RU2520737C1 - METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION - Google Patents
METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- RU2520737C1 RU2520737C1 RU2013119209/10A RU2013119209A RU2520737C1 RU 2520737 C1 RU2520737 C1 RU 2520737C1 RU 2013119209/10 A RU2013119209/10 A RU 2013119209/10A RU 2013119209 A RU2013119209 A RU 2013119209A RU 2520737 C1 RU2520737 C1 RU 2520737C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dbd
- protein
- esat6
- dextran
- pesat6
- Prior art date
Links
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 title claims abstract description 57
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title abstract description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 241000768462 Leuconostoc citreum KM20 Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 claims description 12
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 108010042194 dextransucrase Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001468192 Leuconostoc citreum Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- -1 liproproteins Proteins 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N (R)-flurbiprofen Chemical compound FC1=CC([C@H](C(O)=O)C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 SYTBZMRGLBWNTM-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 1
- 108091034946 ESAT-6 family Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031800 Homeobox protein ESX1 Human genes 0.000 description 1
- 101000920856 Homo sapiens Homeobox protein ESX1 Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001467553 Mycobacterium africanum Species 0.000 description 1
- 241000187919 Mycobacterium microti Species 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000193987 Streptococcus sobrinus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение и преимущественная область использования изобретенияThe technical field to which the invention relates and the preferred field of use of the invention
Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения рекомбинантного (химерного) белка ESAT6-DBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза.The invention relates to genetic engineering, biochemistry, biotechnology and immunology and can be used to produce recombinant (chimeric) protein ESAT6-DBD and an immunogenic composition containing it, aimed at inducing immunity against tuberculosis infection. The invention allows to obtain a producer strain that provides a high level of production of stable immunogenic proteins that can be obtained, immobilized and purified in one stage, as well as to obtain effective immunogenic compositions against tuberculosis.
Описание аналогов изобретенияDescription of the analogues of the invention
Туберкулез (ТБ) остается одной из самых опасных и распространенных инфекционных болезней. По данным ВОЗ в мире регистрируется около 9 млн. новых случаев и около 2 млн смертей в год. В разных регионах России заболеваемость ТБ составляет от 35 до 100 случаев на 100 тыс. населения и остается относительно стабильной в течение последних лет. При этом Россия остается в числе стран с высоким уровнем заболеваемости (в несколько раз выше, чем в Западной Европе и Северной Америке), поэтому создание новых средств борьбы с ТБ - приоритетная задача российской биомедицинской науки.Tuberculosis (TB) remains one of the most dangerous and common infectious diseases. According to the WHO, about 9 million new cases and about 2 million deaths per year are recorded worldwide. In different regions of Russia, the incidence of TB ranges from 35 to 100 cases per 100 thousand people and has remained relatively stable over recent years. At the same time, Russia remains among the countries with a high incidence rate (several times higher than in Western Europe and North America), so the creation of new TB control agents is a priority for Russian biomedical science.
Mycobacterium tuberculosis - это внутриклеточный патоген, и основная роль в адаптивном иммунитете к ТБ принадлежит клеточным, а не гуморальным факторам защиты. Разные группы антигенов микобактерий, например белки теплового шока, липропротеины, секреторные белки, ферменты, изучены достаточно хорошо. По мнению многих авторов основными мишенями (иммунодоминатными антигенами) протективного иммунитета являются секреторные белки, присутствующие в культуральном фильтрате М. tuberculosis. Среди них наиболее полно охарактеризованы близкородственные белки комплекса Ag85 (Ag85A, В и С), ESAT-6 (Early Secret Antigen Target) и CFP-10 (Culture-Filtrate Protein).Mycobacterium tuberculosis is an intracellular pathogen, and cellular rather than humoral defense factors play a major role in adaptive immunity to TB. Different groups of mycobacterial antigens, such as heat shock proteins, liproproteins, secretory proteins, enzymes, have been studied quite well. According to many authors, the main targets (immunodominate antigens) of protective immunity are secretory proteins present in the culture filtrate of M. tuberculosis. Among them, the closely related proteins of the complex Ag85 (Ag85A, B and C), ESAT-6 (Early Secret Antigen Target) and CFP-10 (Culture-Filtrate Protein) are most fully characterized.
Известно изобретение US 2011/0206713 A1, которое описывает иммуногенную композицию или лекарственные средства, состоящие из одного антигена ESAT-6, Ag85A, Ag85B, ТВ10.4 Mycobacterium tuberculosis; сочетания различных химерных белков на основе этих антигенов; использование гибридных (fusion) белков в разных сочетаниях с вакциной BCG.The invention is known US 2011/0206713 A1, which describes an immunogenic composition or drugs consisting of a single antigen ESAT-6, Ag85A, Ag85B, TB10.4 Mycobacterium tuberculosis; combinations of various chimeric proteins based on these antigens; the use of fusion proteins in various combinations with BCG vaccine.
В патенте US 2011/0027349 A1 на изобретение описывается состав иммуногенной композиции, предназначенной для борьбы с латентными формами инфекции и предупреждения развития активного ТБ на основе белков семейства ESX1 и ESAT6.In the patent US 2011/0027349 A1 for the invention describes the composition of the immunogenic composition designed to combat latent forms of infection and prevent the development of active TB based on proteins of the ESX1 and ESAT6 family.
Известно изобретение (патент US8293250 В2), которое описывает иммуногенную композицию для профилактики и лечения заболеваний, вызванных микобактериями (М. tuberculosis, М. Bovis, М. africanum, М. microti). В основе иммуногенных композиций лежат гибридные (fusion) белки, в том числе ESAT6.Known invention (patent US8293250 B2), which describes an immunogenic composition for the prevention and treatment of diseases caused by mycobacteria (M. tuberculosis, M. Bovis, M. africanum, M. microti). The immunogenic compositions are based on fusion proteins, including ESAT6.
Изобретение ЕР 1200466 А2 предполагает создание вакцинных композиций для профилактики туберкулеза на основе белков семейства, к которому принадлежит ESAT6.The invention of EP 1200466 A2 involves the creation of vaccine compositions for the prevention of tuberculosis based on the proteins of the family to which ESAT6 belongs.
Целью приведенных изобретений является создание иммуногенных композиций на основе белков микобактерий, включая ESAT6. Во всех изобретениях не описан способ получения белков, так как это не является предметом патента.The aim of the above inventions is the creation of immunogenic compositions based on proteins of mycobacteria, including ESAT6. All inventions do not describe a method for producing proteins, since this is not the subject of a patent.
