RU2523596C2 - Одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения - Google Patents
Одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2523596C2 RU2523596C2 RU2009145502/10A RU2009145502A RU2523596C2 RU 2523596 C2 RU2523596 C2 RU 2523596C2 RU 2009145502/10 A RU2009145502/10 A RU 2009145502/10A RU 2009145502 A RU2009145502 A RU 2009145502A RU 2523596 C2 RU2523596 C2 RU 2523596C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rna
- nucleotide sequence
- dumbbell
- unpaired nucleotides
- stranded
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 title abstract 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 108
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 108
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 28
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 149
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 23
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical group OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/532—Closed or circular
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
- C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения одноцепочечной кольцевой РНК. Способ включает синтез смысловой цепи и антисмысловой цепи, содержащих нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце и 3'-конце, и одновременно лигирование нуклеотида на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи с нуклеотидом на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи и, наоборот, с использованием лигазы. Нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли. Нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи также связаны друг с другом с образованием петли. Смысловая и антисмысловая цепи спарены с образованием стебля. Длина петли составляет 9 нуклеотидов, а длина стебля составляет от 19 до 31 нуклеотида. 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к одноцепочечной кольцевой РНК, к способу получения такой РНК и к фармацевтической композиции, содержащей такую РНК.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Обычные способы интерференции РНК, как правило, разделяют на две группы: способ с использованием химически синтезированных двухцепочечных РНК и способ с использованием плазмидных векторов. Способ интерференции РНК с использованием плазмидных векторов широко используется в области биотехнологии, главным образом в фундаментальных биологических экспериментах. Однако когда способ интерференции РНК применяется для разработки фармацевтических препаратов, способ с использованием плазмидных векторов связан с проблемой безопасности для человеческого организма. Таким образом, вероятно, более предпочтительным является использование химически синтезированных двухцепочечных РНК.
Однако с химически синтезированными двухцепочечными РНК связана проблема, состоящая в том, что они нестабильны in vivo, а именно восприимчивы к деградации ферментами (нуклеазами) в клетках. Для решения этой проблемы были разработаны цепочки РНК с искусственными нуклеиновыми кислотами для увеличения стабильности двухцепочечных РНК в клетках; однако существует другая проблема, состоящая в том, что их биологическая активность снижается, несмотря на то, что стабильность повышается. Более того, не известна токсичность, вызванная искусственными нуклеиновыми кислотами. Поэтому сохраняется трудность в применении в фармацевтических препаратах.
Формы двухцепочечной РНК, используемые в способе интерференции РНК, включают двухцепочечную РНК, обладающую тупыми концами или липкими концами, РНК, обладающую шпилечной структурой с петлей на любом конце двухцепочечной РНК (JP2003-502012A), кольцевую нуклеиновую кислоту, которая содержит приблизительно 19 пар оснований, две петли, и необязательно химически модифицированные полинуклеотиды (JP2006-271387A), и тому подобное. Однако эту кольцевую нуклеиновую кислоту не подвергали тестированию на эффект интерференции РНК.
Кроме того, описана химерная РНК-ДНК нуклеиновая кислота в форме гантели (JP11-137260A(1999)). Эта нуклеиновая кислота не предназначена для использования для интерференции РНК. Рибонуклеиновая часть нуклеиновой кислоты в форме гантели расщепляется ферментом в клетках, и полученная антисмысловая дезоксирибонуклеиновая часть связывается с мРНК в клетках и ингибирует ее. В JP11-137260A(1999) описана нуклеиновая кислота, которая обладает высокой устойчивостью к ферментам, участвующим в деградации нуклеиновой кислоты в клетках, и остается стабильной в процессе действия рибонуклеазы H из-за ее структуры в форме гантели. Дополнительно описано, что, так как одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий антисмысловую дезоксирибонуклеиновую часть, может быть высвобожден в цитоплазму клетки только после расщепления комплементарной рибонуклеиновой части под действием рибонуклеазы H, то предполагается увеличение антисмыслового эффекта на дозу.
Кроме того, относительно способа синтеза кольцевой нуклеиновой кислоты, обладающей структурой в форме гантели, например, раскрыто, что синтезированы линейные олигонуклеотиды, стебель и петля шпильки образованы для получения одноцепочечного разрыва олигонуклеотида в форме гантели, где мишеневый кольцевой олигонуклеотид в форме гантели (противоположный конец вышеупомянутой петли шпильки) в одном месте не связан, и 5'-конец лигирован лигазой для создания кольцевой нуклеиновой кислоты в форме кольцевой гантели (JP11-137260(1999)).
Целью настоящего изобретения является одноцепочечная кольцевая РНК и способ ее получения.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что одноцепочечная кольцевая РНК может быть получена с высоким выходом посредством раздельного синтеза смысловой цепи и антисмысловой цепи, обе содержат нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на каждом конце, и предоставления лигазе возможности действовать на нуклеотиды на обоих концах одновременно, и что полученная одноцепочечная кольцевая РНК приводит в действие продолжительный или медленно высвобождающийся эффект интерференции РНК. Основываясь на этих научных данных, авторы настоящего изобретения осуществили настоящее изобретение.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующим изобретениям.
(1) Одноцепочечной кольцевой РНК, обладающей продолжительным или медленно высвобождающимся эффектом интерференции РНК, отличающейся тем, что одноцепочечная кольцевая РНК содержит последовательность смысловой цепи, последовательность антисмысловой цепи, комплементарную последовательности смысловой цепи, две одинаковые или отличающиеся последовательности петли между смысловой цепью и антисмысловой цепью, соединяющие обе цепи, где смысловая цепь и антисмысловая цепь спарены с образованием стебля.
(2) Одноцепочечная кольцевая РНК, как описано в (1), где экспрессия мешеневой РНК составляет 0,4 или менее 24 часа после введения одноцепочечной кольцевой РНК в эукариотические клетки, по сравнению с контрольными клетками, уровень экспрессии в которых мишеневой РНК взят за 1.
(3) Одноцепочечная кольцевая РНК согласно вышеупомянутому (1) или (2), где 70% или более одноцепочечной кольцевой РНК после 8 часов сохраняется в сыворотке человека.
(4) Способ получения одноцепочечной кольцевой РНК согласно любому из вышеупомянутых с (1) до (3), включающий синтез смысловой цепи и антисмысловой цепи, которые содержат нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце и 3'-конце, и одновременно лигирование нуклеотида на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи, с нуклеотидом на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи, и наоборот, используя лигазу,
где нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли, нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли, и смысловая цепь, и антисмысловая цепь спарены с образованием стебля.
(5) Способ согласно вышеупомянутому (4), дополнительно включающий фосфорилирование каждого 5'-конца нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи и нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи.
(6) Способ согласно вышеупомянутому (4) или (5), в котором последовательности петли являются одинаковыми или отличаются друг от друга.
(7) Способ согласно любому из вышеупомянутых с (4) до (6), где длина петли составляет от 2 до 20 нуклеотидов.
