнотранскриптомных микрочипов [Dan, S., M. Shirakawa, Y. Mukai, et al., Identification of candidate predictive markers of anticancer drug sensitivity using a panel of human cancer cell lines. Cancer Sci, 2003. 94(12):1074-82, Dan, S., Т. Tsunoda, O. Kitahara, et al., An integrated database of chemosensitivity to 55 anticancer drugs and gene expression profiles of 39 human cancer cell lines. Cancer Res, 2002. 62(4):1139-47, Gyorffy, В., Р. Surowiak, О. Kiesslich, et al., Gene expression profiling of 30 cancer cell lines predicts resistance towards 11 anticancer drugs at clinically achieved concentrations. Int J Cancer, 2006. 118(7):1699-712] [Yatomi, M., Y. Takiguchi, Y. Asaka-Amano, et al., Altered gene expression by cisplatin in a human squamous cell lung carcinoma cell line. Anticancer Res, 2007. 27(5A):3235-43, Кашкин, K.H., E.A. Мусаткина, А.В. Комельков, et al., Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легких человека. Доклады Академии Наук, 2010. 430(3):412-415]. Один экспрессионный микрочип может содержать множество различных зондов, перекрывающих весь транскриптом (совокупность всех РНК) организма. Так, микрочип Human Gene 1.1 ST Array фирмы Affymetrix (Santa Clara, CA) содержит более 750000 различных олигонуклеотидных зондов. Главными недостатками этого способа являются дороговизна, необходимость в высокотехнологичном оборудовании для изготовления и обработки микрочипов, сложность анализа результата и избыточность получаемой информации. Эти недостатки ограничивают практическое применение полнотранскриптомных микрочипов разных производителей, например фирм Affymetrix и Agilent. Фактически число генов, для которых экспериментально подтверждена корреляция экспрессии с лекарственной устойчивостью опухолей, исчисляется десятками. Для анализа такого числа генов используют микрочипы низкой плотности. Их преимущество перед полнотранскриптомными чипами состоит в том, что они могут быть изготовлены и проанализированы в небольшой диагностической лаборатории. Микрочипы низкой плотности позволяют исследовать экспрессию минимального и достаточного набора генов, соответствующего конкретной задаче. Несмотря на то, что корреляция экспрессии некоторых генов с чувствительностью к доксорубицину известна, в литературе не описаны способы расчета показателя IC50 доксорубицина в зависимости от уровня экспрессии генов, определяемого с помощью микрочипов низкой плотности.
Известны узкоспециализированные биочипы низкой плотности на основе гидрогеля, производимые в ИМБ РАН и компанией Биочип-ИМБ (патент 2157385 RU). Эти чипы используются для детекции нескольких клинически важных мутаций и полиморфизмов в геноме различных организмов, включая человека (см. патенты 2458131 RU, 2453606 RU, 2453605 RU), а также для определения ряда антигенов иммунологическими способами [Gryadunov, D., E. Dementieva, V. Mikhailovich, et al., Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. Expert Rev Mol Diagn, 2011. 11(8):839-53]. Однако для количественного исследования экспрессии нормальных генов гелевые биочипы не применяют. Принципиальный недостаток гелевых микрочипов состоит в том, что размер гелевых пор накладывает ограничения как на длину иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, так и на способ подготовки анализируемого препарата. Все системы анализа нуклеиновых кислот на гелевых чипах требуют предварительной амплификации с помощью ПЦР строго ограниченных участков ДНК или РНК. Этот способ требует синтеза не менее трех олигонуклеотидов на каждый ген или мутацию: праймеров для ПЦР и зондов для гибридизации продукта ПЦР. Введение в систему анализа каждого дополнительного гена требует расчета не менее трех олигонуклеотидов, а в варианте с мультиплексной ПЦР - перерасчета всех олигонуклеотидов, задействованных в анализе. Все это лишает гелевые микрочипы преимуществ перед способами с использованием только ПЦР в различных вариациях. Кроме того, микрочипы, в которых олигонуклеотидные зонды иммобилизованы на поверхности твердой подложки (поверхностные микрочипы), позволяют использовать олигонуклеотидные зонды длиной 50-80 и более нуклеотидов с последовательностью, уникальной для генома человека. Таким образом, для анализа экспрессии любого гена может использоваться всего один олигонуклеотидный зонд.