Известно изобретение US 6174700, которое описывает способ очистки полипептидов, несущих в своем составе карбогидратсвязывающий домен. В качестве карбогидратсвязывающего домена описывается целлюлозосвязывающий домен.The invention is known US 6174700, which describes a method for purification of polypeptides containing a carbohydrate-binding domain. As the carbohydrate binding domain, a cellulose binding domain is described.
Недостатком изобретения является то, что метод очистки белков, приведенный в качестве примера не может быть применен для фармацевтического применения вследствие загрязнения конечного продукта эндотоксинами E. coli и сложности удаления карбогидратсвязывающего домена из белковой молекулы.The disadvantage of the invention is that the protein purification method given as an example cannot be applied for pharmaceutical use due to contamination of the final product with E. coli endotoxins and the difficulty of removing the carbohydrate-binding domain from the protein molecule.
Найден патент (WO 2009/143413), который описывает использование гибридного белка pneumolysin и микобактериальных белков ESAT6, mtb или Ag85, конъюгированных с полисахаридами, в том числе декстраном. Однако в найденном патенте не используются карбогидратсвязывающие домены, специфически взаимодействующие с полисахаридом, а препараты, полученные описанным в изобретении способом, относятся к классическим конъюгированным вакцинам.A patent has been found (WO 2009/143413) that describes the use of the pneumolysin fusion protein and the mycobacterial proteins ESAT6, mtb or Ag85 conjugated to polysaccharides, including dextran. However, the patent found does not use carbohydrate-binding domains that specifically interact with the polysaccharide, and the preparations obtained by the method described in the invention relate to classical conjugate vaccines.
Известны патенты, в которых описывается использование декстрансвязывающего домена из микроорганизма Leuconostoc mesenteroides в качестве домена, взаимодействующего с декстраном. В патенте RU 2428477 приводится описание химерной белковой конструкции ДСД-сп-β-ГАЛ, содержащей декстрансвязывающий домен из микроорганизма Leuconostoc mesenteroides, который генно-инженерным путем объединен через глицин-сериновый спейсер с термостабильной бета-галактозидазой из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter ethanolicus. Однако в патенте не приводится способ очистки рекомбинантного белка с использованием декстрана в качестве сорбента, а приводимый в патенте пример по определению декстрансвязывающих свойств у химерного белка можно использовать только для очистки термостабильных рекомбинантных белков. Использовать этот метод для получения иммуногенных компонентов медицинских иммунобиологических препаратов невозможно по причине термолабильности антигенов.Patents are known which describe the use of a dextran binding domain from the microorganism Leuconostoc mesenteroides as a domain interacting with dextran. Patent RU 2428477 describes a chimeric protein construct of DSD-cn-β-HAL containing a dextran binding domain from the microorganism Leuconostoc mesenteroides, which is genetically engineered via a glycine-serine spacer with thermostable beta-galactosidase from the thermophilic Thermananaerus microorganism. However, the patent does not provide a method for purifying a recombinant protein using dextran as a sorbent, and the example given in the patent for determining the dextran binding properties of a chimeric protein can be used only for purification of thermostable recombinant proteins. It is impossible to use this method to obtain immunogenic components of medical immunobiological preparations due to the thermolability of antigens.
Описание прототипа изобретенияDescription of the prototype of the invention
Прототипом заявленного изобретения является патент RU 2422525, в котором излагается способ получения рекомбинантного белка ESAT6-CBD, состоящего из антигенного домена - белка ESAT6, и целлюлозосвязывающего домена - CBD. Описана рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD, состоящая из искусственного бактериального оперона химерного белка, включающего промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, ген химерного белка и терминатор транскрипции; бактериального оперона бета-лактамазы и бактериального участка инициации репликации типа ColE1. Изобретение также включает штамм Escherichia coli - продуценты химерного белка ESAT6-CBD, а также способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученного белка на целлюлозе. Кроме того, изобретение относится к самому рекомбинантному белку ESAT6-CBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза.The prototype of the claimed invention is patent RU 2422525, which sets forth a method for producing a recombinant ESAT6-CBD protein consisting of an antigenic domain - ESAT6 protein, and a cellulose-binding domain - CBD. Describes the recombinant plasmid pESAT6-CBD, consisting of an artificial bacterial operon of a chimeric protein, including the promoter region of the early promoter of the bacteriophage T5, the gene of the chimeric protein and the transcription terminator; the bacterial operon of beta-lactamase and the bacterial replication initiation site of ColE1 type. The invention also includes a strain of Escherichia coli - producers of the chimeric protein ESAT6-CBD, as well as a method for immobilizing, concentrating and purifying the resulting protein on cellulose. In addition, the invention relates to the recombinant ESAT6-CBD protein itself and an immunogenic composition containing it, aimed at inducing immunity against tuberculosis infection. The invention allows to obtain a producer strain that provides a high level of production of stable immunogenic proteins that can be obtained, immobilized and purified in one stage, as well as to obtain effective immunogenic compositions against tuberculosis.
Недостатком данного изобретения является низкая биодеградируемость целлюлозы, что ограничивает область применения иммуногенной композиции «рекомбинантный белок ESAT6-CBD - целлюлоза».The disadvantage of this invention is the low biodegradability of cellulose, which limits the scope of the immunogenic composition "recombinant protein ESAT6-CBD - cellulose".
Задача изобретения и способ ее решенияThe objective of the invention and method of solving it
Задачей изобретения является разработка способа получения антигенного белкового компонента вакцины с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих компонентов в бактериальной системе, эффективная система их очистки. Для решения этой задачи используется декстрансвязывающий домен из микроорганизма Leuconostoc citreum для получения стабильной в течение продолжительного времени (не менее года) иммуногенной композиции путем объединения последовательности, кодирующей DBD, с последовательностью микобактериального белка (антигена) и иммобилизации полученного в экспрессионной системе Е. coli химерного антигена на молекуле полисахарида декстран, который применяется в качестве адъюванта.The objective of the invention is to develop a method for producing an antigenic protein component of a vaccine with a high level of expression and stability of these components in the bacterial system, an effective system for their purification. To solve this problem, a dextran domain from the Leuconostoc citreum microorganism is used to obtain an immunogenic composition stable for a long time (at least a year) by combining the DBD coding sequence with the mycobacterial protein (antigen) sequence and immobilizing the chimeric antigen obtained in the E. coli expression system on a dextran polysaccharide molecule that is used as an adjuvant.