(8) Способ согласно любому из вышеупомянутых с (4) до (7), где длина стебля составляет от 19 до 31 нуклеотида.
(9) Способ подавления экспрессии гена, кодирующего белок in vitro, включающий введение одноцепочечной кольцевой РНК согласно любому из вышеупомянутых с (1) до (3) в выделенные из человека клетки, и ослабление мишеневой РНК с помощью одноцепочечной кольцевой РНК для продолжительного ингибирования трансляции мишеневой РНК в белок.
(10) Способ подавления экспрессии гена, кодирующего белок, включающий введение одноцепочечной кольцевой РНК согласно любому из вышеупомянутых с (1) до (3) в животных, отличных от человека, растения или их клетки, и ослабление мишеневой РНК с помощью одноцепочечной кольцевой РНК для продолжительного ингибирования трансляции мишеневой РНК в белок.
(11) Фармацевтическая композиция, содержащая одноцепочечную кольцевую РНК согласно любому из вышеупомянутых с (1) до (3) в качестве активного ингредиента.
Как используют в настоящем документе, термин «одноцепочечная кольцевая РНК» может обозначать РНК в форме гантели. РНК в форме гантели относится к одноцепочечной кольцевой РНК, в которой смысловая цепь и антисмысловая цепь комплементарно спарены с образованием стебля, петли образованы обеими сторонами стебля с помощью нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами, и полная форма одноцепочечной кольцевой РНК представляет собой гантель.
Может быть эффективно получена синтетическая РНК в форме гантели по настоящему изобретению, которая обладает отличной стабильностью, устойчивостью и медленно высвобождающимся свойством.
В частности, РНК в форме гантели для использования в способе интерференции РНК может быть получена циклизацией двух цепочек РНК. Так как оба конца закрыты в петлю, у РНК нет конца и поэтому маловероятно, что она будет служить субстратом для ферментнов, экзонуклеазы (РНаза) и тому подобное, за исключением определенных ферментов, таких как дайсер в клетках. Таким образом, она является менее восприимчивой к ферментативной деградации и обладает значительно увеличенной стабильностью в клетке. В результате, отсутствует необходимость в использовании искусственных нуклеиновых кислот для увеличения стабильности.
Кроме того, РНК в форме гантели специфически распознается ферментами in vivo, такими как дайсер в клетках, и петлевые участки на обеих сторонах расщеплены для формирования типа двухцепочечной РНК, встречающегося в природе (фигура 1). В результате, она может обладать активностью, эквивалентной активности двухцепочечной РНК, и приводить в действие более устойчивый или медленно высвобождающийся эффект, чем эффект интерференции РНК с помощью традиционных двухцепочечных РНК.
РНК в форме гантели по настоящему изобретению также является более стабильной, чем обычные двухцепочечные РНК в сыворотке человека.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Изобретение поясняется фиг. 1-9
На фигуре 1 схематически представлен вид РНК в форме гантели по настоящему изобретению.
На фигуре 2 показана структура РНК и изображение электрофореза каждой РНК.
На фигуре 3 показана структура миРНК и РНК в форме гантели.
На фигуре 4 показаны изображения электрофореза РНК в форме гантели и линейных двухцепочечных РНК, расщепленных дайсером.
На фигуре 5 показан эффект интерференции каждой РНК в форме гантели через 24 часа после трансфекции.
На фигуре 6 показан устойчивый эффект интерференции РНК для РНК в форме гантели.
На фигуре 7 показана стабильность РНК в форме гантели в сыворотке человека.
НАЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одноцепочечная кольцевая РНК по настоящему изобретению содержит последовательность смысловой цепи, гомологичную нуклеотидной последовательности мишеневой РНК или ее части, последовательность антисмысловой цепи, которая комплементарна последовательности смысловой цепи и способна спариваться с ней, и последовательности петель, которые не могут образовывать спаривание между цепями.
Смысловая цепь и антисмысловая цепь спарены с образованием стебля. Длина стебля конкретно не ограничена и может быть определена в зависимости от типа, структуры мишеневой РНК и тому подобного. Например, стебель состоит из 19-31 пары оснований, предпочтительно от 21 до 25 пар оснований, более предпочтительно от 22 до 24 пар оснований и еще более предпочтительно 23 пары оснований.
Нуклеотидные последовательности с неспаренными нуклеотидами присутствуют на 5'-конце и 3'-конце как смысловой цепи, так и антисмысловой цепи. Нуклеотид на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи и нуклеотид на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи лигированы вместе с образованием петли. Нуклеотид на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи и нуклеотид на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи лигированы вместе с образованием петли. Длина петли, предпочтительно, составляет от 2 до 20 оснований, более предпочтительно, от 6 до 12 оснований. Поэтому целая одноцепочечная кольцевая РНК, предпочтительно, состоит из от 42 до 102 оснований.
Если нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи представлена как A, то нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи представлена как B, нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи представлена как C, и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи представлена как D, например, если длина петли составляет 20 оснований, то A в длину составляет от 1 до 19 оснований, B в длину составляет от 19 до 1 оснований, C в длину составляет от 19 до 1 основания, и D в длину составляет от 1 до 19 оснований. Поэтому нуклеотид на 5'-конце A и нуклеотид на 3'-конце B лигированы вместе с образованием петли из 20 оснований, и нуклеотид на 3'-конце C и нуклеотид на 5'-конце D лигированы вместе собразованием петли из 20 оснований.
Предпочтительно, последовательности, которые не могут спариваться друг с другом, отличались по длине между A и B, и между C и D, например, на 1 основание, 2 основания или 3 основания или, альтернативно, чтобы последовательности были одинаковой длины. Поэтому, например, если длина петли составляет 8 оснований, предпочтительно, чтобы A составляла от 3 до 5 оснований в длину, B составляла от 5 до 3 оснований в длину, C составляла от 5 до 3 оснований в длину, и D составляла от 3 до 5 оснований в длину. Когда длина петли составляет 9 оснований, предпочтительно, чтобы A составляла от 3 до 6 оснований в длину, B составляла от 6 до 3 оснований в длину, C составляла от 6 до 3 оснований в длину, и D составляла от 3 до 6 оснований в длину. Когда длина петли составляет 10 оснований, предпочтительно, чтобы A составляла от 4 до 6 оснований в длину, B составляла от 6 до 4 оснований в длину, C составляла от 6 до 4 оснований в длину, и D составляла от 4 до 6 оснований в длину.
Кроме того, нуклеотидные последовательности петли, образованной с помощью A и B, и петли, образованной с помощью C и D, могут быть одинаковыми или различными.
Одноцепочечные кольцевые РНК по настоящему изобретению можно использовать в способе интерференции РНК.
Интерференция РНК также известна как RNAi и представляет собой феномен, когда маленькая молекула РНК, обладающая последовательностью, комплементарной мишеневой РНК, связывается с мишеневой РНК, таким образом деградируя мишеневую РНК или подавляя трансляцию мишеневой РНК.