Наиболее близкими аналогами способа подготовки материала, используемыми в настоящее время, являются два способа. Первый способ применяется в наборе Amino Allyl cDNA Labelling Kit, (Ambion; США, патенты США 5256555, 6586218, 6586219), который основан на способе двойной амплификации [Van Gelder, R.N., M.E. Von Zastrow, A. Yool, et al., Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Nati Acad Sci USA, 1990. 87(5):1663-7]. Этот способ не предусматривает этапа амплификации кДНК: в нем отдельно синтезируют кДНК, затем вторую цепь кДНК, после этого проводят амплификацию РНК с помощью Т7 РНК-полимеразы, получая аРНК. Для одного эксперимента требуется не менее 10 мкг РНК каждой линии клеток или ткани. Для меньших количеств мРНК применяют повторный цикл двойной амплификации с помощью того же набора, что вносит значительные отклонения в репрезентативность исходных молекул мРНК в конечном препарате. Второй способ, применяемый в MiniAmp mRNA amplification kit (Arrayit, США, патент US 8343721 B2), использует SMART-технологию для синтеза кДНК [Chenchik, A., Y.Y. Zhu, L. Diatchenko, et al., Gene Cloning and Analysis by RT-PCR, 1998. 305-319, Zhu, Y.Y., E.M. Machleder, A. Chenchik, et al., Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques, 2001. 30(4):892-7], промежуточную амплификацию кДНК с помощью ограниченной ПЦР, и синтез с помощью Т7 РНК-полимеразы аРНК, которая потом еще раз переводится в кДНК с введением аминоаллил-дНТФ для последующего мечения. Главный недостаток такого подхода состоит в лишнем этапе ферментативного копирования материала, который нарушает репрезентативность исходных молекул мРНК в конечном препарате.
Настоящее изобретение решает задачу оценки чувствительности (IC50) к доксорубицину (оценки IC50) клеток рака легкого. Изобретение позволяет отнести опухолевые клетки определенной линии к устойчивым (IC50≥0.54 мкМ) или чувствительным (IC50≤0.073 мкМ) к доксорубицину. Изобретение может быть использовано в тех случаях, когда нет возможности определить чувствительность клеток к доксорубицину классическим способом МТТ [Alley, М.С., D.A. Scudiero, A. Monks, et al., Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res, 1988. 48(3):589-601] - например, в лабораториях, не имеющих оборудования для культивирования животных клеток. Поставленная задача решается за счет определения уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в исследуемых клетках по отношению к уровням экспрессии указанных генов в клетках NCI-H322. Способ включает получение биологического материала, выделение из него суммарной РНК, приготовление флуоресцентно- меченных препаратов нуклеиновых кислот, комплементарных поли(A)-содержащей фракции РНК, выделенных из исследуемого материала и контрольных клеток NCI-H322, гибридизацию смеси полученных препаратов в соотношении 1:1 с набором уникальных олигонуклеотидных зондов, гомологичных мРНК указанных генов, иммобилизованных на твердой подложке, отмывку несвязавшихся препаратов аРНК, сканирование подложки лазерным сканером, обработку полученного изображения и проведение количественного анализа результата. В предлагаемом способе применяют SMART-синтез кДНК и ее ограниченную амплификацию методом ПЦР с использованием недорогого набора для амплификации кДНК фирмы Евроген (Россия) с последующей линейной амплификацией РНК с помощью Т7 РНК-полимеразы. Такой подход, с одной стороны, обеспечивает эффективный синтез полноразмерных кДНК, а с другой позволяет сократить стадии ферментативного копирования исходной мРНК при сохранении репрезентативности транскриптов. Еще одно преимущество данного способа состоит в том, что при необходимости можно неограниченно копировать промежуточный материал (кДНК) с помощью ПЦР. Для постановки экспериментов на микрочипах используется стандартное оборудование, имеющееся в каждой молекулярно-биологической лаборатории. Сами подложки с олигонуклеотидными зондами (микрочипы низкой плотности) могут быть изготовлены и проанализированы либо в той же лаборатории с использованием бюджетных принтеров (Xact XpressLine) и сканеров (DITABIS MaRS), либо на оборудовании для массовой печати микрочипов в специализированных технопарках - например, с использованием станций для печати ArrayIt NanoPrint™ Workstations и сканеров GenePix 4400A Microarray Scanner с автоматическим загрузчиком GenePix SL50.