При использовании этого подхода был получен двухкомпонентный рекомбинантный белок. Последовательность гена М. tuberculosis ESAT6 кодирует полноразмерный белок, который формирует первый белковый домен, определяющий функциональные иммунологические свойства комплексной молекулы. Далее следует соединяющая (спейсерная) аминокислотная последовательность из нескольких чередующихся остатков глицина и серина (Gly-Ser). Второй белковый домен кодируется последовательностью гена декстрансукразы Leuconostoc citreum KM20, он определяет способность продукта взаимодействовать с декстрановым сорбентом. Белковые продукты нарабатываются в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli. Иммобилизованный на декстране антиген представляет собой суспензию сорбента с адсорбированным на нем белке. Декстрановый носитель выступает в роли адъюванта при иммунизации, так как обеспечивает укрупнение и полимеризацию антигена. Отличительной особенностью декстрана в качестве адъюванта является его биодеградируемость. Антигены в свободном состоянии представляют собой растворы с определенной ионной силой, свободные от примесей липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента.Using this approach, a two-component recombinant protein was obtained. The sequence of the M. tuberculosis ESAT6 gene encodes a full-sized protein that forms the first protein domain that determines the functional immunological properties of the complex molecule. The following is the connecting (spacer) amino acid sequence of several alternating glycine and serine residues (Gly-Ser). The second protein domain is encoded by the sequence of the Leuconostoc citreum KM20 dextransurase gene; it determines the ability of the product to interact with the dextran sorbent. Protein products are produced in non-pathogenic laboratory strains of Escherichia coli. The antigen immobilized on dextran is a suspension of a sorbent with a protein adsorbed on it. Dextran carrier acts as an adjuvant in immunization, as it provides antigen enlargement and polymerization. A distinctive feature of dextran as an adjuvant is its biodegradability. Free antigens are solutions with a certain ionic strength, free from impurities of lipopolysaccharides and DNA of the producer strain.
Очистка конечных продуктов от высокотоксичных для организма липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов является важной проблемой.Purification of end products from highly toxic lipopolysaccharides, ballast proteins, DNA and RNA of producer strains is an important problem.
Использование декстрансвязывающего домена декстрансукразы Leuconostoc citreum определяется тем, что он обеспечивает большую стабильность рекомбинантных белков, чем описанный в литературе последовательности из микроорганизмов Leuconostoc mesenteroides и Streptococcus sobrinus (S. Suwannarangsee, С. Moulis, G. Potocki-Veronese, P. Monsan, M. Remaud-Simeon, and W. Chulalaksananukul, "Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding.,» FEBS letters, vol. 581, no. 24, pp.4675-80, Oct. 2007.).The use of the dextran binding domain of Leuconostoc citreum dextransurase is determined by the fact that it provides greater stability of recombinant proteins than the sequences from microorganisms Leuconostoc mesenteroides and Streptococcus sobrinus (S. Suwannarangsee, C. Moulis, G. Potocki-Veronese, P. Monsan Remaud-Simeon, and W. Chulalaksananukul, "Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding.," FEBS letters, vol. 581, no. 24, pp. 4675-80, Oct. 2007.).
Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет создавать штамм Е. coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка, содержащего белок M. tuberculosis ESAT6; получить простую и эффективную схему очистки рекомбинантного белка, специфически и эффективно индуцирующего иммунный ответ на антиген микобактерий, в том числе синтез ИФН-гамма, необходимый для противотуберкулезной защиты; создать иммуногенную композицию на основе рекомбинантных белка на декстрановом носителе (биодеградируемый адъювант).Thus, the claimed group of inventions allows you to create a strain of E. coli, providing a high level of production of a recombinant protein containing protein M. tuberculosis ESAT6; to obtain a simple and effective scheme for purification of a recombinant protein that specifically and effectively induces an immune response to the mycobacterial antigen, including the synthesis of IFN-gamma, necessary for anti-tuberculosis protection; to create an immunogenic composition based on recombinant protein on a dextran carrier (biodegradable adjuvant).
Указанный результат достигается за счет синтеза рекомбинантного белка ESAT6-DBD в клетках рекомбинантного штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD], несущего рекомбинантную плазмиду pESAT6-DBD. Также за счет создания комплексного препарата ESAT6-DBD-декстран, в котором рекомбинантный белок ESAT6-DBD (концентрация 3,5 мг/мл) иммобилизован на декстране (концентрация декстрана 500 50 мг/мл) и ресуспендирован в 1x PBS буфере рН 7,2-7,4.This result is achieved through the synthesis of the recombinant protein ESAT6-DBD in the cells of the recombinant strain of E. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD], carrying the recombinant plasmid pESAT6-DBD. Also, by creating a complex preparation ESAT6-DBD-dextran, in which the recombinant protein ESAT6-DBD (concentration 3.5 mg / ml) is immobilized on dextran (concentration of
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Создана рекомбинантная плазмида pESAT6-DBD (3753 п.н., последовательность №1), кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок ESAT6-DBD (последовательность №2), обладающий способностью самопроизвольно связываться с декстрансодержащим сорбентом. Плазмида pESAT6-DBD содержит следующие существенные для ее функционирования структурные элементы:Created recombinant plasmid pESAT6-DBD (3753 bp, sequence No. 1) encoding a bifunctional recombinant protein ESAT6-DBD (sequence No. 2), which has the ability to spontaneously bind to a dextran-containing sorbent. Plasmid pESAT6-DBD contains the following structural elements essential for its functioning:
- искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка pESAT6-sp-DBD2, включающий: промоторную область бактериофага Т5 (7-87 п.н.), ген рекомбинантного белка ESAT6-sp-DBD2 (117-852 п.н), нетранслируемую область терминации транскрипции (892-986 п.н.);- artificial bacterial operon of the recombinant protein pESAT6-sp-DBD2, including: the promoter region of the T5 bacteriophage (7-87 bp), the gene of the recombinant protein ESAT6-sp-DBD2 (117-852 bp), the untranslated region of transcription termination ( 892-986 bp);
- бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампицилину (2688-3548 п.н.);- the bacterial operon beta-lactamase, which provides resistance to ampicillin (2688-3548 bp);
- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (2466-2477 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli.- a bacterial site of replication initiation type ColE1 (2466-2477 bp), which ensures replication of the plasmid in E. coli strains.
Штамм-продуцент рекомбинантного белка ESAT6-DBD получают трансформацией клеток Е. coli штамма M15 [pREP4] плазмидой pESAT6-DBD. Штамм обеспечивает продукцию рекомбинантного белка ESAT6-DBD после проведения процедуры индукции изопропил-β-D-тио-галактопиранозидом (ИПТГ) до 25-30% от тотального белка клетки.The ESAT6-DBD recombinant protein producing strain is obtained by transforming E. coli cells of strain M15 [pREP4] with the plasmid pESAT6-DBD. The strain provides the production of recombinant protein ESAT6-DBD after the induction procedure of isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside (IPTG) up to 25-30% of the total protein of the cell.