Антисмысловая цепь РНК в форме гантели обладает последовательностью, комплементарной мишеневой РНК (например, мРНК или ее прекурсорной РНК). Кроме того, нуклеотидные последовательности с неспаренными нуклеотидами включают, но ими не ограничиваясь, UUCAAGAGA и UGUGCUGUC (M. Miyagishi et al., Oligonucleotides 2003, Vol. 13: pp. 1-7).
Кроме того, петля в РНК в форме гантели может быть химически модифицирована. Например, стабильность РНК в форме гантели in vivo может быть увеличена посредством модификации полиэтиленгликолем, молекулярная масса которого составляет приблизительно от 2000 до 5000. Петля РНК в форме гантели расщепляется ферментом, подобным дайсеру, в клетках, подлежащих удалению. Поэтому полагают, что полиэтиленгликоль обладает небольшим эффектом, если стебель приводит в действие свой эффект интерференции РНК в виде миРНК или мкРНК.
С РНК в форме гантели по настоящему изобретению, экспрессия мишеневой РНК в клетках, в которые была введена РНК в форме гантели, предпочтительно составляет 0,4 или менее через 24 часа после введения РНК в форме гантели в клетки, по сравнению с контрольными клетками (без введенной РНК в форме гантели), в которых уровень экспрессии мишеневой РНК взят за 1.
В соответствии с настоящим изобретением клетки представляют собой эукариотические клетки, предпочтительно клетки животных и клетки растений.
Экспрессия мишеневой РНК может быть подтверждена, например, трансформацией клеток репортерным геном (например, геном люциферазы, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы или зеленого флуоресцентного белка (GFP)), и измерением окраски или флуоресценции белка, полученного из репортерного гена, для проверки уровня ингибирования экспрессии мишеневой РНК с помощью РНК в форме гантели, где мРНК репортерного гена можно использовать в качестве мишеневой РНК.
Кроме того, РНК в форме гантели по настоящему изобретению отличается тем, что 70% или более РНК в форме гантели сохраняется без деградации после 8 часов в сыворотке человека. Например, это может быть подтверждено инкубацией РНК в форме гантели в сыворотке человека и измерением молекулярной массы с использованием электрофореза и тому подобное для проверки деградации с течением времени.
Способ получения одноцепочечной кольцевой РНК в форме гантели по настоящему изобретению относится к синтезу смысловой цепи и антисмысловой цепи, содержащих нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце и 3'-конце, и одновременно лигированию нуклеотида на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи с нуклеотидом на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи, и наоборот, с использованием лигазы.
Смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть сконструированы для подавления функции мишеневого гена, основанного на нуклеотидной последовательности мишеневого гена. Конструкции могут быть подтверждены посредством синтеза множества смысловых и антисмысловых цепей и тестирования каждой на эффективность подавления. Например, может быть использован алгоритм конструирования с использованием конструкции миРНК или подобной (ссылки: J. A. Jaeger et al., Methods in Enzymology (1989) 183: 281-306; D. H. Mathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-940). При конструировании предпочтительно, чтобы цепи не подавляли экспрессию генов, отличных от мишеневого гена, генов, обладающих последовательностями, сходными с мишеневым геном (что известно как неспецифический эффект). Длины смысловой и антисмысловой цепей предпочтительно разработаны, например, в диапазоне от 19 до 31 основания, предпочтительно от 21 до 25 оснований, более предпочтительно от 22 до 24 оснований и даже более предпочтительно 23 основания.
Мишеневый ген включает, но ими не ограничивается, ген лейкемии abl/bcr, ген VEGF возрастной дегенерации желтого пятна и HCV ген гепатита.
Последовательность, которая впоследствии образует петлю, например вышеупомянутая последовательность UUCAAGAGA, разделена на два фрагмента в случайном положении с образованием нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами (где последовательность состоит из 9 оснований и когда разделена на два фрагмента, как описано выше, разница по длине предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 3 оснований). Последовательность сконструирована так, чтобы один фрагмент был лигирован к 3'-концу антисмысловой цепи и другой лигирован к 5'-концу смысловой цепи. Тем же способом другая последовательность сконструирована так, чтобы один фрагмент был лигирован к 3'-концу смысловой цепи, другой лигирован к 5'-концу антисмысловой цепи. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты, обладающие этими двумя сконструированными последовательностями, синтезируются раздельно. При выполнении этого предпочтительно осуществить фосфорилирование 5'-конца с использованием химического фосфорилирующего агента. Кроме того, предпочтительно сконструировать последовательность с образованием петли, длина которой составляет, например, от 2 до 20 оснований, и, предпочтительно, от 6 до 12 оснований.
Существуют различные способы синтеза нуклеиновых кислот, такие как способ транскрипционного синтеза in vitro, способы с использованием плазмид или вирусных векторов и способы с использованием ПЦР кассет. Хотя способ синтеза нуклеиновых кислот конкретно не ограничен, способ химического синтеза является предпочтительным с точки зрения высокой чистоты, возможности производить большие количества, безопасности использования in vivo, возможности химической модификации и тому подобное. Примеры способа химического синтеза включают, но ими не ограничиваются, способ с H-фосфонатом и способ с фосфорамидитом. Для этой цели можно использовать коммерчески доступные автоматические синтезаторы нуклеиновых кислот.
Концы нуклеотидных последовательностей с неспаренными нуклеотидами на обоих концах смысловой цепи и антисмысловой цепи лигированы лигазой (например, T4 РНК лигазой или T4 ДНК лигазой) с образованием двух петель одновременно. Условия реакции включают, например, инкубирование в буфере, содержащем полиэтиленгликоль (ПЭГ), БСА и тому подобное в течение 20 часов при низкой температуре. Синтезированная одноцепочечная кольцевая РНК в форме гантели может быть собрана и очищена с помощью обычных способов (например, высокоэффективной жидкостной хроматографией и способом с электрофорезом в полиакриламидном геле).
Кроме того, одноцепочечная кольцевая РНК может быть химически модифицирована с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) или тому подобного, когда химическая модификация предпочтительно выполняется в области петли. Для связывания оба конца ПЭГ модифицированы для введения функциональной группы, реагирующей с аминогруппами в основаниях, таких как формильная группа или N-гидроксисукцинимидэфирная группа.
Кроме того, в настоящем документе описывается способ интерференции РНК с использованием РНК в форме гантели, полученной вышеуказанным способом.
Согласно настоящему изобретению одноцепочечная кольцевая РНК по настоящему изобретению может вводиться в клетки и ослаблять мишеневую РНК для продолжительного ингибирования трансляции мишеневой РНК в белок, где клетки человека или не относящегося к человеку животного или клетки растения можно использовать в качестве клеток.
Когда способ интерференции РНК осуществляется in vitro, РНК в форме гантели вводят в клетки, например, способом электропорации, способом микроинъекции, способом липофекции или трансфекцией с фосфатом кальция.