Таким образом, предлагаемый способ оценки IC50 доксорубицина для клеток рака легкого на основе измерения уровней экспрессии (количества мРНК) маркерных генов объединяет следующие достоинства ПЦР-РВ, поверхностных полнотранскриптомных микрочипов и микрочипов низкой плотности:
1) минимальное количество стартового материала - 1-2 мкг суммарной РНК, выделенной из биологического материала;
2) универсальный способ подготовки из РНК по п.1 меченого препарата для гибридизации из суммарной РНК, основанный на недорогом отечественном наборе для амплификации кДНК фирмы Евроген. Способ подготовки не зависит от набора генов, подлежащих исследованию;
3) возможность неограниченного воспроизводства промежуточного материала по п.2 для анализа путем амплификации кДНК;
4) использование всего одного олигонуклеотида на каждый ген;
5) использование ограниченного набора олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на твердой подложке, достаточного для решения поставленной задачи, при необходимости набор может быть изменен или расширен;
6) относительно невысокая стоимость микрочипов из-за небольшого количества иммобилизованных зондов;
7) возможность печати, обработки и анализа микрочипов как на бюджетном оборудовании в исследовательской лаборатории, так и на оборудовании для массовой печати микрочипов в условиях специализированных технопарков;
8) удешевление анализа при массовом производстве микрочипов.
Сочетание используемых в данном изобретении генов, конкретных последовательностей олигонуклеотидов, способа подготовки материала для гибридизации и экспериментального подхода с использованием микрочипов низкой плотности для определения или оценки чувствительности клеток к доксорубицину в литературе не встречается и в практике не используется.
Технический результат
Техническим результатом изобретения является повышение достоверности оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину основе анализа экспрессии генов за счет новой комбинации маркерных генов и дополнительное подтверждение определения IC50 доксорубицина для клеток рака легкого другими методами.
Осуществление изобретения
Олигонуклеотиды (Таблица 1; SEQ NO:1-15) синтезируют с помощью олигонуклеотидного синтезатора Applied Biosystems ABI 3900 или аналогичного. Праймирующий олигонуклеотид (SEQ ID NO:1) служит для синтеза кДНК и представляет собой модифицированный 3′-праймер Mint (Евроген), в котором в положении 5′ дополнительно включен промотор РНК-полимеразы фага Т7, укорочен до 20 остатков 3′-олиго(Т)-участок и отсутствует 3′-концевой вариабельный нуклеотид (VN). Олигонуклеотиды с последовательностями SEQ NO: 2-15 гомологичны мРНК соответствующих генов (указаны названия). Эти олигонуклеотиды иммобилизуют на активированной твердой подложке в определенном порядке посредством концевой реактивной аминогруппы с помощью принтера для микрочипов (Xact Xpress Line, Arrayt Spotbot3 или другого) в соответствии с руководствами изготовителей подложки и принтера. Олигонуклеотид SEQ NO:2, гомологичный мРНК гена GAPDH, используют в качестве положительного контроля и «якоря» для позиционирования изображения. Олигонуклеотид SEQ NO:3 (GAPDH76) имеет 76% гомологии с зондом GAPDH и негомологичен другим генам человека; его используют для корректировки неспецифического сигнала и контроля отмывки. Олигонуклеотиды SEQ NO:11, 9, 10, 12, 13, 14, 15 гомологичны мРНК генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, MT2A, RRM1, TUBB3, соответственно, которые используют в качестве маркерных. Олигонуклеотиды SEQ NO:4, 5, 6, 7, 8 гомологичны мРНК генов ACTB, ESD, PolR2A, YAP I, YWHAZ соответственно, которые используют в качестве контрольных генов для нормирования результатов.