Штамм Е. coli M15 [pREP4], несущий плазмиду pESAT6-DBD - продуцент бифункционального рекомбинантного белка ESAT6-DBD - характеризуется следующими признаками.The strain E. coli M15 [pREP4], carrying the plasmid pESAT6-DBD - producer of the bifunctional recombinant protein ESAT6-DBD - is characterized by the following features.
Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 2,0% агаризованной средой LB рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-агар, МПА, МПБ).Cultural and morphological characters. Cells are straight, rod-shaped, motionless, gram-negative. When sieving on a plate with 2.0% agarized LB medium, growth is in the form of separate colonies, sometimes in the R-form with uneven edges. It grows well on solid and liquid nutrient media (LB-broth, LB-agar, MPA, MPB).
Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от +4°С до +42°С, при оптимуме рН=6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данного штамма является чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляет устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pESAT6-DBD и к канамицину (до 50 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.Physiological and biochemical characteristics. Cells grow at temperatures from + 4 ° C to + 42 ° C, with optimum pH = 6.8-7.5. The strain decomposes glucose, mannitol with the formation of acid, does not decompose sucrose, arabinose, galactose, ferments maltose, xylose, sorbitol, rhamnose. Significant when using this strain is sensitivity to nalidixic acid (25 mg / ml), streptomycin (20 mg / ml) and rifampicin (25 mg / ml). It is resistant to ampicillin (up to 300 μg / ml) due to the presence of the plasmid pESAT6-DBD and to kanamycin (up to 50 μg / ml) due to the presence of the plasmid pREP4.
По созданию комплексного препарата рекомбинантного белка и декстрана 500 технический результат достигается за счет создания двухкомпонентного рекомбинантного белка, состоящего из белка ESAT6 М. tuberculosis и гена декстрансукразы Leuconostoc citreum KM20. А также за счет получения комплексного препарата (иммунологической композиции), в которой рекомбинантный белок (Ag-DBD) иммобилизован на декстране (Ag-DBD-декстран).To create a complex preparation of recombinant protein and
Рекомбинантный белок ESAT6-DBD имеет в своем составе домен, определяющий его способность связываться с декстраном, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на декстране. Иммобилизация на декстране обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке декстрансвязывающего домена декстрансукразы из микроорганизма Leuconostoc citreum KM20.The recombinant protein ESAT6-DBD incorporates a domain that determines its ability to bind to dextran, which allows concentration, purification and immobilization of the protein product on dextran in one step. Immobilization on dextran is ensured by the presence in the recombinant protein of the dextran binding domain of dextransurase from the microorganism Leuconostoc citreum KM20.
Поскольку в Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с декстраном, то синтезируемый в клетках Е. coli, трансформированных плазмидой pESAT6-DBD, рекомбинантный белок ESAT6-DBD является единственным белком штамма-продуцента, прочно связывающимся с декстраном. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата белка, иммобилизованного на сорбенте. На фиг.1 приведена схема плазмиды pESAT6-DBD.Since there are no dextran binding proteins in E. coli, the recombinant ESAT6-DBD protein synthesized in E. coli cells transformed with the pESAT6-DBD plasmid is the only protein of the producer strain that binds strongly to dextran. This provides the possibility of a single-stage preparation of a highly purified protein preparation immobilized on a sorbent. Figure 1 shows a diagram of the plasmid pESAT6-DBD.
Сравнение стабильности рекомбинантных микобактериальных белков, слитых с декстрансвязывающими доменами из L. mesenteroides и L. citreum выявили, что белки, слитые с декстрансвязывающим доменом из L. mesenteroides являются нестабильными и склонны к деградации при хранении свыше полугода, что не позволяет использовать вышеупомянутый домен для очистки этих рекомбинантных белков. Использование DBD L. citreum в качестве субъединицы, которая связывается с декстраном, позволяет получать более стабильные иммуногенные композиции.Comparison of the stability of recombinant mycobacterial proteins fused to dextran binding domains from L. mesenteroides and L. citreum revealed that proteins fused to the dextran binding domain from L. mesenteroides are unstable and are prone to degradation after storage for more than six months, which makes it impossible to use the above domain for these recombinant proteins. The use of DBD L. citreum as a subunit that binds to dextran allows for more stable immunogenic compositions.
Была исследована иммуногенность комплексного препарата ESAT6-DBD - декстран на мышах линии C57b1/6. Животных иммунизировали под кожу спины 2-кратно с 2-недельным интервалом иммуногенным (рекомбинантный белок ESAT6-DBD на декстране) и контрольным препаратом (физиологический раствор). Через 5 недель был исследован пролиферативный ответ Т-клеток и количество Т-клеток, продуцирующих ИФН-гамма. Был выявлен прирост ИФН-гамма-положительных Т-клеток и усиление пролиферации в присутствии соответствующего антигена в культуре клеток по сравнению с контрольными животными.The immunogenicity of the complex preparation ESAT6-DBD - dextran in C57b1 / 6 mice was investigated. Animals were immunized under the skin of the
Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является получение штамма-продуцента, обеспечивающего высокий уровень продукции устойчивого иммуногенного белка, который может быть получен, иммобилизован и очищен в одну стадию. Нековалентное взаимодействие декстрансвязывающего домена с декстраном обеспечивает постоянный, но медленный выход антигена из комплекса с субстратом за счет естественной диссоциации, тем самым обеспечивая пролонгированное взаимодействие компонентов вакцины с иммунной системой организма (депонирование), достаточное для индукции сильного и продолжительного иммунного ответа. Тем самым достигается получение эффективной иммуногенной композиции против туберкулеза, стабильной в течение продолжительного времени.The technical result achieved by the implementation of the invention is to obtain a producer strain that provides a high level of production of a stable immunogenic protein that can be obtained, immobilized and purified in one stage. The non-covalent interaction of the dextran binding domain with dextran provides a constant, but slow exit of the antigen from the complex with the substrate due to natural dissociation, thereby ensuring a prolonged interaction of the vaccine components with the body's immune system (deposition), sufficient to induce a strong and prolonged immune response. Thereby, obtaining an effective immunogenic composition against tuberculosis that is stable for a long time is achieved.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, приведенными ниже. Генно-инженерные и микробиологические манипуляции, амплификацию и секвенирование ДНК проводили по стандартным методикам (T.Parish, N.G.Stoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, Vol.239, No. 4839, pp.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNAsequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase/nucleotide sequences/bacteriophage 4Х174). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, Vol.74, No.12, pp.5463-5467).The invention is illustrated by the following examples below. Genetic engineering and microbiological manipulations, amplification and DNA sequencing were performed according to standard methods (T. Parish, NGStoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular Cloning, M .: Mir, 1984; DNA Cloning, Methods, Edited by D. Glover, Per. Eng., Moscow, Mir, 1988; Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S. et al. Primer -directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, Vol. 239, No. 4839, pp. 487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson AR DNAsequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase / nucleotide sequences / bacteriophage 4X174). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, Vol. 74, No.12, pp. 5463-5467).