Когда способ интерференции РНК осуществляется in vivo, сначала образец, содержащий РНК в форме гантели, подвергают диализу, регулировке pH или тому подобное для того, чтобы позволить ему приспособиться к живому организму. Способы введения РНК в форме гантели в организм животного или растения включают, но ими не ограничиваются, местное введение, внутривенное введение и способ с использованием генной пушки. При использовании для человека, использование микроорганизмов и тому подобное не является предпочтительным с точки зрения безопасности.
РНК в форме гантели, введенная в клетки, расщепляется дайсером в клетках для создания двухцепочечной РНК (миРНК), которая обладает эффектом интерференции РНК (фигура 1). Концы миРНК могут быть или тупыми концами или липкими концами. миРНК превращается в отдельную цепь с образованием РНК-нуклеазного комплекса (РНК-индуцированный сайленсинг комплекс (RISC)), который распознает мишеневую мРНК, обладающую последовательностью, комплементарной для миРНК, и деградирует мишеневую мРНК, таким образом подавляя экспрессию соответствующего мишеневого гена.
Одноцепочечную кольцевую РНК по настоящему изобретению можно использовать на любых растениях, животных (например, людях, комнатных животных, млекопитающих, включая домашних животных) и их клетках. Ожидается широкое применение в области медицины и сельского хозяйства. Например, одноцепочечную кольцевую РНК по настоящему изобретению можно использовать для различных целей, включая объяснение функции определенного гена или белка в растениях или животных, или на клеточном уровне у растений и животных, с использованием, например, способа нокаута.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей одноцепочечную кольцевую РНК в качестве активного ингредиента.
Количество одноцепочечной кольцевой РНК, введенной в состав фармацевтической композиции, может быть подобрано в соответствии с типом и целью композиции. Например, количество РНК включает, но ими не ограничивается, 1 % масс., 3 % масс., 5 % масс., 10 % масс., 20 % масс., 30 % масс., 40 % масс., 50 % масс., 60 % масс., 70 % масс., 80 % масс., 90 % масс. или 100 % масс. по отношению к общему количеству композиции.
Примеры фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают жидкие препараты (такие как раствор, суспензия, эмульсия), твердые препараты (такие как лиофилизированные препараты, допускающие восстановление перед использованием), препараты, инкапсулированные в липосомы (предпочтительно, катионные липосомы). Кроме того, предпочтительным путем введения является парентеральное введение, которое включает, например, местное введение с применением препарата прямо в пораженный участок, чрезлегочное введение, чресслизистое введение, такое как назальное введение, и внутривенное введение.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать в себя эксципиенты (солевой раствор, стерилизованная вода, раствор Рингера и тому подобное), буферные вещества, тонические средства, стабилизаторы и тому подобное, в зависимости от составов или лекарственных форм.
Кроме того, дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению может меняться в зависимости от пола, веса, возраста, тяжести, симптомов пациента или подобного.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению применима, например, при лечении заболеваний, таких как раковые опухоли (например, подавление функций генов или белков, которые специфически экспрессируются в злокачественных клетках).
В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более конкретно с помощью следующих примеров. Однако следует понимать, что объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение РНК в форме гантели
Все 5'-фосфорилированные РНК, служащие в качестве сырого материала для РНК в форме гантели, были синтезированы на ДНК синтезаторе (GeneWorld H8-SE) в соответствии со способом с фосфороамидитом. Защищенные TBDMS (Proligo Corp.) использовали для РНК амидитов, и химический фосфорилирующий реактив (Glen Research Corp.) использовали для 5'-фосфорилирования. Защитные группы снимали обычным способом, с последующей очисткой электрофорезом в полиакриламидном геле. Последовательности синтезированных РНК показаны в SEQ ID NO:1 (смысловая цепь, 28 мономерных звеньев полимера), SEQ ID NO:2 (антисмысловая цепь, 28 мономерных звеньев полимера), SEQ ID NO:3 (56 мономерных звеньев полимера), и на фигуре 2. Кроме того, в последовательности РНК, показанной на фигуре 2, подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности, которые образуют область петли РНК в форме гантели.
Впоследствии ферментативную реакцию проводили в смеси из 2 мкМ двухцепочечной РНК, 2,0 единиц/мкл T4 РНК лигазы, 0,006% БСА, 25% ПЭГ6000, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT и 1 мМ АТФ в конечном объеме 25 мкл.
Более конкретно, сначала 5'-фосфорилированную двухцепочечную РНК растворили в 12,5 мкл буфера (2 × буфер), содержащего 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 20 мМ MgCl2, 20 мМ DTT и 2 мМ АТФ, при концентрации 4 мкМ. Раствор нагревали при 65°C в течение 5 минут, и затем медленно охлаждали до комнатной температуры. Впоследствии раствор БСА, раствор ПЭГ6000 и T4 РНК лигазу (Takara Bio Inc.) добавляли для образования вышеупомянутого состава и реакционного объема. Затем раствор инкубировали при 11°C в течение 20 часов. РНК собирали преципитацией этанолом и анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле.
На каждой дорожке электрофореза в полиакриламидном геле на фигуре 2 присутствуют следующие образцы.
Дорожка 1: смесь смысловой цепи из 28 оснований и антисмысловой цепи из 28 оснований (маркер)
Дорожка 2: РНК из 57 оснований (маркер)
Дорожка 3: РНК в форме гантели, образованная из смысловой цепи из 28 оснований и антисмысловой цепи из 28 оснований
Дорожка 4: РНК в форме гантели, образованная из 56 оснований (одноцепочечная)
Дорожка 5: смысловая цепь из 28 оснований, обработанная РНК-лигазой (эталон)
Дорожка 6: антисмысловая цепь из 28 оснований, обработанная РНК-лигазой (эталон)
РНК в форме гантели на дорожке 4 изготовили синтезом одинарной цепи, содержащей 56 оснований (SEQ ID NO:3), образующих область стебля и область шпильки, и лигированием первого нуклеотида и последнего нуклеотида T4 лигазой.
Полоса, обведенная в круг на дорожке 3 представляет РНК в форме гантели, изготовленную способом по настоящему изобретению, и выход составил приблизительно 80%. РНК в форме гантели на дорожке 4 имела выход приблизительно 5% или менее.
Пример 2: Проверка длины стебля РНК в форме гантели
РНК, представленные в SEQ ID NO:4-13, были синтезированы с помощью вышеупомянутого ДНК синтезатора. SEQ ID NO:4 и 5 образуют двухцепочечную РНК, которая образует 18 пар оснований (миРНК-1), SEQ ID NO:6 и 7 образуют РНК в форме гантели, длина стебля которой составляет 19 оснований (Db-19), SEQ ID NO:8 и 9 образуют РНК в форме гантели, длина стебля которой составляет 23 основания (Db-23), SEQ ID NO:10 и 11 образуют РНК в форме гантели, длина стебля которой составляет 27 оснований (Db-27), и SEQ ID NO:12 и 13 образуют РНК в форме гантели, длина стебля которой составляет 31 основание (Db-31) (фигура 3).
Ферментативную реакцию проводили в составе из 2 мкМ двухцепочечной РНК, 1,0 единицы/мкл T4 РНК лигазы, 0,006% БСА, 25% ПЭГ6000, 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT и 1 мМ АТФ в реакционном объем в диапазоне от 1,5 до 2,5 мл.
Более конкретно, 5'-фосфорилированную двухцепочечную РНК растворяли в буфере (2×буфер, половина от объема конечного реакционного раствора), содержащем 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 20 мМ MgCl2, 20 мМ DTT и 2 мМ АТФ, при концентрации 4 мкМ. Раствор нагревали при 65°C в течение 5 минут и затем медленно охлаждали до комнатной температуры. Впоследствии, раствор БСА, раствор ПЭГ6000 и T4 РНК лигазу (Takara Bio Inc.) добавляли для образования вышеупомянутого состава и реакционного объема. Затем раствор инкубировали при 11°C в течение 20 часов.
РНК собирали преципитацией спиртом из реакционного раствора, и циклические продукты выделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Полосы, содержащие мишени, визуализировали способом ультрафиолетового оттенения, вырезали, дробили на маленькие кусочки и экстрагировали 3 раза в 4 мл буфера для элюирования (0,2 M NaCl, 1 мМ ЭДТА (pH 8,0)). Экстракт обессаливали с использованием картриджа Sep-Pak (элюированного 6-ю мл 50% ацетонитрила в воде), конденсировали с помощью центробежного испарителя и дополнительно подвергали осаждению спиртом в присутствие ацетата аммония. Количество целей определяли посредством измерения УФ-спектров.
Две единицы ColdShock-DICER (Takara Bio Inc.) добавляли к 2 мкг каждой из вышеупомянутых РНК в форме гантели в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (pH 8,5), 150 мМ NaCl и 2,5 мМ MgCl2 (реакционный объем: 20 мкл), и затем полученный раствор инкубировали при 37°C. После 1, 6 и 18 часов 3 мкл реакционного раствора забирали в качестве образца. Каждый образец смешивали с 2 мкл 120 мМ раствора ЭДТА для остановки ферментативной реакции. Затем их анализировали посредством нативного электрофореза в полиакриламидном геле (электрофорез в 10% полиакриламидном геле, 1×TBE) (после окрашивания в 1×SYBR Green I, образцы визуализировали и количественно оценивали на BioRad Molecular Imager FX).
На фигуре 4 показан электрофорез в полиакриламидном геле каждой РНК в форме гантели. В качестве контроля перед реакцией гантелеобразования реакцию расщепления с использованием двухцепочечной РНК в качестве субстрата проверяли тем же способом. В результате, реакция расщепления Db-19 была выполнена приблизительно на 5% после 1 часа, и синтез двухцепочечных РНК длиной в 20 оснований был подтвержден. Фрагменты расщепления Db-19 в пределах 20 оснований поддерживали почти тот же уровень концентрации после 6 и 18 часов. В отличие от этого почти 100% контроля, содержащего линейную цепь из 19 пар оснований (лайнер), было расщеплено после 1 часа, и наблюдались двухцепочечные РНК длиной в 20 оснований. Впоследствии двухцепочечные РНК продукта деградировали и исчезли со временем. Для Db-23, приблизительно 8% было расщеплено после 1 часа, и были образованы двухцепочечные РНК длиной в 20 оснований. Было подтверждено, что с увеличением длины стебля, скорость расщепления после 1 часа увеличивается на 10% и 20% в Db-27 и Db-31 соответственно. После 18 часов приблизительно 75% Db-19 остаются без изменений, тогда как Db-31 полностью исчезала. На основании этих результатов заключили, что РНК в форме гантели с более короткой длиной стебля является более устойчивой против ферментов.
Пример 3: эффект интерференции РНК для РНК в форме гантели
Эффект интерференции РНК для вышеуказанной РНК в форме гантели (Db-19, Db-23, Db-27 и Db-31) оценивали с помощью эксперимента по ингибированию экспрессии репортерного гена люциферазы светляка pGL3.
Клетки NIH 3T3 (Riken Cell Bank) культивировали в среде DMEM (GIBCO), содержащей 10% ФТС при 37°C в 5% CO2, и аликвоту культуры в 100 мкл инокулировали в каждую лунку 96-луночного планшета при концентрации 1,6×104 клеток/лунка. Образец дополнительно инкубировали при 37°C в 5% CO2 в течение 39 часов, чтобы получить приблизительно 70% степень смыкания монослоя. Затем клетки котрансфецировали 2 типами плазмидных векторов (pGL3-Control и pRL-TK (для внутреннего стандарта), из Promega Corp.) и каждый тип РНК, с использованием реактива для трансфекции GeneSilencer (Genlantis Inc.), в соответствии с протоколом присоединили к реактиву для трансфекции. Состояние концентраций в момент трансфекции было следующим:
0,2 мкг pGL3-Control/0,02 мкг pRL-TK/25 нМ РНК (конечный объем, мкл)
| GeneSilencer | 1 мкл |
| Среда DMEM | 25 мкл |
| Разбавленный раствор миРНК | 2,5 мкл |
| Среда DMEM | 15 мкл |
| РНК (5 пмоль/мкл) | 0,5 мкл |
| pGL3-Control (1 мкг/мкл) | 0,2 мкл |
| pRL-TK (0,1 мкг/мкл) | 0,2 мкл |
| 44,4 мкл |
После трансфекции культуру инкубировали при 37°C в 5% CO2 в течение 4 часов. 100 мкл среды DMEM, содержащей 20% сыворотки, добавляли в каждую лунку. После дополнительного инкубирования при 37°C в течение 20 часов клетки растворяли для измерения уровня экспрессии люциферазы с использованием Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) в соответствии с приложенным протоколом (Условия: количество реактива 30 мкл, время задержки 2 секунды, время считывания 10 секунд. Оборудование: Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter).
Для сравнения, контроль (только буфер) оценивали тем же способом. Интенсивность флуоресценции люциферазы светляка была скорректирована по интенсивности флуоресценции люциферазы renilla в качестве внутреннего стандарта. Результаты показаны на фигуре 5. После 24 часов, среди РНК в форме гантели, Db-23 показала самую высокую активность и проявила эффект ингибирования, равный всего лишь 0,24. Исходя из этих результатов, наиболее предпочтительной длиной двойной цепи считают 23 основания.
Пример 4: Устойчивость эффекта интерференции РНК
Сравнивали устойчивость эффекта интерференции РНК для Db-23 и миРНК-1.
Клетки NIH 3T3 культивировали в Dulbeco's Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco) с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС, Invitro/Gibco) в 5% CO2-увлажненной камере. За 40 часов до трансфекции при 70% степени смыкания монослоя клетки рассеяли в 96-луночные планшеты при плотности 1,6×104 клеток на лунку (100 мкл). Котрансфекцию репортерными плазмидами и РНК проводили с использованием GeneSilencer (Gene Therapy systems, Inc.) в соответствии с предписаниями производителя для прилипающих клеточных линий. На лунку использовали 16 нг/мкл или 1,6 нг/мкл pGL3-Control (Promega Corp.), 1,6 нг/мкл pRL-TK (Promega Corp.) и 25 нМ РНК, смешанных с реактивом для трансфекции (100 мкл). После 4 часов инкубации добавили 100 мкл 20% ФТС в DMEM. При длительной инкубации, превышающей 3 дня, среду заменяли по необходимости. Экспрессию люциферазы наблюдали после 24 часов, 72 часов и 120 часов с помощью Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) в соответствии с инструкциями, предоставленными с Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter (Perkin-Elmer, Inc.) (фиг. 6). Образец без РНК использовали в качестве контроля.
Db-23 и миРНК-1 показали почти одинаковые уровни активности люциферазы после 24 часов. Однако после 120 часов Db-23 показала более выраженный эффект подавления экспрессии гена. Исходя из этих результатов были показаны как медленно высвобождающийся эффект, так и эффект длительной активации РНК в форме гантели.
Пример 5: Стабильность РНК в форме гантели в сыворотке человека
Сравнивали стабильность Db-23 и миРНК в сыворотке человека.
4 мкл предварительно ренатурированной дцРНК (миРНК-1, 20 мкМ) или РНК в форме гантели (Db-23, 20 мкМ) в буфере для ренатурации (100 мМ ацетата калия, 30 мМ HEPES-KOH (pH 7,4), 2 мМ ацетата магния) смешали с 32 мкл PBS, 4 мкл сыворотки здорового человека (Chemicon International, Inc.), инкубировали при 37°C. Аликвоту (5 мкл) забирали после 0,5, 1, 1,5, 3, 8 и 20 часов. Реакцию анализировали с помощью 15% нативного электрофореза в полиакриламидном геле, окрашенном SYBR Green I, и визуализировали с помощью MolecularImager FX (BioRad Laboratories, Inc.).
В результате до 50% миРНК деградировало после 3 часов, тогда как 80% или более Db-23 все еще сохранялось после 3 часов и 70% или более даже после 8 часов. Поэтому можно ожидать высокую стабильность Db-23 in vivo.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Настоящее изобретение можно использовать в качестве молекулы нуклеиновой кислоты, применяемой к живым организмам, и можно производить молекулу с высоким выходом.
Claims (3)
1. Способ получения одноцепочечной кольцевой РНК, включающий синтез смысловой цепи и антисмысловой цепи, содержащих нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце и 3'-конце, и одновременно лигирование нуклеотида на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи с нуклеотидом на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи и, наоборот, с использованием лигазы,
где нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли, нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли и смысловая цепь и антисмысловая цепь спарены с образованием стебля,
где длина петли составляет 9 нуклеотидов, а длина стебля составляет от 19 до 31 нуклеотида.
где нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли, нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 3'-конце смысловой цепи и нуклеотидная последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце антисмысловой цепи связаны друг с другом с образованием петли и смысловая цепь и антисмысловая цепь спарены с образованием стебля,
где длина петли составляет 9 нуклеотидов, а длина стебля составляет от 19 до 31 нуклеотида.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий фосфорилирование каждого 5'-конца нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи и нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи.
3. Способ по п.1 или 2, где последовательности петли являются одинаковыми или отличающимися друг от друга.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007125045A JP5296328B2 (ja) | 2007-05-09 | 2007-05-09 | １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法 |
| JP2007-125045 | 2007-05-09 | ||
| PCT/JP2008/058990 WO2008140126A1 (ja) | 2007-05-09 | 2008-05-09 | １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009145502A RU2009145502A (ru) | 2011-06-20 |
| RU2523596C2 true RU2523596C2 (ru) | 2014-07-20 |
Family
ID=40002313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009145502/10A RU2523596C2 (ru) | 2007-05-09 | 2008-05-09 | Одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20100137407A1 (ru) |
| EP (1) | EP2143792B1 (ru) |
| JP (1) | JP5296328B2 (ru) |
| KR (1) | KR101525633B1 (ru) |
| CN (1) | CN101679962A (ru) |
| AR (1) | AR072034A1 (ru) |
| AU (1) | AU2008250075B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0811440A2 (ru) |
| CA (1) | CA2685994A1 (ru) |
| CO (1) | CO6241167A2 (ru) |
| CY (1) | CY1115283T1 (ru) |
| DK (1) | DK2143792T3 (ru) |
| ES (1) | ES2446040T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20140170T1 (ru) |
| IL (1) | IL201975A (ru) |
| MX (1) | MX2009011101A (ru) |
| MY (1) | MY154495A (ru) |
| NZ (1) | NZ581251A (ru) |
| PL (1) | PL2143792T3 (ru) |
| PT (1) | PT2143792E (ru) |
| RU (1) | RU2523596C2 (ru) |
| SI (1) | SI2143792T1 (ru) |
| TW (1) | TWI468515B (ru) |
| UA (1) | UA101806C2 (ru) |
| WO (1) | WO2008140126A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2788402C2 (ru) * | 2017-03-20 | 2023-01-19 | Иллюмина, Инк. | Способы и композиции для получения библиотек нуклеиновых кислот |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009102081A1 (ja) * | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Riken | 環状１本鎖核酸複合体およびその製造方法 |
| WO2011143659A2 (en) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Fluidigm Corporation | Nucleic acid isolation methods |
| ES2670017T3 (es) * | 2010-07-08 | 2018-05-29 | Bonac Corporation | Molécula de ácido nucleico de cadena simple para el control de la expresión de genes |
| US8785121B2 (en) | 2010-07-08 | 2014-07-22 | Bonac Corporation | Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression |
| US8691782B2 (en) | 2010-08-03 | 2014-04-08 | Bonac Corporation | Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton |
| CA2807552A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP3431485B2 (en) | 2010-10-01 | 2024-09-04 | ModernaTX, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| AR083445A1 (es) | 2010-10-14 | 2013-02-27 | Univ Mie | siARN CONTRA LA FIBROSIS |
| US9115167B2 (en) * | 2011-03-10 | 2015-08-25 | Biomics Biotechnologies Co., Ltd. | Multi-targets interfering RNA molecules and their applications |
| WO2012135805A2 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | modeRNA Therapeutics | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP2763701B1 (en) | 2011-10-03 | 2018-12-19 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
| WO2013077446A1 (ja) * | 2011-11-26 | 2013-05-30 | 株式会社ボナック | 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子 |
| KR20140102759A (ko) | 2011-12-16 | 2014-08-22 | 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물 |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| DE18200782T1 (de) | 2012-04-02 | 2021-10-21 | Modernatx, Inc. | Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen |
| US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| US9663784B2 (en) | 2012-05-26 | 2017-05-30 | Bonac Corporation | Single-stranded nucleic acid molecule for regulating expression of gene having delivering function |
| CA2892529C (en) | 2012-11-26 | 2023-04-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Terminally modified rna |
| JP6296434B2 (ja) * | 2013-01-25 | 2018-03-20 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 機能性核酸分子の構築法 |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| EP2996697B1 (en) * | 2013-05-15 | 2019-06-26 | Robert Kruse | Intracellular translation of circular rna |
| US20160194368A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-07 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
| CN104419704B (zh) * | 2013-09-05 | 2016-09-14 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种内含子来源环形rna分子及其成环关键核酸序列的应用 |
| US10023626B2 (en) | 2013-09-30 | 2018-07-17 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| EA201690675A1 (ru) | 2013-10-03 | 2016-08-31 | Модерна Терапьютикс, Инк. | Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности |
| EP3088524A4 (en) | 2013-12-26 | 2017-08-09 | Tokyo Medical University | Artificial mimic mirna for controlling gene expression, and use of same |
| KR102357337B1 (ko) | 2013-12-27 | 2022-01-28 | 가부시키가이샤 보낙 | 유전자 발현 제어를 위한 인공 매치형 miRNA 및 그 용도 |
| SG11201705223XA (en) | 2014-12-27 | 2017-07-28 | Bonac Corp | NATURALLY OCCURING miRNA FOR CONTROLLING GENE EXPRESSION, AND USE OF SAME |
| WO2016158809A1 (ja) | 2015-03-27 | 2016-10-06 | 株式会社ボナック | デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子 |
| CN105063210A (zh) * | 2015-08-12 | 2015-11-18 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种环状rna的鉴定方法 |
| CN107557363B (zh) * | 2016-06-30 | 2021-03-12 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 可诱导型siRNA表达载体及其制备和应用 |
| WO2018182008A1 (ja) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 株式会社ボナック | 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子 |
| CN110603330B (zh) | 2017-04-28 | 2023-09-05 | 协和麒麟株式会社 | 寡核苷酸衍生物或其盐 |
| EP3642342A4 (en) | 2017-06-23 | 2021-03-17 | Cornell University | RNA MOLECULES, CIRCULAR RNA PRODUCTION METHODS, AND PROCESSING METHODS |
| KR20250035034A (ko) | 2017-09-15 | 2025-03-11 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 | Rna 분자 |
| WO2019074071A1 (ja) * | 2017-10-11 | 2019-04-18 | 日東電工株式会社 | 核酸分子発現の調節 |
| US12357653B2 (en) | 2017-12-15 | 2025-07-15 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof |
| CN108251424A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-07-06 | 天利康（天津）科技有限公司 | 一种单链环状rna和dna及其制备方法和应用 |
| US11920131B2 (en) * | 2018-03-30 | 2024-03-05 | Toray Industries, Inc. | Method of producing hairpin single-stranded RNA molecule |
| BR112020024292A2 (pt) | 2018-06-06 | 2021-03-02 | Massachusetts Institute Of Technology | rna circular para translação em células eucarióticas |
| AU2020232238B2 (en) | 2019-03-01 | 2025-10-30 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Polyribonucleotides and cosmetic uses thereof |
| KR20210134716A (ko) | 2019-03-01 | 2021-11-10 | 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 | 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 위한 조성물, 방법, 및 키트 |
| EP3935162A1 (en) | 2019-03-04 | 2022-01-12 | Flagship Pioneering Innovations VI, LLC | Circular polyribonucleotides and pharmaceutical compositions thereof |
| WO2020198403A2 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof |
| IL288284B2 (en) | 2019-05-22 | 2024-06-01 | Massachusetts Inst Technology | Circular rna compositions and methods |
| WO2020252436A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Circular rnas for cellular therapy |
| US20220305128A1 (en) | 2019-06-19 | 2022-09-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions comprising circular polyribonucleotides for protein modulation and uses thereof |
| JP2022536951A (ja) | 2019-06-19 | 2022-08-22 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー | 環状ポリリボヌクレオチドを投与する方法 |
| GB201913898D0 (en) * | 2019-09-26 | 2019-11-13 | Lightbio Ltd | Nucleic acid construct |
| JP2023504568A (ja) | 2019-12-04 | 2023-02-03 | オルナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 環状ｒｎａ組成物及び方法 |
| US20230104113A1 (en) | 2020-01-29 | 2023-04-06 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Delivery of compositions comprising circular polyribonucleotides |
| EP4096682A1 (en) | 2020-01-29 | 2022-12-07 | Flagship Pioneering Innovations VI, LLC | Compositions for translation and methods of use thereof |
| WO2021236952A1 (en) | 2020-05-20 | 2021-11-25 | Flagship Pioneering, Inc. | Compositions and methods for producing human polyclonal antibodies |
| AU2021275213A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-02-02 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Immunogenic compositions and uses thereof |
| IL298362A (en) | 2020-05-20 | 2023-01-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Coronavirus antigen compositions and their uses |
| WO2022051629A1 (en) | 2020-09-03 | 2022-03-10 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Immunogenic compositions and uses thereof |
| CA3178127A1 (en) | 2021-03-10 | 2022-09-15 | Rznomics Inc. | Self-circularized rna structure |
| EP4392560A4 (en) * | 2021-08-27 | 2024-11-13 | Peking University | CONSTRUCTS AND METHODS FOR THE PRODUCTION OF CIRCULAR RNA |
| CA3238370A1 (en) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses |
| US20250352638A1 (en) | 2021-11-24 | 2025-11-20 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Coronavirus immunogen compositions and their uses |
| MX2024006440A (es) | 2021-11-24 | 2024-08-19 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Composiciones inmunogenicas y sus usos. |
| WO2023115013A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Methods for enrichment of circular rna under denaturing conditions |
| JP2025500360A (ja) | 2021-12-22 | 2025-01-09 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー | ポリリボヌクレオチドを精製するための組成物及び方法 |
| IL313714A (en) | 2021-12-23 | 2024-08-01 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Cyclic polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides |
| US12297285B2 (en) | 2022-06-24 | 2025-05-13 | Orna Therapeutics, Inc. | Circular RNA encoding chimeric antigen receptors targeting BCMA |
| CN115786374B (zh) * | 2022-07-06 | 2023-10-13 | 广州吉赛生物科技股份有限公司 | 一种利用鱼腥藻内含子自剪切核酶精准制备环状rna的方法 |
| AU2023372397A1 (en) | 2022-10-31 | 2025-05-08 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions and methods for purifying polyribonucleotides |
| CN116694638A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-09-05 | 天津微环生物医药科技有限责任公司 | 环状核酸应用-miRNA抑制剂 |
| WO2024192422A1 (en) | 2023-03-15 | 2024-09-19 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Immunogenic compositions and uses thereof |
| KR20250162610A (ko) | 2023-03-15 | 2025-11-18 | 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 | 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이의 용도 |