Для осуществления изобретения выделяют суммарную РНК из клеток человека. РНК выделяют с использованием различных способов, например, с помощью хаотропных агентов [Chomczynski, P. and N. Sacchi, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987. 162(1):156-9], с использованием реагента Trizol (Gibco/Life Technologies, США) либо коммерческих наборов для выделения РНК типа RNAEasy Kit (Quiagen, США) или ExtracrRNA (Евроген, Россия). Необходимое качество препарата РНК оценивают по соотношению фракций рибосомных РНК 28S к 18S близкому к 2, определяемому по электрофорезу суммарной РНК [Sambrook, J. and D.W. Russell, Molecular cloning: a laboratory manual. 3d Ed. 2001], либо по индексу RIN близкому к 10, определяемому приборами, аналогичными биоанализатору Agilent Bioanalyzer 2100. Из суммарной РНК клеток при помощи праймирующего олигонуклеотида, процесса обратной транскрипции и SMART-технологии готовят суммарные препараты комплементарной ДНК (к ДНК). Данную к ДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Из препаратов амплифицированной кДНК с помощью Т7 РНК-полимеразы готовят препараты амплифицированной РНК (аРНК) с включением аминоаллил-УТФ. Полученные препараты аРНК метят конъюгацией с сукцинимидными эфирами флуоресцентных красителей, которые различаются спектрами поглощения и эмиссии - например, Су3 контрольную аРНК метят Су3, а исследуемую аРНК метят Су5, либо наоборот. Могут использоваться и другие флуоресцентные красители. Для получения контрольного препарата аРНК используют клетки аденокарциномы легкого NCI-Н322. Меченые двумя разными красителями контрольный и исследуемый препараты смешивают в равных соотношениях и проводят гибридизацию с ДНК-микрочипом, содержащим иммобилизованные олигонуклеотиды SEQ NO 2-15. Несвязавшуюся часть препаратов отмывают солевым раствором. После гибридизации и отмывки подложки сканируют с помощью сканера для микрочипов (Perkin Elmer ScanArray GL Plus, DITABIS MaRS или другого аналогичного) в двух длинах волн, соответствующих максимуму эмиссии использованных флуоресцентных красителей. Полученные изображения совмещают и обрабатывают с помощью программ для обработки изображений (Perkin Elmer ScanArray Express, Imaging Research Array Vision 7.0, Axon GenePix Pro или других). По соотношению сигналов флуоресценции двух красителей для каждого зонда определяют уровни экспрессии генов в исследуемых клетках относительно контрольных. По результатам гибридизации в зависимости от сигналов флуоресценции зондов определяют уровни экспрессии генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, MT2A, RRM1, TUBB3 в исследуемых клетках относительно контрольных клеток NCI-H322. В качестве контрольных генов для нормирования результата используют гены АСТВ, ESD, PolR2A, YAP1, YWHAZ. В качестве положительного контроля используют ген GAPDH. По соотношению уровней экспрессии указанных маркерных генов оценивают чувствительность (IC50) исследуемых клеток к доксорубицину. При повышенной экспрессии генов ERCC1, MT2A, RRM1 и TUBB3 и пониженной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к экспрессии указанных генов в клетках NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≥0.54 мкМ, и клетки относят к устойчивым. При пониженной экспрессии генов ERCC1, MT2A, RRM1 и TUBB3 и повышенной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к экспрессии указанных генов в клетках NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≤0.073 мкМ, и клетки относят к чувствительным. Для зонда GSTP1 данная закономерность соблюдается полностью, а для других зондов - с вероятностью 83.3% (для пяти из шести клеточных линий).
Способ иллюстрируют следующие примеры
Пример 1
а) Синтез олигонуклеотидов проводят с использованием стандартной фосфоамитидной процедуры на автоматическом синтезаторе ABI 3900 (″Applied Biosystems″, США). На 3′-конце олигонуклеотидов SEQ NO:2-15, предназначенных для иммобилизации на твердой подложке, при синтезе вводят спейсер со свободной аминогруппой с помощью 3′-Amino-Link (″Glen Reseach″, США).