Пример 1. Получение экспрессионной генетической конструкции pESAT6-DBDExample 1. Obtaining the expression of the genetic construct pESAT6-DBD
а) Получение фрагмента гена белка sp-DBD с последующим его клонированном в вектор pQE6.a) Obtaining a fragment of the sp-DBD protein gene followed by its cloned into the pQE6 vector.
Фрагмент гена белка sp-DBD, содержащий Gly-Ser спейсер (последовательность №3) и последовательность декстрансвязывающего домена DBD из Leuconostoc citreum KM20 (последовательность №4), получали синтетическим путем в фирме Евроген. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок sp-DBD, была спланирована с использованием оптимальных кодонов для экспрессии в Е. coli с учетом отсутствия выраженной вторичной структуры мРНК.The sp-DBD protein gene fragment containing the Gly-Ser spacer (sequence No. 3) and the sequence of the DBD dextran domain of Leuconostoc citreum KM20 (sequence No. 4) was synthetically prepared by Eurogen. The nucleotide sequence encoding the sp-DBD protein was designed using optimal codons for expression in E. coli, taking into account the absence of a pronounced secondary structure of mRNA.
Для клонирования гена белка sp-DBD плазмидный вектор pQE6 и синтезированную в фирме Евроген плазмиду pAT-sp-DBD гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoI и Kpn2I при 37°С в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия и 0,1 мг/мл BSA в течение 1 ч. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенный из агарозного геля фрагмент вектора pQE6 (размером 3016 п.н.) объединяли с фрагментом плазмиды pAT-sp-DBD (464 п.н.). Далее фрагменты дотировали при 25°С в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТФ (рН 7,8 при 37°С) с помощью ДНК лигазы бактериофага Т4 в течение 1 ч. Продукты реакции переосаждали при -20°С 96% этиловым спиртом с добавлением ацетата аммония в течение 1,5 ч. После переосаждения смесь растворяли в деионизированной воде. Методом электропорации полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма M15 [pREP4] (NalS, StrS, rifS, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+). После трансформации клоны отбирали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин (50 мг/мл) и канамицин (25 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса; анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BglI, BglII, BspMII и NcoI. Отбирали клоны плазмидной ДНК psp-DBD (3480 п.н.), содержащие в своем составе последовательность гена белка sp-DBD. Первичную структуру полученных генно-инженерных конструкций подтверждали секвенированием.To clone the sp-DBD protein gene, the plasmid vector pQE6 and the plasmid pAT-sp-DBD synthesized at Eurogen were hydrolyzed with restriction endonucleases NcoI and Kpn2I at 37 ° C in a buffer containing 33 mM Tris acetate (pH 7.9 at 37 ° C) , 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate and 0.1 mg / ml BSA for 1 h. Restriction products were separated on a 1.2% agarose gel. A pQE6 vector fragment (3016 bp) isolated from agarose gel was combined with a plasmid fragment pAT-sp-DBD (464 bp). The fragments were then subsidized at 25 ° C in a buffer containing 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.5 mM ATP (pH 7.8 at 37 ° C) using bacteriophage T4 DNA ligase for 1 h. The reaction products were reprecipitated at -20 ° C with 96% ethanol with the addition of ammonium acetate for 1.5 hours. After reprecipitation, the mixture was dissolved in deionized water. Using electroporation, the obtained ligase mixture was used to transform competent E. coli cells of strain M15 [pREP4] (Nal S , Str S , rif S , lac - , ara - , gal - , mtl - , F - , recA + , uvr + ). After transformation, clones were selected on LB agar medium containing antibiotics ampicillin (50 mg / ml) and kanamycin (25 mg / ml). Plasmid DNA from the colonies was isolated by alkaline lysis; were analyzed by restriction mapping with restriction endonucleases BglI, BglII, BspMII and NcoI. Clones of plasmid DNA psp-DBD (3480 bp) containing the sp-DBD protein gene sequence were selected. The primary structure of the resulting genetic engineering constructs was confirmed by sequencing.
б) Получение фрагмента гена белка ESAT6 с последующим его клонированном в плазмиду psp-DBD.b) Obtaining a gene fragment of the ESAT6 protein, followed by its cloned into the plasmid psp-DBD.
Фрагмент гена белка ESAT6 из М. tuberculosis получали синтетическим путем в фирме Евроген. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок ESAT6, была спланирована с использованием оптимальных кодонов для экспрессии в Е. coli с учетом отсутствия выраженной вторичной структуры мРНК.A gene fragment of the ESAT6 protein from M. tuberculosis was synthetically prepared by Eurogen. The nucleotide sequence encoding the ESAT6 protein was designed using optimal codons for expression in E. coli, taking into account the absence of a pronounced secondary structure of mRNA.