| WO2024220625A1 (en) | 2023-04-19 | 2024-10-24 | Sail Biomedicines, Inc. | Delivery of polynucleotides from lipid nanoparticles comprising rna and ionizable lipids |
| WO2024220712A2 (en) | 2023-04-19 | 2024-10-24 | Sail Biomedicines, Inc. | Vaccine compositions |
| WO2024220752A2 (en) | 2023-04-19 | 2024-10-24 | Sail Biomedicines, Inc. | Rna therapeutic compositions |
| WO2024226621A1 (en) | 2023-04-25 | 2024-10-31 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Novel internal ribosome entry site (ires) and intron sequences |
| WO2025006684A1 (en) | 2023-06-28 | 2025-01-02 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides |
| WO2025042786A1 (en) | 2023-08-18 | 2025-02-27 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof |
| WO2025106915A1 (en) | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Sail Biomedicines, Inc. | Circular polyribonucleotides encoding glucagon-like peptide 1 (glp-1) and uses thereof |
| WO2025106930A1 (en) | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Sail Biomedicines, Inc. | Circular polyribonucleotides encoding glucagon-like peptide 2 (glp-2) and uses thereof |
| WO2025179198A1 (en) | 2024-02-23 | 2025-08-28 | Sail Biomedicines, Inc. | Circular polyribonucleotides and unmodified linear rnas with reduced immunogenicity |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2003119457A (ru) * | 2000-12-01 | 2004-12-20 | Макс-Планк-Гезелльшафт Цур Фердерунг Дер Виссеншафтен Е.Ф. | Малые молекулы рнк, опосредующие интерференцию рнк |
| US20060051789A1 (en) * | 2004-07-01 | 2006-03-09 | Somagenics, Inc. | Methods of preparation of gene-specific oligonucleotide libraries and uses thereof |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11137260A (ja) | 1997-11-06 | 1999-05-25 | Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk | 抗インフルエンザウイルス環状ダンベル型ｒｎａ−ｄｎａキメラ化合物及び抗インフルエンザウイルス剤 |
| US6210931B1 (en) * | 1998-11-30 | 2001-04-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA |
| DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
| WO2000063364A2 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | American Home Products Corporation | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
| WO2003070918A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Rna interference by modified short interfering nucleic acid |
| RU2322500C2 (ru) * | 2000-12-01 | 2008-04-20 | Макс-Планк-Гезелльшафт Цур Фердерунг Дер Виссеншафтен Е.Ф. | Малые молекулы рнк, опосредующие интерференцию рнк |
| US20040019001A1 (en) * | 2002-02-20 | 2004-01-29 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of protein typrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering RNA |
| US20090247606A1 (en) * | 2001-08-28 | 2009-10-01 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA Interference Mediated Inhibition of Adenosine A1 Receptor (ADORA1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) |
| EP1430157B1 (en) * | 2002-02-20 | 2011-08-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS (HCV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
| AU2003207708A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of map kinase genes |
| AU2003220136A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TGF-BETA AND TGF-BETA RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
| US7501503B2 (en) * | 2002-12-31 | 2009-03-10 | Mcgill University | Compositions and methods for inhibiting RNase H activity of retroid reverse transcriptase |
| EP1644531A4 (en) * | 2003-06-25 | 2009-03-11 | Somagenics Inc | TARGET-INDEPENDENT CIRCULARIZATION AND TOPOLOGICAL ASSOCIATION CAPABLE POLYNUCLEOTIDES |
| US7972816B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-07-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Efficient process for producing dumbbell DNA |
-
2007
- 2007-05-09 JP JP2007125045A patent/JP5296328B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-05-07 AR ARP080101917A patent/AR072034A1/es unknown
- 2008-05-09 CA CA002685994A patent/CA2685994A1/en not_active Abandoned
- 2008-05-09 DK DK08764303.7T patent/DK2143792T3/da active
- 2008-05-09 CN CN200880015108A patent/CN101679962A/zh active Pending
- 2008-05-09 PT PT87643037T patent/PT2143792E/pt unknown
- 2008-05-09 HR HRP20140170AT patent/HRP20140170T1/hr unknown
- 2008-05-09 MY MYPI20094697A patent/MY154495A/en unknown
- 2008-05-09 UA UAA200912771A patent/UA101806C2/ru unknown
- 2008-05-09 NZ NZ581251A patent/NZ581251A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-05-09 SI SI200831175T patent/SI2143792T1/sl unknown
- 2008-05-09 BR BRPI0811440-4A2A patent/BRPI0811440A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-05-09 RU RU2009145502/10A patent/RU2523596C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-05-09 AU AU2008250075A patent/AU2008250075B2/en not_active Ceased
- 2008-05-09 US US12/598,974 patent/US20100137407A1/en not_active Abandoned
- 2008-05-09 PL PL08764303T patent/PL2143792T3/pl unknown
- 2008-05-09 KR KR1020097025654A patent/KR101525633B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2008-05-09 MX MX2009011101A patent/MX2009011101A/es active IP Right Grant
- 2008-05-09 TW TW97117329A patent/TWI468515B/zh not_active IP Right Cessation
- 2008-05-09 EP EP08764303.7A patent/EP2143792B1/en active Active
- 2008-05-09 ES ES08764303.7T patent/ES2446040T3/es active Active
- 2008-05-09 WO PCT/JP2008/058990 patent/WO2008140126A1/ja not_active Ceased
-
2009
- 2009-11-05 IL IL201975A patent/IL201975A/en not_active IP Right Cessation
- 2009-12-09 CO CO09140877A patent/CO6241167A2/es not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-03-24 CY CY20141100228T patent/CY1115283T1/el unknown
-
2017
- 2017-08-21 US US15/681,884 patent/US20180073020A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-12-28 US US16/235,656 patent/US20190292538A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2003119457A (ru) * | 2000-12-01 | 2004-12-20 | Макс-Планк-Гезелльшафт Цур Фердерунг Дер Виссеншафтен Е.Ф. | Малые молекулы рнк, опосредующие интерференцию рнк |
| US20060051789A1 (en) * | 2004-07-01 | 2006-03-09 | Somagenics, Inc. | Methods of preparation of gene-specific oligonucleotide libraries and uses thereof |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2788402C2 (ru) * | 2017-03-20 | 2023-01-19 | Иллюмина, Инк. | Способы и композиции для получения библиотек нуклеиновых кислот |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2523596C2 (ru) | Одноцепочечная кольцевая рнк и способ ее получения | |
| US10323246B2 (en) | Interfering RNA molecules | |
| US20040248299A1 (en) | RNA interference | |
| JP5540312B2 (ja) | 環状１本鎖核酸複合体およびその製造方法 | |
| JPWO2005014810A1 (ja) | ダンベル型ｄｎａの効率的な製造方法 | |
| WO2023245126A2 (en) | Products and compositions | |
| JP2011511776A (ja) | ＲＮＡ干渉のためのカチオン性ｓｉＲＮＡ、合成及び使用 | |
| ES2665274T5 (es) | Nuevas formas adicionales de moléculas de ARN de interferencia | |
| HK1135140B (en) | Single-stranded cyclic rna, and method for production thereof | |
| US20070110722A1 (en) | Methods and compositions for the Synthesis of RNA and DNA | |
| Calegari | Acute RNA Interference for Basic Research and Therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160510 |