б) Для иммобилизации на твердых подложках олигонуклеотидных зондов, синтезированных по п.1а, используют принтер для контактной печати Xact Xpress Lane и подложки VALS-25 с активированной поверхностью (CEL Associates, Inc, США) в условиях, рекомендованных изготовителями подложки и принтера. Зонды наносят в определенном порядке в трех повторах.
в) Клетки рака легкого исследуемых линий (А549, NCI-H23, NCI-H292, NCI-H358, NCI-H1299, NCI-H460 или других) и контрольной линии NCI-H322, выращивают в 25 см2 флаконах в среде DMEM/F12 (1:1), содержащей 10% фетальной коровьей сывороткой с добавлением стрептомицина до концентрации 10 мкг/мл и пенициллина до концентрации 10 ед./мл при температуре 37°C в CO2-инкубаторе при относительной влажности 96%.
г) Суммарную РНК из клеток, выращенных по п.1в, выделяют стандартным способом с использованием гуанидин изотиоцианата и фенола [Chomczynski, P. and N. Sacchi, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987. 162 (1):156-9], дополнительно очищают с помощью набора RNeasy Mini RNA Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) и обрабатывают ДНКазой I. Качество РНК оценивают с помощью электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием [Sambrook, J. and D.W. Russell, Molecular cloning: a laboratory manual. 3d Ed. 2001]. Соотношение фракций 28S:18S рибосомной РНК близкое к 2 свидетельствует о высоком качестве препарата РНК, что является необходимым условием для определения экспрессии генов. Более надежным показателем хорошего качества является индекс RIN (RNA Integrity Number), близкий к 10. Индекс RIN определяют с помощью Agilent 2100 Bioanalyser.
д) Синтез меченых препаратов аРНК проводят следующим способом. кДНК синтезируют из 2 мкг суммарной РНК, полученной по п.1 г, с помощью набора Mint (Евроген, Россия) по рекомендациям изготовителя, используя праймирующий олигонуклеотид SEQ NO:1 и стандартный Plug-олигонуклеотид (Mint) для переключения цепи. Далее проводят 18-21 цикл ПНР с праймером M1 (Mint) для амплификации кДНК в условиях, рекомендованных Евроген для набора Mint. Препарат кДНК очищают на спин-колонках Clean-up (Евроген, Россия) или аналогичных по инструкции изготовителя. 100 нг амплифицированной кДНК используют для синтеза амплифицированной аминоаллил-РНК (аРНК) с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Ambion, Austin, ТХ, США или Fermentas, Литва) в объеме 40 мкл в присутствии АТФ, ГТФ, ЦТФ (7.5 мМ), УТФ и аминоаллил-УТФ (Fermentas, Литва; 3.75 мМ). Реакцию проводят при 37°C в течение 4-8 часов, после чего останавливают разбавлением безнуклеазной водой до 100 мкл. Продукт синтеза (аРНК) очищают на спин-колонках RNAEasy Kit (Quiagen, США) или аналогичных по инструкции изготовителя. Полученную аРНК метят реакцией с сукцинимидными эфирами флуоресцентных красителей красителями Су3 или Су5. Для этого используют Amino Allyl MessageAmp II aRNA Amplification kit (Ambion, США, #1797), либо Cy-Dye Post-Labelling Reactive Dye Pack (Amersham/GE Healthcare, США, #RPN 5661) или аналогичные препараты других производителей. Один флакон красителя в расчете на 1 реакцию разводят в 11 мкл ДМСО. 10-20 мкг аРНК лиофилизируют и растворяют в 9 мкл буфера для конъюгации (Coupling buffer, Ambion, США), после чего смешивают с раствором красителя в ДМСО и осторожно перемешивают. Смесь инкубируют 30 минут в темноте, затем добавляют 4.5 мкл 4М гидроксиламина, перемешивают и инкубируют еще 15 минут в темноте. Объем реакции доводят до 30 мкл. Меченую аРНК очищают на спин-колонках для очистки от красителя Ambion из набора #1797, или с помощью RNAEasy Kit (Quiagen, США), либо аналогичных по инструкции изготовителя.
е) В качестве контрольного препарата используют аРНК из клеток NCI-Н322. Исследуемый и контрольный препараты аРНК, меченые флуоресцентными красителями Су3 и Су5 соответственно (либо наоборот), полученные по п.1д, смешивают в соотношении 1:1, фрагментируют с помощью буфера для фрагментации (АМ8740, Ambion) по рекомендациям изготовителя, добавляют буфер для гибридизации (RPK0325, GE Healthcare) и наносят на ДНК-микрочипы, полученные по п.1б, для гибридизации. Микрочипы инкубируют в течение ночи при 37°C, после чего отмывают цитратным буфером. Отмывку проводят в следующем режиме: 2×SSC, 2×15 мин при 20°, 1×SSC, 15 мин при 50°, 0.1×SSC, 5 мин при 20° с добавлением 0.1% Tween 20. Затем микрочипы ополаскивают 0.1×SSC без Tween 20 и высушивают в беспылевых условиях.
ж) Микрочипы, отмытые по п.1е, сканируют с помощью сканера ScanArray GL Plus (Perkin Elmer, США). Изображения анализируют с помощью программы ArrayVision 7.0 (Imaging Research, США). Коррекцию фона проводят по свободной от олигонуклеотидов области чипа и флуоресценции некомплементарного зонда SEQ NO:3, который служит для контроля качества отмывки по п.«1е». Результаты нормируют по сигналам контрольных зондов (SEQ NO:4-8). При анализе изображения с помощью программы ArrayVision 7.0 определяют показатели cnLogARMDens для каждого зонда по двум красителям. Дифференциальную экспрессию фиксируют в случаях не менее чем двукратного различия отношения нормализованных сигналов Су3/Су5 (Ratio (cnLogARMDens): Ctrl:Data>0.3 или Ratio (cnLogARMDens): Ctrl:Data<-0.3) при соотношении сигнал/шум S/N≥3.
з) На основании сигналов флуоресценции, определенных по п.1ж, оценивают уровень экспрессии маркерных генов и чувствительность клеток к доксорубицину (IC50). При повышенной экспрессии генов ERCC1, МТ2А, RRM1 и TUBB3 и пониженной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к клеткам NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≥0.54 мкМ, и клетки относят к устойчивым. При пониженной экспрессии генов ERCC1, МТ2А, RRM1 и TUBB3 и повышенной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к клеткам NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≤0.073 мкМ, и клетки относят к чувствительным.
Пример 2
Оценка чувствительности клеток линии NCI-H460 к доксорубицину при использовании в качестве контрольной линии клеток NCI-Н322.
При гибридизации смеси аРНК из клеток NCI-H460, меченой Су3, и аРНК из клеток NCI-H322, меченой Су5, получены следующие показатели «Ratio (cnLogARMDens): Ctrl:Data»:
| Зонд | Ratio (cnLogARMDens): Ctrl: Data Су3/Су5 |
| МТ2А | -1,22 |
| TUBB3 | -0,57 |
| ERCC1 | -0,58 |
| RRM1 | -0,34 |
| GSTP1 | 1,50 |
| FTL | 0,58 |
| АВСС1 | 0,57 |
Из результатов следует, что экспрессия генов МТ2А, TUBB3, ERCC1, RRM1 в клетках NCI-H460 ниже, а генов АВСС1, GSTP1 и FTL выше, чем в клетках NCI-H322. Следовательно, IC50 доксорубицина клеток NCI-H460 менее 0.074 мкМ, и клетки относят к чувствительным к данному препарату. Этот результат подтверждается тем, что величина IC50 доксорубицина для клеток NCI-H460, определенная методом МТТ, составила 0.054 мкМ [Кашкин, К.Н., Е.А. Мусаткина, А.В. Комельков, et al., Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легких человека. Доклады Академии Наук, 2010. 430 (3):412-415]. Аналогично могут быть оценены IC50 для других клеток (Фиг.1).
Изобретение иллюстрирует Фиг.1, которые демонстрирует зависимость экспрессии маркерных генов в клетках рака легкого от чувствительности к доксорубицину. В качестве контрольной использована аРНК из устойчивых к доксорубицину клеток NCI-H322, меченая красителем Су5; аРНК остальных (исследуемых) линий помечены Су3. Показаны сигналы олигонуклеотидных зондов, ассоциированные с устойчивостью (МТ2А, TUBB3, ERCC1, RRM1) и чувствительностью (GSTP1, FTL, АВСС1) к доксорубицину. Представлены средние значения и стандартная ошибка среднего (SEM). По оси ординат отложен параметр Ratio (cnLogARMDens): Ctrl: Data.
Промышленная применимость
Предлагаемый способ позволяет оценивать чувствительность клеток к доксорубицину в тех случаях, когда прямые методы определения чувствительности неприменимы. Метод может быть использован как альтернатива или дополнение к существующим методам.
Claims (2)
1. Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50) на основании сравнения уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в исследуемых клетках с уровнями экспрессии указанных генов в контрольных клетках NCI-H322, включающий выделение из исследуемых и контрольных клеток суммарной РНК, приготовление из суммарной РНК флуоресцентно-меченных препаратов нуклеиновых кислот, комплементарных поли(A)-содержащей фракции РНК, выделенных из клеток, с помощью праймирующего олигонуклеотида SEQ ID NO:1, гибридизации указанных препаратов с олигонуклеотидами SEQ ID NO:2-15, иммобилизованными на твердой подложке, где олигонуклеотид SEQ ID NO:2, гомологичный мРНК гена GAPDH, используется как положительный контроль, олигонуклеотид SEQ ID NO:3 используется для контроля отмывки подложки, олигонуклеотиды SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, гомологичные мРНК генов АСТВ, ESD, PolR2A, YAP1, YWHAZ соответственно, используются для нормирования результата гибридизации, и олигонуклеотиды SEQ ID NO: 11, 9, 10, 12, 13, 14, 15, гомологичные мРНК генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 соответственно, используются для анализа уровней экспрессии указанных генов, в результате чего при повышенной экспрессии генов ERCC1, МТ2А, RRM1 и TUBB3 и пониженной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к клеткам NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≥0,54 мкМ, и клетки относят к устойчивым, а при пониженной экспрессии генов ERCC1, МТ2А, RRM1 и TUBB3 и повышенной экспрессии генов АВСС1, GSTP1, FTL в исследуемых клетках по отношению к клеткам NCI-H322, IC50 доксорубицина для исследуемых клеток оценивают на уровне IC50≤0,073 мкМ, и клетки относят к чувствительным.
2. Набор олигонуклеотидов SEQ ID NO:1-15 для осуществления способа по п.1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013120607/10A RU2528247C2 (ru) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013120607/10A RU2528247C2 (ru) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013120607A RU2013120607A (ru) | 2013-09-27 |
| RU2528247C2 true RU2528247C2 (ru) | 2014-09-10 |
Family
ID=49253802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013120607/10A RU2528247C2 (ru) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2528247C2 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3404118A1 (en) * | 2017-05-16 | 2018-11-21 | Oncology Venture ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
| US10570457B2 (en) | 2014-09-26 | 2020-02-25 | Medical Prognosis Institute A/S | Methods for predicting drug responsiveness |
| US10907214B2 (en) | 2016-12-30 | 2021-02-02 | Oncology Venture ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
| US11207269B2 (en) | 2009-09-17 | 2021-12-28 | Bio-Bedst Aps | Medical use of sPLA2 hydrolysable liposomes |
| US11421284B2 (en) | 2016-10-07 | 2022-08-23 | Allarity Therapeutics Europe ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100130527A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Lehrer Raphael | Individualized cancer treatment |
| WO2012024543A1 (en) * | 2010-08-18 | 2012-02-23 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| US20120136583A1 (en) * | 2009-07-08 | 2012-05-31 | Worldwide Innovative Network | Method for predicting efficacy of drugs in a patient |
| RU2458131C1 (ru) * | 2010-12-07 | 2012-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта | Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека |
-
2013
- 2013-05-07 RU RU2013120607/10A patent/RU2528247C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100130527A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Lehrer Raphael | Individualized cancer treatment |
| US20120136583A1 (en) * | 2009-07-08 | 2012-05-31 | Worldwide Innovative Network | Method for predicting efficacy of drugs in a patient |
| WO2012024543A1 (en) * | 2010-08-18 | 2012-02-23 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| RU2458131C1 (ru) * | 2010-12-07 | 2012-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта | Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DAN S. ET AL., Identification of candidate predictive markers of anticancer drug sensitivity using a panel of human cancer cell lines, Cancer Sci. 2003, v.94, no.12, p.1074-1082. DAN S. ET AL., An integrated database of chemosensitivity to 55 anticancer drugs and gene expression profiles of 39 human cancer cell lines, Cancer Res, 2002, v.62, no.4, p. 1139-1147. KAWABATA S. ET AL., Expression and functional analyses of breast cancer resistance protein in lung cancer, Clin Cancer Res, 2003, v.9, no.8, p. 3052-3057. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11207269B2 (en) | 2009-09-17 | 2021-12-28 | Bio-Bedst Aps | Medical use of sPLA2 hydrolysable liposomes |
| US10570457B2 (en) | 2014-09-26 | 2020-02-25 | Medical Prognosis Institute A/S | Methods for predicting drug responsiveness |
| US11421284B2 (en) | 2016-10-07 | 2022-08-23 | Allarity Therapeutics Europe ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
| US10907214B2 (en) | 2016-12-30 | 2021-02-02 | Oncology Venture ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
| EP3404118A1 (en) * | 2017-05-16 | 2018-11-21 | Oncology Venture ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
| US10900089B2 (en) | 2017-05-16 | 2021-01-26 | Oncology Venture ApS | Methods for predicting drug responsiveness in cancer patients |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013120607A (ru) | 2013-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102971435B (zh) | 用于内分泌治疗下的乳腺癌复发预测的方法 | |
| US20210108266A1 (en) | Method for discovering pharmacogenomic biomarkers | |
| US20220127676A1 (en) | Methods and compositions for prognostic and/or diagnostic subtyping of pancreatic cancer | |
| CN104093859A (zh) | 多基因生物标志物的鉴定 | |
| AU2014346788A1 (en) | Method for subtyping lymphoma types by means of expression profiling | |
| KR102029775B1 (ko) | 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| CN105925681A (zh) | 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用 | |
| RU2528247C2 (ru) | Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления | |
| EP2982986B1 (en) | Method for manufacturing gastric cancer prognosis prediction model | |
| CN107130027B (zh) | 生物标志物在结直肠癌中的应用 | |
| CN108130368B (zh) | lncRNA在制备诊断或预示青少年特发性脊柱侧凸产品中的应用 | |
| AU2008294687A1 (en) | Methods and tools for prognosis of cancer in ER- patients | |
| AU2016251655A1 (en) | Metagenomic compositions and methods for the detection of breast cancer | |
| CN105985955B (zh) | 小rna组成的指纹图谱在胃癌中的应用 | |
| CN110714080A (zh) | 用于诊断和治疗乳腺癌的生物标志物 | |
| CN110157808A (zh) | 一种与喉鳞癌发生发展相关的非编码rna的应用 | |
| Lang et al. | A comparison of RNA amplification techniques at sub-nanogram input concentration | |
| CN110628914B (zh) | 与乳腺癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用 | |
| EP1683862B1 (en) | Microarray for assessing neuroblastoma prognosis and method of assessing neuroblastoma prognosis | |
| RU2557976C2 (ru) | Способ определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления | |
| US20180113133A1 (en) | Gene relevant to papillary thyroid tumors | |
| CN111100863A (zh) | 小rna组成的指纹图谱在肺癌的诊断和治疗中的应用 | |
| KR101453887B1 (ko) | 퍼플루오르옥탄산 노출 특이적 메틸화 마커 유전자 및 이를 이용한 퍼플루오르옥탄산 노출 여부 확인 방법 | |
| RU2755663C1 (ru) | Способ измерения числа копий митохондриальной ДНК человека методом цифровой полимеразной цепной реакции | |
| CN110079601B (zh) | 放射性相关疾病诊疗标志物及其应用 |