Для клонирования гена белка ESAT6-sp-DBD плазмиду psp-DBD и синтезированную в фирме Евроген плазмиду pAT-ESAT6 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoI-BamHI и NcoI-BglII, соответственно, при 37°С в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия и 0,1 мг/мл BSA в течение 1 ч. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенный из агарозного геля фрагмент вектора psp-DBD (размером 3469 п.н.) объединяли с фрагментом плазмиды pAT-ESAT6 (284 п.н.). Далее фрагменты лигировали при 25°С в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТФ (рН 7,8 при 37°С) с помощью ДНК лигазы бактериофага Т4 в течение 1 ч. Продукты реакции переосаждали при -20°С 96% этиловым спиртом с добавлением ацетата аммония в течение 1,5 ч. После переосаждения смесь растворяли в деионизированной воде. Методом электропорации полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма M15 [pREP4] (NalS, StrS, rifS, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+). После трансформации клоны отбирали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин (50 мг/мл) и канамицин (25 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса; анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BglI, BglII, BspMII и NcoI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pESAT6-sp-DBD (3753 п.н.), содержащие в своем составе последовательность гена белка ESAT6-sp-DBD. Первичную структуру полученных конструкций подтверждали секвенированием.To clone the ESAT6-sp-DBD protein gene, the psp-DBD plasmid and the pAT-ESAT6 plasmid synthesized at Eurogen were digested with restriction endonucleases NcoI-BamHI and NcoI-BglII, respectively, at 37 ° C in a buffer containing 33 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37 ° C), 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate and 0.1 mg / ml BSA for 1 h. Restriction products were separated on a 1.2% agarose gel. A psp-DBD vector fragment (3469 bp) isolated from agarose gel was combined with a pAT-ESAT6 plasmid fragment (284 bp). Then the fragments were ligated at 25 ° С in a buffer containing 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.5 mM ATP (pH 7.8 at 37 ° С) using bacteriophage T4 DNA ligase for 1 h. The reaction products were reprecipitated at -20 ° C with 96% ethanol with the addition of ammonium acetate for 1.5 hours. After reprecipitation, the mixture was dissolved in deionized water. Using electroporation, the obtained ligase mixture was used to transform competent E. coli cells of strain M15 [pREP4] (Nal S , Str S , rif S , lac - , ara - , gal - , mtl - , F - , recA + , uvr + ). After transformation, clones were selected on LB agar medium containing antibiotics ampicillin (50 mg / ml) and kanamycin (25 mg / ml). Plasmid DNA from the colonies was isolated by alkaline lysis; were analyzed by restriction mapping with restriction endonucleases BglI, BglII, BspMII and NcoI. Clones of plasmid DNA pESAT6-sp-DBD (3753 bp) containing the sequence of the ESAT6-sp-DBD protein gene were selected. The primary structure of the resulting constructs was confirmed by sequencing.
Пример 2. Конструирование штамма Е. coli - продуцента антигена М. tuberculosis, соединенного с декстрансвязывающим доменом.Example 2. Construction of a strain of E. coli, a producer of M. tuberculosis antigen, coupled to a dextran binding domain.
Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка ESAT6-DBD, клетки штамма Е. coli M15 [pREP4] трансформировали плазмидой pESAT6-DBD. Трансформированные клетки выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм (около 2,5 ч). В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Для контроля продукции рекомбинантных белков в штамме Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] применяли метод электрофореза по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте.To obtain E. coli strain, producer of the recombinant protein ESAT6-DBD, cells of E. coli strain M15 [pREP4] were transformed with plasmid pESAT6-DBD. Transformed cells were grown in 3.5 ml of LB medium with ampicillin and kanamycin at 37 ° C to an optical density corresponding to 1 unit. absorption at a wavelength of 550 nm (about 2.5 hours). 3 μl of a 0.1 M IPTG solution was added to the culture and grown for 3 h. To control the production of recombinant proteins in E. coli M15 strain [pREP4, pESAT6-DBD], the Laemmli electrophoresis method in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) was used. Protein separation was carried out on a 12% polyacrylamide gel (PAGE) in a standard buffer system (electrode buffer: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0.1% sodium dodecyl sulfate, pH 8.3; gel buffer: 375 mM Tris-HCl pH 8.8). At the end of electrophoresis, the gels were stained with 0.15% Coomassie G250 solution in 25% isopropanol and 10% acetic acid and washed in 10% acetic acid.
При сравнении спектра белков в штаммах Е.coli M15 [pREP4] и Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы 26,4 кДа, соответствовала расчетной для белка ESAT6-DBD. Уровень синтеза белков в E. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка-стандарта Unstained Protein Molecular Weight Marker («Fermentas», Литва).When comparing the spectrum of proteins in E. coli M15 [pREP4] and E. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] strains, the appearance of an additional protein band was detected. The molecular weight of the additional band of 26.4 kDa, consistent with the calculated for the ESAT6-DBD protein. The level of protein synthesis in E. coli was determined by comparing the staining intensity of the band of the recombinant protein with the band of the corresponding protein standard Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas, Lithuania).
Для проверки растворимости синтезируемого белка биомассу выращенного штамма (Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD]) подвергали разрушению в 1% TES буфере (25 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 5 мг/мл лизоцим) при соотношении биомасса-буфер 1:2 и гомогенизировали до однородной массы. После центрифугирования пробы разделяли на 2 фракции: растворимых клеточных белков (надосадочная жидкость) и нерастворимых (осадок). Обе фракции подвергали разрушению в лизирующем буфере (0,05 М Трис-HCl, рН 6.8, 0,5% Triton Х-100, 0,5 М NaCl, 0,25 М MgCl2, 5 мг/мл лизоцим, 10 мг/мл PMSF, 20 мг/мл ДНКаза) в соотношении 1:1; гомогенизировали до однородной массы; прогревали при +95°С 15 мин. Результаты контролировали с помощью электрофореза по Лэммли. Было показано, что рекомбинантный белок ESAT6-DBD синтезируется в клетках Е. coli как в растворимой фракции, так и виде телец-включений.To test the solubility of the synthesized protein, the biomass of the grown strain (E. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD]) was destroyed in 1% TES buffer (25 mm Tris-HCl, 5 mm EDTA, 50 mm NaCl, 1% Triton X-100, 5 mg / ml lysozyme) with a biomass-buffer ratio of 1: 2 and homogenized to a homogeneous mass. After centrifugation, the samples were divided into 2 fractions: soluble cellular proteins (supernatant) and insoluble (precipitate). Both fractions were subjected to destruction in a lysis buffer (0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.5% Triton X-100, 0.5 M NaCl, 0.25 M MgCl 2 , 5 mg / ml lysozyme, 10 mg / ml PMSF, 20 mg / ml DNase) in a 1: 1 ratio; homogenized to a homogeneous mass; warmed at + 95 ° C for 15 minutes The results were monitored by electrophoresis according to Laemmli. It was shown that the recombinant ESAT6-DBD protein is synthesized in E. coli cells both in the soluble fraction and in the form of Taurus inclusions.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка ESAT6-DBD в свободном состоянии и в виде белка, иммобилизованного на декстране.Example 3. Obtaining recombinant ESAT6-DBD protein in the free state and in the form of a protein immobilized on dextran.
Для получения рекомбинантного белка культуру штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-DBD] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 100 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 об/мин в течение 15 мин.To obtain a recombinant protein, a culture of E. coli M15 strain [pREP4, pESAT6-DBD] was grown in 1000 ml of LB medium with ampicillin and kanamycin at 37 ° C to an optical density corresponding to 1 unit. absorption at a wavelength of 550 nm. 100 μl of a 0.1 M IPTG solution was added to the medium and grown for 3 hours. Cells were pelleted by centrifugation at 5500 rpm for 15 minutes.
Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,15 мМ PMSF, 0,1% Тритон-Х100, 0,5 мг/мл лизоцима, 20 мг/мл ДНКазы; из расчета 1 г биомассы на 4 мл буфера. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 20 с. После центрифугирования при 16000 об/мин в течение 30 мин фракция нерастворимых клеточных белков оставалась в осадке, растворимых - в надосадочной жидкости.The pellet was resuspended in lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.25 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.15 mM PMSF, 0.1% Triton-X100, 0.5 mg / ml lysozyme, 20 mg / ml DNase; based on 1 g of biomass per 4 ml of buffer. Additionally, the suspension was treated with
Осадок (нерастворимая фракция) суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 0,002 объема β-меркаптанола) и добавляли равный (по массе) объем мочевины. После перемешивания выдерживали на водяной бане при +37°С до полного растворения мочевины. Центрифугировали при 12000 об./мин 30 мин и отбирали надосадочную жидкость. Для очистки рекомбинантного белка надосадочную жидкость переносили на колонку с Sephadex G200 (декстран со сшивками). Элюцию белков с декстрана проводили градиентным раствором (8-2 М) мочевины и 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Для удаления мочевины образцы диализовали против PBS буфера при 25°С в течение ночи.The precipitate (insoluble fraction) was suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.002 volume β-mercaptanol) and an equal (by weight) volume of urea was added. After mixing, it was kept in a water bath at + 37 ° C until the urea was completely dissolved. It was centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes and the supernatant was taken. For purification of the recombinant protein, the supernatant was transferred onto a Sephadex G200 column (dextran crosslinked). Elution of proteins from dextran was carried out with a gradient solution (8-2 M) of urea and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). To remove urea, the samples were dialyzed against PBS buffer at 25 ° C. overnight.
Растворимую фракцию белков использовали для иммобилизации на декстране. К надосадочной жидкости добавляли раствор декстрана 500 с концентрацией 50 мг/мл в физиологическом растворе; инкубировали при 25°С 1 ч. В иммобилизованном на сорбенте состоянии белки представляют собой суспензию.The soluble protein fraction was used for immobilization on dextran. A solution of
Концентрацию белков в свободной и иммобилизованной форме определяли по Бредфорду при длине волны 595 нм. Образцы подвергали лиофилизации. Таким образом, были получены следующие комплексные препараты (иммуногенные композиции) (антиген-DBD, антиген-DBD-декстран), степень чистоты которых составила не менее 95%.The concentration of proteins in free and immobilized form was determined by Bradford at a wavelength of 595 nm. Samples were lyophilized. Thus, the following complex preparations (immunogenic compositions) were obtained (antigen-DBD, antigen-DBD-dextran), the purity of which was not less than 95%.
Пример 4. Оценка стабильности очищенного рекомбинантного белкаExample 4. Evaluation of the stability of the purified recombinant protein
Оценка стабильности рекомбинантных белков, полученного путем слияния последовательности микобактериального белка ESAT6 и DBD Leuconostoc citreum или DBD Leuconostoc mesenteroides, проводилась с помощью электрофореза в 12% ПААГ. Препараты химерных белков ESAT6-DBD Leuconostoc citreum и ESAT6-DBD Leuconostoc mesenteroides хранились при температуре 0-4°С в течение 6 и 12 месяцев с даты лиофилизации. Исследования выявили, что белок ESAT6-DBD Leuconostoc mesenteroides менее стабилен, чем ESAT6-DBD Leuconostoc citreum и после 6 месяцев хранения начинается его денатурация (см. фиг.2, где 1. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. mesenteroides после 6 месяцев хранения; 2. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. mesenteroides после 12 месяцев хранения; М - маркер молекулярных масс; 3. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. citreum после 6 месяцев хранения; 4. Рекомбинантный белок ESAT6-DBD L. citreum после 12 месяцев хранения).Assessment of the stability of recombinant proteins obtained by fusion of the sequence of mycobacterial protein ESAT6 and DBD Leuconostoc citreum or DBD Leuconostoc mesenteroides was carried out by electrophoresis in 12% PAG. The preparations of chimeric proteins ESAT6-DBD Leuconostoc citreum and ESAT6-DBD Leuconostoc mesenteroides were stored at a temperature of 0-4 ° C for 6 and 12 months from the date of lyophilization. Studies have shown that the ESAT6-DBD protein of Leuconostoc mesenteroides is less stable than the ESAT6-DBD Leuconostoc citreum and after 6 months of storage its denaturation begins (see figure 2, where 1. Recombinant ESAT6-DBD L. mesenteroides protein after 6 months of storage; 2. Recombinant protein ESAT6-DBD L. mesenteroides after 12 months of storage; M - molecular weight marker; 3. Recombinant protein ESAT6-DBD L. citreum after 6 months of storage; 4. Recombinant protein ESAT6-DBD L. citreum after 12 months of storage )
Пример 5. Способ проверки иммуногенности комплексных препаратов антиген-DBD-декстран на мышах.Example 5. A method for checking the immunogenicity of complex preparations of antigen-DBD-dextran in mice.
Самкам мышей инбредной линии С57В16 вводили подкожно с двухнедельным интервалом следующие препараты: 1) ESAT-6-DBD-декстран (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); 2) DBD-декстран (10 мкг на мышь по содержанию DBD) - отрицательный контроль; 3) однократно вакцина BCG (106 КОЕ на мышь) - положительный контроль. Через 5 недель оценивали содержание в селезенках Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-гамма в присутствии соответствующих антигенов в культуральной жидкости методом ELISPOT, с подсчетом клеток, реагирующих с антителами анти-ИФН-гамма, через 60 часов после начала культивирования. Результаты приведены в таблице:The following preparations were administered to female C57B16 inbred line mice subcutaneously at a two-week interval: 1) ESAT-6-DBD-dextran (10 μg per mouse according to ESAT-6 content); 2) DBD-dextran (10 μg per mouse by DBD content) - negative control; 3) a single vaccine BCG (10 6 CFU per mouse) - a positive control. After 5 weeks, the content in the spleens of T-lymphocytes producing IFN-gamma in the presence of the corresponding antigens in the culture fluid was evaluated by ELISPOT method, with counting of cells reacting with anti-IFN-gamma antibodies, 60 hours after the start of cultivation. The results are shown in the table:
Результаты показывают, что вакцинация моноантигенами, связанными с декстраном через DBD-домен, приводит к специфической активации продуцентов ИФН-гамма. Вакцинация теми же антигенами, в тех же количествах, но без адсорбции на декстране, не вызывает иммунного ответа.The results show that vaccination with monoantigens bound to dextran via the DBD domain leads to specific activation of IFN-gamma producers. Vaccination with the same antigens, in the same quantities, but without adsorption on dextran, does not cause an immune response.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013119209/10A RU2520737C1 (en) | 2013-04-25 | 2013-04-25 | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013119209/10A RU2520737C1 (en) | 2013-04-25 | 2013-04-25 | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2520737C1 true RU2520737C1 (en) | 2014-06-27 |
Family
ID=51217984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013119209/10A RU2520737C1 (en) | 2013-04-25 | 2013-04-25 | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2520737C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2360926C1 (en) * | 2008-03-17 | 2009-07-10 | Всеволод Иванович Киселев | Hybrid protein cfp10-esat6, inducing reaction of hypersensitivity of delayed type with respect to m tuberculosis, coding it chimeric nucleic acid and recombinant plasmid expression vector, containing it, method of obtaining hybrid protein and based on it dosed medicinal form for intracutaneous injection |
| RU2422525C1 (en) * | 2010-06-15 | 2011-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России) | RECOMBINANT PLASMID, Escherichia coli STRAIN, CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION |
| US20110206713A1 (en) * | 2005-06-23 | 2011-08-25 | Statens Serum Institut | Tuberculosis vaccines comprising antigens expressed during the latent infection phase |
| RU2428477C2 (en) * | 2009-05-15 | 2011-09-10 | Дмитрий Викторович Гришин | RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN |
-
2013
- 2013-04-25 RU RU2013119209/10A patent/RU2520737C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110206713A1 (en) * | 2005-06-23 | 2011-08-25 | Statens Serum Institut | Tuberculosis vaccines comprising antigens expressed during the latent infection phase |
| RU2360926C1 (en) * | 2008-03-17 | 2009-07-10 | Всеволод Иванович Киселев | Hybrid protein cfp10-esat6, inducing reaction of hypersensitivity of delayed type with respect to m tuberculosis, coding it chimeric nucleic acid and recombinant plasmid expression vector, containing it, method of obtaining hybrid protein and based on it dosed medicinal form for intracutaneous injection |
| RU2428477C2 (en) * | 2009-05-15 | 2011-09-10 | Дмитрий Викторович Гришин | RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN |
| RU2422525C1 (en) * | 2010-06-15 | 2011-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России) | RECOMBINANT PLASMID, Escherichia coli STRAIN, CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5327873B2 (en) | Recombinant Helicobacter pylori oral vaccine and preparation method thereof | |
| US11339194B2 (en) | Truncated rotavirus VP4 protein and application thereof | |
| JP7273214B2 (en) | Treatment of canine atopic dermatitis | |
| AU2003291365A1 (en) | Compositions and methods for treating or preventing pneumococcal infection | |
| US11421021B2 (en) | Immunogenic compositions comprising Staphylococcus aureus leukocidin LukA and LukB derived polypeptides | |
| CN107737334A (en) | A kind of multi-joint subunit vaccine of wide spectrum of prevention A type streptococcal infections | |
| CN104560780B (en) | Toxin attenuation mutant for epsilon toxin of clostridium perfringens and application of toxin attenuation mutant | |
| KR20190110090A (en) | Pneumococcal vaccine combining selected alpha-helix domains and proline-rich domains of pneumococcal surface protein A | |
| ES2367128T3 (en) | PROCEDURE FOR PREPARING A VARIANT OF THE SURFACE PROTECTING ANTIGEN OF ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE IN E. COLI. | |
| US10898569B2 (en) | Treatment of peanut allergy | |
| RU2422524C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID, Escherichia coli STRAIN, CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION | |
| RU2422525C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID, Escherichia coli STRAIN, CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION | |
| RU2520737C1 (en) | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION | |
| RU2539026C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pESAT6-CFP10-DBD, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-CFP10-DBD], METHOD FOR PREPARING, IMMOBILISING, CONCENTRATING AND PURIFYING RECOMBINANT PROTEIN ESAT6-CFP10-DBD ON DEXTRAN, RECOMBINANT PROTEIN ESAT6-CFP10-DBD AND IMMUNOGENIC COMPOSITION CONTAINING PROTEIN ESAT6-CFP10-DBD | |
| WO2017113050A1 (en) | Method of preparing porcine circovirus type 2 capsid protein and pharmaceutical composition comprising same | |
| WO2015081711A1 (en) | Antigen chimera, antigen combination, vaccine, method of preparing same, and kit thereof | |
| CN108671227B (en) | Broad-spectrum multi-subunit vaccine for preventing streptococcus suis infection | |
| CN105903009A (en) | Subunit vaccine against Mycobacterium tuberculosis based on modification by arabinogalactan-polyinosinic acid polycytidylic acid and preparation method thereof | |
| RU2546875C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON CFP10-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pCFP10-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pCFP10-DBD] STRAIN; CFP10-DBD CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION | |
| RU2520078C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON Ag85A-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pAg85A-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD] STRAIN; Ag85A-DBD CHIMERIC PROTEIN | |
| KR20210146392A (en) | Optimized cell-free synthesis of invasive plasmid antigen B and related compositions and methods of use | |
| RU2429292C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pAg85A-CBD, Escherichia coli [pREP4, pAg85A-CBD] STRAIN, CHIMERIC PROTEIN Ag85A-CBD AND THEIR APPLICATION | |
| FR2736064A1 (en) | New immunogenic fragments of Bordetella adenyl:cyclase haemolysin | |
| RU2486243C1 (en) | POLYNUCLEOTIDE ENCODING MUTANT RECOMBINANT IgA1 PROTEASE OF Neisseria meningitidis OF SEROGROUP B, RECOMBINANT PLASMID DNA COMPRISING SAID POLYNUCLEOTIDE, HOST CELL CONTAINING SAID PLASMID DNA, RECOMBINANT IgA1 PROTEASE OF Neisseria memingitidis OF SEROGROUP B, METHOD OF PRODUCING MATURE FORM OF IgA1 PROTEASE | |
| RU2560588C1 (en) | METHOD OF PREPARING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON THREE FUSION PROTEINS OF SHELL OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS DEFINING BELONGING TO SIBERIAN (DBD2-D3S), EUROPEAN (DBD2-D3E) AND FAR EAST (DBD2-D3D) VIRUS SUBTYPES; RECOMBINANT PLASMIDS pDBD2-D3S, pDBD2-D3E AND pDBD2-D3D; PRODUCER STRAINS Escherichia coli M15 [pREP4]; CHIMERIC PROTEINS AND THEIR APPLICATION |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |