RU2519947C2

RU2519947C2 - Соединения и фармацевтические композиции для лечения вирусных инфекций

Info

Publication number: RU2519947C2
Application number: RU2011103559/04A
Authority: RU
Inventors: Эрика КРЕТТОН-СКОТТ; Кусум ГУПТА; Бренда ЭРНАНДЕС-САНТИАГО; Марита ЛАРССОН
Original assignee: Айденикс Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2014-06-20
Also published as: JP2014196336A; RU2011103559A; TW201004632A; JP2011526893A; RU2014112319A; WO2010014134A8; CA2729168A1; EP2307434B1; BRPI0913677A2; EP2307434A1; AU2009277172B2; US20100003217A1; HK1156038A1; ES2458358T3; AU2009277172A1; IL210319A0; EP2476690A1; CN102177172A; KR20110065440A; WO2010014134A1

Abstract

Изобретение относится к производным нуклеозидов, композициям на их основе и способам лечения расстройств печени, опосредованных инфекцией Flaviviridae, включая гепатит С. Указанные производные нуклеозидов включают

где R¹ представляет собой гидроксил, амино или бензиламино; и R² представляет собой водород,

,

или

, и когда R¹ представляет собой гидроксил, R² отличен от водорода,

и,

, когда R¹ представляет собой бензиламино, R² отличен от

.

Предложены новые эффективные противовирусные соединения. 11 н. и 32 з.п. ф-лы, 64 табл., 18 пр., 6 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет на основании заявок США № 61/133844, поданной 2 июля 2008 года, и 61/147722, поданной 27 января 2009 года, содержание каждой из которых включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе представлены соединения, способы и фармацевтические композиции для применения в лечении вирусных инфекций, включая инфекцию вирусом гепатита C и инфекцию вирусом гепатита B, у хозяина, нуждающегося в этом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вирусы Flaviviridae

Семейство вирусов Flaviviridae включает по меньшей мере три различных рода: пестивирусы, которые вызывают заболевания у крупного рогатого скота и свиней; флавивирусы, которые являются основной причиной таких заболеваний, как лихорадка денге и желтая лихорадка; и гепацивирусы, единственным представителем которого является HCV. Род флавивирусов включает более 68 представителей, разделенных на группы на основе серологической родственности (Calisher et al., J. Gen. Virol, 1993, 70, 37-43). Клинические симптомы варьируют и включают лихорадку, энцефалит и геморрагическую лихорадку (Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 1996, Chapter 31, 931-959). Представляющие мировой интерес флавивирусы, которые ассоциированы с заболеванием у человека, включают вирусы геморрагической лихорадки денге (DHF), вирус желтой лихорадки, вирус синдрома шока и японского энцефалита (Halstead, S. B., Rev. Infect. Dis., 1984, 6, 251-264; Halstead, S. B., Science, 239:476-481, 1988; Monath, T. P., New Eng. J. Med, 1988, 319, 641-643).

Род пестивирусов включает вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), вирус классической свиной лихорадки (CSFV, также называемый вирусом холеры свиней) и вирус пограничной болезни (BDV) овец (Moennig, V. et al. Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Инфекции пестивирусом домашнего скота (крупного рогатого скота, свиней и овец) вызывают существенные экономические потери по всему миру. BVDV вызывает заболевание слизистой оболочки крупного рогатого скота и имеет большое экономическое значение в промышленном животноводстве (Meyers, G. and Thiel, H.-J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-118; Moennig V., et al., Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Пестивирусы человека не настолько широко охарактеризованы, как пестивирусы животных. Однако серологические исследования указывают на значительное воздействие пестивирусов на человека.

Пестивирусы и гепацивирусы являются близкородственными группами вирусов в семействе Flaviviridae. Другие близкородственные вирусы в этом семействе включают вирус-A GB, подобные вирусу-A GB агенты, вирус-B GB и вирус-C GB (также называемый вирусом гепатита G, HGV). Группа гепацивирусов (вирус гепатита C; HCV) состоит из ряда близкородственных, но генотипически отличающихся вирусов, которые инфицируют людей. Существует приблизительно 6 генотипов HCV и более 50 субтипов. Вследствие сходства между пестивирусами и гепацивирусами в сочетании с низкой способностью гепацивирусов расти эффективно в клеточной культуре, часто в качестве заместительного вируса для исследования вируса HCV используют вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV).

Генетическая организация пестивирусов и гепацивирусов является высоко сходной. Эти РНК-вирусы с положительными цепями имеют одну большую открытую рамку считывания (ORF), кодирующую все вирусные белки, необходимые для репликации вируса. Эти белки экспрессируются в качестве полибелка, который котрансляционно и посттрансляционно процессируется как клеточными, так и кодируемыми вирусом протеазами с образованием зрелых вирусных белков. Вирусные белки, ответственные за репликацию вирусной геномной РНК, расположены около C-конца. Две трети ORF называют неструктурными (NS) белками. Генетическая организация и процессинг полибелка в неструктурной части белка ORF для пестивирусов и гепацивирусов являются высоко сходными. Как для пестивирусов, так и для гепацивирусов зрелые неструктурные (NS) белки, в последовательном порядке от N-конца кодирующей неструктурные белки области к С-концу ORF, состоят из p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B.

NS-белки пестивирусов и гепацивирусов обладают доменами с общими последовательностями, которые являются характерными для определенных белковых функций. Например, белки NS3 вирусов в обеих группах обладают мотивами аминокислотной последовательности, характерными для сериновых протеаз и хеликаз (Gorbalenya et al. (1988) Nature 333:22; Bazan and Fletterick (1989) Virology 171:637-639; Gorbalenya et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17, 3889-3897). Аналогично, белки NS5B пестивирусов и гепацивирусов имеют мотивы, характерные для РНК-направленных РНК-полимераз (Koonin, E.V. and Dolja, V.V. (1993) Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28:375-430).

Истинные роли и функции NS-белков пестивирусов и гепацивирусов в жизненном цикле вирусов являются полностью аналогичными. В обоих случаях сериновая протеаза NS3 отвечает за протеолитический процессинг предшественников полибелков ниже ее положения в ORF (Wiskerchen and Collett (1991) Virology 184:341-350; Bartenschlager et al. (1993) J. Virol. 67:3835-3844; Eckart et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 192:399-406; Grakoui et al. (1993); J. Virol. 67:2832-2843; Grakoui et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10583-10587; Hijikata et al. (1993) J. Virol. 67:4665-4675; Tome et al. (1993) J. Virol. 67:4017-4026). Белок NS4A в обоих случаях действует в качестве кофактора для сериновой протеазы NS3 (Bartenschlager et al. (1994) J. Virol. 68:5045-5055; Failla et al. (1994) J. Virol. 68: 3753-3760; Lin et al. (1994) 68:8147-8157; Xu et al. (1997) J. Virol. 71:5312-5322). Белок NS3 обоих вирусов также выполняет функцию хеликазы (Kim et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 160-166; Jin and Peterson (1995) Arch. Biochem. Biophys., 323:47-53; Warrener and Collett (1995) J. Virol. 69:1720-1726). Наконец, белки NS5B пестивирусов и гепацивирусов имеют предсказанную активность РНК-направленной РНК полимеразы (Behrens et al. (1996) EMBO J. 15:12-22; Lchmann et al. (1997) J. Virol. 71:8416-8428; Yuan et al. (l997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 232:231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; патенты США № 5981247; 6248589 и 6461845 Zhong et al. (1998) J. Virol. 72, 9365-9369).

Вирус гепатита C

Вирус гепатита C (HCV) является основной причиной хронического заболевания печени во всем мире. (Boyer, N. et al. J. Hepatol. 32:98-112, 2000). HCV обусловливает медленнорастущую вирусную инфекцию, и он является основной причиной цирроза и печеночно-клеточной карциномы (Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, Oct.: 80-85, (1999); Boyer, N. et al. J. Hepatol. 32:98-112, 2000). Согласно оценкам 170 миллионов по всему миру инфицировано HCV. (Boyer, N. et al. J. Hepatol. 32:98-112, 2000). В США цирроз, вызываемый хронической инфекцией гепатитом C, является причиной 8000-12000 смертей в год, и инфекция HCV является основным показанием для трансплантации печени.

Известно, что HCV является причиной по меньшей мере 80% просттрансфузионного гепатита и значительной части спорадического острого гепатита. Предварительные данные также указывают на участие HCV во многих случаях "идиопатического" хронического гепатита, "криптогенного" цирроза и, вероятно, печеночно-клеточной карциномы, не связанной с другими вирусами гепатита, такими как вирус гепатита B (HBV). Небольшая доля здоровых людей, по-видимому, являются хроническими носителями HCV, варьируя по географии и другим эпидемиологическим факторам. Их количества могут существенно превышать эти количества для HBV, хотя информация все еще является предварительной; неясно, сколько из этих людей имеют бессимптомное хроническое заболевание печени. (The Merck Manual, 18th ed., (2006)).

HCV является оболочечным вирусом, содержащим геном из положительной одноцепочечной РНК размером приблизительно 9,4 т.п.н. Геном вируса состоит из 5'-нетранслируемой области (UTR), длинной открытой рамки считывания, кодирующей полибелок-предшественник приблизительно из 3011 аминокислот, и короткой 3'-UTR. 5'-UTR является наиболее высоко консервативной частью генома HCV, и она важна для инициации и контроля трансляции полибелка. Трансляция генома HCV инициируется независимым от кэппирования механизмом, известным как внутренняя посадка рибосомы. Этот механизм вовлекает связывание рибосом с последовательностью РНК, известной как участок внутренней посадки рибосомы (IRES). Недавно было определено, что структура псевдоузла РНК является необходимым структурным элементом IRES HCV. Вирусные структурные белки включают нуклеокапсидный коровый белок (C) и два гликопротеина оболочки, E1 и E2. HCV также кодирует две протеазы, цинкзависимую металлопротеиназу, кодируемую областью NS2-NS3, и сериновую протеазу, кодируемую областью NS3. Эти протеазы требуются для расщепления определенных областей полибелка-предшественника на зрелые пептиды. С-концевая половина неструктурного белка 5, NS5B, содержит РНК-зависимую РНК-полимеразу. Функция остальных неструктурных белков, NS4A и NS4B, и функция NS5A (N-концевая половина неструктурного белка 5) остается неизвестной.

Значительная часть современных противовирусных исследований направлена на разработку усовершенствованных способов лечения хронических инфекций HCV у человека (Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, Oct.: 80-85, (1999)).

Ввиду того факта, что инфекция HCV достигла эпидемических уровней по всему миру и имеет трагические последствия для инфицированного пациента, остается острая потребность в предоставлении новых эффективных фармацевтических средств для лечения гепатита C, которые обладают низкой токсичностью для хозяина.

Кроме того, с учетом возрастающей угрозы других инфекций flaviviridae, остается острая потребность в предоставлении новых эффективных фармацевтических средств для лечения инфекций flaviviridae.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, представляют собой соединения формулы I

или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму, где R¹ представляет собой гидроксил, амино или бензиламино; и R² представляет собой водород,

или

так что когда R¹ представляет собой гидроксил, R² отличен от водорода,

и,

и когда R¹ представляет собой бензиламино, R² отличен от

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 1a формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 1b формулы:

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, имеют формулу VI.

или ее фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную формы, где R^a и R^b выбраны следующим образом:

i) R^a представляет собой водород или алкил, и R^b представляет собой алкил, циклоалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил или диалкиламиноалкил; или

ii) R^a и R^b вместе с атомом азота, на котором они являются заместителями, образуют 3-7-членное гетероциклическое или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное одной или двумя алкильными группами.

В определенных вариантах осуществления соединение 1 представляет собой пролекарство исходного лекарственного средства 2'-C-метилгуанозина. Иными словами, исходное лекарственное средство может образовываться путем метаболизма соединения 1 в печени, и, таким образом, исходное лекарственное средство способно накапливаться в печени хозяина.

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, пригодны для предупреждения и лечения инфекций Flaviviridae и других родственных состояний, таких как положительные по антителам против Flaviviridae и положительные по Flaviviridae состояния, хроническое воспаление печени, вызванное HCV, цирроз, фиброз, острый гепатит, молниеносный гепатит, хронический персистирующий гепатит и утомляемость. Эти соединения или составы также можно использовать профилактически для предупреждения или замедления прогрессирования клинического заболевания у индивидов, которые являются положительными по антителам против Flaviviridae или положительными по антигенам Flaviviridae или которые подвергались воздействию Flaviviridae. В одном варианте осуществления Flaviviridae представляет собой гепатит C. В определенных вариантах осуществления соединение применяют для лечения любого вируса, который реплицируется с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы.

В одном варианте осуществления предусматривается способ лечения инфекции Flaviviridae у хозяина, в том числе человека, который включает введение эффективного количества соединения, представленного в настоящем документе, либо отдельно, либо в комбинации или поочередно с другим средством против Flaviviridae, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

В одном аспекте соединения, описанные в настоящем документе, предоставляют или вводят в комбинации со вторым лекарственным средством, таким как средство, пригодное для лечения или предупреждения инфекций HCV. Иллюстративные лекарственные средства подробно описаны в представленных ниже разделах.

В одном варианте осуществления предусматривается способ лечения инфекции Flaviviridae у хозяина, в том числе человека, который включает введение S-(2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2-амино-6-оксо-1,6-дигидропурин-9-ил)-3,4-дигидрокси-4-метилтетрагидрофуран-2-илметокси]бензиламинофосфорилокси}этилового сложного эфира) в количестве от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 150 мг/сутки, либо отдельно, либо в комбинации или поочередно с другим средством против Flaviviridae, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается способ лечения инфекции Flaviviridae у хозяина, в том числе человека, который включает введение S-(2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2-амино-6-оксо-1,6-дигидропурин-9-ил)-3,4-дигидрокси-4-метилтетрагидрофуран-2-илметокси]бензиламинофосфорилокси}этилового сложного эфира) в количестве от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 150 мг/сутки, в комбинации или поочередно с терапевтически эффективным количеством рибавирина, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте осуществления вводимое количество рибавирина составляет от приблизительно 800 мг до приблизительно 1400 мг.

В другом аспекте предусматриваются фармацевтические композиции, стандартные лекарственные формы и наборы, пригодные для применения для лечения или предупреждения расстройств, таких как инфекции HCV, которые содержат терапевтически или профилактически эффективное количество соединения, описанного в настоящем документе, и терапевтически или профилактически эффективное количество второго лекарственного средства, такое как лекарственное средство, пригодное для лечения или предупреждения инфекций HCV.

В определенных вариантах осуществления предусматривается способ лечения расстройства печени, включающий введение индивиду, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения, представленного в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются

(a) соединения, как описано в настоящем документе, и их фармацевтически приемлемые соли и композиции;

(b) соединения, как описано в настоящем документе, и их фармацевтически приемлемые соли и композиции для применения для лечения и/или профилактики расстройства печени, в том числе инфекции Flaviviridae, особенно у индивидов, у которых диагностировано наличие инфекции Flaviviridae или которые имеют риск инфицирования гепатитом C;

(c) способ получения соединений, как описано в настоящем документе;

(d) фармацевтические препараты, содержащие соединение, как описано в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем;

(e) фармацевтические препараты, содержащие соединение, как описано в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемую соль вместе с одним или несколькими другими эффективными средствами против HCV, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе;

(f) способ лечения и/или профилактики у хозяина инфекции Flaviviridae, который включает введение эффективного количества соединения, как описано в настоящем документе, его фармацевтически приемлемой соли или композиции; и

(g) способ лечения и/или профилактики у хозяина инфекции Flaviviridae, который включает введение эффективного количества соединений, как описано в настоящем документе, их фармацевтически приемлемых солей или композиций в комбинации и/или поочередно с одним или несколькими эффективными средствами против HCV.

Flaviviridae, от которых можно лечить, рассмотрены, например, главным образом, в Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 31, 1996. В конкретном варианте осуществления Flaviviridae представляет собой HCV. В альтернативном варианте осуществления Flaviviridae представляет собой флавивирус или пестивирус. Конкретные флавивирусы включают, но не ограничиваются ими: Абсеттаров, Алфуи, Апои, Ароа, Багаза, Банзи, Боубоуи, Буссуквара, Касипакор, острова Керри, летучих мышей Дакара, денге 1, денге 2, денге 3, денге 4, Эдж-хилл, летучих мышей Энтеббе, Гаджетс Галли, Гансалова, Гипр, Ильеус, менингоэнцефалита индюков Израиля, японского энцефалита, Югры, Джутиапа, Кадама, Карши, Кедоугоу, Кокобера, Коутангу, Кумлинге, Кунжин, киасанурской лесной болезни, Лангат, шотландского энцефалита овец, Мибан, Модока, лейкоэнцефалита Монтана-Миотис, энцефалита долины Муррей, Наранжал, Негиши, Нтайя, омской геморрагической лихорадки, летучих мышей Пномпеня, Повассан, Рио-Браво, Росио, Ройял-Фарм, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, Сабойи, энцефалита Сент-Луис, Сал-Виеджа, Сан Перлита, рифов Саумарез, Сепик, Сокулук, Спондвени, Стратфорд, Тембусу, Тюлений, Уганда S, Усуту, Вессельсброна, западного Нила, Яунде, желтой лихорадки и Зика.

Пестивирусы, от которых можно лечить, рассмотрены, главным образом, в Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 33, 1996. Конкретные пестивирусы включают, но не ограничиваются ими, вирус вирусной диарии крупного рогатого скота ("BVDV"), вирус классической свиной лихорадки ("CSFV", также называемый вирусом холеры свиней) и вирус пограничной болезни ("BDV").

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На ФИГ. 1 представлена хроматограмма ВЭЖХ, иллюстрирующая разделение двух диастереомеров соединения 1 с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ - два пика на записи: пик 1 (диастереомер 1) и пик 2 (диастереомер 2), соответствуют диастереомерам соединения 1.

На ФИГ. 2 представлена иллюстративная хроматограмма ВЭЖХ для соединения 1 и стандартов метаболитов, полученных способом 1 примера 14.

На ФИГ. 3 представлена иллюстративная хроматограмма ВЭЖХ соединения 1 и стандартов метаболитов, полученных способом 2 примера 15.

На ФИГ. 4 представлена иллюстративная хроматограмма ВЭЖХ соединения 1 и стандартов метаболитов, полученных способом 2 примера 16.

На ФИГ. 5 представлен результат анализа MacSynergyTM II (независимость Bliss) для пяти индивидуальных групп экспериментальных данных при 99,9% доверительном интервале.

На ФИГ. 6 представлены различия между вычисленными аддитивными и наблюдаемыми эффектами против HCV для всех комбинаций лекарственных средств из 5 независимых экспериментов, которые были получены с помощью программного обеспечения CombiTool с использованием модели аддитивности Loewe.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В настоящем документе представлены соединения, композиции и способы, пригодные для лечения расстройств печени, таких как инфекция HCV, у индивидуума. Кроме того, представлены лекарственные формы, пригодные для таких способов.

Определения

При описании соединений, представленных в настоящем документе, представленные ниже термины имеют следующие значения, если нет иных указаний.

"Фармацевтически приемлемая соль" включает любую соль соединения, представленного в настоящем документе, которая сохраняет его биологические свойства и которая не является токсичной или иным образом нежелательной для фармацевтического применения. Такие соли можно получать из множества органических и неорганических противоионов, хорошо известных в данной области. Такие соли включают (1) кислотно-аддитивные соли, образованные с органическими или неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная, сульфаминовая, уксусная, трифторуксусная, трихлоруксусная, пропионовая, капроновая, циклопентилпропионовая, гликолевая, глутаровая, пировиноградная, молочная, малоновая, янтарная, сорбиновая, аскорбиновая, яблочная, малеиновая, фумаровая, вино-каменная, лимонная, бензойная, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная, пикриновая, коричная, миндальная, фталевая, лауриновая, метансульфоновая, этансульфоновая, 1,2-этандисульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, 4-хлорбензолсульфоновая, 2-нафталинсульфоновая, 4-толуолсульфоновая, камфорная, камфорсульфоновая, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновая, глюкогептоновая, 3-фенилпропионовая, триметилуксусная, трет-бутилуксусная, лаурилсерная, глюконовая, бензойная, глутаминовая, гидроксинафтойная, салициловая, стеариновая, циклогексилсульфаминовая, хинная, муконовая кислота и сходные с ними кислоты; или (2) соли, образованные, когда кислотный протон, присутствующий в исходном соединении, либо (a) заменяется ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия, или гидроксидами щелочных металлов или щелочноземельных металлов, такими как гидроксид натрия, калия, кальция, магния, алюминия, лития, цинка и бария, аммиаком, либо (b) координируется с органическим основанием, таким как алифатическим, алициклические или ароматические органические амины, такие как аммиак, метиламин, диметиламин, диэтиламин, пиколин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, этилендиамин, лизин, аргинин, орнитин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, диэтаноламин, прокаин, N-бензилфенэтиламин, N-метилглюкаминпиперазин, трис(гидроксиметил)аминометан, гидроксид тетраметиламмония и т.п.

Кроме того, соли включают, только в качестве примера, соли натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.п., и когда соединение содержит основную функциональную группу, соли нетоксических органических или неорганических кислот, такие как гидрогалогениды, например гидрохлорид и гидробромид, сульфат, фосфат, сульфамат, нитрат, ацетат, трифторацетат, трихлорацетат, пропионат, гексаноат, циклопентилпропионат, гликолят, глутарат, пируват, лактат, малонат, сукцинат, сорбат, аскорбат, малат, малеат, фумарат, тартрат, цитрат, бензоат, 3-(4-гидроксибензоил)бензоат, пикрат, циннамат, манделат, фталат, лаурат, метансульфонат (мезилат), этансульфонат, 1,2-этандисульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, бензолсульфонат (безилат), 4-хлорбензолсульфонат, 2-нафталинсульфонат, 4-толуолсульфонат, камфорат, камфорсульфонат, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоксилат, глюкогептонат, 3-фенилпропионат, триметилацетат, трет-бутилацетат, лаурилсульфат, глюконат, бензоат, глутамат, гидроксинафтоат, салицилат, стеарат, циклогексилсульфамат, хинат, муконат и т.п.

Термин "чистый" или "очищенный" в отношении соединения, предоставленного в настоящем документе, включает композицию, которая включает по меньшей мере от 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9% до 100% по массе, соединения, а остальная часть содержит другие химические вещества или диастереомеры. Как используют в настоящем документе термин "чистый", когда его применяют к хиральному соединению, относится к энантиомеру или диастереомеру хирального соединения, по существу, не содержащему его противоположного энантиомера или диастереомера (т.е. в энантиомерном или диастереомерном избытке). Например, чистая "R"-форма соединения по существу не содержит "S"-формы соединения и, таким образом, находится в энантиомерном или диастереомерном избытке относительно "S"-формы. Термин "энантиомерно или диастереомерно чистый" или "чистый энантиомер или диастереомер" означает, что соединение содержит избыток энантиомера или диастереомера, например, более 75% по массе, более 80% по массе, более 85% по массе, более 90% по массе, более 91% по массе, более 92% по массе, более 93% по массе, более 94% по массе, более 95% по массе, более 96% по массе, более 97% по массе, более 98% по массе, более 98,5% по массе, более 99% по массе, более 99,2% по массе, более 99,5% по массе, более 99,6% по массе, более 99,7% по массе, более 99,8% по массе или более 99,9% по массе энантиомера или диастереомера. В определенных вариантах осуществления масса представлена в расчете на общую массу соединения, т.е. всех энантиомеров или диастереомеров соединения. В определенных вариантах осуществления один энантиомер или диастереомер может быть в избытке на 30-80% или на 30-70%, 30-60%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% или 60%, или на любой процент между этими значениями.

Аналогично термин "выделенный" в отношении соединения включает композицию, которая включает по меньшей мере от 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% до 100% по массе, соединения, а остальная часть содержит другие химические вещества или энантиомеры или диастереомеры.

"Сольват" включает соединение, представленное в настоящем документе, или его соль, которая, кроме того, включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, связанного нековалентными межмолекулярными силами. Когда растворитель представляет собой воду, сольват представляет собой гидрат.

Термин "хозяин", как используют в настоящем документе, включает любой одноклеточный или многоклеточный организм, в котором может реплицироваться вирус, включая клеточные линии и животных, и предпочтительно человека. Альтернативно хозяин может содержать часть генома вируса Flaviviridae, репликация или функция которого могут быть изменены с помощью соединений, представленных в настоящем документе. Термин "хозяин" конкретно включает инфицированные клетки, клетки, трансфицированные всем геномом Flaviviridae или его частью, и животных, в частности, приматов (в том числе шимпанзе) и людей. В большинстве применений у животных хозяином является пациент-человек. Однако также в настоящем документе предусматриваются ветеринарные применения при определенных показаниях (например, у шимпанзе).

Как используют в настоящем документе, термины "индивидуум" и "пациент" используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Термины "индивидуум" и "индивидуумы" относятся к животному, такому как млекопитающее, включающее не примата (например, корову, свинью, лошадь, кошку, собаку, крысу и мышь) и примата (например, обезьяну, такую как яванский макак, шимпанзе и человек), и например, человека. В одном варианте осуществления индивидуум являются рефрактерным или не отвечающим на современные способы лечения инфекции гепатитом C. В другом варианте осуществления индивидуумом является сельскохозяйственное животное (например, лошадь, корова, свинья и т.д.) или домашнее животное (например, собака или кошка). В одном варианте осуществления индивидуумом является человек.

Как используют в настоящем документе, термины "лекарственное средство" и "лекарственные средства" относятся к любому средству(ам), которое можно использовать для лечения или предупреждения расстройства или одного или нескольких его симптомов. В определенных вариантах осуществления термин "лекарственное средство" включает соединение, представленное в настоящем документе. В одном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой средство, которое, как известно, является пригодным для лечения или предупреждения расстройства или одного или нескольких его симптомов, или средство, которое использовали или в настоящее время используют для лечения или предупреждения расстройства или одного или нескольких его симптомов.

"Терапевтически эффективное количество" включает количество соединения или композиции, которое при введении индивидууму для лечения заболевания является достаточным для осуществления такого лечения заболевания. "Терапевтически эффективное количество" может варьировать, в зависимости, помимо прочего, от соединения, заболевания и его тяжести и возраста, массы тела и т.д. индивидуума, подвергаемого лечению.

"Проведение лечения" или "лечение" любого заболевания или расстройства относится, в одном варианте осуществления, к смягчению заболевания или расстройства, которое имеется у индивидуума. В другом варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" включает смягчение по меньшей мере одного физического параметра, который может быть неощутимым для индивидуума. В другом варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" включает модулирование заболевания или расстройства, либо физически (например, стабилизация ощущаемого симптома), либо или физиологически (например, стабилизация физического параметра) или обоими путями. В другом варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" включает замедление начала заболевания или расстройства.

Как используют в настоящем документе, термины "профилактическое средство" и "профилактические средства" относятся к любому средству(ам), которое можно использовать для предупреждения расстройства или одного или нескольких его симптомов. В определенных вариантах осуществления термин "профилактическое средство" включает соединение, представленное в настоящем документе. В некоторых других вариантах осуществления термин "профилактическое средство" не относится к соединению, представленному в настоящем документе. Например, профилактическое средство представляет собой средство, которое известно в качестве пригодного для предупреждения или препятствования возникновению, развитию, прогрессированию и/или тяжести расстройства, или средство, которое использовали или в настоящее время используют для этого.

Как используют в настоящем документе, выражение "профилактически эффективное количество" включает количество лекарственного средства (например, профилактического средства), которое является достаточным, чтобы обеспечить предупреждение или снижение развития, рецидива или возникновения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с расстройством (или чтобы усилить или улучшить профилактический эффект(ы) другого лекарственного средства (например, другого профилактического средства).

Как используют в настоящем документе, "изотопный состав" относится к количеству каждого изотопа, присутствующего для данного атома, и "природный изотопный состав" относится к встречающемуся в природе изотопному составу или преобладанию для данного атома. Атомы, имеющие их природный изотопный состав, могут также называться "необогащенными" атомами. Если нет иных обозначений, подразумевается, что атомы соединений, приведенных в настоящем документе, соответствуют любому стабильному изотопу этого атома. Например, если нет иных указаний, когда положение обозначено, в частности, как "H" или "водород", подразумевают, что в данном положении находится водород в соответствии с его природным изотопным составом.

Как используют в настоящем документе, "изотопно обогащенный" относится к атому, имеющему изотопный состав, отличный от природного изотопного состава для этого атома. "Изотопно обогащенный" также может относиться к соединению, содержащему по меньшей мере один атом, имеющий изотопный состав, отличный от природного изотопного состава для этого атома.

Как используют в настоящем документе "изотопное обогащение" относится к проценту включения количества конкретного изотопа данного атома в молекуле вместо изотопа этого атома, преобладающего в природе. Например, обогащение дейтерием, составляющее 1%, в данном положении, означает, что 1% молекул в данном образце содержит дейтерий в указанном положении. Поскольку встречающееся в природе распределение дейтерия составляет приблизительно 0,0156%, обогащение дейтерием в данном положении соединения, синтезированного с использованием необогащенных исходных материалов, составляет приблизительно 0,0156%. Изотопное обогащение соединений, представленных в настоящем документе, можно определять с использованием общепринятых аналитических способов, известных специалисту в данной области, включая масс-спектрометрию и ядерную магнитно-резонансную спектроскопию.

Соединения

Соединения, представленные в настоящем документе, являются производными 2'-C-метилгуанозина. Соединения пригодны для лечения и/или профилактики инфекций Flaviviridae и вирусом гепатита C.

В одном варианте осуществления соединения, представленные в настоящем документе, представляют собой диастереомеры или метаболиты S-2-{[(2R,3R,4R,5R)-5-(2-амино-6-оксо-1,6-дигидропурин-9-ил)-3,4-дигидрокси-4-метилтетрагидрофуран-2-илметокси]бензиламинофосфорилокси}этилового сложного эфира 3-гидрокси-2,2-диметилтиопропионовой кислоты, обозначенного в настоящем документе как соединение 1. Соединение 1 имеет следующую структуру:

Соединение 1

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 1a, имеющее формулу:

или его фармацевтически приемлемая соль, стереоизомер, сольват или гидрат. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 1a. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 1a.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 1b, имеющее формулу:

или его фармацевтически приемлемая соль, стереоизомер, сольват или гидрат. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 1b. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 1b.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма, где R¹ представляет собой гидроксил, амино или бензиламино; и R² представляет собой водород,

или

и,

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы I.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение формулы Ia:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение формулы Ib:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы Ia или Ib. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение формулы Ia или Ib.

В одном варианте осуществления R¹ представляет собой гидроксил, амино или бензиламино. В другом варианте осуществления R¹ представляет собой амино или бензиламино. В другом варианте осуществления R¹ представляет собой гидрокси.

В одном варианте осуществления R² представляет собой водород,

или

В другом варианте осуществления R² представляет собой водород,

или

В одном варианте осуществления R² представляет собой водород.

В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы II:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму, где R² представляет собой водород,

или

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы II.

В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы IIa:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму.

В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы IIb:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы IIa или IIb. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение формулы IIa или IIb.

В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы III:

или

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы III.

В одном варианте соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы IIIa:

В одном варианте соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы IIIb:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы IIIa или IIIb. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение формулы IIIa или IIIb.

В одном варианте соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы IV:

или

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы IV.

В одном варианте соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы V:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму, где R¹ представляет собой гидроксил или амино.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы V.

В одном варианте соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы Va:

В одном варианте соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой соединение формулы Vb:

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомерную или таутомерную форму. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение формулы Va или Vb. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение формулы Va или Vb.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 2 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 2.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 2a формулы:

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 2b формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 2a или 2b. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 2a или 2b.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 3 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 3.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 3a формулы:

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 3b формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 3a или 3b. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 3a или 3b.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 4 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 4.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 5 формулы:

или фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 5.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 6 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 6.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 7 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 7.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 8 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 8.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 9 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 9.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 9a формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 9a. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 9a.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 9b формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 9b. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 9b.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 10 формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 10.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 10a формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 10a. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 10a.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 10b формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 10b. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 10b.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 11 формулы:

Соединение 11

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 11.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 11a формулы:

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение 11b формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается чистое соединение 11a или 11b. В другом варианте осуществления в настоящем документе предусматривается диастереомерно чистое соединение 11a или 11b.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматривается изотопно обогащенное соединение, выбранное из группы, состоящей из изотопно обогащенного соединения формулы I, изотопно обогащенного соединения формулы Ia, изотопно обогащенного соединения формулы Ib, изотопно обогащенного соединения формулы II, изотопно обогащенного соединения формулы IIa, изотопно обогащенного соединения формулы IIb, изотопно обогащенного соединения формулы III, изотопно обогащенного соединения формулы IIIa, изотопно обогащенного соединения формулы IIIb, изотопно обогащенного соединения формулы IV, изотопно обогащенного соединения формулы V, изотопно обогащенного соединения формулы Va и изотопно обогащенного соединения формулы Vb.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматривается изотопно обогащенное соединение, выбранное из группы, состоящей из изотопно обогащенного соединения формулы VI, изотопно обогащенного соединения формулы VIa и изотопно обогащенного соединения формулы VIb.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматривается изотопно обогащенное соединение, выбранное из группы, состоящей из изотопно обогащенного соединения 1, изотопно обогащенного соединения 1a, изотопно обогащенного соединения 1b, изотопно обогащенного соединения 2, изотопно обогащенного соединения 2a, изотопно обогащенного соединения 2b, изотопно обогащенного соединения 3, изотопно обогащенного соединения 3a, изотопно обогащенного соединения 3b, изотопно обогащенного соединения 4, изотопно обогащенного соединения 5, изотопно обогащенного соединения 6, изотопно обогащенного соединения 7, изотопно обогащенного соединения 8, изотопно обогащенного соединения 8a, изотопно обогащенного соединения 8b, изотопно обогащенного соединения 9, изотопно обогащенного соединения 9a, изотопно обогащенного соединения 9b, изотопно обогащенного соединения 10, изотопно обогащенного соединения 10a, изотопно обогащенного соединения 10b, изотопно обогащенного соединения 11, изотопно обогащенного соединения 11a и изотопно обогащенного соединения 11b.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение, его сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма, где соединение представляет собой метаболит соединения формулы

и где соединение выбрано из группы, состоящей из

(a) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 2,1 минуты;

(b) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 6,2 минуты,

(c) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 8,0 минут,

(d) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 9,4 минуты,

(e) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 10,9 минуты,

(f) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 12,4 минуты,

(g) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 13,1 минуты,

(h) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 17,1 минуты,

(i) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 25,2 минуты, и

(j) соединения, которое элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 26,5 минуты, где описанное время удержания получают способом 1 ВЭЖХ, как описано в примере 16.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматривается соединение, сольват, гидрат, стереоизомерная или таутомерная форма, где соединение представляет собой метаболит соединения формулы

и где соединение элюируется с колонки C-18 (2) 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 16,4 минуты, в способе 2 ВЭЖХ, описанном в примере 16.

(a) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 38,4 минуты;

(b) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 39,8 минуты,

(c) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 36,8 минуты,

(d) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 26,8 минуты,

(e) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 33,8 минуты,

(f) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 30,9 минуты,

(g) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 4,6 минуты, и

(h) соединения, которое элюируется с колонки C-18 4,6×250 мм с размером частиц 5 мкм приблизительно через 28,1 минуты, где описанное время удержания получают способом 1 ВЭЖХ, как описано в примере 15.

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, представляют собой соединения формулы VI:

или их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты, стереоизомерные или таутомерные формы, где R^a и R^b выбраны следующим образом:

i) R^a представляет собой водород; и R^b представляет собой алкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил или диалкиламиноалкил; или

ii) R^a и R^b вместе с атомом азота, на котором они являются заместителями, образуют 3-7-членное кольцо, необязательно замещенное одной или двумя алкильными группами.

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, представляют собой соединения формулы VIa

или их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты, стереоизомерные или таутомерные формы, где переменные параметры являются такими, как описано в настоящем документе.

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, представляют собой соединения формулы VIb

В одном варианте осуществления R^a представляет собой водород; и R^b представляет собой изопропил, трет-бутил, циклогексил, этоксикарбонилметил, трет-бутилоксикарбонилметил, карбоксиметил или диметиламиноэтил. В одном варианте осуществления R^a и R^b вместе с атомом азота, на котором они являются заместителями, образуют 4-метилпиперазиновое или морфолиновое кольцо.

В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, выбрано из

и

или их фармацевтически приемлемых солей, сольватов, гидратов, стереоизомерных или таутомерных форм. В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой изотопно обогащенное соединение согласно этому абзацу.

и

их фармацевтически приемлемых солей, сольватов, гидратов, стереоизомерных или таутомерных форм согласно этому абзацу.

и

В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой диастереомерно чистое соединение или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сложный эфир. В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, представляет собой диастереомерно чистое соединение или его фармацевтически приемлемую соль. В определенных вариантах осуществления диастереомерно чистое соединение содержит по меньшей мере приблизительно 80% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 20% по массе другого стереоизомера(ов), по меньшей мере приблизительно 90% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 10% по массе другого стереоизомера(ов), по меньшей мере приблизительно 95% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 5% по массе другого стереоизомера(ов), по меньшей мере приблизительно 96,6% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 3,4% по массе другого стереоизомера(ов), по меньшей мере приблизительно 97% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 3% по массе другого стереоизомера(ов), по меньшей мере приблизительно 99% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 1% по массе другого стереоизомера(ов), или по меньшей мере приблизительно 99,9% по массе указанного диастереомера и не более чем приблизительно 0,1% по массе другого стереоизомера(ов). В определенных вариантах осуществления масса представлена в расчете на общую массу соединения.

В одном варианте осуществления соединения, представленные в настоящем документе, находятся по существу в чистой форме.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются соединения, которые можно вводить в качестве солей или сложных эфиров, которые при введении реципиенту обеспечивают прямо или непрямо соединение, представленное в настоящем документе, или которые сами проявляют желаемую активность.

Также в настоящем документе предусматриваются изотопно обогащенные аналоги соединений, представленных в настоящем документе. Изотопное обогащение (например, дейтерирование) фармацевтических средств для улучшения фармакокинетики ("PK"), фармакодинамики ("PD") и профилей токсичности было продемонстрировано ранее для некоторых классов лекарственных средств. См., например, Lijinsky et al., Food Cosmet. Toxicol., 20: 393 (1982); Lijinsky et al., J. Nat. Cancer Inst., 69: 1127 (1982); Mangold et al., Mutation Res. 308: 33 (1994); Gordon et al., Drug Metab. Dispos., 15: 589 (1987); Zello et al., Metabolism, 43: 487 (1994); Gately et al., J. Nucl. Med., 27: 388 (1986); Wade D, Chem. Biol. Interact. 117: 191 (1999).

Изотопное обогащение лекарственного средства можно применять, например, для (1) снижения или устранения нежелательных метаболитов, (2) увеличения времени полужизни исходного лекарственного средства, (3) снижения количества доз, требуемых для достижения желаемого эффекта, (4) снижения величины дозы, необходимой для достижения желаемого эффекта, (5) увеличения образования активных метаболитов, если они образуются, и/или (6) снижения продукции вредоносных метаболитов в конкретных тканях и/или создания более эффективного лекарственного средства и/или более безопасного лекарственного средства для комбинированной терапии, где комбинированная терапия является преднамеренной или не является преднамеренной.

Замена атома одним из его изотопов часто приводит к изменению скорости химической реакции. Это явление известно как кинетический эффект изотопов ("KIE"). Например, если в процессе определяющей скорость стадии (т.е. стадии с наиболее высокой энергией переходного состояния) в химической реакции разрушается связь C-H, замена водорода дейтерием приводит к снижению скорости реакции, и процесс замедляется. Этот феномен известен как кинетический эффект изотопа дейтерия ("DKIE"). (См., например, Foster et al., Adv. Drug Res., vol. 14, p. 1-36 (1985); Kushner et al., Can. J. Physiol. Pharmacol., vol. 77, p. 79-88 (1999)).

Величина DKIE может быть выражена в качестве соотношения между скоростями данной реакции, в которой разрушается связь C-H, и той же реакции, где водород замещен дейтерием. DKIE может находиться в диапазоне от приблизительно 1 (нет эффекта изотопа) до очень больших чисел, таких как 50 или более, что означает, что реакция может протекать медленнее в пятьдесят раз или более, когда водород заменен дейтерием. Высокие величины DKIE могут быть следствием, частично, явления, известного как туннелизация, которое является следствием принципа неопределенности. Туннелизацию приписывают небольшой массе атома водорода, и она происходит вследствие того, что переходные состояния, вовлекающие протон, иногда могут образовываться в отсутствие требуемой энергии активации. Поскольку дейтерий имеет большую массу, чем водород, он имеет статистически значительно более низкую вероятность этого феномена.

Тритий ("T") является радиоактивным изотопом водорода, используемым в исследованиях, термоядерных реакторах, генераторах нейтронов и радиофармацевтических средствах. Тритий представляет собой атом водорода, который имеет 2 нейтрона в ядре и имеет атомную массу около 3. В природе он встречается в очень низких концентрациях и наиболее часто встречается в качестве T₂O. Тритий распадается медленно (время полураспада = 12,3 лет) и испускает низкоэнергетические бета-частицы, которые не могут проникать через наружный слой кожи человека. Внутреннее воздействие является главным источником опасности, ассоциированным с этим изотопом, и, тем не менее, чтобы вызвать существенный риск для здоровья, его необходимо употребить внутрь в больших количествах. По сравнению с дейтерием необходимо употребить меньшее количество трития, чтобы оно достигло опасного уровня. Замена тритием ("T") водорода приводит к еще более сильной связи, чем в случае дейтерия, и приводит к численно более высоким эффектам изотопов. Аналогично, замена изотопами других элементов, включая, но не ограничиваясь ими, ¹³C или ¹⁴C для углерода, ³³S, ³⁴S или ³⁶S для серы, ¹⁵N для азота и ¹⁷O или ¹⁸O для кислорода обеспечивает сходные кинетические эффекты изотопов.

Например, DKIE использовали для снижения гепатотоксичности галотана путем предполагаемого ограничения продукции реакционноспособных молекул, таких как трифторацетилхлорид. Однако этот способ не может быть применим для всех классов лекарственных средств. Например, включение дейтерия может привести к метаболическому переключению. Концепция метаболического исключения состоит в том, что ксеногены, которые блокируются ферментами фазы I, могут связываться временно и повторно связываться в различных конформациях перед химической реакцией (например, окислением). Эта гипотеза подтверждается относительно большим размером связывающих карманов ферментов фазы I и беспорядочным характером многих метаболических реакций. Метаболическое переключение потенциально может приводить к различным соотношениям известных метаболитов, а также к совершенно новым метаболитам. Этот новый метаболический профиль может обеспечить большую или меньшую токсичность.

В организме животного экспрессируется множество ферментов для выведения чужеродных веществ, таких как лекарственные средства, из их системы циркуляции. Примеры таких ферментов включают ферменты цитохрома P450 ("CYP"), эстеразы, протеазы, редуктазы, дегидрогеназы и моноаминоксидазы для реакции и конвертирования этих чужеродных веществ в более полярные промежуточные соединения или метаболиты для экскреции почками. Некоторые из наиболее распространенных метаболических реакций фармацевтических соединений вовлекают окисление углерод-водородной связи (C-H) до пи-связи либо углерод-кислород (C-O), либо углерод-углерод (C-C). Полученные метаболиты могут быть стабильными или нестабильными в физиологических условиях и могут иметь по существу различные фармакокинетические, фармакодинамические и кратковременные и длительные профили токсичности относительно исходных соединений. Для многих лекарственных средств такое окисление является быстрым. Таким образом, эти лекарственные средства требуют введения многократных или высоких суточных доз.

Таким образом, изотопное обогащение в определенных положениях соединения, представленного в настоящем документе, может обеспечить поддающийся детекции KIE, который может влиять на фармакокинетические, фармакодинамические и/или токсикологические профили соединения, представленного в настоящем документе, по сравнению со сходным соединением, имеющим природный изотопный состав.

Получение соединений

Соединения, представленные в настоящем документе, можно изготавливать, выделять или получать любым способом, известным специалистам в данной области. Иллюстративные способы получения подробно описаны в примерах ниже. Соединение 1 можно получать способами, описанными в заявке США № 12/005937, поданной 27 декабря 2007 года.

Понятно, что соединения, представленные в настоящем документе, имеют несколько хиральных центров и могут существовать и могут быть выделены в оптически активных и диастереомерных формах. Некоторые соединения могут проявлять полиморфизм. Следует понимать, что в объем заявленного объекта входит любая рацемическая, оптически активная, диастереомерная, полиморфная или стереоизомерная форма соединения, представленного в настоящем документе, которая обладает полезными свойствами, описанными в настоящем документе, или их смеси. В данной области хорошо известно, как получать оптически активные формы (например, путем разделения рацемической формы способами перекристаллизации, синтезом из оптически активных исходных материалвх, хиральным синтезом или хроматографическим разделением с использованием хиральной неподвижной фазы).

Примеры способов получения диастереомерно чистых материалов известны в данной области и включают по меньшей мере следующие способы или их комбинации:

i) фракционная кристаллизация - способ, в котором диастереомеры разделяют фракционной кристаллизацией вследствие различий их растворимости;

ii) фракционная дистилляция - способ, в котором диастереомеры разделяют фракционной дистилляцией вследствие различий в их температуре кипения;

iii) хроматографическое разделение - способ, в котором диастереомеры разделяют в жидкой подвижной фазе благодаря различиям их взаимодействия с неподвижной фазой;

iv) химический асимметричный синтез - способ синтеза, посредством которого желаемый диастереомер синтезируют из ахирального предшественника в условиях, которые приводят к асимметрии (т.е. хиральности) в продукте, которую можно достигать с использованием хиральных катализаторов или хиральных вспомогательных соединений.

Соединения, представленные в настоящем документе, можно получать одним из способов, описанных в настоящем документе, или комбинацией способов, когда это необходимо.

Способы анализа

Соединения можно анализировать на активность в отношении HCV любым анализом, известным специалистам в данной области. Кроме того, соединения можно анализировать в отношении их накопления в клетках печени индивидуума в любом анализе, известном специалистам в данной области. В определенных вариантах осуществления соединение можно вводить индивидууму и клетку печени индивидуума можно анализировать в отношении соединения или его производного, например, его производного с нуклеозидом, нуклеозидфосфатом или нуклеозидтрифосфатом.

В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят в клетки, такие как клетки печени, in vivo или in vitro, и измеряют внутриклеточные уровни нуклеозидтрифосфата, указывающие на доставку соответствующего соединения и его трифосфорилирование в клетке. Уровень внутриклеточного нуклеозидтрифосфата можно измерять с использованием аналитических способов, известных в данной области.

Способы применения

В одном варианте осуществления соединения, представленные в настоящем документе, могут обладать усиленной доставкой в печень. В некоторых вариантах осуществления соединения позволяют доставку активного 5'-монофосфата нуклеозида в печень, которая может усилить образование активного трифосфорилированного соединения.

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматриваются способы лечения и/или профилактики у хозяина инфекции Flaviviridae, которые включают введение эффективного количества соединений, представленных в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемых солей, стереоизомеров, сольватов или гидратов. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматриваются способы лечения инфекции HCV у индивидуума. В определенных вариантах осуществления способы включают стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, количества соединения, эффективного для лечения или предупреждения инфекции HCV в комбинации со вторым средством, эффективным для лечения или предупреждения инфекции. Соединение может представлять собой любое соединение, как описано в настоящем документе, и второе средство может представлять собой любое второе средство, описанное в данной области или в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления соединение находится в форме фармацевтической композиции или лекарственной формы, как описано в разделах выше.

Flaviviridae, от которых можно лечить, рассмотрены, главным образом, в Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 31, 1996. В конкретном варианте осуществления Flaviviridae представляет собой HCV. В альтернативном варианте осуществления Flaviviridae представляет собой флавивирус или пестивирус. Конкретные флавивирусы включают, но не ограничиваются ими: Абсеттаров, Алфуи, Апои, Ароа, Багаза, Банзи, Боубоуи, Бусуквара, Касипакор, острова Керри, летучих мышей Дакара, денге 1, денге 2, денге 3, денге 4, Эдж-хилл, летучих мышей Энтеббе, Гаджетс Галли, Гансалова, Гипр, Ильеус, менингоэнцефалита индюков Израиля, японского энцефалита, Югры, Джутиапа, Кадама, Карши, Кедоугоу, Кокобера, Коутангу, Кумлинге, Кунжин, киасанурской лесной болезни, Лангат, шотландского энцефалита овец, Мибан, Модока, лейкоэнцефалита Монтана-Миотис, энцефалита долины Муррей, Наранжал, Негиши, Нтайя, омской геморрагической лихорадки, летучих мышей Пномпеня, Повассан, Рио-Браво, Росио, Ройял-Фарм, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, Сабойи, энцефалита Сент-Луис, Сал-Виеджа, Сан Перлита, рифов Саумарез, Сепик, Сокулук, Спондвени, Стратфорд, Тембусу, Тюлений, Уганда S, Усуту, Вессельсброна, западного Нила, Яунде, желтой лихорадки и Зика.

Пестивирусы, от которых можно лечить, рассмотрены, главным образом, в Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 33, 1996. Конкретные пестивирусы включают, но не ограничиваются ими: вирус вирусной диарии крупного рогатого скота ("BVDV"), вирус классической свиной лихорадки ("CSFV", также называемый вирусом холеры свиней) и вирус пограничной болезни ("BDV").

В определенных вариантах осуществления индивидуумом может быть любой индивидуум, инфицированный HCV или имеющий риск инфицирования HCV. Инфекцию или риск инфицирования можно определять любым способом, который специалист в данной области сочтет пригодным. В одном варианте осуществления индивидуумами являются люди, инфицированные HCV и/или HBV.

В определенных вариантах осуществления у индивидуума никогда не проводили терапию или профилактику инфекции HCV и/или HBV. В следующих вариантах осуществления индивидууму ранее проводили терапию или профилактику инфекции HCV и/или HBV. Например, в определенных вариантах осуществления индивидуум не отвечает на терапию HCV и/или HBV. Например, при современной терапии интерфероном, вплоть до 50% или более HCV индивидуумов не отвечают на терапию. В определенных вариантах осуществления индивидуум может представлять собой индивидуума, у которого была проведена терапия, но который продолжает страдать от вирусной инфекции или одного или нескольких ее симптомов. В определенных вариантах осуществления индивидуум может представлять собой индивидуума, которому проводили терапию, но который не достиг постоянного вирусологического ответа. В определенных вариантах осуществления индивидууму проводили терапию от инфекции HCV, но у него не было выявлено, например, снижение уровней РНК HCV, составляющее 2 log₁₀, после терапии в течение 12 недель. Полагают, что индивидуумы, которые не продемонстрировали снижение РНК HCV в сыворотке после терапии в течение 12 недель, составляющее более 2 log₁₀, имеют вероятность 97-100%, что ответа не будет.

В определенных вариантах осуществления индивидуумом является индивидуум, который прекратил терапию HCV вследствие одного или нескольких побочных действий, ассоциированных с этой терапией. В определенных вариантах осуществления индивидуумом является индивидуум, которому современная терапия не показана. Например, определенные способы лечения HCV ассоциированы с нейропсихиатрическими явлениями. Интерферон (IFN)-альфа вместе с рибавирином ассоциированы с высоким уровнем депрессии. Депрессивные симптомы связаны с худшим исходом при ряде медицинских расстройств. Угрожающие жизни или летальные нейропсихиатрические явления, включая самоубийство, суицидальное и убийственное мышление, депрессию, рецидив наркотической зависимости/передозировку и агрессивное поведение встречаются в процессе терапии HCV у индивидуумов с предшествующими психиатрическими расстройствами и без них. Индуцируемая интерфероном депрессия является ограничением для лечения хронического гепатита C, особенно для индивидуумов с психиатрическими расстройствами. Психиатрические побочные эффекты распространены в случае терапии интерфероном, и они ответственны приблизительно за 10%-20% случаев прекращения современной терапии инфекции HCV.

Таким образом, в настоящем документе предусматриваются способы лечения или предупреждения инфекции HCV у индивидуумов, где риск нейропсихиатрических явлений, таких как депрессия, является противопоказанием для лечения современной терапией HCV. В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматриваются способы лечения или предупреждения инфекции HCV у индивидуумов, где нейропсихиатрическое явление, такое как депрессия, или его риск являются показанием к прекращению лечения современной терапией HCV. Кроме того, предусматриваются способы лечения или предупреждения инфекции HCV у индивидуумов, где нейропсихиатрическое явление, такое как депрессия, или его риск являются показанием к снижению дозы современной терапии HCV.

Также современная терапия противопоказана у индивидуумов с гиперчувствительностью к интерферону или рибавирину, или обоим из них, или к любому другому компоненту фармацевтического продукта для введения интерферона или рибавирина. Современная терапия не показана для индивидуумов с гемоглобинопатиями (например, большой талассемией, серповидно-клеточной анемией) и для индивидуумов с риском гематологических побочных эффектов современной терапии. Обычные гематологические побочные эффекты включают подавление костного мозга, нейтропению и тромбоцитопению. Более того, рибавирин является токсичным для эритроцитов и ассоциирован с гемолизом. Таким образом, в одном варианте осуществления предусматриваются способы лечения или предупреждения инфекции HCV у индивидуумов с гиперчувствительностью к интерферону или рибавирину, или обоим из них, у индивидуумов с гемоглобинопатией, например у индивидуумов с большой талассемией и серповидно-клеточной анемией, и у других индивидуумов с риском гематологических побочных эффектов современной терапии.

В определенных вариантах осуществления индивидууму проводили терапию HCV, и он прекратил эту терапию перед проведением способа, представленного в настоящем документе. В следующих вариантах осуществления индивидууму проводили терапию HCV и ему продолжают проводить эту терапию совместно с проведением способа, представленного в настоящем документе. Способы можно проводить совместно с другим способом лечения HCV по решению специалиста в данной области. В определенных вариантах осуществления способы или композиции, представленные в настоящем документе, можно проводить совместно со снижением дозы в другой терапии HCV.

В определенных вариантах осуществления предусматриваются способы лечения индивидуума, который является рефрактерным к лечению интерфероном. Например, в некоторых вариантах осуществления индивидуумом может являться индивидуум, который не отвечает на лечение одним или несколькими средствами, выбранными из группы, состоящей из интерферона, интерферона α, пегилированного интерферона α, интерферона с рибавирином, интерферона α с рибавирином и пегилированного интерферона α с рибавирином. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом может являться индивидуум, который плохо отвечает на лечение одним или несколькими средствами, выбранными из группы, состоящей из интерферона, интерферона α, пегилированного интерферона α, интерферона с рибавирином, интерферона α с рибавирином и пегилированного интерферона α с рибавирином. Также можно использовать пролекарство рибавирина, такое как тарибавирин.

В определенных вариантах осуществления индивидуум имеет коинфекцию HCV с ВИЧ или имеет ее риск. Например, в США 30% индивидуумов с ВИЧ коинфицированы HCV, и данные указывают, что люди, инфицированные ВИЧ, имеют более быстрое течение их инфекции вирусом гепатита C. Maier and Wu, 2002, World J Gastroenterol 8:577-57. Способы, представленные в настоящем документе, можно использовать для лечения или предупреждения инфекции HCV у таких индивидуумов. Полагают, что элиминация HCV у этих индивидуумов может снизить смертность вследствие заболевания печени на конечной стадии. Действительно, риск прогрессирующего заболевания печени является более высоким у индивидуумов с более тяжелым иммунодефицитом вследствие СПИД, чем у индивидуумов без него. См., например, Lesens et al., 1999, J Infect Dis 179:1254-1258. В одном варианте осуществления показано, что соединения, представленные в настоящем документе, подавляют ВИЧ у индивидуумов с ВИЧ. Таким образом, в определенных вариантах осуществления предусматриваются способы лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции и инфекции HCV у индивидуумов, нуждающихся в этом.

В определенных вариантах осуществления соединения или композиции вводят индивидууму после трансплантации печени. Гепатит C является основной причиной трансплантации печени в США, и многие индивидуумы, которым проводят трансплантацию печени, остаются положительными по HCV после трансплантации. В одном варианте осуществления предусматриваются способы лечения таких индивидуумов с рецидивирующим HCV соединением или композицией, представленными в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления предусматриваются способы лечения индивидуума до, в процессе или после трансплантации печени для предупреждения рецидива инфекции HCV.

В определенных вариантах осуществления соединения формулы I, представленные в настоящем документе, пригодны в качестве маркеров или стандартов для оценки метаболизма соединения 1 у индивидуума, в том числе человека.

Второе лекарственное средство

В определенных вариантах осуществления соединения и композиции, представленные в настоящем документе, можно использовать в способе лечения расстройства печени, включающем введение эффективного количества соединения, представленного в настоящем документе, и, кроме того, введение эффективного количества второго средства, эффективного для лечения расстройства, такого как инфекция HCV, индивидууму, нуждающемуся в этом. Второе средство может представлять собой любое средство, известное специалистам в данной области в качестве эффективного для лечения расстройства, включая средства, на сегодняшний день одобренные FDA.

В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят в комбинации с одним вторым средством. В следующих вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят в комбинации с двумя вторыми средствами. В других вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят в комбинации с двумя или более вторыми средствами.

Как используют в настоящем документе, термин "в комбинации" включает применение более одного лекарственного средства (например, одного или нескольких профилактических и/или терапевтических средств). Применение термина "в комбинации" не ограничивает порядка, в котором лекарственные средства (например, профилактические и/или терапевтические средства) вводят индивидууму, нуждающемуся в этом. Например, первое лекарственное средство (например, профилактическое или терапевтическое средство, такое как соединение, представленное в настоящем документе) можно вводить до (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго лекарственного средства (например, профилактического или терапевтического средства) индивидууму с расстройством.

Как используют в настоящем документе, термин "синергический" включает комбинацию соединения, представленного в настоящем документе, и второго лекарственного средства (например, профилактического или терапевтического средства), которое использовали или в настоящее время используют для предупреждения, управления течением или лечения расстройства, которая является более эффективной, чем суммарные эффекты лекарственных средств по отдельности. Синергический эффект комбинирования лекарственных средств (например, комбинирования профилактических или терапевтических средств) может позволить использовать меньшие дозировки одного или нескольких лекарственных средств и/или менее частое введение указанных лекарственных средств индивидууму, нуждающемуся в них. Возможность использовать более низкие дозировки лекарственного средства (например, профилактического или терапевтического средства) и/или вводить указанное лекарственное средство менее часто может снизить какую-либо токсичность, ассоциированную с введением указанного лекарственного средства индивидууму без снижения эффективности указанного лекарственного средства в отношении предупреждения или лечения расстройства. Кроме того, синергический эффект может приводить к более высокой эффективности средств при предупреждении или лечении расстройства. Наконец, синергический эффект комбинации лекарственных средств (например, комбинации профилактических или терапевтических средств) может предотвратить или снизить неблагоприятные или нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с применением каждого лекарственного средства отдельно.

Активные соединения, представленные в настоящем документе, можно вводить в комбинации с другим лекарственным средством, в частности со средством против HCV или гепатита B. Активные соединения можно вводить в дозах, выбранных специалистом в данной области. Например, вводимые дозировки могут зависеть от скоростей всасывания, инактивации и экскреции лекарственного средства, а также от других факторов, известных специалистам в данной области. Следует отметить, что дозировки также могут варьировать в зависимости от тяжести состояния, подлежащего смягчению. Кроме того, понятно, что для любого конкретного индивидуума конкретные дозировки и режимы можно корректировать с течением времени согласно индивидуальным потребностям и мнению специалиста, проводящего введение или наблюдающего за введением композиций. В определенных вариантах осуществления пригодным является соединение против HCV (или против пестивируса или против флавивируса), которое проявляет EC₅₀ 10-15 мкМ или предпочтительно менее 1-5 мкМ.

Известно, что после длительного лечения противовирусным средством могут появляться устойчивые к лекарственному средству варианты флавивирусов, пестивирусов или HCV. Наиболее часто, устойчивость к лекарственному средству возникает, как правило, вследствие мутации в гене, который кодирует фермент, используемый при репликации вируса. Эффективность лекарственного средства против вирусной инфекции можно продлевать, усиливать или восстанавливать путем введения соединения в комбинации со вторым или, возможно, третьим противовирусным соединением, которые индуцируют мутацию, отличающуюся от мутации, которую вызывает главное лекарственное средство. Альтернативно с помощью такой комбинированной терапии можно изменять фармакокинетику, биораспределение или другие параметры лекарственного средства. В определенных вариантах осуществления сопутствующее введение лекарственного средства можно использовать, поскольку оно может индуцировать множество одновременных воздействий на вирус.

В комбинации с соединениями, описанными в настоящем документе, можно использовать любые из способов лечения вирусов, описанные в разделе "Уровень техники".

Иллюстративные вторые средства для лечения HCV

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибиторами протеаз против вируса гепатита C. Пригодные ингибиторы протеаз включают, но не ограничиваются ими, TMC435350 (Medivir/Tibotec, Huddinge, Sweden); ITMN-191 (R-7227; InterMune Pharma., Inc., Brisbane, CA), ACH-806 (GS-9132; Achillion Pharma., Inc., New Haven, CT), ACH-1095 (Achillion Pharma., Inc.), BI 12202 (Boehringer Ingelheim, Ingelheim Germany), цилупревир (BILN-2061; Boehringer Ingelheim), MK-7009 (Merck Pharma., Inc., Whitehouse Station, NJ), боцепревир (SCH 503034; Schering-Plough, Kenilworth, NJ), SCH 446211 (SCH6; Schering-Plough), SCH 351633 (Schering-Plough) и телапревир (VX-950; Vertex Pharma., Inc., Cambridge, MA).

В определенных вариантах осуществления пригодные ингибиторы протеаз против вируса гепатита C включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы протеазы NS3 на основе субстрата (WO 98/22496; Attwood et al. Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10, 259-273; German Patent Pub. DE 19914474; и WO 98/17679), включающие альфакетоамиды и гидразиномочевины, и ингибиторы, которые оканчиваются электрофилом, такие как бороновая кислота или фосфонат (WO 99/07734); ингибиторы протеазы NS3 не на основе субстрата, такие как производные 2,4,6-тригидрокси-3-нитробензамида (Sudo K. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 238, 643-647; Sudo K. et al. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 1998, 9, 186), включающие RD3-4082 и RD3-4078, причем первое из них замещено по амиду цепью из 14 атомов углерода, а во второе преобразовано пара-феноксифенильной группой; и Sch 68631, фенантренхинон (Chu M. et al., Tetrahedron Letters 37:7229-7232, 1996).

В определенных вариантах осуществления пригодные ингибиторы протеаз против гепатита C включают, но не ограничиваются ими, эглин c (Qasim M.A. et al., Biochemistry 36:1598-1607, 1997); ингибиторы цистеинпротеазы для ингибирования эндопептидазы 2 HCV (патент США No. 6004933); синтетические ингибиторы протеазы NS3 вируса гепатита C (патент США № 5990276); ингибиторные трипептиды (патенты США № 6534523, 6410531 и 6420380, и WO 02/060926); диарилпептиды (WO 02/48172 и патент США № 6911428); и имидазолидиноны (WO 02/08198, WO 02/48157 и патенты США № 6727366 и 6838475).

В определенных вариантах осуществления пригодные ингибиторы сериновых протеаз против вируса гепатита C включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы сериновых протеаз HCV, описанные в патенте США № 6872805; WO 2006000085; патенте США № 7208600; публикации патента США № 2006/0046956; WO 2007/001406 (Chiron); публикации патента США № 2005/0153877; WO 2006/119061 (Merck); WO 00/09543; патенте США № 6323180; WO 03/064456; патенте США № 6642204; WO 03/064416; патенте США № 7091184; WO 03/053349; патенте США № 6867185; WO 03/099316; патенте США № 6869964; WO 03/099274; патенте США № 6995174; WO 2004/032827; патенте США № 7041698; WO 2004/043339, патенте США № 5538865; WO 02/008251; патенте США № 7169760; публикации патента США № 2005/176648; WO 02/08187; WO 02/008256; WO 98/17679; патенте США № 6265380; WO 02/48116; патенте США № 6653295 и US 6878722.

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с производным тиазолидина, которое демонстрирует значительное ингибирование в анализе обращенно-фазовой ВЭЖХ со слитым белком NS3/4A и субстратом NS5A/5B (Sudo K. et al., Antiviral Research, 1996, 32, 9-18). Пригодные производные тиазолидина включают, но не ограничиваются ими, RD-1-6250 (обладающий конденсированной циннамоильной группой, замещенной длинной алкильной цепью), RD4 6205 и RD4 6193.

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с тиазолидином и/или бензанилидом (Kakiuchi N. et al. J. EBS Letters 421, 217-220; Takeshita N. et al. Analytical Biochemistry, 1997, 247, 242-246).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с фенантренхиноном, обладающим активностью против протеазы в SDS-PAGE и радиоавтографическом анализе, после выделения из ферментационного бульона культуры Streptomyces sp. Пригодные фенантренхиноны включают, но не ограничиваются ими, SCH 68631 (Chu M. et al., Tetrahedron Letters, 1996, 37, 7229-7232) и SCH 351633 (Chu M. et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9, 1949-1952).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибитором хеликазы (патент США № 5633358; WO 97/36554).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибитором полимеразы нуклеотидов. Пригодные ингибиторы полимеразы нуклеотидов включают, но не ограничиваются ими, глиотоксин (Ferrari R. et al. Journal of Virology, 1999, 73, 1649-1654) и церуленин (Lohmann V. et al., Virology, 1998, 249, 108-118).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с противовирусными средствами на основе РНК-интерференции (RNAi). Пригодные противовирусные средства на основе RNAi включают, но не ограничиваются ими, противовирусные средства на основе коротких интерферирующих РНК (siRNA), такие как Sirna-034, и другие средства, описанные в WO/03/070750, WO 2005/012525 и публикации патента США № US 2004/0209831 и противовирусные средства на основе микроРНК, такие как miR-122 (Pan Q-W. et al., World J. Gastroenterol., 2007, 13, 4431-4436).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с антисмысловым фосфоротиоатным олигодезоксинуклеотидом (S-ODN), комплементарным участкам последовательности в 5'-некодирующей области (NCR) вируса (Alt M. et al., Hepatology, 1995, 22, 707-717), или нуклеотидам 326-348, включающим 3'-конец NCR, и нуклеотидам 371-388, расположенным в центре кодирующей области РНК HCV (Alt M. et al., Archives of Virology, 1997, 142, 589-599; Galderisi U. et al., Journal of Cellular Physiology, 1999, 181, 251-257).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибитором IRES-зависимой трансляции (публикация патента Японии JP-08268890; публикация патента Японии JP-10101591).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с рибозимом. Пригодные рибозимы включают, но не ограничиваются ими, устойчивые к нуклеазе рибозимы (Maccjak, D. J. et al., Hepatology 1999, 30, abstract 995), HEPTAZYME® (Ribozyme Pharma. Inc., Boulder, CO) и рибозимы, описанные в патентах США № 6043077, 5869253 и 5610054.

В определенных вариантах осуществления соединения, представленные в настоящем документе, можно вводить в комбинации с любыми из соединений, описанных Idenix Pharmaceuticals в международных публикациях № WO 01/90121, WO 01/92282, WO 2004/003000, 2004/002422 и WO 2004/002999.

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с одним или несколькими аналогами нуклеозидов. Пригодные аналоги нуклеозидов включают, но не ограничиваются ими, аналоги нуклеозидов, описанные в PCT/CA00/01316 (WO 01/32153) и PCT/CA01/00197 (WO 01/60315); WO 02/057425); WO 02/057287; патентах США № 7202224, 7125855, 7105499 и 6777395; PCT/EP/01/09633 (WO 02/18404); публикациях патентов США № 2006/0040890, 2005/0038240 и 2004/0121980; патентах США № 6846810, 6784166 и 6660721; публикации PCT № WO 01/79246, WO 02/32920, и WO 02/48165; US 2005/0009737; публикации патента США № 2005/0009737; и патентах США № 7094770 и 6927291.

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с одним или несколькими вторыми средствами. Пригодные вторые средства включают, но не ограничиваются ими, 2'-фторнуклеозиды (WO 99/43691), 1-аминоалкилциклогексаны (патент США № 6034134), алкиллипиды (патент США № 5922757), витамин E и другие антиоксиданты (патент США № 5922757), сквален, амантадин, желчные кислоты (патент США № 5846964), N-(фосфоноацетил)-L-аспарагиновую кислоту (патент США № 5830905), бензолдикарбоксамиды (патент США № 5633388), производные полиаденильных кислот (патент США № 5496546), 2',3'-дидезоксиинозин (патент США № 5026687), бензимидазолы (патент США № 5891874), экстракты растений (патенты США № 5837257, 5725859 и 6056961) и пиперидины (патент США № 5830905).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с интерфероном против вируса гепатита C. Пригодные интерфероны включают, но не ограничиваются ими, INTRON A® (интерферон альфа-2b; Schering-Plough, Inc.) и PEGASYS® (пегинтерферон альфа-2a; Hoffmann-LaRoche, Inc., Nutley, NJ); ROFERON A® (рекомбинантный интерферон альфа-2a; Hoffmann-LaRoche, Inc.), INFERGEN® (консенсусный интерферон; интерферон альфакон-1; Three Rivers Pharma., Cranberry Township, PA PEG-INTRON® (пегилированный интерферон альфа-2b; Schering-Plough, Inc.), и PEGASYS® (пегилированный интерферон альфа-2a; Hoffmann-LaRoche, Inc.).

В определенных вариантах осуществления пригодные интерфероны против вируса гепатита C включают, но не ограничиваются ими, INFERGEN®, IL-29 (PEG-интерферон лямбда; ZymoGenetics, Inc., Seattle, WA), ACTIMMUNE® (интерферон гамма-1b; Intermune, Inc.), R7025 (Maxy-alpha; Maxygen, Redwood City, CA), BELEROFON (Nautilus Biotech., Evry, France), пероральный интерферон альфа (Amarillo Biosciences, Inc., Amarillo, TX), LOCTERON® (BLX-883; OctoPlus, Inc., Cambridge, MA), омега-интерферон (Intarcia Therapeutics, Inc. Hayward, CA), MULTIFERON® (Viragen, Inc., Plantation, FL), OMNIFERON^TM (Viragen, Inc.), интерферон медуза (Flamel Technologies, Inc., Venissieux Cedex, France), WELLFERON® (GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA), ALBUFERON® (Human Genome Sciences, Inc., Rockville, MD), REBETRON® (Schering-Plough, Inc.) и REBIF® (интерферон β-1a; Serono, Inc., Rockland, MA).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибитором полимеразы против вируса гепатита C. Пригодные ингибиторы полимеразы включают, но не ограничиваются ими, REBETOL® (рибавирин; Schering-Plough, Inc.), левовирин (ICN Pharma., Costa Mesa, CA), VIRAMIDINE® (Valeant Pharma. International, Aliso Viejo, CA), MK-0608 (7-деаза-2'-C-метиладенозин; Merck Pharma. Inc.), 7-деаза-MK-0608 (7-деаза-7-фтор-2'-C-метиладенозин; Merck Pharma. Inc.), NM 283 (валопицитабин; Idenix Pharma., Inc., Cambridge, MA), PSI-6130 (2'-дезокси-2'-фтор-2'-C-метилцитидин; Hoffmann-LaRoche, Inc.), 2'-O-метилцитидин (Carroll, S.S. et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 11979-11984), 2'-C-метиладенозин (Tomassini, J.E. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2005, 49, 2050-2058; Migliaccio, G. et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 49164-49170), 2'-C-метилгуанозин (Migliaccio, G. et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 49164-49170; Eldrup, A.B. et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 2283-2295), R1479 (4'-азидоцитидин; Hoffmann-LaRoche, Inc.), ANA598 (Anadys Pharma. Inc., San Diego, CA), R1626 (Hoffmann-LaRoche, Inc.), RO-0622 (4'-азидо-2'-дезоксинуклеозид аналог, Roche Palo Alto, LLC, Palo Alto, CA), GL-59728 (Genelabs Technologies, Inc., Redwood City, CA), GL-60667 (Genelabs Technologies, Inc.) и R7128 (Pharmasset, Inc., Princeton, NJ).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ненуклеозидным ингибитором полимеразы против вируса гепатита C. Пригодные ненуклеозидные ингибиторы полимеразы включают, но не ограничиваются ими, BILB 1941 (Boehringer Ingelheim), HCV-796 (ViroPharma, Inc., Exton, PA), DKA соединение 30 (Summa, V. et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 14-17; Summa, V. et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5336-5339), 5-карбоксамидное производное бензимидазола (Beaulieu, P.L. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 967-971), производное индол-N-ацетамида (Di Marco, S. et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 29765-29770; Harper, S. et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 1314-1317), производное бензотиадизина (Dhanak, D. et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 38322-38327; Tomei, L. et al., J. Virol, 2004, 78, 938-946), производное фенилаланина (Wang, M. et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 9489-9495), производное тиофена с 2-карбоновой кислотой (Chan, L. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 793-796; Biswal, B.K. et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 18202-18210), производное дигидропирона (De Clercq, E., Nat. Rev. Drug Dis., 2007, 6, 1001-1018), производное тетрагидропираноиндолилуксусной кислоты HCV-371 (Howe, A.Y. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48, 4813-4821) и серия 5-гидрокси-3(2H)-пиридазинонов (Zhou, Y. et al., Antiviral Res., 2007, 74, A38, abstract 27; Zhou, Y. et al., Antiviral Res., 2007, 74, A51-A52, abstract 59).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с рибаварином и интерфероном против вируса гепатита C. Пригодные интерфероны включают, но не ограничиваются ими, INTRON A® (интерферон альфа-2b) и PEGASYS® (пегинтерферон альфа-2a); ROFERON A® (рекомбинантный интерферон альфа-2a), INFERGEN® (консенсусный интерферон; интерферон альфакон-1), PEG-INTRON® (пегилированный интерферон альфа-2b) и PEGASYS® (пегилированный интерферон альфа-2a).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибитором циклофилина B против вируса гепатита C. Пригодные ингибиторы циклофилина B включают, но не ограничиваются ими, NIM-811 (Novartis, East Hanover, NJ), циклоспорин A (CsA; Novartis), SCY-635 (Scynexis, Inc., Research Triangle Park, NC) и DEBIO-025 (Debiopharm Group, Lausanne, Switzerland).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с ингибитором α-глюкозидазы против гепатита C. Пригодные ингибиторы α-глюкозидазы включают, но не ограничиваются ими, целгосивир (Migenix, Inc., Vancouver, Canada).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с вакциной против вируса гепатита C. Пригодные вакцины включают, но не ограничиваются ими, TG4040, PeviPRO^TM, CGI-5005, HCV/MF59, GV1001, IC41 и INNO0101 (E1).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с моноклональными или поликлональными антителами против вируса гепатита C. Пригодные моноклональные антитела включают, но не ограничиваются ими, AB68 и XTL-6865 (прежде HepX-C; XTL Biopharma., Rehovot, Israel). Пригодные поликлональные антитела включают, но не ограничиваются ими, цикавир.

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с иммуномодулятором против вируса гепатита C. Пригодные иммуномодуляторы включают, но не ограничиваются ими, ZADAXIN® (тималфазин; SciClone Pharma. International, Foster City, CA), CEPLENE^TM (Maxim Pharma. Inc., San Diego, CA), CELLCEPT® (Hoffmann-LaRoche, Inc.), CIVACIR® (Nabi Biopharma., Rockville, MD), CPG 10101 (Pfizer, Inc., New York, NY), ANA773 (Anadys Pharma. Inc.), ANA971 (Anadys Pharma. Inc.), ANA975 (Anadys Pharma. Inc.), NOV-205 (Novelos Therapeutics, Inc., Newton, MA), и оглуфанид (Implicit Bioscience, Inc., Woodside, CA).

В определенных вариантах осуществления одно или несколько соединений, представленных в настоящем документе, можно вводить в комбинации с другими вторыми средствами. Пригодные вторые средства включают, но не ограничиваются ими, нексавар, доксорубицин, PI-88, амантадин, JBK-122, VGX-410C, MX-3253 (цеглосивир), Suvus (BIVN-401 или виростат), PF-03491390 (прежде IDN-6556), G126270, UT-231B, EMZ702, ACH-0137171, MitoQ, ANA975, AVI-4065, бавитуксинаб (тарвацин), Alinia (нитразоксанид), меримеподиб (VX-497; Vertex Pharma., Inc.), сумметрел (Endo Pharma. Holdings, Inc., Chadds Ford, PA), ISIS 14803 (Isis Pharma., Inc., Carlsbad, CA) и PYN 17.

Фармацевтические композиции и способы введения

Соединения, представленные в настоящем документе, можно изготавливать в виде фармацевтических композиций с использованием способов, доступных в данной области и описанных в настоящем документе. Такие соединения можно использовать в некоторых вариантах осуществления для повышения доставки лекарственного средства в печень.

В определенных вариантах осуществления вместе с соединением, представленным в настоящем документе, можно включать в состав или упаковывать второе средство. Безусловно, второе средство можно включать в состав с соединением, представленным в настоящем документе, только тогда, когда, согласно мнению специалистов в данной области, такое совместное включение в состав не препятствует активности каждого из средств или способу введения. В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство включают в разные составы. Их можно упаковывать вместе или по отдельности для удобства практикующего специалиста в данной области.

В клинической практике активные средства, представленные в настоящем документе, можно вводить любым общепринятым способом, в частности перорально, парентерально, ректально или путем ингаляции (например, в форме аэрозолей). В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят перорально.

В качестве твердых композиций для перорального введения можно применять таблетки, пилюли, твердые желатиновые капсулы, порошки или гранулы. В этих композициях активный продукт смешивают с одним или несколькими инертными разбавителями или адъювантами, такими как сахароза, лактоза или крахмал.

Эти композиции могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например смазывающее вещество, такое как стеарат магния, или покрытие, предназначенное для контролируемого высвобождения.

В качестве жидких композиций для перорального введения можно применять растворы, такие как фармацевтически приемлемые суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, такие как вода или вазелиновое масло. Эти композиции также могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например смачивающие средства, подсластители или вкусовые добавки.

Композиции для парентерального введения могут представлять собой эмульсии или стерильные растворы. В качестве растворителя или носителя можно применять пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, в частности оливковое масло, или инъецируемые органические сложные эфиры, например этилолеат. Эти композиции также могут содержать адъюванты, в частности смачивающие средства, обеспечивающие изотоничность средства, эмульгаторы, диспергирующие средства и стабилизаторы. Стерилизацию можно осуществлять несколькими способами, например, с использованием бактериологического фильтра, радиационным излучением или нагреванием. Также композиции можно получать в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять во время применения в стерильной воде или в любой другой инъецируемой стерильной среде.

Композиции для ректального введения представляют собой суппозитории или ректальные капсулы, которые содержат, в дополнение к активному веществу, такие эксципиенты, как масло какао, полусинтетические глицериды или полиэтиленгликоли.

Композиции также могут представлять собой аэрозоли. Для применения в форме жидких аэрозолей композиции могут представлять собой стабильные стерильные растворы или твердые композиции, растворенные во время применения в апирогенной стерильной воде, в физиологическом растворе или любом другом фармацевтически приемлемом носителе. Для применения в форме сухих аэрозолей, предназначенных для прямого ингалирования, активное вещество мелко измельчают и комбинируют с растворимым в воде твердым разбавителем или носителем, например декстраном, маннитом или лактозой.

В одном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем документе, представляет собой фармацевтическую композицию или единичную лекарственную форму. Фармацевтические композиции и единичные лекарственные формы, представленные в настоящем документе, содержат профилактически или терапевтически эффективное количество одного или нескольких профилактических или терапевтических средств (например, соединения, представленного в настоящем документе, или другого профилактического или терапевтического средства), и, как правило, один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. В конкретном варианте осуществления и в этом контексте термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулятивным органом федерального или штатного правительства или приведенный в фармакопее США или другой общепринятой фармакопее для применения у животных и более конкретно у человека. Термин "носитель" включает разбавитель, адъювант (например, адъювант Фрейнда (полный и неполный)), эксципиент или носитель, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Воду можно использовать в качестве носителя, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Также в качестве жидких носителей можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности для инъецируемых растворов. Примеры пригодных фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin.

Типичные фармацевтические композиции и лекарственные формы содержат один или несколько эксципиентов. Пригодные эксципиенты хорошо известны специалистам в области фармацевтики, и неограничивающие примеры пригодных эксципиентов включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, известняк, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Пригодность конкретного эксципиента для включения в фармацевтическую композицию или лекарственную форму зависит от множества факторов, хорошо известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, способ, которым лекарственную форму вводят индивидууму, и конкретные активные ингредиенты в лекарственной форме. Композиция или единичная лекарственная форма, если желательно, также может содержать небольшие количества смачивающих средств или эмульгаторов, или pH-буферных средств.

Не содержащие лактозы композиции, представленные в настоящем документе, могут содержать эксципиенты, которые хорошо известны в данной области и приведены, например, в фармакопее США (USP) SP (XXI)/NF (XVI). Как правило, не содержащие лактозы композиции содержат активный ингредиент, связующее вещество/наполнитель и смазывающее вещество в фармацевтически совместимых и фармацевтически приемлемых количествах. Иллюстративные не содержащие лактозу лекарственные формы включают активный ингредиент, микрокристаллическую целлюлозу, прежелатинизированный крахмал и стеарат магния.

Кроме того, в настоящем документе рассмотрены безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие активные ингредиенты, поскольку вода может способствовать деградации некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко применяют в области фармацевтики в качестве средства имитации длительного хранения для определения таких характеристик, как срок годности и стабильность составов с течением времени. См., например, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, p. 379 80. Фактически, вода и нагревание ускоряют разложение некоторых соединений. Таким образом, эффект воды на состав может иметь большое значение, поскольку влажность и/или сырость часто встречаются в процессе изготовления, обработки, упаковывания, хранения, транспортировки и применения составов.

Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, представленные в настоящем документе, можно получать с использованием безводных или содержащих низкое количество влаги ингредиентов и в условиях низкой влажности или сырости. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, которые содержат лактозу и по меньшей мере один активный ингредиент, который содержит первичный или вторичный амин, могут быть безводными, если ожидается существенный контакт с влагой или сыростью в процессе изготовления, упаковывания и/или хранения.

Безводную фармацевтическую композицию следует изготавливать и хранить таким образом, чтобы сохранить ее безводную природу. Таким образом, безводные композиции можно упаковывать с использованием материалов, о которых известно, что они предохраняют от воздействия воды, так что их можно включать в приемлемые составные наборы. Примеры пригодных упаковочных материалов включают, но не ограничиваются ими, герметичную фольгу, пластмассы, контейнеры для разовой дозы (например, ампула), блистерную упаковку и контурную упаковку.

Кроме того, предусматриваются фармацевтические композиции и лекарственные формы, которые содержат одно или несколько соединений, которые снижают скорость разложения активного ингредиента. Такие соединения, которые в настоящем документе называют "стабилизаторами", включают, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, pH-буферы или солевые буферы.

Фармацевтические композиции и единичные лекарственные формы могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Пероральный состав может включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, магний карбонат и т.д., пригодные для применения в фармацевтике. Такие композиции и лекарственные формы содержат профилактически или терапевтически эффективное количество профилактического или терапевтического средства, в определенных вариантах осуществления в очищенной форме, вместе с пригодным количеством носителя, так чтобы обеспечить форму для надлежащего введения индивидууму. Состав должен соответствовать способу введения. В определенном варианте осуществления фармацевтические композиции или единичные лекарственные формы являются стерильными и имеют подходящую форму для введения индивидууму, например, индивидууму-животному, такому как индивидуум-млекопитающее, например индивидуум-человек.

Фармацевтическую композицию формулируют таким образом, чтобы она была совместима с предполагаемым способом введения. Примеры способов введения включают, но не ограничиваются ими, парентеральное, например внутривенное, внутрикожное, подкожное, внутримышечное, подкожное, пероральное, буккальное, сублингвальное, ингаляционное, интраназальное, трансдермальное, местное, трансмукозальное, внутриопухолевое, интрасиновиальное и ректальное введение. В конкретном варианте осуществления композицию изготавливают общепринятыми способами в качестве фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения человеку. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию изготавливают общепринятыми способами для подкожного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Когда это необходимо, композиция также может включать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин для смягчения боли в области инъекции.

Примеры лекарственных форм включают, но не ограничиваются ими: таблетки; таблетки в форме капсул; капсулы, такие как мягкие эластичные желатиновые капсулы; крахмальные капсулы; лепешки; пастилки; дисперсии; суппозитории; мази; припарки (примочки); пасты; порошки; повязки; кремы; пластыри; растворы; наклейки; аэрозоли (например, спреи для носа или ингаляторы); гели; жидкие лекарственные формы, пригодные для перорального введения или введения через слизистую оболочку индивидууму, включая суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии, эмульсии типа масло-в-воде или эмульсии типа вода-в-масле), растворы и эликсиры; жидкие лекарственные формы, пригодные для парентерального введения индивидууму; и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые можно разбавлять для получения жидких лекарственных форм, пригодных для парентерального введения индивидууму.

Состав, форма и тип лекарственных форм, как правило, варьируют, в зависимости от их применения. Например, лекарственная форма, используемая при начальном лечении вирусной инфекции, может содержать большие количества одного или нескольких из активных ингредиентов, которые она содержит, чем лекарственная форма, используемая для поддержания лечения указанной инфекции. Аналогично, парентеральная лекарственная форма может содержать меньшие количества одного или нескольких активных ингредиентов, которые она содержит, чем пероральная лекарственная форма, используемая для лечения того же заболевания или расстройства. Эти и другие пути, посредством которых конкретные лекарственные формы, описанные в настоящем документе, будут отличаться друг от друга, хорошо понятны специалистам в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).

Как правило, ингредиенты композиций предоставляют либо по отдельности, либо смешанными друг с другом в стандартной лекарственной форме, например, в качестве сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, на которых указано количество активного вещества. Когда композиция подлежит введению путем инфузии, ее можно распределять с помощью бутили для инфузии, содержащей стерильную воду или физиологический раствор, пригодные для применения в фармацевтике. Когда композицию вводят путем инъекции, можно предоставлять ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, так чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

Типичные лекарственные формы включают соединение, представленное в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, в количестве в диапазоне от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 1000 мг в сутки, которые вводят в качестве однократной дозы раз в сутки или в качестве разделенных доз в течение суток вместе с приемом пищи. Конкретные лекарственные формы могут иметь приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 2,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 100, 200, 250, 500 или 1000 мг активного соединения.

Оральные лекарственные формы

Фармацевтические композиции, которые пригодны для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных лекарственных форм, таких как, но не ограничиваясь ими, таблетки (например, жевательные таблетки), таблетки в форме капсул, капсулы, и жидкости (например, ароматизированные сиропы). Такие лекарственные формы содержат заданные количества активных ингредиентов и их можно получать способами фармацевтики, хорошо известными специалистам в данной области. См., главным образом, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).

В определенных вариантах осуществления оральные лекарственные формы являются твердыми и их получают в безводных условиях с использованием безводных ингредиентов, как подробно описано в предыдущих разделах. Однако объем композиций, представленных в настоящем документе, выходит за пределы безводных твердых оральнных лекарственных форм. По существу, дополнительные формы описаны в настоящем документе.

Типичные оральные лекарственные формы по этому изобретению получают объединением активного ингредиента(ов) в однородную смесь по меньшей мере с одним эксципиентом в соответствии с традиционными способами изготовления фармацевтических препаратов. В зависимости от формы препарата, желательной для введения, эксципиенты могут иметь различные формы. Например, эксципиенты, пригодные для применения в оральных жидких или аэрозольных лекарственных формах, включают, но не ограничиваются ими, воду, гликоли, масла, спирты, вкусовые добавки, консерванты и красители. Примеры наполнителей, пригодных для применения в твердых пероральных лекарственных формах (например, порошках, таблетках, капсулах и таблетках в форме капсул), включают, но не ограничиваются ими, крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие средства, связующие средства и дезинтегрирующие средства.

Вследствие простоты введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее преимущественные лекарственные формы и в этом случае используют твердые эксципиенты. Если желательно, таблетки можно покрывать стандартными способами водного и неводного нанесения покрытия. Такие лекарственные формы можно получать любыми способами фармацевтики. В общем, фармацевтические композиции и лекарственные формы получают равномерным и однородным смешиванием активных ингредиентов с жидкими носителями, мелкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими и затем, если необходимо, придавая продукту желательную форму.

Например, таблетку можно изготовить прессованием или формованием. Прессованные таблетки можно получать прессованием в подходящем устройстве активных ингредиентов в сыпучей форме, таких как порошок или гранулы, необязательно смешанные с эксципиентом. Формованные таблетки можно изготовить посредством формования в подходящем устройстве смеси порошкованного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем.

Примеры эксципиентов, которые можно использовать в пероральных лекарственных формах, включают, но не ограничиваются ими, связующие вещества, наполнители, дезинтегрирующие вещества и смазывающие вещества. Связующие вещества, пригодные для применения в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, но не ограничиваются ими, кукурузный крахмал, картофельный крахмал или другие крахмалы, желатин, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, альгинат натрия, альгиновая кислота, другие альгинаты, порошкованная трагакантовая камедь, гуаровая камедь, целлюлозу и ее производные (например, этилцеллюлозу, ацетат целлюллозы, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу, (например, No. 2208, 2906, 2910), микрокристаллическую целлюлозу и их смеси.

Примеры наполнителей, пригодных для применения в фармацевтических композициях и лекарственных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, тальк, карбонат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу, порошкованную целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбит, крахмал, прежелатизинированный крахмал и их смеси. Связующее вещество или наполнитель в фармацевтических композициях по этому изобретению, как правило, представлены в количестве от приблизительно 50 до приблизительно 99 весовых процентов фармацевтической композиции или лекарственной формы.

Пригодные формы микрокристаллической целлюлозы включают, но не ограничиваются ими, материалы, продаваемые в качестве AVICEL PH 101, AVICEL PH 103 AVICEL RC 581, AVICEL PH 105 (доступные от FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA) и их смеси. Конкретное связующее вещество представляет собой смесь микрокристаллической целлюлозы и натрийкарбоксиметилцеллюлозы, продаваемых в качестве AVICEL RC-581. Приемлемые безводные эксципиенты или эксципиенты с низким содержанием влаги включают AVICEL PH 103^TM и крахмал 1500 LM.

Дезинтегрирующие вещества используют в композициях по этому изобретению для получения таблеток, которые дезинтегрируют под воздействием водного окружения. Таблетки, в которых содержится слишком много дезинтегрирующего вещества, могут дезинтегрироваться при хранении, в то время как таблетки, которые содержат его слишком мало, могут не дезинтегрироваться с требуемой скоростью или в требуемых условиях. Таким образом, для получения твердых оральных лекарственных форм по этому изобретению следует применять достаточное количество дезинтегрирующего вещества, которое не является ни чрезмерным, ни недостаточным для того, чтобы отрицательным образом изменить высвобождение активных ингредиентов. Количество применяемого дезинтегрирующего вещества варьирует в зависимости от типа препарата и его может легко определить специалист в данной области. Типичные фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 весовых процентов дезинтегрирующего средства, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5 весовых процентов дезинтегрирующего средства.

Дезинтегрирующие вещества, которые можно использовать в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, но не ограничиваются ими, агар-агар, альгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, кроскармелозу натрия, кросповидон, полакрилин калия, натрийкрахмалгликолят, картофельный или маниоковый крахмал, прежелатинизированный крахмал, другие крахмалы, глины, другие альгины, другие виды целлюлозы, камеди и их смеси.

Связующие вещества, которые можно использовать в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, но не ограничиваются ими, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, легкое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, лаурилсульфат натрия, тальк, гидрогенизованное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллауриат, агар и их смеси. Дополнительные смазывающие вещества включают, например, силоидный силикагель (AEROSIL 200, изготавливаемый W. R. Grace Co. of Baltimore, MD), коагулированный аэрозоль из синтетического диоксида кремния (поставляемый Degussa Co. of Plano, TX), CAB O SIL (продукт из пирогенетического диоксида кремния, продаваемый Cabot Co. of Boston, MA) и их смеси. Смазывающие вещества, если их вообще используют, как правило, применяют в количестве менее приблизительно 1 весового процента фармацевтических композиций или лекарственных форм, в состав которых они включены.

В иллюстративном варианте осуществления соединение 1 растворяют/диспергируют в полиэтиленгликоле и лаурилсульфате натрия и заполняют в твердые капсулы из гипромеллозы. В одном варианте осуществления капсула содержит приблизительно 1-150 мг соединения 1. В другом варианте осуществления капсула содержит приблизительно 5-50 мг соединения 1. В другом варианте осуществления капсула содержит приблизительно 5 мг соединения 1. В другом варианте осуществления капсула содержит приблизительно 25 мг соединения 1.

Лекарственные формы с замедленным высвобождением

Активные ингредиенты, такие как соединения, представленные в настоящем документе, можно вводить с помощью средств с контролируемым высвобождением или с помощью устройств для доставки, хорошо известных среднему специалисту в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, средства и устройства, описанные в патентах США № 3845770; 3916899; 3536809; 3598123; и 4008719; 5674533; 5059595; 5591767; 5120548; 5073543; 5639476; 5354556; 5639480; 5733566; 5739108; 5891474; 5922356; 5972891; 5980945; 5993855; 6045830; 6087324; 6113943; 6197350; 6248363; 6264970; 6267981; 6376461; 6419961; 6589548; 6613358; 6699500, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок. Такие лекарственные формы можно использовать для обеспечения замедленного или контролируемого высвобождения одного или нескольких активных ингредиентов, используя, например, гидропропилметилцеллюлозу, другие полимерные матриксы, гели, проницаемые мембраны, осмотические системы, многослойные покрытия, микрочастицы, липосомы, микросферы или их сочетания в различных соотношениях для обеспечения желательного профиля высвобождения. Пригодные препараты с контролируемым высвобождением, известные средним специалистам в данной области, включая препараты, описанные в настоящем описании, можно легко выбрать для применения с активными ингредиентами, представленными в настоящем документе. Таким образом, это изобретение относится к стандартным лекарственным формам, пригодным для перорального введения, таким как, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и таблетки в форме капсул, пригодные для контролируемого высвобождения.

Все фармацевтические продукты с контролируемым высвобождением имеют общее назначение, связанное с улучшением лекарственной терапии по сравнению с терапией, достигаемой при применении неконтролируемых аналогов. В идеальном случае применение оптимально разработанного препарата с контролируемым высвобождением характеризуется минимальным количеством лекарственного вещества, используемого для лечения или контроля состояния в течение минимального периода времени. Преимущества препаратов с контролируемым высвобождением включают продолжительную активность лекарственного средства, снижение частоты дозирования и повышение соблюдения режима и схемы лечения пациентом. Кроме того, препараты с контролируемым высвобождением можно использовать для влияния на время начала действия или другие характеристики, такие как уровень лекарственного средства в крови, и, таким образом, можно влиять на возникновение побочных (например, неблагоприятных) эффектов.

Большинство препаратов с контролируемым высвобождением разработано для первоначального высвобождения количества лекарственного средства (активного ингредиента), которое быстро вызывает требуемый терапевтический эффект, и постепенного и непрерывного высвобождения других количеств лекарственного средства для поддержания этого уровня терапевтического или профилактического эффекта в течение продолжительного периода времени. В целях поддержания этого постоянного уровня лекарственного средства в организме лекарственное средство должно высвобождаться из лекарственной формы со скоростью, которая будет заменять количество лекарственного средства, метаболизируемого и экскретируемого из организма. Контролируемое высвобождение активного ингредиента может стимулироваться различными условиями, включая, но не ограничиваясь ими, pH, температуру, ферменты, воду или другие физиологические условия или соединения.

В определенных вариантах осуществления лекарственное средство можно вводить с использованием внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном варианте осуществления можно использовать насос (см., Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы. В другом варианте осуществления индивидууму можно помещать систему для контролируемого высвобождения в соответствующую область, определенную практикующим специалистом в данной области, т.е., таким образом, требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, p. 115-138 (1984)). Другие системы с контролируемым высвобождением описаны в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990)). Активный ингредиент может быть диспергирован в твердой внутренней матрице, например полиметилметакрилате, полибутилметакрилате, пластифицированном или непластифицированном поливинилхлориде, пластифицированном нейлоне, пластифицированном полиэтилентерефталате, природном каучуке, полиизопрене, полиизобутилене, полибутадиене, полиэтилене, сополимерах этилен-винилацетат, силиконовом каучуке, полидиметилсилоксанах, силикон-карбонатных сополимерах, гидрофильных полимерах, таких как гидрогели из сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты, коллагене, поперечно-сшитом поливиниловом спирте и поперечно-сшитом частично гидролизованном поливинилацетате, которая окружена наружной полимерной мембраной, например, из полиэтилена, полипропилена, сополимеров этилен/пропилен, сополимеров этилен/этилакрилат, сополимеров этилен/винилацетат, силиконовых каучуков, полидиметилсилоксанов, неопренового каучука, хлорированного полиэтилена, поливинилхлорида, сополимеров винилхлорида с винилацетатом, винилиденхлоридом, этиленом и пропиленом, иономерного терефталата полиэтилена, бутилкаучука, эпихлоргидриновых каучуков, сополимера этилен/виниловый спирт, терполимера этилен/винилацетат/виниловый спирт и сополимера этилен/винилоксиэтанол, которые являются нерастворимыми в жидкостях организма. Затем активный ингредиент диффундирует через наружную полимерную мембрану на стадии с контролируемой скоростью высвобождения. Процент активного ингредиента в таких парентеральных композициях в высокой степени зависит от его конкретных свойств, а также от потребностей индивидуума.

Парентеральные лекарственные формы

В одном варианте осуществления предусматриваются парентеральные лекарственные формы. Парентеральные лекарственные формы можно вводить индивидуумам различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, подкожное, внутривенное (включая болюсную инъекцию), внутримышечное и внутриартериальное введение. Вследствие того, что их введение, как правило, обходит природную защиту пациентов против загрязнителей, парентеральные лекарственные формы обычно являются стерильными или их можно стерилизовать перед введением пациенту. Примеры парентеральных лекарственных форм включают, но не ограничиваются ими, готовые растворы для введения, сухие продукты, готовые к разведению или суспендированию в фармацевтически приемлемом носителе для инъекции, готовые суспензии для инъекции и эмульсии.

Приемлемые носители, которые можно использовать для получения парентеральных лекарственных форм по этому изобретению, хорошо известны специалистам в данной области. Их примеры включают, но не ограничиваются ими: воду для инъекций USP; водные носители, такие как, но не ограничиваясь ими, инъекцию хлорида натрия, инъекцию раствора Рингера, инъекцию декстрозы, инъекцию декстрозы и хлорида натрия и инъекцию раствора лактата Рингера; растворимые в воде носители, такие как, но не ограничиваясь ими, этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; и неводные носители, такие как, но не ограничиваясь ими, кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.

Соединения, которые повышают растворимость одного или нескольких активных ингредиентов, описанных в настоящем описании, также могут быть включены в парентеральные лекарственные формы.

Лекарственные формы для трансдермального введения, местного введения и введения через слизистую оболочку

Также предусматриваются формы для трансдермального введения, местного введения и введения через слизистую оболочку. Формы для трансдермального введения, местного введения и введения через слизистую оболочку включают, но не ограничиваются ими, офтальмологические растворы, спреи, аэрозоли, кремы, лосьоны, мази, гели, растворы, эмульсии, суспензии или другие формы, известные специалисту в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th, 18th и 20th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 & 2000); и Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Лекарственные формы, пригодные для нанесения на слизистые ткани полости рта, можно изготавливать в виде жидкостей для полоскания рта или в виде гелей для полости рта. Кроме того, трансдермальные лекарственные формы включают пластыри "резервуарного типа" или "матричного типа", которые можно наносить на кожу и носить в течение конкретного периода времени для обеспечения проникновения желаемого количества активных ингредиентов.

Пригодные эксципиенты (например, носители и разбавители) и другие вещества, которые можно использовать для получения лекарственных форм для трансдермального, местного применения и введения через слизистую оболочку, охватываемые этим изобретением, хорошо известны специалистам в области фармацевтики и зависят от конкретной ткани, на которую данная фармацевтическая композиция или лекарственная форма будет нанесена. С учетом этого факта, типичные эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, воду, ацетон, этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло и их смеси для получения примочек, настоек, кремов, эмульсий, гелей или мазей, которые являются нетоксичными и фармацевтически приемлемыми. Также, если желательно, в фармацевтические композиции и лекарственные формы можно добавлять увлажняющие или смачивающие вещества. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th, 18^th and 20^th eds., Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 & 2000).

В зависимости от конкретной ткани, подвергаемой лечению, можно использовать дополнительные компоненты до, одновременно или после введения активных ингредиентов, представленных в настоящем документе. Например, для облегчения доставки активных ингредиентов в ткани можно использовать способствующее проникновению вещество. Пригодные способствующие проникновению вещества включают, но не ограничиваются ими: ацетон; различные спирты, такие как этанол, олеил и тетрагидрофурил; алкилсульфоксиды, такие как диметилсульфоксид; диметилацетамид; диметилформамид; полиэтиленгликоль; пирролидоны, такие как поливинилпирролидон; вещества класса Kollidon (повидон, поливидон); мочевину; и ризличные растворимые или нерастворимые в воде сложные эфиры сахаров, такие как Tween 80 (полисорбат 80) и Span 60 (моностеарат сорбитана).

Также для повышения доставки одного или нескольких активных ингредиентов можно корректировать pH фармацевтической композиции или лекарственной формы или ткани, для которой применяют фармацевтическую композицию или лекарственную форму. Аналогично, для повышения доставки можно корректировать полярность являющегося растворителем носителя, его ионную силу или тоничность. Также чтобы увеличить доставку в фармацевтические композиции или лекарственные формы можно добавлять такие соединения, как стеараты, для преимущественного изменения гидрофильности или липофильности одного или нескольких активных ингредиентов. В этом отношении, стеараты могут служить в качестве липидного носителя для состава, в качестве эмульгатора или поверхностно-активного вещества и в качестве средства, усиливающего доставку или проникновение. Для дальнейшей коррекции свойств конечной композиции можно использовать различные соли, гидраты или сольваты.

Дозировки и стандартные лекарственные формы

В случае лекарственных средств для человека врач определяет дозирование, которое он сочтет наиболее подходящим в соответствии с профилактическим или терапевтическим лечением и в соответствии с возрастом, массой тела, стадией инфекции и другими факторами, характерными для индивидуума, подвергаемого лечению. В определенных вариантах осуществления дозы составляют от приблизительно 1 до приблизительно 1000 мг в сутки для взрослого, или от приблизительно 5 до приблизительно 250 мг в сутки, или приблизительно от 10 до 50 мг в сутки для взрослого. В определенных вариантах осуществления дозы составляют от приблизительно 5 до приблизительно 400 мг в сутки или от 25 до 200 мг в сутки для взрослого. В определенных вариантах осуществления также предусматриваются уровни доз от приблизительно 50 до приблизительно 500 мг в сутки.

В следующих аспектах предусматриваются способы лечения или предупреждения инфекции HCV у индивидуума путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения, представленного в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемой соли. Количество соединения или композиции, которое является эффективным для предупреждения или лечения расстройства или одного или нескольких симптомов, варьируют, в зависимости от природы и тяжести заболевания или состояния и способа, посредством которого вводят активный ингредиент. Частоту введения и дозировку также варьируют в соответствии с факторами, индивидуальными для каждого индивидуума, в зависимости от конкретного вводимого лекарственного средства (например, терапевтического или профилактического средства), тяжести расстройства, заболевания или состояния, способа введения, а также от возраста, массы тела, ответа и предшествующего медицинского анамнеза у индивидуума. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых доза-эффект, полученных в тест-системах in vitro или в моделях на животных.

В определенных вариантах осуществления иллюстративные дозы композиции включают количества в миллиграммах или микрограммах активного соединения на килограмм массы индивидуума или образца (например, от приблизительно 10 микрограммов на килограмм до приблизительно 50 миллиграммов на килограмм, от приблизительно 100 микрограммов на килограмм до приблизительно 25 миллиграммов на килограмм или от приблизительно 100 микрограммов на килограмм до приблизительно 10 миллиграммов на килограмм). Для композиций, представленных в настоящем документе, в определенных вариантах осуществления дозировка, вводимая индивидууму, составляет от 0,140 мг/кг до 3 мг/кг массы тела индивидуума в расчете на массу активного соединения. В определенных вариантах осуществления дозировка, вводимая индивидууму, составляет от 0,20 мг/кг до 2,00 мг/кг или от 0,30 мг/кг до 1,50 мг/кг массы тела индивидуума.

В определенных вариантах осуществления рекомендованный суточный диапазон доз композиции, представленной в настоящем документе, для состояний, описанных в настоящем документе, находится в диапазоне от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 1000 мг в сутки, при введении в качестве однократной дозы раз в сутки или в качестве разделенных доз на протяжении суток. В одном варианте осуществления суточную дозу вводят два раза в сутки поровну разделенными дозами. В определенных вариантах осуществления диапазон суточной дозы составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 200 мг в сутки, в других вариантах осуществления от приблизительно 10 мг до приблизительно 150 мг в сутки, в следующих вариантах осуществления от приблизительно 25 до приблизительно 100 мг в сутки. В некоторых случаях может быть необходимым использование дозировки активного ингредиента за пределами диапазонов, описанных в настоящем документе, как будет понятно специалисту в данной области. Более того, следует отметить, что клиницист или лечащий врач знают, когда и как прервать, скорректировать или завершить терапию с учетом ответа индивидуума.

Для различных заболеваний и состояний могут быть применимы различные терапевтически эффективные количества, как хорошо известно специалисту в данной области. Аналогично, также описанные выше величины дозировок и режимы частоты дозирования охватывают количества, достаточные для предупреждения, управления течением, лечения или смягчения таких нарушений, но недостаточные, чтобы вызвать, или достаточные, чтобы снизить, неблагоприятные эффекты, ассоциированные с композицией. Кроме того, когда индивидууму вводят множество дозировок композиции, представленной в настоящем документе, не все дозировки должны быть одинаковыми. Например, дозировку, вводимую индивидууму, можно повышать для усиления профилактического или терапевтического эффекта композиции или ее можно снижать для уменьшения одного или нескольких побочных эффектов, которые испытывает конкретный индивидуум.

В определенном варианте осуществления дозировка композиции, представленной в настоящем документе, в расчете на массу активного соединения, вводимого для предупреждения, лечения, управления течением или смягчения расстройства, или одного или нескольких его симптомов у индивидуума, составляет 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 10 мг/кг, или 15 мг/кг массы тела индивидуума или более. В другом варианте осуществления дозировка композиции или композиция, представленная в настоящем документе, вводимая для предупреждения, лечения, управления течением или смягчения расстройства, или одного или нескольких его симптомов у индивидуума, представляют собой стандартную дозу, составляющую от 0,1 мг до 200 мг, от 0,1 мг до 100 мг, от 0,1 мг до 50 мг, от 0,1 мг до 25 мг, от 0,1 мг до 20 мг, от 0,1 мг до 15 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 7,5 мг, от 0,1 мг до 5 мг, от 0,1 до 2,5 мг, от 0,25 мг до 20 мг, от 0,25 до 15 мг, от 0,25 до 12 мг, от 0,25 до 10 мг, от 0,25 мг до 7,5 мг, от 0,25 мг до 5 мг, от 0,5 мг до 2,5 мг, от 1 мг до 20 мг, от 1 мг до 15 мг, от 1 мг до 12 мг, от 1 мг до 10 мг, от 1 мг до 7,5 мг, от 1 мг до 5 мг или от 1 мг до 2,5 мг.

В определенных вариантах осуществления лечение или предупреждение можно начинать одной или несколькими ударными дозами соединения или композиции, представленных в настоящем документе, с последующими одной или несколькими поддерживающими дозами. В таких вариантах осуществления ударная доза может составлять, например, от приблизительно 60 до приблизительно 400 мг в сутки или от приблизительно 100 до приблизительно 200 мг в сутки в течение от одних суток до пяти недель. За ударной дозой может следовать одна или несколько поддерживающих доз. В определенных вариантах осуществления каждая поддерживающая доза составляет, независимо, от приблизительно 10 мг до приблизительно 200 мг в сутки, от приблизительно 25 мг до приблизительно 150 мг в сутки или от приблизительно 25 до приблизительно 80 мг в сутки. Поддерживающие дозы можно вводить раз в сутки и их можно вводить в качестве однократных доз или разделенных доз.

В определенных вариантах осуществления дозу соединения или композиции, представленных в настоящем документе, можно вводить для достижения постоянной концентрации активного ингредиента в крови или сыворотке индивидуума. Постоянную концентрацию можно определять путем измерения способами, доступными специалистам в данной области, или она может быть основана на физических характеристиках индивидуума, таких как высота, масса тела и возраст. В определенных вариантах осуществления вводят достаточное количество соединения или композиции, представленных в настоящем документе, для достижения постоянной концентрации в крови или сыворотке индивидуума, составляющей от приблизительно 300 до приблизительно 4000 нг/мл, от приблизительно 400 до приблизительно 1600 нг/мл или от приблизительно 600 до приблизительно 1200 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления для достижения постоянных концентраций в крови или сыворотке, составляющих от приблизительно 1200 до приблизительно 8000 нг/мл или от приблизительно 2000 до приблизительно 4000 нг/мл, можно вводить ударные дозы в течение от одних до пяти суток. В определенных вариантах осуществления для поддержания постоянной концентрации в крови или сыворотке индивидуума от приблизительно 300 до приблизительно 4000 нг/мл, от приблизительно 400 до приблизительно 1600 нг/мл или от приблизительно 600 до приблизительно 1200 нг/мл можно вводить поддерживающие дозы.

В определенных вариантах осуществления введение одной и той же композиции можно повторять и введения могут быть разделены интервалом по меньшей мере 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток, 30 суток, 45 суток, 2 месяца, 75 суток, 3 месяца или 6 месяцев. В других вариантах осуществления введение одного и того же профилактического или лекарственного средства можно повторять и введения могут быть разделены интервалом по меньшей мере 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток, 30 суток, 45 суток, 2 месяца, 75 суток, 3 месяца или 6 месяцев.

В некоторых аспектах в настоящем документе предусматриваются стандартные лекарственные формы, содержащие соединение или его фармацевтически приемлемую соль, в пригодной для введения форме. Такие формы подробно описаны выше. В определенных вариантах осуществления стандартная лекарственная форма содержит от 1 до 1000 мг, от 5 до 250 мг или от 10 до 50 мг активного ингредиента. В конкретных вариантах осуществления стандартная лекарственная форма содержит приблизительно 1, 5, 10, 25, 50, 100, 125, 250, 500 или 1000 мг активного ингредиента. Такие стандартные лекарственные формы можно получать способами, известными специалистам в данной области.

В комбинированных способах лечения, представленных в настоящем документе, используют дозировки вторых средств. В определенных вариантах осуществления в комбинированных способах лечения, представленных в настоящем документе, используют дозировки ниже, чем дозировки, которые использовали или в настоящее время используют для предупреждения или лечения инфекции HCV. Рекомендованные дозировки второго средства получают, исходя из знаний специалиста в данной области. Для второго средства, которое одобрено для клинического применения, рекомендованные дозировки описаны, например, в Hardman et al., eds., 1996, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics 9^th Ed, Mc-Graw-Hill, New York; Physician's Desk Reference (PDR) 57^th Ed., 2003, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, которые включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

В различных вариантах осуществления лекарственные средства (например, соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство) вводят с интервалом между ними менее 5 минут, менее 30 минут, 1 час, приблизительно 1 час, от приблизительно 1 до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 3 часов, от приблизительно 3 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 5 часов, от приблизительно 5 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 7 часов, от приблизительно 7 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до приблизительно 9 часов, от приблизительно 9 часов до приблизительно 10 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 11 часов, от приблизительно 11 часов до приблизительно 12 часов, приблизительно от 12 часов до 18 часов, от 18 часов до 24 часов, от 24 часов до 36 часов, от 36 часов до 48 часов, от 48 часов до 52 часов, от 52 часов до 60 часов, от 60 часов до 72 часов, от 72 часов до 84 часов, от 84 часов до 96 часов, или от 96 часов до 120 часов. В различных вариантах осуществления лекарственные средства вводят с интервалом не более 24 часов или не более 48 часов. В определенных вариантах осуществления два или более лекарственных средств вводят за один визит пациента. В других вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство вводят одновременно.

В других вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство вводят с интервалом приблизительно от 2 до 4 суток, приблизительно от 4 до 6 суток, приблизительно 1 неделя, приблизительно от 1 до 2 недель или более 2 недель.

В определенных вариантах осуществления введение одного и того же средства можно повторять и введения могут быть разделены интервалом по меньшей мере 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток, 30 суток, 45 суток, 2 месяца, 75 суток, 3 месяца или 6 месяцев. В других вариантах осуществления введение одного и того же средства можно повторять и введения могут быть разделены интервалом по меньшей мере 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток, 30 суток, 45 суток, 2 месяца, 75 суток, 3 месяца или 6 месяцев.

В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство вводят пациенту, например млекопитающему, такому как человек, последовательно и в пределах такого временного интервала, чтобы соединение, представленное в настоящем документе, могло действовать вместе с другим средством для обеспечения увеличенной пользы относительно того, как если бы их вводили иным образом. Например, второе активное средство можно вводить одновременно или последовательно с первым в любом порядке в различные моменты времени; однако, если их вводят не одновременно, их следует вводить с интервалом, достаточно близким, чтобы обеспечить желаемый терапевтический или профилактический эффект. В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе активное средство оказывают их эффекты в периоды времени, которые перекрываются. Каждое второе активное средство можно вводить отдельно, в любой подходящей форме и любым пригодным способом. В других вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят до, одновременно или после введения второго активного средства.

В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство вводят пациенту курсами. Курсовая терапия включает введение первого средства (например, первого профилактического или терапевтического средства) в течение некоторого периода времени с последующим введением второго средства и/или третьего средства (например, второго и/или третьего профилактического или терапевтического средств) в течение некоторого периода времени и повторением этого последовательного введения. Курсовая терапия может снизить развитие устойчивости к одному или нескольким лекарственным средствам, предотвратить или снизить побочные эффекты одного из лекарственных средств и/или повысить эффективность лечения.

В определенных вариантах осуществления соединение, представленное в настоящем документе, и второе средство вводят в курсе менее чем приблизительно из 3 недель, приблизительно один раз каждые две недели, приблизительно один раз каждые 10 суток или приблизительно один раз в неделю. Один курс может включать введение соединения, представленного в настоящем документе, и второго средства путем инфузии в течение приблизительно 90 минут в каждом курсе, приблизительно 1 часа в каждом курсе, приблизительно 45 минут в каждом курсе. Каждый курс может включать по меньшей мере 1 неделю покоя, по меньшей мере 2 недели покоя, по меньшей мере 3 недели покоя. Количество проведенных курсов составляет от приблизительно 1 до приблизительно 12 курсов, более конкретно от приблизительно 2 до приблизительно 10 курсов и более конкретно от приблизительно 2 до приблизительно 8 курсов.

В других вариантах осуществления курсы лечения проводят пациенту одновременно, т.е. индивидуальные дозы второго средства вводят отдельно, но в пределах такого временного интервала, чтобы соединение, представленное в настоящем документе, могло действовать вместе со вторым активным средством. Например, один компонент можно вводить один раз в неделю в комбинации с другими компонентами, которые можно вводить раз в две недели или раз в три недели. Иными словами, режимы дозирования проводят одновременно, даже если лекарственные средства не вводят одновременно или в течение одного дня.

Второе средство может действовать аддитивно или синергично с соединением, представленным в настоящем документе. В одном варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят одновременно с одним или несколькими вторыми средствами в одной фармацевтической композиции. В другом варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят одновременно с одним или несколькими вторыми средствами в отдельных фармацевтических композициях. В другом варианте осуществления соединение, представленное в настоящем документе, вводят до или после введения второго средства. Также предусматривается введение соединения, представленного в настоящем документе, и второго средства тем же или другим путем введения, например пероральным и парентеральным. В определенных вариантах осуществления, когда соединение, представленное в настоящем документе, вводят одновременно со вторым средством, которое потенциально вызывает тяжелые побочные эффекты, включая, но не ограничиваясь ими, токсичность, второе средство преимущественно можно вводить в дозе ниже порога, при котором возникает неблагоприятный побочный эффект.

Иллюстративные дозировки и способы лечения

В одном варианте осуществления в настоящем документе предусматриваются способы лечения инфекции Flaviviridae у хозяина, в том числе человека, которые включают введение соединения 1 в количестве от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 150 мг/сутки, либо отдельно, либо в комбинации или поочередно с другим средством против Flaviviridae, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. В определенных вариантах осуществления вводимое количество соединения 1 составляет от приблизительно 5 мг/сутки до приблизительно 100 мг/сутки. В определенных вариантах осуществления вводимое количество соединения 1 составляет приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг/сутки. В определенных вариантах осуществления вводимое количество соединения 1 составляет приблизительно 5, 10, 25, 50, 75 или 100 мг/сутки.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе предусматриваются способы лечения инфекции Flaviviridae у хозяина, в том числе человека, которые включают введение соединения 1 в количестве от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 150 мг/сутки, в комбинации или поочередно с терапевтически эффективным количеством рибавирина, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте осуществления вводимое количество рибавирина составляет от приблизительно 800 мг до приблизительно 1400 мг. В одном варианте осуществления способы включают введение соединения 1 в количестве от приблизительно 5 мг/сутки до приблизительно 100 мг/сутки и рибавирина в количестве от приблизительно 800 мг до приблизительно 1400 мг. В определенных вариантах осуществления вводимое количество соединения 1 составляет приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг/сутки и количество рибавирина составляет 800 мг, 1000 мг, 1200 мг или 1400 мг. В определенных вариантах осуществления вводимое количество соединения 1 составляет приблизительно 5, 10, 25, 50, 75 или 100 мг/сутки и количество рибавирина составляет приблизительно 800 мг, 1000 мг, 1200 мг или 1400 мг.

Наборы

Также в настоящем документе предусматриваются наборы для применения в способах лечения расстройства печени, такого как инфекции HCV. Наборы могут включать соединение или композицию, представленные в настоящем документе, второе средство или композицию, и инструкции, на которых предоставлена информация для медицинских специалистов, касающаяся применения для лечения расстройства. Инструкции могут быть предоставлены в печатной форме или в форме электронного носителя, такого как гибкий диск, CD или DVD, или в форме адреса web-сайта, где могут быть получены такие инструкции. Единичная доза соединения или композиции, представленных в настоящем документе, или второго средства или композиции может включать такую дозировку, что при введении индивидууму у индивидуума может поддерживаться терапевтически или профилактически эффективный уровень соединения или композиции в плазме в течение по меньшей мере 1 суток. В некоторых вариантах осуществления соединение или композиция могут быть включены в качестве стерильной водной фармацевтической композиции или композиции в виде сухого порошка (например, лиофилизированной).

В некоторых вариантах осуществления предусматривается пригодная упаковка. Как используют в настоящем документе, "упаковка" включает твердую матрицу или материал, обычно используемый в системе и способный содержать в фиксированных предельных количествах соединение, представленное в настоящем документе, и/или второе средство, пригодное для введения индивидууму. Такие материалы включают стекло или пластмассу (например, полиэтилен, полипропилен и поликарбонат) бутыли, флаконы, бумажные, пластиковые и ламинированные полимерной пленкой обертки и т.п. Если используют способы стерилизации e-пучком, упаковка должна иметь достаточно низкую плотность, чтобы обеспечить стерилизацию содержимого.

В представленных ниже примерах проиллюстрирован синтез иллюстративных соединений, представленных в настоящем документе. Эти примеры не предназначены для ограничения объема заявленного объекта, а также их не следует истолковывать как ограничивающие его. Понятно, что объем заявленного объекта можно применять на практике иначе, чем конкретно описано в настоящем документе. Возможно множество модификаций и вариантов объекта ввиду представленных в настоящем документе указаний, и, таким образом, они находятся в объеме заявленного объекта.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Получение гидрокси-tBuSate-фосфорамидатного производного 2'-C-метилгуанозина (соединение 3)

Стадия 1: {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-H-фосфонат

К перемешиваемому раствору 9-(2-C-метил-β-D-рибофуранозил)гуанина (4,87 ммоль) и соли S-(2-фосфитэтил)-2,2-диметил-3-трифенилметилокситиопропионата с триэтиламином (6,34 ммоль) в пиридине (75 мл) при -15°C капельно добавляли пивалоилхлорид (9,74 ммоль) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при -15°C в течение 2 часов. Добавляли дихлорметан и раствор NH₄Cl. Органическую фазу отделяли, промывали раствором NH₄Cl, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением указанного в заголовке соединения.

Молекулярная формула C₃₇H₄₂N₅O₉PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,80 (с, 3H), 1,13 (с, 6H), 3,04 (с, 2H), 3,14 (м, 2H), 3,97-4,08 (м, 4H), 4,28-4,38 (м, 2H), 5,35-5,10 (м, 2H), 5,77 (с, 1H), 6,52 (ушир.с, 2H), 6,87-6,89 (м, 2H), 7,11-7,43 (м, 15H), 7,75 (с, 1H), ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 9,20 (с) 9,47 (с). Сканограмма ES⁺ 764 (M+H)⁺

Стадия 2: {9-[(2R)-2-С-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)фосфорамидат

К охлажденному раствору (-45°С) соединения 1-1 (0,76 ммоль) в тетрахлорметане (8 мл) добавляли 0,5 M раствор NH₃ в диоксане (3,80 ммоль, 8 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при температуре от -15°C до -10°С. Летучие вещества упаривали в вакууме. Полученный осадок совместно упаривали с дихлорметаном и использовали без очистки для следующей стадии. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула C₃₇H₄₃N₆O₉PS. Сканограмма ES⁺ 779 (M+H)⁺.

Стадия 3: гидрокси-tBuSate-фосфорамидатное производное 2'-C-метилгуанозина

Соединение 1-2 (0,78 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в водном 80% AcOH (31 мл) в течение 8 часов. Добавляли EtOAc (20 мл) и водный слой концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал очищали C₁₈-хроматографией (вода/ацетонитрил) с получением указанного в заголовке соединения. Белый порошок. Молекулярная формула C₁₈H₂₉N₆O₉PS. ¹H-ЯМР (D₂O-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,96 (с, 3H), 1,02 (2с, 6H), 3,00-3,07 (м, 2H), 3,47 (2c, 2H), 3,98-4,03 (м, 2H), 4,14-4,18 (м, 1H), 4,24-4,38 (м, 3H), 5,88 (2c, 1H), 7,85 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (D₂O-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 12,93-13,04 (2c, 1P). Сканограмма ES⁺ 537 (M+H)⁺.

ПРИМЕР 2

Получение {9-[(2R)-2-С-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-илфосфорамидата (соединение 4)

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)фосфорамидат (соединение 3) (0,20 моль) растворяли в растворе метанола, насыщенном NH₃ (4 мл), при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин и при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворитель упаривали и неочищенный материал очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией на силикагеле (C₁₈), элюируя градиентом 0-3% метанола с получением указанного в заголовке соединения (соединение 4) в виде белого твердого вещества. Молекулярная формула C₁₁H₁₇N₆O₇P. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,79 (с, 3H), 3,82-3,88 (м, 2H), 4,25-3,35 (м, 2H), 4,81 (ушир.с, 1H), 5,63 (с, 1H), 6,85 (ушир.с, 2H), 7,80 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 7,58 (с, 1P).

ПРИМЕР 3

Получение [(2R)-2-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин-5'-монофосфата (соединение 5)

К перемешиваемому раствору 9-(2-C-метил-β-D-рибофуранозил)гуанина (0,33 ммоль) в триэтилфосфате (825 мкл) добавляли фосфорилхлорид (75 мкл, 1,07 ммоль) при 0°С. Эту реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 5°С. Реакцию осторожно гасили 1 M TEAB (pH 7,5, 15 мл), перемешивали в течение 20 мин при 0°С, затем разбавляли водой и этилацетатом. Водную фазу концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал подвергали хроматографии DEAE-Sephadex, элюируя с помощью TEAB. Требуемые фракции объединяли, концентрировали при пониженном давлении, совместно упаривали со смесью вода/метанол и, наконец, совместно упаривали с водой. Полученный осадок очищали полупрепаративной ВЭЖХ. Фракции, содержавшие ожидаемый продукт, концентрировали при пониженном давлении, совместно упаривали со смесью вода/метанол и лиофилизировали из воды. Соль триэтиламмония и монофосфата элюировали водой на колонке со смолой Dowex Na⁺ с получением после лиофилизации соли натрия. Белое твердое вещество. Молекулярная формула C₁₁H₁₅N₅O₈P Na. ¹H-ЯМР (D₂O, 400 МГц) δ (м.д.) 0,83 (с, 3H), 4,05-4,11 (м, 3H), 4,21-4,24 (м, 1H), 5,79 (м, 1H), 7,94 (м, 1H). ³¹P-ЯМР (D₂O, 121 МГц) δ (м.д.) -0,42 (с, 1P). LRFAB-MS (GT): 422 (M+Na)⁺.

ПРИМЕР 4

Получение {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-эритрофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(карбокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)бензиламинфосфорамидата (соединение 11)

Стадия 1: ди-трет-бутиловый сложный эфир 2,2-диметилмалоновой кислоты

Соединение 3-5 синтезировали из диметилмалоновой кислоты способом, описанным в Synthesis, 1983, 135. Желтое масло. Молекулярная формула C₁₃H₂₄O₄. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆ 400 МГц) δ (м.д.) 1,26 (с, 6H), 2,89 (с, 18H).

Стадия 2: трет-бутиловый сложный эфир 2,2-диметилмалоновой кислоты

Соединение 3-6 синтезировали из соединения 5 способом, описанным в J. Org. Chem, 2004, 69, 6185. Белое твердое вещество. Молекулярная формула C₉H₁₆O₄. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 1,22 (с, 6H), 1,37 (с, 9H).

Стадия 3: трет-бутиловый сложный эфир 2-(2-гидроксиэтилсульфанилкарбонил)-2-метилпропионовой кислоты

К перемешиваемому раствору соединения 3-6 (1,30 ммоль) в безводной смеси толуола (6 мл) и ДМФА (455 мкл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (1,69 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, разбавляли в толуол/ДМФА (93/7, об./об.), охлаждали до -16°C и обрабатывали 2-меркаптоэтанолом (1,69 ммоль). Смесь перемешивали в течение 3 часов при температуре от -15°C до -5°C. Растворители удаляли при пониженном давлении. Осадок отбирали в DCM и промывали водой. Органический слой отделяли, сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. Желтое масло. Молекулярная формула C₁₁H₂₀O₄S. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 1,22 (с, 6H), 1,37 (с, 9H), 2,60 (м, 2H), 2,80 (м, 2H).

Стадия 4: триэтиламин трет-бутилового сложного эфира S-(2-фоссфитэтил)-2,2-диметилсульфанилкарбонилпропионовой кислоты

Соединение 3-7 (1,3 ммоль), растворенное в пиридине (6 мл), добавляли к фосфорной кислоте (13 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли пивалоилхлорид (7,15 ммоль). Смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. Реакцию осторожно гасили 1 M водным TEAB (3 мл), разбавляли EtOAc (50 мл) и промывали 0,5 M TEAB (15 мл). Органический слой отделяли, сушили над Na₂SO₄, концентрировали при пониженном давлении, совместно упаривали с толуолом и очищали хроматографией на силикагеле (DCM+1%TEA/DCM, 10% MeOH, 1% TEA) с получением указанного в заголовке соединения. Желтое масло. Молекулярная формула C₁₁H₂₀NO₆PS. ¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ (м.д.) 1,19 (с, 9H), 1,30 (с, 6H), 3,62 (м, 2H), 3,94 (м, 2H). ³¹P-ЯМР (CDCl₃, 162 МГц) δ (м.д.) 4,25 (с, 1P).

Стадия 5: {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-эритрофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трет-бутилкарбокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-H-фосфонат

Соединение 3-9 синтезировали из триэтиламина трет-бутилового сложного эфира 9-(2-C-метил-β-D-рибофуранозил)гуанина и S-(2-фосфитэтил)-2,2-диметилсульфанилкарбонилпропионовой кислоты способом, описанным для соединения 1-1. Светло-желтое масло. Молекулярная формула C₂₂H₃₄N₅O₁₀PS. Сканограмма ES⁺ 592 (M+H)⁺.

Стадия 6: {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-эритрофуранозил]гуанин)-5'-ил-O-(трет-бутилкарбокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)бензиламинфосфорамидат

К перемешиваемому раствору соединения 3-9 (0,84 ммоль) в тетрахлорметане (8,4 мл) капельно добавляли бензиламин (8,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (100 мл) и промывали 1н. HCl (50 мл). Органический слой отделяли, сушили над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле (метанол/дихлорметан) с получением указанного в заголовке соединения. Белое твердое вещество. Молекулярная формула C₂₉H₄₁N₆O₁₀PS. Сканограмма ES⁺ 697 (M+H)⁺.

Стадия 7: (9-[(2R)-2-C-метил-β-D-эритрофуранозил]гуанин-5'-ил-O-(карбокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)бензиламинфосфорамидат

К перемешиваемому раствору соединения 3-10 (0,07 ммоль) в DCM (1 мл) добавляли TFA (2,24 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляли TFA (1,12 ммоль) и смесь оставляли перемешиваться в течение еще 1 часа. Растворитель упаривали. Неочищенный материал очищали препаративной ВЭЖХ с получением указанного в заголовке соединения. Белое твердое вещество. Молекулярная формула C₂₅H₃₃N₆O₁₀PS. ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 9,64-9,90 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 642 (M+H)⁺.

ПРИМЕР 5

[(2R)-2-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин-N-бензиламинил-5'-монофосфат (соль) (соединение 2, соль натрия)

Соединение 1 (0,24 ммоль) перемешивали в NH₃/MeOH (7 Н) (10 мл) при комнатной температуре в течение 5 часов. Смесь упаривали, полученный осадок очищали хроматографией на силикагеле (вода/ацетонитрил) и элюировали водой на колонке со смолой Dowex Na⁺ с получением после лиофилизации соли натрия. Белое твердое вещество. Молекулярная формула C₁₈H₂₃N₆O₇P. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆ + D₂O, 400 МГц) δ (м.д.) 0,79 (с, 3H), 3,75-4,15 (м, 6H), 5,70 (с, 1H), 7,09-7,15 (м, 5H), 8,07 (с, 1H). ³¹P ЯМР (ДМСО-d₆ + D₂O, 162 МГц) δ (м.д.) 6,31 (с, 1P). Сканограмма ES⁺ 489 (M+Na)⁺.

ПРИМЕР 6

[(2R)-2-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин-5'-дифосфат

Соединение 5-4 (0,276 ммоль) растворяли в воде (0,7 мл) с Bu₃N (1,1 ммоль). Смесь концентрировали при пониженном давлении, три раза упаривали совместно с пиридином и два раза с толуолом. Добавляли ДМФА (2,25 мл), а затем 1,1-карбодиимидазол (1,68 ммоль). Смесь перемешивали в течение 16 часов и добавляли TEAB (7 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, гидролизовали водой (нейтральное значение pH) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал элюировали с помощью TEAB через колонку Sephadex-DEAE-A25 5 (Fluka) и очищали препаративной ВЭЖХ. Полученный белый порошок элюировали на колонке со смолой Dowex Na⁺ с получением после лиофилизации соли натрия. Белое твердое вещество. Молекулярная формула C₁₁H₁₅N₅Na₂O₁₁P₂. ¹H-ЯМР (D₂O, 400 МГц) δ (м.д.) 0,90 (с, 3H), 4,13-4,24 (м, 4H), 5,87 (с, 1H), 7,99 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (D₂O, 162 МГц) δ (м.д.) -11,15, -10,45 (2д, 2P).

ПРИМЕР 7

[(2R)-2-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин-5'-трифосфат (соль натрия)

К раствору 9-(2-C-метил-β-D-рибофуранозил)гуанина (0,40 ммоль) в триэтилфосфате (1 мл) добавляли фосфорилхлорид (1,08 ммоль) при 0°С. Эту реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 5°С. Пирофосфат трибутиламмония (PPi/Bu₃N 1/1,5, 1 г, 2,19 ммоль) растворяли в безводном ДМФА (2 мл). 2,4 мл этого раствора добавляли к реакционной смеси. Затем смесь перемешивали при 0°С в течение 1 мин. Реакцию осторожно гасили 1 M TEAB (pH 7,5, 5 мл), перемешивали в течение 20 мин при 0°С, затем разбавляли водой и этилацетатом. Водную фазу концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал подвергали хроматографии DEAE-Sephadex (с элюированием TEAB). Требуемые фракции объединяли, концентрировали при пониженном давлении и совместно упаривали со смесью вода/метанол и, наконец, совместно упаривали с водой. Полученный осадок очищали полупрепаративной ВЭЖХ. Трифосфат соли триэтиламмония элюировали три раза водой на колонке со смолой Dowex Na с получением после лиофилизации соли натрия. Белый порошок. Молекулярная формула C₂₉H₆₃N₈Na₃O₁₄P₃. ¹H-ЯМР (D₂O, 400 МГц) δ (м.д.) 0,91 (с, 3H), 4,14-4,36 (м, 4H), 5,88 (с, 1H), 8,01 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (D₂O, 162 МГц) δ (м.д.) -11,20, -10,65 (2д, 2P), -22,74 (т, 1P).

ПРИМЕР 8

O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-2'-C-метилгуанозин-5'-илфосфат (соль натрия)

Соединение 1 (0,11 ммоль) растворяли в 1н. водном растворе HCl и перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Полученный осадок очищали хроматографией на силикагеле C18 (с элюированием водой/ацетонитрилом) и элюировали водой на колонке со смолой Dowex Na⁺ с получением после лиофилизации соли натрия. Белый порошок. ¹H-ЯМР (D₂O, 400 МГц) δ (м.д.) 0,94-0,98 (м, 9H), 2,94 (т, J=6,8 Гц, 2H), 3,43 (с, 2H), 3,77 (т, J=7,2 Гц, 2H), 4,12-4,30 (м, 4H), 5,88 (с, 1H), 7,94 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (D₂O, 162 МГц) δ (м.д.) -0,08 (с, P).

ПРИМЕР 9

Очистка неочищенного соединения 1 с соотношением диастереомеров P>1,00:1,00

Неочищенное соединение 1 очищали обращенно-фазовой хроматографией (готовили 40 мкм C-18 RP-диоксид кремния - промывали градиентом от 100% ацетонитрила до 100% H₂O). Неочищенное вещество растворяли в тетрагидрофуране, H₂O и насыщенном водном растворе бикарбоната натрия.

Элюирование при мягком вакууме поэтапным ступенчатым градиентом*:

1,5% MeCN/H₂O

5% MeCN/H₂O

10% MeCN/H₂O

15% MeCN/H₂O

18% MeCN/H₂O

20% MeCN/H₂O

25% MeCN/H₂O

Чистое соединение 1 получали после нескольких фракций 25% MeCN. Химически очищенные фракции (смесь диастереоизомеров >1,00:1,00) хранили при 2-6°С в течение 15 ч, после чего преципитированные твердые вещества (главным образом, диастереомер 2) фильтровали и сушили в вакууме при 32-38°С, что приводило к чистому диастереомеру 2 (диастереомерная чистота: 98%).

Химическую чистоту твердого вещества проверяли посредством ВЭЖХ с использованием способа A, описанного ниже. Диастереомерную чистоту проверяли хиральной ВЭЖХ и ³¹P-ЯМР.

ПРИМЕР 10

Выделение соединения 1, диастереомер 1:

Соединение 1, диастереомер 1 выделяли с использованием обращенно-фазовой колоночной хроматографии (C₁₈ силикагель) на системе для очистки CombiFlash. Смесь диастереомеров (1 г, 83/17 диастереомер 2/1, химическая чистота = 97,3%) растворяли в смеси ТГФ/вода (3:1, 4 мл). Раствор загружали в предварительно уравновешенную колонку C₁₈ (Reusable RediSep Rf C₁₈, 130 г) и элюировали градиентом метанол/вода (от 40/60 до 50/50, скорость потока = 50 мл/мин). Первый элюированный изомер представлял собой диастереомер 1. Фракции проверяли посредством ВЭЖХ в отношении химической и диастереомерной чистоты диастереомера 1. Чистые фракции объединяли и упаривали в вакууме с получением диастереомера 1. Суммарный выход = 290 мг; как химическая, так и диастереомерная чистота составляет >99% (AUC, способ A ВЭЖХ и способ B ВЭЖХ соответственно).

Способ A ВЭЖХ: химическая чистота

Колонка: Zorbax Eclipse XDB-C8; 4,6×75 мм 3,5-мкм

Подвижная фаза A: ацетонитрил

Подвижная фаза B: 0,01 M аммоний-ацетатный буфер, рH 4,4

Температура колонки: 28°С

Скорость потока: 1,4 мл/мин

Детекция: УФ 254 нм, УФ 272 нм

Градиент:

Время	Подвижная фаза А	Подвижная фаза В
0	5	95
5,5	80	20
10	80	20

Способ B: способ ВЭЖХ для разделения диастереомеров соединения 1

Колонка: Agilent Eclipse XDB C₁₈; 4,6×150 мм 5-мкм

Подвижная фаза A: метанол

Подвижная фаза B: вода

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Детекция: УФ 272 нм

Градиент:

Время	Подвижная фаза А	Подвижная фаза В
0	40	60
20	55	45

Время удержания:

Соединение 1, диастереомер 2: 16,5±0,5 мин

Соединение 1, диастереомер 1: 14,4±0,5 мин

На фигуре 1 представлена хроматограмма ВЭЖХ, иллюстрирующая разделение двух диастереомеров соединения 1 - два пика на хроматограмме, пик 1 и пик 2, соответствуют диастереомерам 1 и 2 соединения 1.

ПРИМЕР 11

A. Получение соединения 1

Соединение 1 синтезируют в качестве смеси фосфорных диастереомеров в соотношении 1:1. Общей выход из 2'-C-метилгуанозина выделенного соединения 1, как правило, составляет 30-35%.

Материал	Чистота	FW, гмоль^-1	Количество	Плотность, гмл^-1	Количество, моль	Экв.
2'-C-метилгуанозин	97%	297,1	242 г	-	0,791	1,0
PhB(OH)₂	98%	122,1	103,4 г	-	0,831	1,05
Безводный ацетонитрил	98%	-	1,47 л	-	-	-
Na₂SO₄ безводный	99%	142,0	281 г	-	1,980	2,5
Na₂SO₄ безводный	99%	142,0	112 г	-	0,791	1,0

2'-C-метилгуанозин суспендировали в ацетонитриле в атмосфере аргона и добавляли безводный сульфат натрия (2,5 экв.). После перемешивания в течение пяти минут добавляли бензолбороновую кислоту за один раз и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Анализ реакционной смеси посредством ¹H-ЯМР (приготовление образца для ЯМР: приблизительно 0,1-мл аликвоты реакционной смеси сушили в потоке аргона для удаления ацетонитрила, осадок растворяли в ДМСО-d₆) показал соотношение продукт:исходный материал >96:4.

После кипячения с обратным холодильником в течение 2 ч смесь охлаждали до 25°С в атмосфере аргона и добавляли дополнительный безводный сульфат натрия (1,0 экв.). Полученную смесь использовали прямо для следующей стадии.

Материал	Чистота	FW, гмоль^-1	Количество	Плотность, гмл^-1	Количество, моль	Экв.
2,3-PhB-2'-C-метилгуанозин	-	-	Смесь	-	~0,791	1
Фосфонат 10-3	-	585,7	695 г	-	1,186	1,5
Безводный ацетонитрил	98%	-	526 мл	-	-	-
Безводный пиридин	99,5%	79,1	690 мл	0,978	8,54	10,8
Пивалоилхлорид	98%	120,6	497 мл	0,98	3,95	5,0
Бензиламин	98%	107,2	1,30 л	0,98	11,86	15
Тетрахлорид углерода	99,5%	153,8	918 мл	1,59	9,49	12

Фосфонат 10-3 растворяли в ацетонитриле (526 мл) и добавляли к неочищенной смеси 2'-C-метилгуанозинбороната 10-2 в атмосфере аргона. Затем эту смесь охлаждали до 5°С в атмосфере аргона. Отдельно пиридин обрабатывали пивалоилхлоридом в атмосфере аргона и полученную смесь капельно добавляли (в течение 1,5 ч) в реакционную колбу со смесью боронат-фосфонат, поддерживая внутреннюю температуру ниже 8°С. После перемешивания при 8°С в течение 30 мин анализ посредством ВЭЖХ (тест 20; 254 нм) показал соотношение 1,5:1 продукта P-H и 2'-C-метилгуанозина. Реакционной смеси позволяли постепенно нагреться до 14°С в течение последующих 50 минут, и в этот момент времени анализ ВЭЖХ (тест 20; 254 нм) показал соотношение 6,5:1 продукта P-H и 2'-C-метилгуанозина. Дополнительный PivCl не добавляли.

Внутреннюю температуру реакционной смеси снижали, а затем поддерживали при температуре ниже 8°С, а затем капельно добавляли бензиламин (1 ч), что приводило к густой суспензии. Затем добавляли тетрахлорметан в течение 15 минут при контроле внутренней температуры на уровне ниже 15°С. Реакция была слабо экзотермической. Анализ посредством ВЭЖХ (тест 20; 272 нм) через 15 минут показал полный расход промежуточного соединения P-H (Rt 5,26 мин) и образование продукта (Rt 5,73 мин). Реакционную смесь хранили в течение ночи при 4°С в атмосфере аргона.

Добавляли TBME (3 л) и полученную смесь переливали в водный раствор лимонной кислоты (22% масс./об., 9,3 л). Для промывания реакционной емкости использовали дополнительный TBME (4,4 л). Двухфазную смесь перемешивали в течение 45 мин при комнатной температуре для достижения расщепления бороната. В водной фазе наблюдали остаточные твердые вещества, таким образом, для достижения приемлемого разделения фаз дополнительно добавляли 1 л раствора лимонной кислоты.

Две фазы разделяли и в анализе ВЭЖХ определили, что водная фаза имела pH 4 без продукта. Органический слой подщелачивали до pH 8 водным бикарбонатом натрия (5% масс./об.; 4,7 л) и слои разделяли после добавления насыщенного рассола (2 л). В анализе ВЭЖХ в водном бикарбонатном слое продукта не наблюдали.

К органическому слою добавляли дополнительный TBME (7,4 л) для индукции дальнейшей преципитации продукта и смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре.

Фильтрация в вакууме и последующий анализ ВЭЖХ показали небольшое количество продукта в фильтрате TBME. Осадок на фильтре промывали водой (8 л, нет продукта в фильтрате), TBME (4 л, очень мало продукта в фильтрате) и этанолом (2 л, в фильтрате наблюдали продукт).

Твердые вещества сушили в вакуумной печи (<35°C) с использованием абсорбента Drierite с получением 465 г светло-желтого фосфорамидата 10-4.

ВЭЖХ AUC тест 20 при 272 нм: 92% - источником двух основных типов примесей Rt 4,5 мин (2,5%) и Rt 5,1 мин (3,5%) была партия фосфоната 10-3.

Выход: 67%. Отношение в ³¹P-ЯМР 9,93 м.д.:9,78 м.д.=1,1:1,0.

Материал	Чистота	FW, гмоль^-1	Количество	Плотность, гмл^-1	Количество, моль	Экв.
Фосфорамидат 10-4	-	868,9	317 г	-	0,365	1
AcCl	99%	78,5	53 мл	1,105	0,730	2,0
Безводный EtOH	98%	-	4,7 л	-	-	-

Фосфорамидат 10-4 растворяли в безводном этаноле (4,0 л) в атмосфере аргона. Отдельно к безводному этанолу (60 мл) осторожно добавляли ацетилхлорид - высоко экзотермическая реакция - в атмосфере аргона. Раствор HCl в этаноле, полученный таким образом, добавляли к раствору фосфорамидата, вследствие чего внутренняя температура возрастала до от 18°С до 20°С. Кроме того, 100 мл безводного этанола использовали для промывания оставшейся частью раствора HCl реакционной смеси.

Реакционную смесь нагревали до 60°С в течение 30 минут, после чего анализ ВЭЖХ (тест 20 при 254 или 272 нм) показал полную конверсию исходного материала (Rt 5,7 мин) в главный продукт (Rt 3,32 мин).

После общего времени реакции 45 мин смесь охлаждали до 25-30°С и добавляли твердый бикарбонат натрия (2,3 кг), поддерживая внутреннюю температуру при 25-30°С при перемешивании в течение 1 ч. Мониторинг pH проводили с использованием индикаторных полосок pH Colorfast и определили, что он составляет pH 5-6.

Смесь фильтровали через целит и промывали этанолом (4 л) и тетрагидрофураном (1,5 л). Фильтрат концентрировали в вакууме при 35°С с получением твердого вещества (356 г). Растирание с TBME (1,5 л) в течение 15 мин при 35°С для удаления побочного продукта, тритила, давало твердое вещество, которое фильтровали, промывали TBME (750 мл) сушили с получением неочищенного 10-5 (268 г; 78% ВЭЖХ тест 20 AUC при 272 нм). В анализе ВЭЖХ в фильтрате продукта не наблюдали.

268 г неочищенного соединения 1 очищали обращенно-фазовой хроматографией (3 кг приготовленного Bakerbond 40 мкм C-18 RP-диоксида кремния - промывали градиентом от 100% ацетонитрила до 100% H₂O). Неочищенное вещество растворяли в тетрагидрофуране (225 мл), H₂O (75 мл) и насыщенном водном растворе бикарбоната натрия (75 мл). Получили 135 г, >98% чистота ВЭЖХ тест 20 AUC при 272 нм (выход 59%).

Типичные данные анализа представлены ниже:

Соединение 1: C₂₅H₃₅N₆O₉PS 626,62 гмоль^-1

ВЭЖХ AUC (способ тест 20): 99% при 272 нм, Rt 3,32 мин

m/z (ESI+): 627,05 [M+H]⁺ 100%; 1253,55 [2M+H]⁺ 20%

¹H ЯМР δ_H (400 МГц, ДМСО-d₆): 0,85 (3H, с, CH₃), 1,11 (6H, с, (CH₃)₂C), 3,05 (2H, м, CH₂S), 3,44 (2H, д, J=5,5 Гц, CH₂OH), 3,89-4,02 (6H, м, H-3', H-4', CH₂O, CH₂Ph), 4,14-4,20 (1H, м, H-5'), 4,22-4,30 (1H, м, H-5"), 4,97 (1H, т, J=5,5 Гц, CH₂OH), 5,22 (1H, с, OH-2'), 5,43, 5,46 (2×0,5H, 2×д, 2×J=6,4 Гц, OH-3'), 5,68 (1H, м, P-N-H), 5,78 (1H, с, H-1'), 6,56 (2H, ушир.с, NH₂), 7,20-7,24 (1H, м, Ar-H), 7,28-7,34 (4H, м, 4×Ar-H), 7,80, 7,81 (2×0,5H, 2×с, H-8), 10,69 (1H, ушир.с, N-H)

³¹P ЯМР δ_P (162 МГц, ДМСО-d₆): 9,78, 9,92 (1P, 2×с, отношение 1,00:1,09)

B. Получение соединения 1, диастереомер 2

Способ 1

Синтез соединения 1 (смесь диастереомеров) - опосредуемая ацетилхлоридом/этанолом реакция детритилирования:

Химические вещества	Поставщик/ Чистота	FW	Количество	ммоль	Экв.
Соединение 4-2	Получено известными способами	868	229,0 г	264	1,0
Ацетилхлорид (d=1,105)	Fluka/98+%	78,5	37,5 мл	527	1,5
Этанол	Aldrich/ безводный	46	3,3 л	растворитель	14,5 мл/г
Сульфат натрия	J.T. Baker безводный	142	65 г	458	1,7
Бикарбонат натрия	J.T. Baker/ порошок	84	1,2 кг	Для нейтрализации

К суспензии соединения 10-4 (229,0 г, 264 ммоль, чистота 89%, соотношение диастереомеров 2:1 TrO-A:TrO-B) в безводном этаноле (3,3 л) добавляли ацетилхлорид (37,5 мл, 527 ммоль) через воронку для добавления в течение 5 минут. Полученную смесь нагревали до 60°С на колбонагревателе и поддерживали при 60°С в течение 1 часа. ВЭЖХ показала, что реакция завершилась (способ A, AUC, 272 нм, было выявлено только менее 0,5% соединения 10-4).

Обработка: Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане до 28°С; добавляли безводный сульфат натрия (65 г). Затем охлаждающую баню удаляли. Добавляли порошок бикарбоната натрия (1,2 кг) порциями в течение 1 часа. Смесь перемешивали при к.т.(RT) в течение 30 минут; pH смеси составлял ~7. Затем нерастворимое твердое вещество удаляли фильтрацией в вакууме. Осадок на фильтре промывали этанолом (700 мл) и ТГФ (700 мл). Фильтрат концентрировали на Rotavap до объема приблизительно 200 мл. Осадок добавляли в трет-бутилметиловый эфир (TBME) (1 л). Из раствора выпадало вязкое твердое вещество и прикреплялось к боковой стенке колбы. Затем смеси позволяли осесть в холодной комнате (4°С) в течение ночи.

Из указанной выше смеси сливали TBME. Добавляли дополнительный TBME (200 мл) для промывания твердого осадка вихревым движением в течение 5 минут. TBME сливали с получением неочищенного вещества.

Выделение/очистка соединения 1, диастереомер 2:

Указанный выше неочищенный материал суспендировали в ТГФ (520 мл) и воде (30 мл). Добавляли небольшое количество (приблизительно 5 мл) насыщенного раствора бикарбоната натрия для доведения pH до 7,5 (начальное значение pH 6, pH-бумага). Смесь вращали в круглодонной колбе в течение 15 минут. К смеси добавляли дополнительный ТГФ (280 мл). После перемешивания в течение 5 минут твердое вещество собирали вакуумной фильтраций. Осадок на фильтре промывали ТГФ (120 мл) и водой (140 мл) и сушили в вакуумной печи при 40°С. Соединение 1, диастереомер 2, получали в виде белого твердого вещества. Суммарный выход = 55,0 г, химическая чистота = 97% (AUC, способ A ВЭЖХ, см. пример 10); диастереомерная чистота = 97,7%. (AUC, ВЭЖХ).

Способ 2

Химические вещества	Поставщик/ Чистота	FW	Количество	ммоль	Экв.
Соединение 10-4	Получено известными способами	868	231,0 г	266	1,0
Ацетилхлорид (d=1,105)	Fluka/ 98+%	78,5	37,8 мл	530	1,5
Этанол	Aldrich/ безводный	46	2,46 л	Растворитель	10 мл/г
Сульфат натрия	J.T. Baker безводный	142	70 г	492	1,8
Бикарбонат натрия	J.T. Baker/ порошок	84	2,0 кг	Для нейтрализации

К суспензии соединения 10-4 (231,0 г, 266 ммоль, чистота 90%, соотношение диастереомеров 2,3:1 TrO-A: TrO-B) в безводном этаноле (2,46 л) добавляли ацетилхлорид (37,8 мл, 530 ммоль) через воронку для добавления в течение 5 минут. Полученную смесь нагревали до 60°С на колбонагревателе и поддерживали при 60°С в течение 1 часа. Результат ВЭЖХ показал, что реакция завершилась (способ A, AUC, 272 нм, было выявлено только менее 1,5% соединения 10-4).

Обработка: Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане до 30°С; добавляли безводный сульфат натрия (70 г). Затем охлаждающую баню удаляли. Добавляли порошок бикарбоната натрия (2,0 кг) порциями в течение 1 часа. Смесь перемешивали при к.т. в течение 30 минут; pH смеси составлял ~6-7. Затем нерастворимое твердое вещество удаляли фильтрацией в вакууме. Осадок на фильтре промывали этанолом (600 мл) и ТГФ (600 мл). Фильтрат концентрировали на Rotavap до объема приблизительно 200 мл. Осадок добавляли в TBME (1 л) и смесь вращали на водяной бане при 35°С в течение 30 минут. Из раствора выпадало вязкое твердое вещество и прикреплялось к боковой стенке колбы. Затем смеси позволяли осесть в холодной комнате (4°С) в течение ночи.

Указанный выше неочищенный материал суспендировали в ТГФ (400 мл) и воде (40 мл). Добавляли небольшое количество (приблизительно 7 мл) насыщенного раствора бикарбоната натрия для доведения pH до 7,5 (начальное значение pH 6, pH-бумага). Смесь вращали в круглодонной колбе в течение 30 минут. К смеси добавляли дополнительный ТГФ (200 мл) для облегчения переноса материала. Осадок на фильтре промывали ТГФ (40 мл) и водой (100 мл) и сушили в вакуумной печи при 40°С. Соединение 1, диастереомер 2, получали в виде белого твердого вещества. Суммарный выход = 50,0 г, химическая чистота = 97% (AUC, способ A ВЭЖХ, см. пример 10); диастереомерная чистота = 94%. Материал далее очищали следующим образом: растирали с ацетонитрилом/водой (50 мл/450 мл) для повышения чистоты диастереомера; растворяли в смеси ТГФ/вода (3:1, 360 мл) и фильтровали через слой целита для удаления полярных примесей (RT=0,7 мин, способ A ВЭЖХ); после второго растирания со смесью ацетонитрил/вода (50 мл/450 мл) для удаления неизвестных примесей проводили ¹H-ЯМР (δ=11,7 м.д.). Был получен конечный чистый диастереомер 2 как с химической, так и с диастереомерной чистотой >99%. Суммарная выход = 38,5 г.

ПРИМЕР 12

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-H-фосфонат, соединение 11-1

К перемешиваемому раствору 9-(2-C-метил-β-D-рибофуранозил)гуанина (4,87 ммоль) и соли триэтиламина S-(2-фосфитэтил)-2,2-диметил-3-трифенилметилокситиопропионата (6,34 ммоль) в пиридине (75 мл) при -15°C капельно добавляли пивалоилхлорид (9,74 ммоль) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при -15°C в течение 2 часов. Добавляли дихлорметан и раствор NH₄Cl. Органическую фазу отделяли, промывали раствором NH₄Cl, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением указанного в заголовке соединения 11-1. Молекулярная формула: C₃₇H₄₂N₅O₉PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,80 (с, 3H), 1,13 (с, 6H), 3,04 (с, 2H), 3,14 (м, 2H), 3,97-4,08 (м, 4H), 4,28-4,38 (м, 2H), 5,35-5,10 (м, 2H), 5,77 (с, 1H), 6,52 (ушир.с, 2H), 6,87-6,89 (м, 2H), 7,11-7,43 (м, 15H), 7,75 (с, 1H), 10,67 (ушир.с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆ 162 МГц) δ (м.д.) 9,20 (с), 9,47 (с). Сканограмма ES⁺ 764 (M+H)⁺.

Соединение 11-2a

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)изопропилфосфорамидат

К раствору соединения 11-1 (0,98 ммоль) в тетрахлорметане (10 мл) добавляли изопропиламин (4,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Летучие вещества упаривали в вакууме. Полученный осадок очищали хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением указанного в заголовке соединения. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула: C₄₀H₄₉N₆O₉PS. Сканограмма ES⁺ 821 (M+H)⁺.

Соединение 11-3a

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-изопропилфосфорамидат

Раствор соединения 11-2a (0,5 ммоль) в дихлорметане (2 мл) перемешивали с трифторуксусной кислотой (160 мкл) в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем смесь очищали хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением указанного в заголовке соединения. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₁H₃₅N₆O₉PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,81 (с, 3H), 1,04 (м, 6H), 1,09 (с, 6H), 3,07 (т, J=6,49 Гц, 2H), 3,42 (м, 2H), 3,87-3,91 (м, 2H), 3,95-3,98 (м, 2H), 4,17-4,20 (м, 2H), 4,92-4,98 (м, 2H), 5,17 (с, 1H), 5,38-5,43 (м, 1H), 6,53 (с, 2H), 7,76 (с, 1H), 10,65 (ушир.с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 8,79-8,91 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 579 (M+H)⁺.

Соединение 11-2b

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)морфолинилфосфорамидат

Соединение 11-2b синтезировали из соединения 11-1 и морфолина согласно способу, описанному для соединения 11-2a. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула: C₄₁H₄₉N₆O₁₀PS. Сканограмма ES⁺ 849 (M+H)⁺.

Соединение 11-3b

S-{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин-5'-ил]-[(морфолин-1-ил)фосфиноилокси]этиловый}сложный эфир 3-гидрокси-2,2-диметилтиопропионовой кислоты

Соединение 11-3b синтезировали из соединения 11-2b способом, описанным для соединения 11-3a. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₂H₃₅N₆O₁₀PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,82 (с, 3H), 1,10 (с, 6H), 3,00 (м, 4H), 3,08-3,11 (м, 2H), 3,42 (м, 2H), 3,48-3,58 (м, 4H), 3,95-4,00 (м, 4H), 4,20 (м, 2H), 4,91-4,94 (м, 1H), 5,20 (с, 1H), 5,46 (м, 1H), 6,52 (с, 2H), 7,75 (2с, 1H), 10,64 (ушир.с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆ 162 МГц) δ (м.д.) 7,61-7,75 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 607 (M+H)⁺.

Соединение 11-2c

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-трет-бутилфосфорамидат

Соединение 11-2c синтезировали из соединения 11-1 и трет-бутиламина способом, описанным для соединения 11-2a. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула: C₄₁H₅₁N₆O₉PS. Сканограмма ES⁺ 835 (M+H)⁺.

Соединение 11-3c

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-трет-бутилфосфорамидат

Соединение 11-3c синтезировали из соединения 11-2c способом, описанным для соединения 11-3c. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₂H₃₇N₆O₉PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,81 (с, 3H), 1,09 (с, 6H), 1,17 (с, 9H), 3,06 (т, J=6,45 Гц, 2H), 3,41 (м, 2H), 3,86-3,90 (м, 2H), 3,99 (м, 2H), 4,12 (м, 1H), 4,82-4,92 (м, 2H), 5,15 (с, 1H), 5,35-5,39 (м, 1H), 6,52 (с, 2H), 7,77 (с, 1H), 10,42 (ушир.с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 7,42-7,46 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 593 (M+H)⁺.

Соединение 11-2d

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-метилпиперазилфосфорамидат

Соединение 11-2d синтезировали из соединения 11-1 и N-метилпиперазина способом, описанным для соединения 11-2a. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула: C₄₂H₅₂N₇O₉PS. Сканограмма ES⁺ 862 (M+H)⁺.

Соединение 11-3d

S-{[9-{[2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин-5'-ил]-[(4-метилпиперазин-1-ил)фосфиноилокси]этиловый} сложный эфир 3-гидрокси-2,2-диметилтиопропионовой кислоты

Соединение 11-3d синтезировали из соединения 11-2d способом, описанным для соединения 11-3a. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₃H₃₈N₇O₉PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,83 (с, 3H), 1,11 (с, 6H), 2,50 (м, 3H), 2,52-2,65 (м, 4H), 2,90-3,02 (м, 2H), 3,05-3,12 (м, 4H), 3,42 (м, 2H), 3,95-4,02 (м, 4H), 4,21-4,24 (м, 2H), 4,64 (м, 1H), 5,22 (с, 1H), 5,45 (м, 1H), 6,62 (с, 2H), 7,74 (с, 1H), 10,73 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 7,25-7,32 (2с, 1P). Сканограмма ES^- 618 (M+H)^-.

Соединение 11-2e

Фосфорамидат этилового эфира {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)уксусной кислоты

Соединение 11-2e синтезировали из соединения 11-1 и этилового сложного эфира глицина способом, описанным для соединения 11-2a. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула: C₄₁H₄₉N₆O₁₁PS. Сканограмма ES⁺ 864 (M+H)⁺.

Соединение 11-3e

Фосфорамидат этилового эфира {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-уксусной кислоты

Соединение 11-3e синтезировали из соединения 11-2e способом, описанным для соединения 11-3a. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₂H₃₅N₆O₁₁PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,81 (с, 3H), 1,10 (с, 6H), 1,12-1,17 (м, 3H), 3,05-3,07 (м, 2H), 3,29 (м, 1H), 3,42 (м, 2H), 3,53-3,57 (м, 2H), 3,85-3,96 (м, 4H), 4,07 (кв, J=7,00 Гц, 2H), 4,15 (м, 1H), 4,24 (м, 1H), 4,92 (тд, J=5,50 Гц и J=1,30 Гц, 1H), 5,15 (с, 1H), 5,36-5,41 (м, 1H), 5,40-5,55 (м, 1H), 6,52 (с, 2H), 7,73 (с, 1H), 10,63 (ушир.с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 9,07-9,19 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 623 (M+H)⁺.

Соединение 11-2f

Фосфорамидат трет-бутилового эфира {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)уксусной кислоты

Соединение 11-2f синтезировали из соединения 11-1 и трет-бутилового сложного эфира глицина способом, описанным для соединения 11-2a. Бежевое твердое вещество. Молекулярная формула: C₄₃H₅₃N₆O₁₁PS. Сканограмма ES⁺ 893 (M+H)⁺.

Соединение 11-3f

Фосфорамидат трет-бутилового эфира {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-уксусной кислоты

Соединение 11-3f синтезировали из соединения 11-2f способом, описанным для соединения 11-3a. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₄H₃₉N₆O₁₁PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,81 (с, 3H), 1,10 (с, 6H), 1,37 (с, 9H), 3,05-3,07 (м, 2H), 3,29 (с, 1H), 3,40-3,44 (м, 4H), 3,93-3,97 (м, 4H), 4,13-4,15 (м, 1H), 4,22-4,25 (м, 1H), 4,92 (тд, J=5,50 Гц и J=1,47 Гц, 1H), 5,15 (с, 1H), 5,36-5,44 (м, 2H), 6,51 (с, 2H), 7,74 (с, 1H), 10,63 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 9,08-9,26 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 651 (M+H)⁺.

Соединение 11-2g

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(трифенилметилокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)диметиламиноэтилфосфорамидат

Соединение 11-2g синтезировали из соединения 11-1 и диметиламиноэтиламина способом, описанным для соединения 11-2a. Молекулярная формула: C₄₁H₅₇N₇O₉PS. Сканограмма ES⁺ 850 (M+H)⁺.

Соединение 11-3g

{9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-диметиламиноэтилфосфорамидат

Соединение 11-3g синтезировали из соединения 11-2g способом, описанным для соединения 11-3a. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₂H₃₈N₇O₉PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,83 (с, 3H), 1,11 (с, 6H), 2,67 (с, 6H), 3,08-3,10 (м, 2H), 3,10-3,12 (м, 4H), 3,42-3,45 (м, 2H), 3,94-4,01 (м, 4H), 4,15-4,26 (м, 2H), 4,95 (м, 1H), 5,22 (м, 1H), 5,41-5,47 (м, 2H), 6,63 (с, 2H), 7,30 (м, 1H), 7,77 (с, 1H), 10,76 (с, 1H). ³¹P-ЯМР (ДМСО-d₆, 162 МГц) δ (м.д.) 9,31-9,40 (2с, 1P). Сканограмма ES⁺ 608 (M+H)⁺.

Соединение 11-3h

Фосфорамидат {9-[(2R)-2-C-метил-β-D-рибофуранозил]гуанин}-5'-ил-O-(гидрокси-трет-бутил-S-ацил-2-тиоэтил)-N-уксусной кислоты

К перемешиваемому раствору соединения 11-3f (0,16 ммоль) в дихлорметане (2 мл) добавляли TFA (35 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при 50°C и в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем смесь упаривали и очищали хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением указанного в заголовке соединения. Белый порошок. Молекулярная формула: C₂₀H₃₁N₆O₁₁PS. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ (м.д.) 0,80 (с, 3H), 1,09 (с, 6H), 2,95 (т, J=6,50 Гц, 2H), 3,28 (м, 2H), 3,40 (м, 2H), 3,67-3,69 (м, 2H), 3,84-3,86 (м, 2H), 4,19-4,20 (м, 1H), 4,27 (м, 1H), 4,89 (с, 1H), 5,08 (т, J=5,70 Гц, 1H), 5,64 (с, 1H), 6,31 (с, 1H), 6,71 (с, 2H), 7,79 (с, 1H), 10,55 (с, 1H).

ПРИМЕР 13

Биологическая активность диастереомера 1 и диастереомера 2 соединения 1

Биологическая активность диастереомера 1 и диастереомера 2 соединения 1 измеряли мониторингом экспрессии белка NS4A твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) и анализом люциферазы, как описано ниже.

Анализ репликона с люциферазой

В анализе репликона HCV с люциферазой измеряют способность тестируемого соединения ингибировать репликацию HCV в культуре клеток после обработки в течение 3 суток клеточной линии гепатомы человека (Huh-7), содержащей репликон HCV генотипа 1b и слитый ген люциферазы-неомицинфосфотрансферазы. Ингибирование репликации HCV измеряли количественным определением экспрессии белка люциферазы. Репликон HCV с люциферазой конструировали слиянием гена люциферазы с N-концом гена неомицинфосфотрансферазы репликона HCV ZS11. Репликон HCV ZS11 (Zhu Q, Guo J-T, and Seeger C, 2003) получен из репликона SP1, однако он содержит три адаптированных для клеточной культуры мутации: E1202G (NS3), S2204I (NS5A) и D2254E (NS5A). Эти мутации позволяют эффективную репликацию in vitro. Репортерный ген люциферазы амплифицировали из вектора pGL4.13[luc2/SV40] (Promega Corp.). Репликон, полученный слиянием люцифераза-неомицин (ZS11-luc) стабильно трансфицировали в клетки Huh-7 с получением клеточной линии Zluc.

Анализ репликона с люциферазой обобщенно является следующим: в непрозрачные белые 96-луночные планшеты для культивирования тканей (BD Falcon) высевали клетки Zluc. Готовили свежие растворы противовирусного соединения в среде в качестве 2X-концентрированных маточных растворов. Из этих маточных растворов готовили восемь дополнительных 3-кратных разведений лекарственного средства в среде, всего в количестве 9 разведений. По меньшей мере через четыре часа после высевания клеток Zluc начинали обработку лекарственным средством путем добавления одного объема каждого из разведений 2X-концентрированного лекарственного средства к одному объему клеток/среды в планшеты для культивирования тканей. Затем клетки инкубировали в течение 3 суток при 37°C/5% CO₂.

Затем среду/соединение удаляли из планшетов и в каждую лунку добавляли реагент для анализа люциферазы ONE-glo (Promega). Планшеты для анализа встряхивали в течение 3 минут при комнатной температуре и активность люциферазы для каждой лунки измеряли при времени считывания 1 с на устройстве для подсчета Victor³V multilabel counter с использованием фильтра с ограничением 700 нм (Perkin Elmer). Величины EC₅₀ вычисляли из кривых доза-эффект исходя из полученных уравнений наилучшего соответствия, определенных с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и XLfit 4.1.

Анализ репликона HCV (NS4A ELISA)

В анализе репликона HCV определяют способность тестируемого соединения ингибировать репликацию HCV в клеточной культуре после обработки в течение 3 суток в клеточной линии гепатомы человека (Huh-7), содержащей репликон HCV генотипа 1b (клетки GS4.1). Ингибирование репликации HCV измеряли количественным определением вирусного белка NS4A с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Клеточная линия GS4.1 (Zhu, Guo and Seeger 2003) получена из клеточной линии печени человека Huh-7, и она стабильно содержит бисцистронный репликон SP1 ΔS HCV, который содержит неструктурные белки от NS3 до NS5B из штамма HCV con1, генотип 1b, под контролем промотора EMCV IRES. Кроме того, репликация содержит ген неомицинфосфотрансферазы под контролем промотора HCV (источник: Dr. Christoph Seeger, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA).

Анализ NS4A ELISA обобщенно представлен ниже. В 96-луночные планшеты для культивирования тканей высевали клетки GS4.1. Готовили свежие растворы противовирусного соединения в среде в качестве 2X-концентрированных маточных растворов. Из этих маточных растворов готовили восемь дополнительных 3-кратных разведений лекарственного средства в среде, всего в количестве 9 разведений. По меньшей мере через четыре часа после высевания клеток GS4.1 начинали обработку лекарственным средством путем добавления одного объема каждого из разведений 2X-концентрированного лекарственного средства к одному объему клеток/среды в планшеты для культивирования тканей. Затем клетки инкубировали в течение 3 суток при 37°C/5% CO₂.

Затем среду/соединение удаляли из планшетов и клетки фиксировали смесью ацетон:метанол, промывали три раза раствором для промывания, а затем блокировали в течение 1 часа 10% эмбриональной телячьей сывороткой в сбалансированном солевом растворе. Клетки промывали три раза и инкубировали с молноклональным антителом против NS4A вируса гепатита C (Virogen Corp.) в течение 2 часов при 37°C. Клетки промывали три раза и инкубировали конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против антитела мыши (Zymed) в течение 1 часа при 37°C. После этого клетки промывали три раза и подвергали действию раствора, содержащего орто-фенилендиамин (Zymed) и пероксид водорода (EMD Biosciences) в течение 30 минут в темноте. Реакцию останавливали разбавленной серной кислотой (Mallinckrodt Chemicals) и поглощение определяли на устройстве для подсчета Victor³V 1420 multilabel counter (Perkin Elmer). Величины EC₅₀ вычисляли из кривых доза-эффект исходя из полученных уравнений наилучшего соответствия, определенных с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и XLfit 4.1.

Анализ цитотоксичности

В анализе цитотоксичности измеряют жизнеспособность клеток после обработки тестируемым соединением в течение 3 суток либо клеток GS4.1, либо клеток Zluc. Результаты анализа представляют собой биовосстановление желтого соединения тетразолия MTS в фиолетовый продукт формазана. Это превращение опосредуется NADPH или NADH и прямо пропорционально числу живых клеток в культуре. Анализ цитотоксичности обобщенно представлен ниже. В 96-луночные планшеты для культивирования тканей высевали клетки GS4.1 или Zluc. Готовили свежие растворы противовирусного соединения в среде в качестве 2X-концентрированных маточных растворов. Из этих маточных растворов готовили восемь дополнительных 3-кратных разведений лекарственного средства в среде, всего в количестве 9 разведений. По меньшей мере через четыре часа после высевания клеток начинали обработку лекарственным средством путем добавления одного объема каждого из разведений 2X-концентрированного лекарственного средства к одному объему клеток/среды в планшеты для культивирования тканей. Затем клетки инкубировали в течение 3 суток при 37°C/5% CO₂. После обработки в течение 3 суток проводили анализ пролиферации клеток CellTiter 96^® Aqueous One Solution (Promega) путем добавления раствора MTS в каждую лунку. Затем планшеты инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение 3,5 часов. Затем планшеты считывали на устройстве для подсчета Victor³V 1420 multilabel counter (Perkin Elmer) и концентрации CC₅₀ определяли с использованием программного обеспечения Microsoft Excel и XLfit 4.1.

Соединение	Анализ NS4A - ELISA			Анализ люциферазы
Соединение	EC₅₀ (нМ)	CC₅₀(мкМ)	n	EC₅₀ (нМ)	CC₅₀(мкМ)	N
Соединение 1	379±83	>100	2	68,0±0,4	>100	5
Диастереомер 2	244±98	>100	2	56,8±0,6	>100	4
Диастереомер 1	704±372	>100	2	165±23	>100	4

ПРИМЕР 14

Метаболическое распределение in vitro соединения 1 в микросомальных фракциях печени крыс, обезьян и человека

Тестируемые соединения, использованные в этом исследовании, представляли собой соединение 1, чистота >95%, соединение 4, чистота >95%; соединение 3, чистота 90% и соединение 2, чистота 80%.

Условия хранения - тестируемые соединения хранили при от 4 до 8°C в защищенном от света месте, маточные растворы ДМСО хранили при -20°С.

В исследовании использовали следующие субклеточные фракции печени.

Таблица 1 Субклеточная фракция печени
Вид	Пол	Клеточная фракция	Источник
Крыса	Самец	Микросомы, Печень	XenoTech, Lenexa,
			KS
Крыса	Самец	Цитозоль, Печень	XenoTech, Lenexa,
			KS
Обезьяна	Самец	Микросомы, Печень	XenoTech, Lenexa,
			KS
Обезьяна	Самец	Цитозоль, Печень	XenoTech, Lenexa,
			KS
Человек	Самец	Микросомы, Печень	XenoTech, Lenexa,
			KS
Человек	Самец	Цитозоль, Печень	XenoTech, Lenexa,
			KS

Таблица 2 Суперсомы CYP450
CYP450	Источник
1A2	BD Gentest, Woburn, MA
2A6	BD Gentest, Woburn, MA
3A4	BD Gentest, Woburn, MA
2B6	BD Gentest, Woburn, MA
2D6	BD Gentest, Woburn, MA
2C8	BD Gentest, Woburn, MA
2C9	BD Gentest, Woburn, MA
2C19	BD Gentest, Woburn, MA
2E1	BD Gentest, Woburn, MA

В исследовании использовали следующие реагенты:

Система регенерации NADPH, раствор A: NADP⁺ + глюкоза-6-фосфат, и раствор B: глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа от BD Gentest, Woburn MA; кетоконазол от BD Gentest, Woburn MA; диметилсульфоксид (ДМСО), эстераза и щелочная фосфатаза печени свиньи Sigma-Aldrich, St Louis, MO; фосфат калия, одноосновный (K₂HPO₄) от Fisher Scientific, Pittsburg, PA; метанол и ацетонитрил от Burdick and Jackson; Muskegon, MI; 0,2 M калий-фосфатный буфер, pH 7,4, полученный следующим образом: для 100 мл буфера, 19 мл раствора A (13,6 г K₂HPO₄/0,5 л) смешивали с 81 мл раствора B (17,4 г K₂HPO₄/0,5 л). Не требовалось коррекции pH.

Для оценки метаболизма соединения 1 in vitro использовали его исчезновение. Относительные уровни неизмененного соединения 1 измеряли способом 1 ВЭЖХ-УФ. Остаток соединения 1 представлен в качестве процентного отличия от нулевого момента времени или контроля. Система ВЭЖХ-УФ была следующей:

Способ 1

ВЭЖХ: Agilent 1100

Колонка: Phenomenex Luna C18 (2), 250×4,6 мм

Предколонка: кассета Phenomenex SecurityGuard C18 4×2 мм

Подвижные фазы (MP): (MPA) 10 мМ K₂HPO₄ pH 5; (MPB) ACN

Элюирование градиентом: анализ от 5 до 60% MPB от 0 до 15 мин

Время анализа: 15 мин

Время после анализа: 6 мин

Скорость потока: 1 мл/мин

Объем инжекции: 20 мкл

УФ: 252 нм

Предварительную идентификацию предполагаемых метаболитов проводили путем сравнения времени удержания наблюдаемых метаболитов со временем удержания, полученным с помощью химически синтезированных стандартов с использованием следующего способа ВЭЖХ-УФ:

Способ 2

Колонка: Phenomenex Luna C18 (2), 250×4,6 мм

Предколонка: кассета Phenomenex SecurityGuard C18 4×2 мм

Подвижные фазы (MP): (MPA) 10 мМ K₂HPO₄ pH 5; (MPB) MeOH

Элюирование градиентом:	Время (мин)	%MPB
	0	5
	15	30
	20	30
	30	45

Время анализа: 60 мин

Время после анализа: 6 мин

Скорость потока: 1 мл/мин

Объем инжекции: 20 мкл

УФ: 252 нм

Иллюстративная хроматограмма ВЭЖХ для соединения 1 (диастереомеры 1 и 2) и стандартов метаболитов, полученных способом 2, представлена на фигуре 2.

Стабильность соединения 1 в микросомах и цитозоле печени

Инкубации с микросомами или цитозолем печени проводили в конечном объеме 0,1 мл на момент времени инкубации. Соединение 1 в концентрации 10 мкМ из маточного раствора в ДМСО (конечная концентрация ДМСО составила 0,1%) инкубировали при 37°С в течение от 0 до 60 мин с объединенным микросомальным белком (1,0 мг/мл), суспендировали в буфере для инкубации (0,1 M фосфат калия, pH 7,4, 5 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ ЭДТА). Микросомальную реакцию начинали добавлением NADPH (конечная концентрация 3 мМ). Инкубации (a) без белка или (b) без NADPH служили в качестве контролей. Реакции завершали добавлением 0,2 мл стоп-раствора (ацетонитрил). Образцы перемешивали на устройстве для встряхивания в течение 30 секунд, а затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин. Супернатант сушили с использованием концентратора Labconco CentriVap и сухой остаток разбавляли в воде, переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали способом 1 ВЭЖХ-УФ (описанным выше).

Результаты: Степень метаболизма соединения 1 в микросомах печени определяли путем оценки его истощения с течением времени, и она представлена в качестве процента (%) оставшегося соединения 1 (таблица 3). Наблюдали выраженный NADPH-зависимый метаболизм; 100% у обезьян в течение 30 мин, и 64 и 66% у крыс и человека в течение 60 мин соответственно. Также выраженный NADPH-независимый метаболизм наблюдали у обезьян, причем через 60 мин оставалось приблизительно 60% неизмененного соединения 1.

Таблица 3 Оставшееся соединение 1 после инкубации с микросомами печени
	Время (мин)	% оставшегося соединения 1
Вид		без кофактора	NADPH
Крыса	0	100	100
	30	103	53
	60	103	36
Обезьяна	0	100	100
	30	81	0
	60	64	0
Человек	0	100	100
	30	100	52
	60	94	34
Инкубации микросом (1 мг/мл) проводили, как описано в методиках экспериментов. Концентрация тестируемого изделия составляла 10 мкМ. Величины выражены в процентах.

Ингибирование CYP3A4

Инкубации проводили в конечном объеме 0,1 мл на момент времени инкубации. Объединенные микросомы печени крысы (1 мг/мл), обезьяны (0,5 мг/мл) или человека (1,0 мг/мл), суспендированные в буфере для инкубации (0,1 M фосфат калия, pH 7,4), инкубировали с 10 мкМ соединением 1 в присутствии кетоконазола или ритонавира (0,1 и 1 мкМ). Конечную концентрацию растворителя (ДМСО или метанола) поддерживали при 0,2%. Реакции начинали добавлением системы для регенерации NADPH (1,3 мМ NADP⁺, 3,3 мМ глюкоза-6-фосфат, 0,4 Е/мл глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа и 3,3 мМ MgCl₂, конечные концентрации). Инкубации без ингибитора служили в качестве контроля. Реакции останавливали через 30 мин (обезьяна) или 60 мин (крыса и человек) добавлением 0,2 мл стоп-раствора (ацетонитрил). Образцы перемешивали на устройстве для встряхивания в течение 30 с, а затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин. Супернатант сушили с использованием концентратора Labconco CentriVap и сухой остаток разбавляли водой, переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали способом 1 ВЭЖХ-УФ (описанным выше).

Дополнительные контрольные инкубации проводили с объединенными микросомами печени (0,25 мг/мл), суспендированными в буфере для инкубации (0,1 M калий фосфат, pH 7,4, 5 мМ MgCl₂, и 0,1 мМ ЭДТА) и инкубировали с 50 мкМ тестостероном (субстрат маркера CYP3A4) в присутствии кетоконазола или ритонавира (0,1 и 1 мкМ). Конечную концентрацию растворителя (ДМСО или метанол) поддерживали на уровне 0,2%. Реакции инициировали добавлением NADPH (конечная концентрация 3 мМ). Инкубации без ингибитора служили в качестве контроля. Реакции останавливали через 15 мин добавлением 0,2 мл стоп-раствора (ацетонитрил). Образцы перемешивали на устройстве для встряхивания в течение 30 с, а затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин. Супернатант переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали ВЭЖХ-УФ.

Результаты: потенциальную роль CYP3 A4 в NADPH-зависимом метаболизме соединения 1 оценивали с использованием кетоконазола и ритонавира, двух ингибиторов CYP3 A4, и результаты обобщенно представлены в таблице 4.

Таблица 4 Эффект ритонавира и кетоконазола на метаболическую стабильность соединения 1 в микросомах
Вид	Кетоконазол (мкМ)	% оставшегося соединения 1	Ритонавир (мкМ)	% оставшегося соединения 1
Крыса	Контроль^а	100	Контроль	100
	0	86	0	86
	0,1	83	0,1	101
	1	120	1	123
Обезьяна	Контроль	100	Контроль	100
	0	25	0	25
	0,1	68	0,1	41
	1	125	1	122
Человек	Контроль	100	Контроль	100
	0	65	0	65
	0,1	103	0,1	92
	1	117	1	117
^a Нет белка. Инкубации микросом проводили в присутствии и в отсутствие ингибиторов CYP3A4, как описано выше. Концентрация тестируемого изделия составляла 10 мкМ. Величины выражены в процентах. Образование 6-β-гидрокситестостерона в микросомах печени человека ингибировалось на 90% при концентрации кетоконазола и ритонавира 1 мкМ.

Поскольку соединение 1 быстро метаболизируется в микросомах печени обезьян, условия инкубации изменяли, снижая содержание белка до 0,5 мг/мл и время инкубации до 30 мин. Условия инкубации для крысы и человека не меняли; концентрация белка составляла 1 мг/мл и время инкубации составляло 60 мин. Полное ингибирование соединения 1 наблюдали при концентрации кетоконазола или ритонавира 1 мкМ у всех трех видов, что указывает на то, что CYP3A ассоциирован с NADPH-зависимым метаболизмом соединения 1 в микросомах печени. 6-β-гидроксилирование тестостерона в микросомах печени человека ингибировалось на 90% при концентрации кетоконазола или ритонавира 1 мкМ, что указывает на подходящие условия реакции для ингибиторов.

Идентификация изофермента CYP, ассоциированного с метаболизмом соединения 1

Суперсомы - инкубации проводили в конечном объеме буфера для реакции 0,1 мл (50-100 мМ фосфат калия, pH 7,4 или 100 мМ Tris-HCL, pH 7,4) согласно протоколу, предоставляемому с каждой суперсомой CYP450. Каждая реакционная смесь содержала 4 пмоль суперсомы CYP450, 1,3 мМ NADP⁺, 3,3 мМ глюкоза-6-фосфат, 0,4 Е/мл глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, 3,3 мМ MgCl₂ и 10 мкМ соединение 1. После инкубации в течение 60 мин при 37°С добавляли 100 мкл стоп-раствора (ацетонитрил:метанол; 1:1) и образцы центрифугировали в течение 10 мин при 10000×g. Затем супернатант сушили и разбавляли 10 мМ фосфатом калия, pH 5, далее переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали способом ВЭЖХ-УФ (описанным выше).

Результаты: С использованием рекомбинантных ферментов CYP человека было показано, что CYP3A4 является единственным CYP, катализирующим метаболизм соединения 1 (таблица 5), далее подтверждая роль CYP3A4.

Таблица 5 Процент оставшегося соединения 1 после инкубации с рекомбинантными ферментами CYP450 человека (суперсомами)
CYP450	% Оставшегося соединения 1
1A2	104
2A6	105
2B6	108
2D6	102
2C8	105
2C9	109
2C19	111
2E1	100
3A4	62
Инкубацию суперсом проводили, как описано в методиках экспериментов, выше. Величины выражены в процентах, и они соответствуют среднему значению для двух независимых экспериментов.

Определение профиля метаболитов

Инкубации с микросомами печени, цитозолем печени или эстеразой печени свиньи проводили в конечном объеме 0,1 мл на момент времени инкубации. Объединенный микросомальный белок (1,0 мг/мл), суспендированный в буфере для инкубации (0,1 M фосфат калия, pH 7,4), инкубировали в течение 2 часов при 37°C с 50 мкМ соединением 1 из маточного раствора в ДМСО (конечная концентрация ДМСО составила 0,1%); микросомальную реакцию инициировали добавлением NADPH (1,3 мМ NADP⁺, 3,3 мМ глюкоза-6-фосфат, 0,4 Е/мл глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, 3,3 мМ MgCl₂, конечные концентрации). Инкубации без NADPH или без белка служили в качестве контроля. Реакции останавливали добавлением 0,1 мл стоп-раствора (ацетонитрил). Образцы перемешивали на устройстве для встряхивания в течение 30 с, а затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин. Супернатант сушили с использованием концентратора Labconco CentriVap и сухой остаток разбавляли водой, переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали способом 2 ВЭЖХ-УФ (описанным выше).

Объединенный цитозоль печени (1,0 мг белка/мл), суспендированный в буфере для инкубации (0,1 M фосфат калия, pH 7,4), инкубировали в течение 2 часов при 37°C с 10 мкМ соединением 1 из маточного раствора в ДМСО (конечная концентрация ДМСО составила 0,1%); реакцию инициировали добавлением тестируемого изделия. Инкубации без белка служили в качестве контроля. Реакции останавливали добавлением 0,1 мл стоп-раствора (ацетонитрил). Образцы перемешивали на устройстве для встряхивания в течение 30 с, а затем центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин. Супернатант сушили с использованием концентратора Labconco CentriVap и сухой остаток разбавляли водой, переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали способом 2 ВЭЖХ-УФ (описанным выше).

Эстеразу печени свиньи (14 Е), суспендированную в буфере для инкубации (0,1 M фосфат калия, pH 7,4), инкубировали в течение 60 мин при 37°C с 10 мкМ соединением 1 из маточного раствора в ДМСО (конечная концентрация ДМСО составила 0,1%); реакцию инициировали добавлением тестируемого изделия. Инкубации без белка служили в качестве контроля. Реакции останавливали добавлением 0,1 мл стоп-раствора (ацетонитрил). Образцы перемешивали на устройстве для встряхивания в течение 30 с, а затем центрифугировали при 10000xg в течение 10 мин. Супернатант сушили с использованием концентратора Labconco CentriVap и сухой остаток разбавляли водой, переносили в стеклянный флакон для ВЭЖХ и анализировали способом 2 ВЭЖХ-УФ (описанным выше).

Метаболическую стабильность предполагаемых метаболитов анализировали инкубацией химически синтезированных стандартов соединения 2, соединения 4 и соединения 3, как описано выше для соединения 1. Когда это было возможно, образование соединения 5 подтверждали инкубацией образцов со щелочной фосфатазой (10 Е) в течение 60 мин при 37°C.

Результаты: Предварительную идентификацию проводили сравнением элюирования в LC метаболитов с элюированием доступных синтетических стандартов предполагаемых метаболитов (фигура 2). Интерпретация метаболитов и их предварительная идентификация обобщенно представлены в таблице 6. Метаболиты U1, U2 и U3 охарактеризовывали исходя из времени удержания.

Таблица 6 Профиль метаболитов в микросомах in vitro после инкубации с соединением 1
Интерпретация метаболитов^a	Время удержания (мин)	Крыса	Обезьяна	Человек
Соединение 5	5,430	ND	+	+
2'-C-метилгуанозин	9,058	+	+	+
Соединение 2	22,861	ND	ND	ND
Соединение 3 (диастереомер 1)	23,499	+	+	+
Соединение 3 (диастереомер 2)	26,700	?	+	?
Соединение U1 (структура неизвестна)	35,597	ND	+	ND
Соединение U2 (структура неизвестна)	36,459	+	ND	ND
Соединение U3 (структура неизвестна)	37,758	ND	+	ND
Соединение 1	48,340 и 53,508	+	+	+
^a Распределение на основе совместного элюирования с синтетическими стандартами. ^b Вследствие мешающего действия матрицы, образование соединения 5 в присутствии NADPH нельзя было оценить. Метаболит наблюдали в микросомах человека и крысы без NADPH. +: Выявленный пик. ?: Наблюдаемый пик. ND: Не выявлено.

Выявили семь потенциальных метаболитов, четыре из которых были экспериментально идентифицированы исходя из совместного элюирования с синтетическими стандартами, в качестве соединения 5, 2'-C-метилгуанина и диастереомеров 1 и 2 соединения 3 и три неизвестных метаболита: соединения U1, U2 и U3. Диастереомеры 1 и 2 соединения 3 и соединения U1, U2 и U3 наблюдали при инкубациях, проводимых с NADPH, что указывает на вовлечение CYP450 в их образование. Диастереомеры 1 и 2 соединения 3 наблюдали у всех трех видов. Соединение U2 наблюдали только у крысы, а соединения U1 и U3 были выявлены только у обезьяны. Образование соединения 5 наблюдали в микросомах обезьяны и человека без NADPH. Его идентификация в качестве 5'-монофосфата 2'-C-метилгуанозина подтвердилась при обработке образцов фосфатазой, которая расщепляет фосфатную группу, высвобождая нуклеозид 2'-C-метилгуанозин. Образование соединения 5 в образцах, инкубированных с NADPH, нельзя было определить вследствие мешающего воздействия матрицы. Однако следует отметить, что соединение 5 может распадаться до 2'-C-метилгуанозина, который был выявлен в образцах с NADPH у всех трех видов, что указывает на то, что соединение 5 в действительности образовывалось.

В цитозоле печени метаболизма соединения 1 не наблюдали. При инкубациях в течение 60 мин с эстеразой печени свиньи, 25% соединения 1 конвертировалось в соединение 2 (таблица 7), метаболит, который не наблюдали при инкубациях микросом.

Соединение 2 претерпевает быстрый метаболизм в соединение 5 в микросомах (таблица 8), в цитозоле (таблица 9) и с эстеразой печени свиньи (таблица 7). Был отмечен от незначительного (10% у крысы) до умеренного (20-30% у человека и обезьяны) NADPH-зависимый метаболизм соединения 3 (диастереомер 1 и диастереомер 2) (таблица 10). Также был отмечен незначительный NADPH-независимый метаболизм, но только в микросомах обезьяны (таблица 8).

Таблица 7 Оставшееся соединение 1, соединение 4, соединение 3 и соединение 2 после инкубации с эстеразой печени свиньи
	Соединение 1	Соединение 3	Соединение 4	Соединение 2
Контроль^a	100	100	100	100
Эстераза	75	97	100	0
^a Без белка Инкубации эстеразы (14 Е) проводили в течение 60 мин, как описано в условиях эксперимента; концентрация тестируемого изделия составляла 10 мкМ. Величины выражены в процентах. Соединения 2 и 3 были идентифицированы in vitro в качестве метаболитов соединения 1. Соединение 4 не наблюдали in vitro.

Таблица 8 Оставшееся соединение 2 после инкубации с микросомами печени
Вид	% оставшегося соединения 2
Вид	Нет кофактора	NADPH
Контроль^a	100	100
Крыса	0	0
Обезьяна	0	19
Человек	0	0
^a Без белка. Инкубации микросом (1 мг/мл) проводили при 37°С в течение 15 мин, как описано для соединения 1 в условиях эксперимента; концентрация тестируемого изделия составляла 10 мкМ. Величины выражены в процентах. Соединение 2 идентифицировано in vitro в качестве метаболитов соединения 1.

Таблица 9 Оставшиеся соединения 1, 4, 3 и 2 после инкубации с цитозолем печени
Вид	Соединение 1	Соединение 3	Соединение 4	Соединение 2
Контроль^a	100	100	100	100
Крыса	100	96	101	0
Обезьяна	100	99	103	0
Человек	100	100	100	0
^a Без белка Инкубации цитозоля (1 мг/мл) проводили в течение 2 часов, как описано в условиях эксперимента; концентрация тестируемого изделия составляла 10 мкМ. Величины выражены в процентах. Соединения 3 и 2 были идентифицированы in vitro в качестве метаболитов соединения 1. Соединение 4 не наблюдали in vitro в качестве метаболита.

Таблица 10 Оставшиеся соединение 4 и соединение 3 после инкубации с микросомами печени
Вид	% оставшегося соединения 4		% оставшегося соединения 3
Вид	Нет кофактора	NADPH	Нет кофактора	NADPH
Контроль^a	100	100	100	100
Крыса	100	89	101	90
Обезьяна	100	83	89	76
Человек	100	83	100	82
^a Без белка. Инкубации микросом (1 мг/мл) проводили в течение 60 мин, по существу как описано для соединения 1 в условиях эксперимента; концентрация тестируемого изделия составляла 50 мкМ. Величины выражены в процентах. Соединение 3 было идентифицировано in vitro в качестве метаболита соединения 1. Соединение 4 не наблюдали in vitro в качестве метаболита.

После инкубации с соединением 1 соединение 4 не наблюдали ни в одном образце. Метаболическую стабильность этого соединения оценивали, чтобы определить, может ли оно превращаться в соединение 5, как наблюдали для соединения 2. В микросомах в присутствии NADPH наблюдали только незначительный метаболизм (10-20%) исходя из оставшегося соединения 4. Образование соединения 5 нельзя было определить в этих образцах вследствие мешающего воздействия матрицы. NADPH-независимого метаболизма не наблюдали. Не наблюдали метаболизма соединения 4 в случае как цитозоля печени (таблица 9), так и в случае эстеразы печени свиньи (таблица 7). Эти данные указывают на то, что отсутствие соединения 4 в образцах, инкубированных с соединением 1, не является следствием дополнительного метаболизма, как в случае соединения 2, таким образом, указывая на то, что соединение 4 не является метаболитом соединения 1 in vitro.

Был отмечен от незначительного (10% у крысы) до умеренного (20-30% у человека и обезьяны) NADPH-зависимый метаболизм соединения 3 (диастереомер 1 и диастереомер 2) (таблица 10). Также был отмечен незначительный NADPH-независимый метаболизм, но только в микросомах обезьяны (таблица 10). Обработка этого образца щелочной фосфатазой приводила к образованию 2'-C-метилгуанозина, что указывает на то, что в микросомах обезьяны после инкубации с соединением 3 образовывалось соединение 5. Метаболизма соединения 3 как в случае цитозоля печени (таблица 9), так и в случае эстеразы печени свиньи (таблица 8) не наблюдали.

Заключение

Соединение 1 проявляло выраженный метаболизм в микросомах печени обезьяны; метаболизм у человека и крысы также был выраженным. Метаболизм соединения 1, по-видимому, опосредуется как каскадом CYP450, так и не каскадом CYP450. С использованием рекомбинантных ферментов CYP человека 3A4 был идентифицирован в качестве единственного CYP, вовлеченного в NADPH-зависимый метаболизм соединения 1. Наблюдали восемь потенциальных метаболитов in vitro, пять из которых идентифицировано в качестве 2'-C-метилгуанозина, соединений 2, 5 и двух диастереомеров соединения 3 (соединения 3a и 3b). Метаболиты U1, U2 и U3 являются неизвестными и, по-видимому, зависят от вида; U2 наблюдали только в микросомах крысы, а U1 и U2 наблюдали только в микросомах обезьяны. Образование соединения 3 происходило у всех трех видов. Образование соединения 5, по-видимому, опосредуется как каскадом CYP450, так и не каскадом CYP450 через образование соединения 2, хотя некоторое образование соединения 5 также было ассоциировано с метаболизмом в соединения 3a и 3b. Хотя соединение 5 нельзя было выявить при инкубациях с NADPH вследствие мешающего действия матрицы, присутствие 2'-C-метилгуанозина в этих образцах указывает на то, что 5 в действительности образовывалось, поскольку монофосфат может распадаться до 2'-C-метилгуанозина. Опосредуемое не CYP450 образование соединения 5 оказалось более выраженным у обезьяны, чем у крысы и человека, что, возможно, объясняет более высокие уровни соединения 5 и 2'-C-метилгуанозина, наблюдаемые в микросомах обезьяны.

ПРИМЕР 15

Метаболическое распределение соединения 1 и 2'-C-метилгуанозина in vitro в первичных гепатоцитах и клетках Huh-7

В этом исследовании использовали следующие клеточные линии.

Вид	Пол	Тип клеток	Источник
Крыса,	Самцы	Первичные гепатоциты	CellzDirect, Pittsboro, NC
Sprague Dawley		Первичные гепатоциты
Обезьяна,	Самцы	Первичные гепатоциты	CellzDirect, Pittsboro, NC
Яванский макак		Первичные гепатоциты
Человек	Самцы /Самки	Первичные гепатоциты	CellzDirect, Pittsboro, NC
	Самцы /Самки	Первичные гепатоциты
Человек		Huh-7	HCV group, Idenix
			Pharmaceuticals, Cambridge, MA

Реагенты: в исследовании использовали следующие реагенты

Ацетонитрил, метанол и вода, пригодная для ВЭЖХ, от Burdick and Jackson, Muskegon, MI; щелочная фосфатаза, диметилсульфоксид (ДМСО), дексаметазон, инсулин и дигидрофосфат тетрабутиламмония (TBAP) от Sigma-Aldrich, St Louis, MO; DMEM с пируватом, L-глутамин, HEPES, заменимые аминокислоты, пенициллин-стрептомицин, фосфатно-солевой буфер (PBS) и трипсин-ЭДТА от Cellgro, Mediatech, Herndon, VA; сцинтилляционная жидкость Eco Lite; эмбриональная телячья сыворотка (FBS), инсулин-трансферрин-селен-A и культуральная среда William's E от Gibco, Invitrogen Corporation; фосфат калия одноосновный (K₂HPO₄) от Fisher Scientific, Pittsburg, PA; и сцинтилляционная жидкость Ultima Flow-AP от Perkin Elmer Life Sciences.

Получение клеточных культур

Первичные гепатоциты: Свежие выделенные клетки из печени животных и человека получали в виде суспензии на льду. Клетки осаждали центрифугированием при 70-75×g (крыса) или 95-90×g (обезьяна и человек) и ресуспендировали в количестве 0,8 миллионов клеток на мл среды для посева (William's E, дополненная 5% FBS, 0,5% пенициллин-стрептомицином, 1% L-глутамином, 4 мкг/мл инсулина и 1 мкМ дексаметазоном). Затем проводили посев в многолуночные покрытые коллагеном I планшеты (коллаген хвоста крысы типа I; 12- или 6-луночные) путем добавления 1 мл (12-луночные; 0,8 миллионов клеток/лунка) или 2 мл (6-луночные; 1,6 миллионов клеток/лунка) суспензии клеток. Планшеты осторожно встряхивали для равномерного распределения клеток и помещали в инкубатор при 37°C на приблизительно от 4 до 6 часов для обеспечения прикрепления клеток. После прикрепления клеток среду для посева удаляли и заменяли средой для культивирования гепатоцитов (William's E, дополненная пенициллин-стрептомицином, 1% L-глутамином, 1% инсулин-трансферрин-селеном и 0,1 мкМ дексаметазоном). Клетки оставляли в течение ночи в инкубаторе при 37°С для акклиматизации к культуре и среде.

Клетки Huh-7: Смыкающиеся монослои клеток Huh-7 диспергировали с использованием трипсин-ЭДТА, промывали и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин (Beckman, Model Allegra 6R). Клетки ресуспендиовали в количестве 0,2, 0,3 и 0,4×10⁶ клеток/мл среды (DMEM, дополненная 1% пируватом, 10% FBS, 0,5% пенициллин-стрептомицином, 1% L-глутамином, 1% заменимыми аминокислотами и 22 мМ HEPES). Затем проводили посев в многолуночные покрытые коллагеном I планшеты (коллаген хвоста крысы типа I; 6-луночные) путем добавления 2,0 мл суспензии клеток для обеспечения конечной плотности клеток 0,4, 0,6 и 0,8×106 клеток/лунка и помещали в инкубатор при 37°С в течение ночи, чтобы позволить клеткам прикрепиться и акклиматизироваться к культуре и среде. Подготавливали дублирующие планшеты с той же плотностью клеток для определения числа клеток в каждый момент времени.

Инкубация с [ ¹⁴ C]-соединением 1 и [ ¹⁴ C]-2'-C-метилгуанозином

Инкубацию гепатоцитов с радиоактивно меченным соединением 1 и 2'-C-метилгуанозином, оба из которых были меченными в C-8 положении группы гуанина, проводили в конечном объеме 2,0 мл среды для культивирования гепатоцитов/лунка (1,6 миллионов клеток/мл). Культуральную среду после инкубации в течение ночи удаляли и заменяли свежей средой, предварительно нагретой до 37°C, содержавшей 1 или 10 мкМ [¹⁴C]-соединение 1 (122 DPM/пмоль) или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (127 DPM/пмоль) из маточного раствора в ДМСО (конечная концентрация в ДМСО составила 0,1%) или 50% этаноле (конечная концентрация в этаноле составляла 0,2%). Через 1, 4, 8 и 24 часа 0,5-1,0 мл инкубационной среды удаляли и хранили при -20°С до анализа (описанного ниже). Оставшуюся среду удаляли и монослои клеток тщательно промывали два раза ледяным PBS. После последнего промывания весь PBS тщательно удаляли и добавляли 1,0 мл раствора для экстракции (ледяной 70% метанол). Клетки соскребали и суспендировали в растворе для экстракции, переносили в 2-мл полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и внутриклеточное содержимое экстрагировали в течение ночи при -20°С.

Инкубацию Huh-7 проводили в конечном объеме 2,0 мл культуральной среды для Huh7/лунка (0,4, 0,6 и 0,8 миллиона клеток/мл). Культуральную среду после инкубации клеток в течение ночи удаляли и заменяли свежей культуральной средой, предварительно нагретой до 37°С, содержавшей [¹⁴C]-соединение 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин, как описано выше для первичных гепатоцитов. Через 24, 48 и 72 часа 0,5-1,0 мл среды удаляли и хранили при -20°С до анализа (описанного ниже). Оставшуюся среду выбрасывали и монослои клеток обрабатывали и экстрагировали, как описано выше.

Определение in vitro внутриклеточного времени полужизни (t _1/2 ) 2'-C-метилгуанозин-5'-трифосфата в первичных гепатоцитах

Первичные гепатоциты инкубировали с 10 мкМ [¹⁴C]-соединением 1 (122 DPM/пмоль) или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином (127 DPM/пмоль) в течение 24 часов, после чего инкубационную среду удаляли и клеточный слой тщательно промывали два раза теплым (37°С) PBS и помещали обратно в культуру с не содержащей лекарственного средства средой. В определенные моменты времени вплоть до 24 часов среду удаляли и монослои клеток тщательно промывали два раза ледяным PBS. После последнего промывания весь PBS тщательно удаляли и монослои клеток обрабатывали и экстрагировали, как описано ранее.

Эффект рибавирина и ритонавира на образование соединений 5, 6 и 7 в первичных гепатоцитах и клетках Huh7 после инкубации с [ ¹⁴ C]-соединением 1 и [ ¹⁴ C]-2'-C-метилгуанозином

Инкубацию первичных гепатоцитов (1,6 миллиона клеток/лунка) и клеток Huh7 (0,4 миллиона клеток/лунка) проводили по существу, как описано выше, со следующими исключениями. Клетки инкубировали с [¹⁴C]-соединением 1 (122 DPM/пмоль) и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином (127 DPM/пмоль) в концентрации 10 мкМ в присутствии или в отсутствие ритонавира (1 мкМ) или рибавирина (5 мкМ) в течение 24 часов (гепатоциты) или 72 часов (Huh7, только рибавирин). Среду для инкубации (0,5-1,0 мл) удаляли и хранили при -20°С для анализа (описанного ниже). Оставшуюся среду выбрасывали и монослои промывали и обрабатывали, как описано выше.

Стабильность нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина (соединения 5, 6 и 7)

Стабильность нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина оценивали путем приготовления 100 мкМ стандартного раствора соединения 7 (2'-C-метилгуанозинтрифосфат), который также содержал соединение 5 (2'-C-метилгуанозинмонофосфат) (10%) и соединение 6 (2'-C-метилгуанозиндифосфат) (30%) в воде, пригодной для ВЭЖХ, и добавлением 100 мкл этого стандартного раствора в (a) 900 мкл раствора для экстракции (70% метанол) и (b) 900 мкл контрольного экстракта клеток гепатоцитов в 70% метаноле. После добавления образцы помещали при -20°С на вплоть до трех суток, после чего их обрабатывали, как описано для экспериментальных образцов.

Предварительная идентификация предполагаемых метаболитов

Предварительную идентификацию предполагаемых метаболитов проводили путем сравнения времени удержания наблюдаемых метаболитов в инкубационной среде и клеточных экстрактах с временем удержания, полученным для химически синтезированных стандартов, с использованием условий хроматографии, описанных ниже. Кроме того, идентификацию нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина (моно-, ди- и трифосфат) проводили путем инкубации образцов клеточных экстрактов с щелочной фосфатазой (10 единиц в течение 60 мин при 37°С) и сравнения времени удержания в ВЭЖХ полученных нуклеозидов с временем удержания достоверного 2'-C-метилгуанозина.

Приготовление и анализ образцов

Клеточные экстракты

Клеточные экстракты получали центрифугированием при 16000 RCF с использованием микроцентрифуги Eppendorf (Eppendorf, Model 5415D) в течение 10 мин для удаления клеточного дебриса. К 5 мл жидкого сцинтилляционного коктейля EcoLite^TM (MP, Irvine, CA) добавляли аликвоту супернатанта объемом 5-10 мкл и радиоактивность определяли жидкостно-сцинтилляционным измерением (LSC) с использованием универсального жидкостного сцинтилляционного счетчика Beckman Coulter LS6500 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Затем оставшийся образец сушили с использованием охлажденного концентратора Labconco Centrivap (Labconco, Kansas City, MO). Сухие экстракты разбавляли в 120 мкл воды, пригодной для ВЭЖХ, и центрифугировали при 16000 RCF с использованием микроцентрифуги Eppendorf в течение 10 мин. Перед анализом ВЭЖХ (описанным ниже) определяли радиоактивность концентрированных экстрактов посредством LSC с использованием аликвот объемом 5 мкл. Затем определяли эффективность экстракции путем сравнения общей радиоактивности в экстрактах до и после сушки. Затем оставшийся экстракт анализировали посредством ВЭЖХ с оперативной детекцией радиоактивности с использованием Flow Scintillation Analyzer Radiomatic^TM 515TR. Радиоактивность отдельных компонентов количественно определяли путем интеграции пиков с использованием программного обеспечения Flo-One^TM (Perkin Elmer Life Sciences). Образцы со слабым выходом (<85%) анализировали повторно, когда это было возможно.

Образцы для определения стабильности нуклеотидов получали и обрабатывали, как описано выше для экспериментальных образцов, за исключением того, что LSC не требовалась, поскольку образцы не были радиоактивными. Сухие экстракты разбавляли в 100 мкл воды, пригодной для ВЭЖХ, центрифугировали при 16000 RCF с использованием микроцентрифуги Eppendorf в течение 10 мин и анализировали LC-UV (способ 2; описанный ниже). Области УФ-пиков для соединения 5, соединения 6 и соединения 7 в этих образцах были сравнимы с областями пиков, полученными для стандартного раствора.

Инкубационная среда

Образцы инкубационной среды размораживали при комнатной температуре, встряхивали и центрифугировали при 16000 RCF с использованием микроцентрифуги Eppendorf. К 5 мл жидкого сцинтилляционного коктейля EcoLite^TM (MP, Irvine, CA) добавляли аликвоту объемом 10 мкл и радиоактивность определяли с помощью LSC с использованием универсального жидкостного сцинтилляционного счетчика Beckman Coulter LS6500 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Затем образцы анализировали посредством ВЭЖХ (описанным ниже) с оперативной детекцией радиоактивности с использованием Flow Scintillation Analyzer Radiomatic^TM 515TR. Радиоактивность отдельных компонентов количественно определяли путем интеграции пиков с использованием программного обеспечения Flo-One^TM (Perkin Elmer Life Sciences). Образцы со слабым выходом (<85%) анализировали повторно, когда это было возможно.

Способы анализа

Все образцы анализировали с использованием следующих способов ВЭЖХ:

Оборудование:

Agilent 1100 с ChemStation LC3D Version A.10.02 (1757) (Agilent Technologies, Inc)

Автоматический пробозаборник с термостатом

Детектор с диодной матрицей

Термостатированное отделение колонки

Насос четверного действия

Вакуумный газоотделитель

Условия хроматографии:

Способ 1 - Анализ соединения 1 в инкубационной среде и клеточных экстрактах:

- Колонка: Phenomenex® Columbus 5 мк C18, 4,6×250 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Защитная колонка: Security Guard Cartridge, 4×2 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Температура колонки: внешняя

- УФ-детекция: 252 нм

- Детекция радиоактивности: ячейка для жидкости объемом 500 мкл, Scintillant Flow Cocktail (Ultima Flow-AP, Perkin Elmer Life Sciences, CT) при 3 мл/мин.

Условия градиента ВЭЖХ - способ 1
Время (мин)	%MPA	%MPB		Поток (мл/мин)
0	95		5	1,0
15	70		30	1,0
20	70		30	1,0
30	50		50	1,0
50	50		50	1,0
MPA = 25 мМ фосфат калия + 5 мМ TBAP pH 6,3. MPB = Метанол.

Иллюстративная хроматограмма ВЭЖХ соединения 1 (диастереомеры 1 и 2) и стандартов метаболитов, полученных способом 1, представлена на фигуре 3.

Способ 2 - Анализ 2'-C-метилгуанозина в клеточных экстрактах:

- Колонка: Phenomenex® Columbus 5 мк C18, 4,6×250 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Защитная колонка: Security Guard Cartridge, 4×2 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Температура колонки: внешняя

- УФ-детекция: 252 нм

Условия градиента ВЭЖХ - способ 2
Время (мин)	%MPA	%MPB		Поток (мл/мин)
0	95		5	1,0
15	70		30	1,0
20	70		30	1,0
30	50		50	1,0
MPA = 25 мМ фосфат калия + 5 мМ TBAP pH 6,3. MPB = Метанол.

Способ 3 - Анализ 2'-C-метилгуанозина в образцах инкубационной среды:

- Колонка: Phenomenex® Columbus 5 мк C18, 4,6×250 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Защитная колонка: Security Guard Cartridge, 4×2 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Температура колонки: внешняя

- УФ-детекция: 252 нм

Условия градиента ВЭЖХ - способ 3
Время (мин)	%MPA	%MPB		Поток (мл/мин)
0	95		5	1,0
15	70		30	1,0
20	70		30	1,0
MPA = 25 мМ фосфат калия + 5 мМ TBAP pH 6,3. MPB = Метанол.

Способ 4 - Анализ соединения 1 в образцах инкубационной среды:

Этот способ использовали для сравнения профилей метаболитов в гепатоцитах с профилями метаболитов, наблюдаемыми при инкубации микросом, пример 14.

- Колонка: Phenomenex® Columbus 5 мк C18, 4,6×250 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Защитная колонка: Security Guard Cartridge, 4×2 мм

- (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Температура колонки: внешняя

- УФ-детекция: 252 нм

Условия градиента ВЭЖХ - способ 4
Время (мин)	%MPA	%MPB		Поток (мл/мин)
0	95		5	1,0
15	70		30	1,0
20	70		30	1,0
30	55		45	1,0
50	55		45	1,0
MPA = 10 мМ фосфат калия pH 5. MPB = Метанол.

Вычисления

Данные концентрация-время для соединения 1 и соединения 7 (2'-C-метилгуанозинтрифосфат) анализировали с использованием Microsoft® Office Excel 2003 для получения значений площади под кривой концентрация-время (AUC). AUC_0-24 представляла собой площадь под кривой концентрация-время, вычисленную с использованием линейного правила трапеции и времени взятия образцов вплоть до 24 часов. Для оценки внутриклеточной величины t_1/2 для соединения 7 использовали линейный регрессионный анализ (Microsoft Excel) исходя из функции t_1/2=0,693/k, где k представляет собой наклон для линейной регрессии, полученный нанесением на график натурального логарифма внутриклеточной концентрации соединения 7 в пмоль/миллион клеток против времени инкубации.

Результаты

Метаболическое распределение и внутриклеточную активацию соединения 1 оценивали в первичных гепатоцитах и в клеточной линии гепатомы человека Huh7 с использованием [¹⁴C]-меченного соединения 1. Также параллельно оценивали активацию исходного нуклеозида, 2'-C-метилгуанозина, с использованием [¹⁴C]-меченного 2'-C-метилгуанозина для оценки того, приводит ли доставка соединения 5 через соединение 1 к более высоким уровням активного трифосфата, соединения 7.

Радиоактивную чистоту [¹⁴C]-соединения 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозина оценивали с использованием ВЭЖХ. Готовили разведение 1:1000 исходного материала в среде для гепатоцитов и анализировали его посредством ВЭЖХ. Оба соединения были >98% чистыми.

Метаболический профиль: инкубационная среда

Первичные гепатоциты

Инкубация с 10-микромолярным [ ¹⁴ C]-соединением 1 или [ ¹⁴ C]-2'-C-метилгуанозином

В гепатоцитах крысы наблюдали экстенсивный метаболизм [¹⁴C]-соединения 1 с приблизительно 50% снижением уровней соединения 1 в среде через 4 часа и не поддающимися детекции уровнями соединения 1 через 24 часа (таблица 11). Метаболизм в гепатоцитах обезьян был умеренным; уровни в среде снижались приблизительно на 40% через 8 часов и 77% через 24 часа (таблица 11). В противоположность как гепатоцитам крысы, так и гепатоцитам обезьяны, метаболизм соединения 1 в гепатоцитах человека (таблица 11) оказался более низким со снижением уровня соединения 1 в среде через 24 часа, составляющим только 38%.

Таблица 11 Процент оставшегося [¹⁴C]-соединения 1 в инкубационной среде первичных гепатоцитов и клеток Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Время (часы)	% оставшегося [¹⁴C]-соединения 1 (10 мкМ) первичные гепатоциты
	Человек (n=2)		Обезьяна (n=2)			Крыса (n=2)
0	97	98	97	91		95	97
1	94	97	95	67		91	93
4^a	91	91	-	66		48	55
8	84	79	63	61		18	32
24	63	60	16	31		0	0
Время (часы)	% оставшегося [¹⁴C]-соединения 1 (1 мкМ) первичные гепатоциты
	Человек (n=1)				Крыса (n=1)
0	97				99
1	100				89
8	78				21
24	51				0
Время (часы)	% оставшегося [¹⁴C]-соединения 1 (10 мкМ) клетки Huh7 (n=2)
0	98				96
24	85				86
48	76				77
72	65				68
Первичные гепатоциты и клетки Huh7 инкубировали с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 1 или 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Значения соответствуют неизмененным уровням [¹⁴C]-соединения 1 в инкубационной среде и выражены в процентах. ^a Вследствие ограниченной доступности клеток взятие образцов момент времени 4 часа не проводили для обезьяны 1 (Cy230).

Всего десять метаболитов наблюдали в инкубационной среде гепатоцитов крысы (таблица 12); девять в гепатоцитах обезьяны (таблица 13) и семь в гепатоцитах человека (таблица 14).

Таблица 12 Метаболиты соединения 1, выявленные в инкубационной среде гепатоцитов крысы после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Партия № Rs448	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (часы)	U8	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 3	U5	U7	Соед. 2^а	U4	U1	U3
0	1,3	BLD^b	BLD	BLD	BLD	BLD	2,2	0,8	BLD	BLD
1	1,3	0,8	1,5	BLD	BLD	BLD	1,9	1,2	1,0	2,1
4	2,8	17,5	5,3	0,9	2,6	BLD	5,3	BLD	6,4	9,8
8	2,3	41,5	6,1	1,4	6,1	1,3	5,7	BLD	7,4	9,4
24	1,3	68,5	2,9	1,4	6,9	BLD	3,7	BLD	6,7	6,6

Партия № Rs458	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (часы)	U8	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 3	U5	U7	Соед. 2^а	U4	U1	U3
0	1,2	BLD	BLD	BLD	BLD	BLD	1,5	0,4	BLD	BLD
1	1,4	0,5	BLD	BLD	BLD	BLD	1,5	BLD	1,4	2,6
4	2,2	10,1	3,6	0,9	2,6	0,4	5,1	BLD	7,1	11,9
8	2,3	23,4	3,3	2,1	4,7	BLD	6,8	BLD	10	14,8
24	2,6	65,3	2,6	1,7	6,2	BLD	4,6	BLD	7,2	10,00
Гепатоциты крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита. ^bBLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 13 Метаболиты соединения 1, выявленные в инкубационной среде гепатоцитов крысы после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Партия № Су230^а	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (часы)	U8	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 3	U5	Соед. 2^b	U4	U1	U3
0	1,5	BLD^c	BLD	BLD	BLD	1,0	BLD	BLD	BLD
1	1,0	BLD	0,9	BLD	BLD	1,9	0,6	0,7	0
8	1,3	10,4	5,7	0,5	BLD	8,5	0,6	6,8	2,8
24	BLD	48,8	8,4	3,1	BLD	7,0	1,0	10,6	4,9

Партия № Су234	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (часы)	U8	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед.3	U5	Соед. 2^b	U4	U1	U3
0	1,1	BLD	BLD	BLD	BLD	6,2	2,1	BLD	BLD
1	0	2,1	28,5	BLD	BLD	0,6	1,8	BLD	BLD
4	1,4	6,8	19,0	BLD	BLD	1,1	2,8	1,8	0,5
8	0,9	14,8	16,6	BLD	BLD	1,8	1,6	3,1	0,8
24	BLD	35,6	7,5	0,9	2,2	8,2	1,7	8,6	4,3
Гепатоциты обезьяны инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a Вследствие ограниченной доступности клеток взятие образцов момент времени 4 часа не проводили для обезьяны 1 (Cy230). ^b Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита. ^c BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 14 Метаболиты соединения 1, выявленные в инкубационной среде гепатоцитов человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Партия № Hu759	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (часы)	U8	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед.2^а	U4	U1	U3
0	0,8	BLD^b	BLD	2,7	BLD	BLD	BLD
1	0,8	BLD	4,4	0	0,6	0	0
4	1,1	1,7	3,9	1,8	0,6	0	0,5
8	0,6	4,6	5,1	2,6	0,8	0,9	1,3
24	BLD	22,1	4,7	2,7	1,9	2,5	2,6

Партия № Hu775	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (часы)	U8	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 2^а	U4	U1	U3
0	1,0	BLD	BLD	1,1	0,5	BLD	BLD
1	1,3	BLD	0,5	BLD	BLD	BLD	BLD
4	1,0	1,6	4,5	0,8	0,8	BLD	BLD
8	1,2	7	7,2	0,6	0,9	0,5	0,9
24	0,8	29	7,1	0,7	1,2	0,6	0,7
Гепатоциты человека инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита. ^b BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Идентификацию метаболитов проводили путем сравнения времени удержания с эталонными стандартами, когда это возможно. Как образцы гепатоцитов, так и образцы микросом, анализировали с использованием способов 1 и 4 ВЭЖХ для дальнейшей проверки и подтверждения индентификации и интерпретации метаболитов в гепатоцитах в качестве сходных с данными, описанными в таблице 14. В таблице 15 обобщенно представлена интерпретация метаболитов для соединения 1, выявленных в первичных гепатоцитах и клетках Huh7.

Таблица 15 Метаболическая интерпретация метаболитов соединения 1, выявленных в первичных гепатоцитах и клетках Huh7
Интерпретация метаболитов	Время удержания (мин) Способ 1 LC	Расположение
Соединение 5	15	Первичные гепатоциты (H,M,R)^a клетки Huh7
2'-C-метилгуанозин	9,4	Первичные гепатоциты (H,M,R) клетки Huh7
Соединение 2	32	Первичные гепатоциты (H,M,R) клетки Huh7
Соединение 3,	24,7	Первичные гепатоциты (R,M) клетки Huh7
диастереомер 1	27,5
Соединение 3, диастереомер 2
U1	38,4	Первичные гепатоциты (H,M,R)
U3	39,8	Первичные гепатоциты (H,M,R)
U4	36,8	Первичные гепатоциты (H,M,R)
U5	26,8	Первичные гепатоциты (R)
U6	33,8	Клетки Huh7
U7	30,9	Первичные гепатоциты (R)
Соединение 6	22,3	Первичные гепатоциты (H,M,R) клетки Huh7
Соединение 7	25,9	Первичные гепатоциты (H,M,R) клетки Huh7
U8	4,6	Первичные гепатоциты (H,M,R) клетки Huh7
U9	28,1	Клетки Huh7

2'-C-метилгуанозин был преобладающим метаболитом у всех видов, составляя 26% (человек), 42% (обезьяна) и 67% (крыса) от общей радиоактивности, измеренной в инкубационной среде через 24 часа.

Таблица 16 Уровни 2'-C-метилгуанозина в инкубационной среде первичных гепатоцитов и клеток Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Время (часы)	2'-C-метилгуанозин (% от общей радиоактивности) Первичные гепатоциты с [¹⁴C]-соединением 1 (10 мкМ)
	Человек (n=2)			Обезьяна (n=2)				Крыса (n=2)
1	BLD^a	BLD		BLD		2,10		0,80	0,50
4^b	1,70		1,60	-	6,80			17,0	10,0
8	4,60		7,00	10,4	14,8			41,0	23,0
24	22,1		29,0	48,8	35,6			69,0	65,0
Время (часы)	2'-C-метилгуанозин (% от общей радиоактивности) Первичные гепатоциты с [¹⁴C]-соединением 1 (1 мкМ)
	Человек (n=1)						Крыса (n=1)
1	BLD						BLD
8	9,20						29,4
24	38,7						58,3
Время (часы)	2'-C-метилгуанозин (% от общей радиоактивности) Клетки Huh7 (n=2) с [14C]-соединением 1
24	2,20						1,10
48	2,70						0,50
72	2,30						1,50
Первичные гепатоциты и клетки Huh7 инкубировали с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 1 или 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Значения соответствуют уровням 2'-C-метилгуанозина в инкубационной среде и выражены в процентах. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM). ^b Вследствие ограниченной доступности клеток взятие образцов момент времени 4 часа не проводили для обезьяны 1 (Cy230).

Наибольший уровень соединения 5 и соединения 2 наблюдали у обезьян, что соответствует 8% общей радиоактивности через 24 часа, в то время как у человека и крысы их уровень составляет от 3 до 5% через 24 часа соответственно. Присутствие соединения 5 в среде для инкубации подтверждали обработкой щелочной фосфатазой. Другой неидентифицированный метаболит(ы) совместно элюируется с соединением 2 в хроматографических условиях способа 1 ВЭЖХ или совместно элюируется с соединением 3 в хроматографических условиях способа 4 ВЭЖХ. Неизвестные метаболиты U1 и U3 составляют от 7 до 8% общей радиоактивности через 24 часа в гепатоцитах крысы, 10 и 5% в гепатоцитах обезьяны и приблизительно 2% в гепатоцитах человека. Другой неизвестный метаболит U5 наблюдали только в гепатоцитах крысы, и он составляет приблизительно 7% от общей радиоактивности через 24 часа. Соединение 3 (смесь соединений 3a и 3b), идентифицированное в качестве важного NADPH-зависимого метаболита в микросомах печени, по-видимому, является второстепенным метаболитом в гепатоцитах, составляя 3% или менее от общей радиоактивности в гепатоцитах обезьяны и крысы, и оно не выявлялось в гепатоцитах человека (таблицы 12-13).

В инкубационной среде первичных гепатоцитов после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином не наблюдали метаболитов.

Инкубация с 1-микромолярным [ ¹⁴ C]-соединением 1 или [ ¹⁴ C]-2'-C-метилгуанозином

Метаболизм [¹⁴C]-соединения 1 в концентрации 1 мкМ оценивали в гепатоцитах человека и крысы и, как наблюдали при 10 мкМ, метаболизм у крысы был экстенсивным приблизительно с 79% снижением уровней соединения 1 в среде через 8 часов и без поддающегося детекции соединения 1 через 24 часа (таблица 11). Метаболизм в гепатоцитах человека (таблица 11) был более низким, причем через 24 часа в среде оставался 51% соединения 1. В инкубационной среде гепатоцитов крысы наблюдали всего восемь метаболитов (таблица 17); в среде для гепатоцитов выявлялись только 2'-C-метилгуанозин, соединение 5 и соединение 2 (таблица 17).

Таблица 17 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в инкубационной среде гепатоцитов человека и крысы, после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Hu775	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 1 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метилгуанозин				Соединение 5		Соединение 2^b
0	BLD^a				BLD		2,22
1	BLD				BLD		BLD
8	9,22				10,4		2,27
24	38,7				8,29		1,72

Rs458	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 1 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 3	М10		U7		Соед. 2^b	U1	U3
0	BLD	BLD	BLD	BLD		BLD		1,05	BLD	BLD
1	BLD	BLD	BLD	BLD		BLD		3,02	2,85	1,76
8	29,4	6,41	BLD	5,04		BLD		9,52	12,7	16,4
24	58,3	BLD	1,71	3,04		1,98		7,43	11,2	14,7
Гепатоциты человека и крысы инкубировали в течение 1, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM). ^b Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита.

Основным метаболитом через 24 часа в гепатоцитах человека и крысы был 2'-C-метилгуанозин, составляя 39 и 58% соответственно (таблица 16). В гепатоцитах человека соединение 5 составляло 8%, и соединение 2 составляло 1,7% через 24 часа. В гепатоцитах крысы не было выявлено соединения 5 через 24 часа и соединение 2 составляло 7% от общей радиоактивности. Неизвестные метаболиты в гепатоцитах крысы составляли 31% от общей радиоактивности. Соединение 3 (3a и 3b; 1,7%) также выявлялось в гепатоцитах крысы через 24 часа (таблица 17).

В инкубационной среде первичных гепатоцитов после инкубации с 1 мкМ [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином метаболитов не наблюдали.

Клетки Huh 7

В противоположность первичным гепатоцитам метаболизм соединения 1 в клеточной линии гепатомы человека Huh7 был низким. Через 24 часа соединение 1 составляло 86% радиоактивности, измеренной в инкубационной среде, и через 72 часа оно составляло 67%. В инкубационной среде клеток Huh7 наблюдали всего шесть метаболитов (таблица 18).

Таблица 18 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в инкубационной среде клеток Huh7 после инкубации с соединением 1
Huh7	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	U8	2'-C-метил-гуанозин		Соединение 5		Соединение 2		U6	U4
0	0,8	BLD^a		BLD		2,9		BLD	0,4
24	1,0	1,2		2,0		8,2		BLD	1,5
48	0,5	0,5		0,8		18,3		0,5	2,4
72	1,0	1,5		0,7		25,3		0,7	3,5

Huh7	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	U8		2'-C-метил-гуанозин		Соединение 5		Соединение 2	U6		U4
0	1,0		BLD		BLD		1,7	BLD		BLD
24	0,7		2,2		3,2		8,0	BLD		1,3
48	0,6		2,7		1,5		17,2	0,3		2,4
72	1,2		2,3		1,0		27,2	0,4		3,2
Клетки инкубировали в течение с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM)

Второстепенный метаболит (<1%) U6, по-видимому, является уникальным для Huh7. Соединение 2, по-видимому, является главным метаболитом в клетках Huh7, составляя 26% общей радиоактивности через 72 часа. 2'-C-метилгуанозин и соединение 5 составляли 2 и 0,9% соответственно от общей радиоактивности через 72 часа. U4 составляло 3,4% радиоактивности через 72 часа.

В инкубационной среде клеток после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином метаболитов не наблюдали.

Метаболический профиль: клеточные экстракты

Стабильность нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина на протяжении процесса приготовления образца и экстракции оценивали с использованием эталонного стандарта соединения 7, который также содержал соединение 5 (10%) и соединение 6 (30%). Распада нуклеотида 2'-C-метилгуанозина не наблюдали.

Первичные гепатоциты

[ ¹⁴ C]-соединение 1 и [ ¹⁴ C]-2'-C-метилгуанозин в концентрации 10 микромоль

Эффективность экстракции исходя из внутриклеточной радиоактивности, определяли посредством LSC, как описано в методиках экспериментов, описанных выше. Как правило, эффективность экстракции находилась в диапазоне от 66% до 79%. Радиоактивность, оставшуюся в клеточных осадках, не определяли. Метаболический профиль [¹⁴C]-соединения 1 в первичных гепатоцитах обобщенно представлен в таблицах 19-22 и в таблицах 26-29, и метаболический профиль [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека, обезьяны и крысы обобщенно представлен в таблицах 23A-25 и в таблице 27.

Таблица 19 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Hu759		Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)		2'-C-метил-гуанозин		Соед. 5		Соед. 6	Соед. 7	Соед. 2^b	U4	U1		U3		Соед. 1
1		3,69		6,44		4,93	34,2	6,50	7,06	6,05		BLD^a		31,1
4		4,20		5,70		8,01	63,1	1,81	4,24	3,44		BLD		8,48
8		7,52		7,99		13,99	70,5	BLD	BLD	BLD		BLD		BLD
24		10,3		5,38		13,4	69,5	BLD	BLD	BLD		BLD		1,38

Hu775	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин		Соед. 5		Соед. 6		Соед. 7	Соед. 2^b	U4		U1		U3	Соед. 1
1	3,75		8,77		6,09		46,4	2,30	3,85		3,52		1,42	23,9
24	3,10		5,54		12,4		69,7	BLD	1,07		1,20		BLD	6,96
48	5,89		4,44		11,1		74,1	BLD	0,57		BLD		BLD	3,90
72	9,06		12,8		17,05		59,6	BLD	BLD		BLD		BLD	1,59
Гепатоциты человека инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM). ^b Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита.

Таблица 20 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов обезьяны после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Су230^а	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 6	Соед. 7	Соед. 2^b	U1	U3	Соед. 1
1	1,68	8,41	9,25	63,4	3,20	6,19	2,72	4,03
8	0,95	3,84	13,8	80,9	BLD^c	0,55	BLD
24	2,31	6,96	18,5	72,2	BLD	BLD	BLD

Су234	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5	Соед. 6	Соед. 7	Соед. 2^b	U1	U3	Соед. 1
1	3,04	18,5	9,65	34,9	7,96	6,49	2,20	17,3
4	1,35	5,47	17,1	70,3	1,25	1,49	BLD	3,03
8	2,06	5,38	14,9	77,6	BLD	BLD	BLD	BLD
24	1,25	3,34	16,0	79,4	BLD	BLD	BLD	BLD
Гепатоциты обезьяны инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a Вследствие ограниченной доступности клеток для обезьяны 1 не проводили взятие образца через 4 часа. ^b Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита. ^c BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 21 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов крысы после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Rs448	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуано-зин	Соед. 5	Соед. 6	Соед. 7	Соед. 3	Соед. 2^b	U4	U1	U3		Соед. 1
1	1,84	4,37	11,4	59,0	1,88	1,92	1,21	1,90	0,91		15,0
4	5,04	4,02	13,4	70,9	0,74	0,78	0,44	0,86	BLD^a		3,86
8	8,77	3,23	12,7	73,0	BLD	BLD	0,26	0,89	BLD		1,20
24	14,7	2,72	15,2	66,2	BLD	BLD	BLD	1,22	BLD		BLD

Rs458	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуано-зин	Соед. 5	Соед. 6	Соед. 7	Соед. 3	Соед. 2^b	U4	U1		U3	Соед. 1
1	1,75	2,65	12,3	50,8	BLD	3,48	1,44	5,55		BLD	19,7
4	3,78	4,53	16,7	69,1	BLD	BLD	0,32	1,54		BLD	4,02
8	4,95	3,84	16,8	72,5	BLD	BLD	BLD	0,92		BLD	0,95
24	16,9	12,8	14,6	54,5	BLD	BLD	BLD	1,2		BLD	BLD
Гепатоциты крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM). ^b Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита.

Таблица 22 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов человека и крысы, после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Hu775	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 1 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соед. 5			Соед. 6		Соед. 7		Соед. 2^b		U1			Соед. 1
1	BLD^a	5,45			7,94		48,5		4,94		5,38			19,9
8	4,34	3,60			13,0		75,0		BLD		BLD			4,07
24	9,05	6,41			12,4		67,0		BLD		BLD			2,78

Rs458	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 1 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин		Соед. 5	Соед. 6		Соед. 7		Соед. 2^b		U1		U3	Соед. 1
1	1,01		3,74	13,0		50,5		5,83		1,93		8,43	12,3
8	5,58		3,51	13,27		77,6		BLD		BLD		BLD	BLD
24	13,1		6,68	18,1		62,1		BLD		BLD		BLD	BLD
Гепатоциты человека и крысы инкубировали в течение 1, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM). ^b Возможное совместное элюирование с соединением 2 неизвестного метаболита.

Таблица 23A Метаболиты 2'-C-метилгуанозина, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов человека после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Hu759	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	97,1	BLD^a	0,51	2,40
4	87,3	BLD	1,64	11,1
8	73,9	1,89	4,54	19,6
24	52,4	3,82	7,71	36,1

Hu775	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	94,9	0,59	0,63	3,93
4	77,3	0,89	2,36	19,4
8	61,4	1,11	3,46	34,1
24	40,2	3,41	10,6	45,8
Гепатоциты человека и крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 23B Метаболиты 2'-C-метилгуанозина, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов обезьяны после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Су230^а	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	96,4	BLD^b	BLD	3,63
8	77,3	BLD	2,82	19,9
24	65,0	BLD	8,41	26,6

Су234	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	86,9	2,19	2,19	8,70
4	57,9	BLD	6,51	35,6
8	45,8	3,32	7,90	43,0
24	29,0	5,03	14,1	51,8
Гепатоциты обезьяны инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 24 Метаболиты 2'-C-метилгуанозина, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов крысы после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Rs448	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	93,6	BLD^a	1,24	5,21
4	78,6	BLD	3,54	17,9
8	69,2	BLD	4,76	24,1
24	51,5	2,56	10,4	35,6

Rs458	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	94,5	BLD^a	1,08	4,42
4	79,8	BLD	4,01	16,2
8	67,2	BLD	5,42	27,0
24	47,1	9,39	9,65	33,9
Гепатоциты крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 25 Метаболиты [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозина, наблюдаемые в экстрактах гепатоцитов человека и крысы после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Hu775	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 1 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	94,6	BLD^a	BLD	5,36
8	65,8	BLD	6,83	27,3
24	41,3	3,39	9,04	46,3

Rs458	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 1 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
1	93,4	BLD^a	1,50	4,56
8	68,7	BLD	5,14	26,1
24	49,2	6,83	9,88	34,1
Гепатоциты человека и крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 26 Метаболиты соединения 1, наблюдаемые в клеточных экстрактах Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1
Huh7	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин		Соедин.5		Соедин.6		Соедин.7		U9		Соедин.1
24	BLD^a		BLD		BLD		59,7		BLD		40,3
48	BLD		6,57		6,14		71,5		BLD		15,8
72	BLD		6,93		6,86		72,1		BLD		14,1

Huh7	Основные метаболиты, наблюдаемые в среде после 10 мкМ соединения 1 (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соедин.5		Соедин.6		Соедин.7		U9		Соедин.1
24	BLD^a	4,81		7,55		71,8		5,40		10,4
48	2,65	5,82		6,42		59,3		4,61		21,2
72	BLD	5,74		8,44		69,6		BLD		16,2
Клетки инкубировали в течение с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 27 Метаболиты 2'-C-метилгуанозина, наблюдаемые в клеточных экстрактах Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Huh7	Основные метаболиты, наблюдаемые в клеточных экстрактах после 10 мкМ 2'-C-метилгуанозина (% от общей радиоактивности)
Время (час)	2'-C-метил-гуанозин	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7
24	89,5	BLD^a	BLD	10,5
48	89,3	BLD	3,56	7,18
72	89,6	BLD	BLD	10,4
Клетки инкубировали в течение с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням метаболитов в инкубационной среде, и они выражены в качестве процента (%) от общей радиоактивности, измеренной в образце. ^a BLD = ниже предела детекции (30 DPM).

Таблица 28 Уровни 2'-C-метилгуанозин-5'-трифосфата в первичных гепатоцитах после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Время (час)	Уровни соединения 7 (пмоль/миллион клеток) Гепатоциты человека
	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)		[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)
	Человек 1 (Hu759)	Человек 2 (Hu775)	Человек 1 (Hu759)	Человек 2 (Hu775)
0	0	0	0		0
1	9,70	18,5	24,0		54
4	51,0	86	166		216
8	96,0	149	225		366
24	214	215	360		564

AUC^a	2871	3548	5759		9036
Время (час)	Уровни соединения 7 (пмоль/миллион клеток) Гепатоциты обезьяны^b
	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)		[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)
	Обезьяна 1 (Cy230^b)	Обезьяна 2 (Cy234)	Обезьяна 1 (Cy230^b)		Обезьяна 2 (Cy234)
0	0	0	0		0
1	2,87	4,00	180		22,0
4	-	29,0	-		183
8	14,58	39,0	895		476
24	6,85	57,0	344		552

AUC	241	956	13765		9861
Время (час)	Уровни соединения 7 (пмоль/миллион клеток) Гепатоциты крысы (n=2)
	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)		[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)
	Крыса (1) (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)	Крыса (1) (Rs448)		Крыса 2 (Rs458)
0	0	0	0		0
1	28,0	23,0	580		534
4	141	113	1429		1347
8	258	239	1791		1618
24	347	319	937		770

AUC	5906	5384	31568		28123
Первичные гепатоциты инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням соединения 7 в клеточных экстрактах гепатоцитов человека (n=2), обезьяны (n=2) и крысы (n=2), и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a AUC = площадь по кривой концентрация-время, выраженная в качестве пмоль*ч/миллион клеток. ^b Вследствие ограниченной доступности клеток для обезьяны #1 не проводили взятие образца через 4 часа.

Таблица 29 Уровни 2'-C-метилгуанозин-5'-трифосфата в первичных гепатоцитах после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Время (час)	Уровни соединения 7 (пмоль/миллион клеток) Гепатоциты человека
	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)		[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)
	Человек 2 (Hu775)	Крыса 2 (Rs458)	Человек 2 (Hu775)	Крыса 2 (Rs458)
0	0	0	0		0
1	1,90	2,60	8,80		80,0
8	11,0	20,1	44,2		238
24	21,0	27,0	60,4		103

AUC^a	302	458	1027		3881
Первичные гепатоциты инкубировали в течение 1, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням соединения 7 в клеточных экстрактах гепатоцитов человека (n=1) и крысы (n=1), и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^aAUC = площадь по кривой концентрация-время, выраженная в качестве пмоль*ч/миллион клеток.

Подтверждение для 2'-C-метилгуанозиннуклеотидов проводили путем расщепления щелочной фосфатазой. Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином обобщенно представлены в таблицах 28-34.

Таблица 30 Общие уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в первичных гепатоцитах после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Время (часы)	[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ) Общий уровень внутриклеточных нуклеотидов (пмоль/миллион клеток)
	Человек (n=2)			Обезьяна^а (n=2)			Крыса (n=2)
0	0	0		0		0	0		0
1	31,0	71,4		231		39,8	735		691
4	202	272		-		242	1779		1761
8	295	443		1091		600	2181		2079
24	457	846		466		686	1191		1158

Время (часы)	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ) Общий уровень внутриклеточных нуклеотидов (пмоль/миллион клеток)
	Человек (n=2)			Обезьяна (n=2)			Крыса (n=2)
0	0	0		0		0	0			0
1	11,8	24,2		2,87		5,90	35,0			29,0
4	58,9	101		-		34,3	169			141
8	127	169		16,7		49,0	305			287
24	283	281		9,01		77,5	473			498

Время (часы)	Общий уровень внутриклеточных нуклеотидов (пмоль/миллион клеток)
	[¹⁴C]-Соединение 1 (1 мкМ)				[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (1 мкМ)
	Человек (n=1)		Крыса (n=1)		Человек (n=1)			Крыса (n=1)
0	0		0		0			0
1	12,6		106		1,90			3,45
8	54,0		290		13,7			24,0
24	77,4		144		26,5			40,4
Первичные гепатоциты инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов
с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 1 мкМ или 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют общим уровням нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в клеточных экстрактах гепатоцитов человека, обезьяны и крысы, и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a Вследствие ограниченной доступности клеток для обезьяны 1 не проводили взятие образца через 4 часа.

Таблица 31 Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
[¹⁴C]-соединение 1 (10 мкМ)	Соединение 5		Соединение 6		Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток
0	0	0	0	0	0	0
1	4,00	10,3	3,00	7,10	24,0	54,0
4	15,0	17,1	21,0	38,4	166	216
8	25,0	21,9	45,0	55	225	366
24	28,0	121	69,0	161	360	564

[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)	Соединение 5		Соединение 6		Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток
0	0	0	0	0	0	0
1	BLD^a	2,80	2,10	2,90	9,70	18,5
4	BLD	4,00	7,50	10,5	51,0	86,0
8	9,00	4,90	22,1	15,0	96,0	149
24	23,0	16,0	46,0	50,0	214	215
Гепатоциты человека инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах от двух доноров (Hu759 и Hu775), и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a BLD = ниже предела детекции (0,02 пмоль/миллион клеток).

Таблица 32 Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах обезьяны после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)	Соединение 5			Соединение 6				Соединение 7

Время (часы)	пмоль/миллион клеток
	Обезьяна 1^а (Су230)	Обезьяна 2 (Су234)		Обезьяна 1 (Су230)		Обезьяна 2 (Су234)		Обезьяна 1 (Су230)		Обезьяна 2 (Су234)
0	0	0		0		0		0		0
1	23,9	11,7		26,3		6,10		180		22,0
4	-	14,3		-		44,5		-		183
8	42,5	33,0		153		91,0		895		476
24	33,2	23,2		88,4		111		344		552

[¹⁴C]-2'-C-метил-гуанозин (10 мкМ)	Соединение 5			Соединение 6				Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток
	Обезьяна 1^а (Су230)		Обезьяна 2 (Су234)		Обезьяна 1 (Су230)		Обезьяна 2 (Су234)		Обезьяна 1 (Су230)	Обезьяна 2 (Су234)
0	0		0		0		0		0	0
1	BLD^b		0,95		BLD		0,95		2,87	4,00
4	-		BLD		-		5,30		-	29,0
8	BLD		3,00		2,07		7,00		14,6	39,0
24	BLD		5,50		2,16		15,0		6,85	57,0
Гепатоциты обезьяны инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах от двух доноров (Cy230 и Cy234), и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a Вследствие ограниченной доступности клеток для обезьяны 1 не проводили взятие образца через 4 часа. ^b BLD = ниже предела детекции (0,02 пмоль/миллион клеток).

Таблица 33 Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
[¹⁴C]-соединение 1 (10 мкМ)	Соединение 5		Соединение 6		Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток
	Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)	Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)	Крыса 1 (Rs448)		Крыса 2 (Rs458)
0	0	0	0	0	0		0
1	43,0	28,0	112	129	580		534
4	81,0	88,0	269	326	1429		1347
8	79,0	86,0	311	375	1791		1618
24	39,0	181	215	207	937		770

[¹⁴C]-2'-C-метил-гуанозин (10 мкМ)	Соединение 5		Соединение 6		Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток
	Крыса 1(Rs448)	Крыса 2(Rs458)	Крыса 1(Rs448)	Крыса 2(Rs458)	Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)
0	0	0	0	0	0	0
1	BLD^a	BLD	7,00	5,60	28,0	23,0
4	BLD	BLD	28,0	28,0	141	113
8	BLD	BLD	47,0	48,0	287	239
24	25,0	88,0	101	91,0	347	319
Гепатоциты крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах от двух доноров (Rs448 и Rs458), и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a BLD = ниже предела детекции (0,02 пмоль/миллион клеток).

Таблица 34 Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
[¹⁴C]-Соединение 1 (1 мкМ)	Соединение 5			Соединение 6				Соединение 7

Время (часы)	пмоль/миллион клеток
	Человек 2 (Hu775)	Крыса 2 (Rs458)		Человек 2 (Hu775)		Крыса 2 (Rs458)			Человек 2 (Hu775)	Крыса 2 (Rs458)
0	BLD^a	BLD		BLD		BLD		BLD		BLD
1	2,40	6,00		1,40		20,0		8,80		80,0
8	2,10	11,0		7,70		41,2		44,2		238
24	5,80	11,0		11,2		30,0		60,4		103

[¹⁴C]-2'-C-метил-гуанозин (1 мкМ)	Соединение 5			Соединение 6				Соединение 7

Время (часы)	пмоль/миллион клеток
	Человек 2 (Hu775)		Крыса 2 (Rs458)		Человек 2 (Hu775)		Крыса 2 (Rs458)	Человек 2 (Hu775)		Крыса 2 (Rs458)
0	BLD		BLD		BLD		BLD	BLD		BLD
1	BLD		BLD		BLD		0,85	1,90		2,60
8	BLD		BLD		2,70		4,00	11,1		20,1
24	1,50		5,40		4,00		8,00	21,0		27,0
Гепатоциты человека и крысы инкубировали в течение 1, 4, 8 и 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах от двух доноров (Rs448 и Rs458), и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a BLD = ниже предела детекции (0,02 пмоль/миллион клеток).

После инкубации в течение 24 с [¹⁴C]-соединением 1 в гепатоцитах человека основным метаболитом было соединение 7 (65%), за которым следовало соединение 6 (15,3%) и 2'-C-метилгуанозин и соединение 5 с 9-10% от общей радиоактивности. Соединение 1 (1,5%) также было выявлено через 24 часа. Максимальные уровни соединения 7, составляющие 296 пмоль/миллион клеток (среднее значение для двух доноров) наблюдали через 24 часа. Поскольку взятия образцов после 24 часов не проводили, неясно, продолжали ли уровни соединения 7 расти. Средняя AUC_0-24ч для соединения 7 в гепатоцитах человека (n=2) составила 7398 пмоль*ч/миллион клеток.

Соединение 7 также было основным внутриклеточным метаболитом в гепатоцитах обезьяны (>70%) и крысы (70-55%) в интервале 4-24 часа. Соединение 1 через 24 часа не поддавалось детекции в обоих видах. В гепатоцитах обезьян соединение 6 составило 17%, в то время как 2'-C-метилгуанозин и соединение 5 составили 2-5% от общей внутриклеточной радиоактивности через 24 часа. 2'-C-метилгуанозин, соединения 5 и 6 составляли 8-16% от общей радиоактивности в гепатоцитах крысы через 24 часа. Соединение 7 достигало максимальных уровней 1705 пмоль/миллион клеток через 8 часов в гепатоцитах крысы, в то время как у обезьяны максимальные уровни, составляющие 895 и 552 пмоль/миллион клеток, достигались через 8 часов у одного донора и через 24 часа у другого. Для соединения 7 величины AUC_0-24ч составили 11813 и 29846 пмоль*ч/миллион клеток в гепатоцитах обезьяны и крысы, соответственно.

Метаболизм [l4C]-2'-C-метилгуанозина также оценивали в первичных гепатоцитах. Метаболический профиль [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозина в первичных гепатоцитах обобщенно представлен в таблицах 21-25 и в таблицах 28-34. Проценты моно-, ди- и трифосфата в гепатоцитах человека, обезьяны и крысы составили 7-12%, 17-20% и 69-76% соответственно. Уровни соединения 7 после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином были в от 2,3 до 19,7 раз ниже, чем после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1. Максимальные уровни соединения 7, составляющие 215, 32 и 249 пмоль/миллион клеток, наблюдали через 24 часа в гепатоцитах человека, обезьяны и крысы соответственно.

[ ¹⁴ C]-соединение 1 и [ ¹⁴ C]-2'-C-метилгуанозин в 1-микромолярной концентрации

Сходную метаболическую динамику и профиль наблюдали для [¹⁴C]-соединения 1 в концентрации 1 мкМ в гепатоцитах крысы и человека (таблица 21, таблица 29, таблица 30 и таблица 34); [¹⁴C]-соединение 1 в концентрации 1 мкМ не оценивали в гепатоцитах обезьян. Соединение 7 являлось основным метаболитом у обоих видов, составляя 70-78% от общей радиоактивности через 24 часа с максимальными уровнями 60,4 и 103 пмоль/миллион клеток в гепатоцитах человека и крысы соответственно. AUC_0-24ч для соединения 7 составила 3881 и 1027 пмоль*ч/миллион клеток для гепатоцитов крысы (n=1) и человека (n=1) соответственно. Эти величины приблизительно в 8,8 и 7,2 раз ниже, чем величины, наблюдаемые для [¹⁴C]-соединения 1 в концентрации 10 мкМ в гепатоцитах человека и крысы соответственно. [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин в концентрации 1 мкМ проявлял профиль, сходный с профилем, наблюдаемым при концентрации 10 мкМ. AUC_0-24ч для соединения 7 после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 1 мкМ составила 302 и 458 пмоль*ч/миллион клеток для гепатоцитов человека (n=1) и крысы (n=1) соответственно, что в 11,7 раз ниже, чем AUC, наблюдаемая в случае 2'-C-метилгуанозина в концентрации 10 мкМ. Эти данные указывают на то, что образование соединения 7 является дозозависимым как для соединения 1, так и для 2'-C-метилгуанозина в этом диапазоне концентраций.

Время полужизни [ ¹⁴ C]-соединения 7 в гепатоцитах человека и крысы

В таблице 35 и в таблице 36 обобщенно представлено разложение соединения 7 в гепатоцитах человека и крысы. Уровни соединения 7 в нулевой момент времени составляли 692 и 932 пмоль/миллион клеток в гепатоцитах человека и крысы, соответственно. После 24 часов без [¹⁴C]-соединения 1 уровни соединения 7 снизились до 273 (61% снижение) и 83 (91% снижение) пмоль/миллион клеток в гепатоцитах человека и крысы соответственно. Время полужизни in vitro для соединения 7 в гепатоцитах человека составило 17,4 часов, в то время как в гепатоцитах крысы оно составило 6,61 часов.

Таблица 35 Разложение соединения 7 в гепатоцитах человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Время (часы)	Соединение 7 (пмоль/миллион клеток)
Время (часы)	[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)
0	692	266
1	702	259
4	597	217
8	497	190
24	273	58,0
t_1/2	17,4	10,8
Разложение соединения 7 измеряли после инкубации в течение 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках экспериментов. Величины соответствуют уровням соединения 7 в клеточных экстрактах от 1 донора (Hu775) и они выражены в пмоль/миллион клеток. Для оценки внутриклеточной величины t_1/2 in vitro для соединения 7 использовали линейно-регрессионный анализ (Microsoft Excel).

Таблица 36 Разложение соединения 7 в гепатоцитах крысы после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином.
Время (часы)	[¹⁴C]-соединение 1 (10 мкМ) Соединение 7 (пмоль/миллион клеток)
0	932
1	954
4	811
8	545
24	83,0
t_1/2	6,61
Разложение соединения 7 измеряли после инкубации в течение 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках экспериментов. Величины соответствуют уровням соединения 7 в клеточных экстрактах от 1 донора (Rs458) и они выражены в пмоль/миллион клеток. Для оценки внутриклеточной величины t_1/2 in vitro для соединения 7 использовали линейно-регрессионный анализ (Microsoft Excel).

Также определяли время полужизни соединения 7 in vitro в гепатоцитах человека после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином. Уровни соединения 7 в нулевой момент времени после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в течение 24 часов составили 266 пмоль/миллион клеток. После 24 часов без [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозина уровни соединения 7 снизились до 58 пмоль/миллион клеток (78% снижение). Время полужизни соединения 7 в гепатоцитах человека после инкубации с 2'-C-метилгуанозином составило 10,8 часов, что составляет практически половину величины, наблюдаемой после соединения 1.

Клетки Huh7

Метаболический профиль [¹⁴C]-соединения 1 в клетках Huh7 обобщенно представлен в таблице 26, таблице 37 и таблице 38. Уровни нуклеотида 2'-C-метилгуанозина после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином обобщенно представлены в таблице 37 и таблице 38.

Таблица 37 Уровни трифосфата 2'-C-метилгуанозина в клетках Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
Время (часы)	Уровни соединения 7 (пмоль/миллион клеток)
Время (часы)	[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ) (n=1)	[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ) (n=2)
0	0	0	0
24	3,10	21,3	8,60
48	1,40	15,2	16,1
72	1,60	13,3	11,1

AUC^a	120	1,020	726
Клетки инкубировали с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням соединения 7 в клеточных экстрактах из клеток Huh7, и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a AUC = площадь по кривой концентрация-время, выраженная в качестве пмоль*ч/миллион клеток.

Таблица 38 Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в клетках Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 и [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином
[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)	Соединение 5		Соединение 6		Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток (n=2)
0	0	0	0	0	0	0
24	BLD^a	1,40	2,20	0	8,60	21,3
48	1,50	1,50	1,60	1,40	16,1	15,2
72	1,10	1,10	1,60	1,10	11,1	13,3

[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)	Соединение 5		Соединение 6		Соединение 7
Время (часы)	пмоль/миллион клеток (n=1)
0	0		0		0
24	BLD^a		BLD		3,10
48	BLD		BLD		1,40
72	BLD		BLD		1,60
Клетки инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах, и они выражены в пмоль/миллион клеток. ^a BLD = ниже предела детекции (0,02 пмоль/миллион клеток).

Соединение 7 было основным метаболитом (83-93% от общей радиоактивности) в клетках Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 в течение вплоть 72 часов. Уровни соединения 7 в клетках Huh7 были на 88% ниже, чем в гепатоцитах человека. Максимальные уровни соединения 7, составляющие 16 пмоль/миллион клеток, выявлялись через 48 часов, и AUC_0-72ч составила 873 пмоль*ч/миллион клеток (n=2). После инкубации в течение 72 часов с [¹⁴C]-соединением 1 уровень неизмененного соединения 1 составлял 15% от общей радиоактивности. Наблюдали один неизвестный метаболит (U9) через 24 и 48 часов в клетках Huh7 (n=1), и он оказался уникальным для Huh7, поскольку его не наблюдали в первичных гепатоцитах.

Уровни соединения 7 были значительно более низкими после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином (таблицы 18-38). Максимальную концентрацию, составляющую 3 пмоль/миллион клеток, наблюдали через 24 часа, и AUC_0-72ч составила 120 пмоль*ч/миллион клеток (n=1), что было в 7,3 раза ниже, чем для [¹⁴C]-соединения 1. Соединение 7 было единственным наблюдаемым внутриклеточным метаболитом.

Эффект рибавирина и ритонавира на уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в первичных гепатоцитах

Рибавирин представляет собой нуклеозидный аналог, в настоящее время используемый для лечения HCV, и проводили оценку его эффектов на уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека (n=1) и крысы (n=2) через 24 часа. В таблице 39 и таблице 40 обобщенно представлены уровни нуклеотида 2'-C-метилгуанозина, которые были достигнуты после обработки [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ в присутствии 5 мкМ рибавирина.

Таблица 39 Уровни нуклеотида 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в присутствии или в отсутствие рибавирина или ритонавира
Обработка	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7	Общий уровень нуклеотидов
	пмоль/миллион клеток
[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)	Hu775	Hu775	Hu775	Hu775
Контроль	57,0	139	600	796
Рибавирин 5 мкМ	36,0	148	548	732
Ритонавир 1 мкМ	57,0	141	409	607
	Соединение 5	Соединение 6	Соединение 7	Общий уровень нуклеотидов
	пмоль/миллион клеток
[¹⁴C]-2'-C-метилгуанозин (10 мкМ)	Hu775	Hu775	Hu775	Hu775
Контроль	24,0	46,0	243	313
Рибавирин 5 мкМ	14,0	38,0	151	203
Ритонавир 1 мкМ	23,0	71,0	217	311
Гепатоциты человека инкубировали в течение 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ в присутствии или в отсутствие рибавирина в концентрации 5 мкМ или ритонавира в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах от одного донора (Hu775), и они выражены в пмоль/миллион клеток.

Таблица 40 Уровни нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах крысы после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в присутствии или в отсутствие рибавирина или ритонавира
Обработка	Соединение 5		Соединение 6				Соединение 7			Общий уровень нуклеотидов
	пмоль/миллион клеток
[¹⁴C]-Соединение 1 (10 мкМ)	Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)		Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)	Крыса 1 (Rs448)		Крыса 2 (Rs458)	Крыса 1 (Rs448)		Крыса 2 (Rs458)
Контроль	75,0	91,0		382	314	1134		893	1591		1298
Рибавирин 5 мкМ	76,0	83,0		335	300	1087		977	1498		1360
Ритонавир 1 мкМ	96,0	116		364	411	1179		1235	1639		1762
Обработка	Соединение 5			Соединение 6		Соединение 7			Общий уровень нуклеотидов
	пмоль/миллион клеток
[¹⁴C]-2'-С-метил-гуанозин (10 мкМ)	Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)		Крыса 1 (Rs448)	Крыса 2 (Rs458)	Крыса 1 (Rs448)		Крыса 2 (Rs458)	Крыса 1 (Rs448)		Крыса 2 (Rs458)
Контроль	24,0	33,0		164	105	419		299	607		437
Рибавирин 5 мкМ	23,0	20,0		125	83,0	324		272	472		375
Ритонавир 1 мкМ	37,0	27,0		136	106	378		279	551		412
Гепатоциты крысы инкубировали в течение 24 часов с [¹⁴C]-соединением 1 или [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином в концентрации 10 мкМ в присутствии или в отсутствие рибавирина в концентрации 5 мкМ или ритонавира в концентрации 1 мкМ, как описано в методиках эксперимента. Величины соответствуют уровням нуклеотидов в клеточных экстрактах от двух доноров (Rs448 и Rs458), и они выражены в пмоль/миллион клеток.

Для соединения 1 в гепатоцитах человека или крысы не наблюдали значительных отличий от контрольных уровней в уровнях нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в присутствии рибавирина. Для 2'-C-метилгуанозина было отмечено небольшое снижение (17%) уровней трифосфата в гепатоцитах крысы, в то время как в гепатоцитах человека наблюдали 38% снижение (n=1). Однако для определения того, действительно ли этот эффект связан с ингибированием фосфорилирования 2'-C-метилгуанозина рибавирином или он является следствием вариабельности анализа, поскольку оценивали только одного донора, требуется дальнейшая оценка.

Исследования в микросомах, описанные выше, указывают на то, что CYP3A может играть роль в метаболизме соединения 1. В этом исследовании ритонавир, ингибитор CYP3A, блокировал NADPH-зависимый метаболизм соединения 1 в микросомах печени. Эффект 1 мкМ ритонавира на метаболизм и последующее образование нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина в гепатоцитах человека и крысы после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 в концентрации 10 мкМ оценивали через 24 часа, и он обобщенно представлен в таблице 39 и таблице 40. В гепатоцитах человека ритонавир снижал уровни соединения 7 на 30% по сравнению с необработанным контролем. Однако для того чтобы определить, действительно ли этот эффект связан с ингибированием катализируемого CYP450 метаболизма или он является следствием вариабельности анализа, требуется дальнейшая оценка. В гепатоцитах крысы не наблюдали снижения уровней нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина (n=2).

Заключение

Как показано в этом исследовании, [¹⁴C]-соединение 1 претерпевает экстенсивный метаболизм in vitro в первичных гепатоцитах (крыса>обезьяна>человек), включая образование нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина (соединения 5, 6 и 7).

В среде для инкубации 2'-C-метилгуанозин был основным метаболитом, наблюдаемым у всех трех видов. Исследования в микросомах печени в примере 14 выявили пять основных NADPH(CYP)-зависимых метаболитов, а именно соединение 3 (3a и 3b), U1, U2 и U3. В данном исследовании U1 и U3 были выявлены у всех трех видов. Напротив U2 не был выявлен ни у одного вида, а соединение 3 (3a и 3b) оказалось второстепенным метаболитом, выявляемым только в гепатоцитах крысы и обезьяны. В инкубационной среде было выявлено соединение 5, что указывает на то, что происходит некоторый метаболизм/разложение соединения 1 перед проникновением в клетки, и это может вносить вклад в уровни 2'-C-метилгуанозина в среде.

В экстрактах первичных гепатоцитов соединение 7 было предобладающим метаболитом, составляя 60-81% от общей внутриклеточной радиоактивности у всех трех видов через 4-24 часа. Через 24 часа помимо небольшого количества (1%) метаболита U1 в гепатоцитах крысы и небольшого количества (1-2%) ниизмененного соединения 1 в гепатоцитах человека 2'-C-метилгуанозин и его нуклеотиды составляли все внутриклеточную радиоактивность.

Уровень нуклеотидов 2'-C-метилгуанозина является значительно более высоким после инкубации гепатоцитов с [¹⁴C]-соединением 1 по сравнению с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином. В частности, это справедливо для гепатоцитов обезьяны, где фосфорилирование 2'-C-метилгуанозина было ограниченным после инкубации с 2'-C-метилгуанозином. У всех трех видов уровень активного трифосфата, соединения 7, было в от 2,3 до 19,7 раз выше в случае соединения 1, чем в случае 2'-C-метилгуанозина. Образование трифосфата оказалось дозозависимым и его время полужизни in vitro составило 17,4 и 6,61 часа в гепатоцитах человека и крысы соответственно. Более того, после инкубации с соединением 1 в первичных гепатоцитах выявлялось соединение 5, и его уровни были значимо более высокими, чем уровни, наблюдаемые в случае 2'-C-метилгуанозина, особенно в гепатоцитах обезьяны и крысы, где после инкубации с 2'-C-метилгуанозином монофосфат не выявлялся или находился на границе детекции.

В противоположность первичным гепатоцитам, метаболизм соединения 1, включающий образование соединения 7, был значимо ниже в клетках Huh7, что указывает на то, что ферментативный каскад(ы), ведущий к высвобождению соединения 5 с последующим фосфорилированием в трифосфат, может быть более активным в первичных гепатоцитах, чем в клеточной линии, происходящей из гепатомы человека. Тем не менее уровни соединения 7 в клетках Huh7 после инкубации с [¹⁴C]-соединением 1 являются существенно более высокими после инкубации с [¹⁴C]-2'-C-метилгуанозином.

ПРИМЕР 16

Исследование метаболизма у крысы с радиоактивно меченным соединением 1

Предварительное исследование метаболизма проводили с радиоактивно меченным соединением 1. Соединение метили [¹⁴C] в положении C-8 группы гуанина. Задачами исследования было определение 1) фармакокинетики в плазме исходя из общей радиоактивности, 2) временных параметров исходя из общей радиоактивности и количества 2'-C-метилгуанозин-5'-TP в печени, 3) основного пути экскреции и 4) метаболического профиля в экскрете, печени и плазме.

Схема эксперимента

Изотопно разбавленное [¹⁴C]-соединение 1 вводили внутривенно самцам крыс Sprague-Dawley в количестве 50 мг/кг или пероральным искусственным кормлением в количестве 100 мг/кг. Схема эксперимента и взятие образцов обобщенно представлены в следующих таблицах:

Номер группы	N	Путь введения дозы	Заданный уровень дозы (мг/кг)	Заданный объем дозы (мл/кг)	Заданная концентрация дозы (мг/мл)	Заданный уровень радио-активности (мкКи/кг)	Время завершения Время (часы)
1A(JVC/FVC)	4	IV	50	1	50	340	2
1B (JVC/FVC)	4	IV	50	1	50	340	6
1C(JVC/FVC)	4	IV	50	1	50	340	24
2A (JVC)	4	PO	100	1	100	340	2
2B (JVC)	4	PO	100	1	100	340	6
2C (JVC)	4	PO	100	1	100	340	24
FVC: канюлированная бедренная вена. JVC: канюлированная яремная вена.

Обобщение коллекции образцов

Группа	Моча	Экскременты	Кровь/Плазма	Печень
1A (IV)	До введения дозы, 0-1, 1-2 ч	До введения дозы, 0-2 ч	15 мин, 1, 2 ч	2 ч
1B (IV)	До введения дозы, 0-1, 1-2, 2-6 ч	До введения дозы, 0-6 ч	До введения дозы, 45 мин, 4, 6 ч	6 ч
1C (IV)	До введения дозы, 0-1, 1-2, 2-6, 6-24 ч	До введения дозы, 0-6, 6-24 ч	5, 30 мин, 10, 24 ч	24 ч
2A (PO)	До введения дозы, 0-1, 1-2 ч	До введения дозы, 0-2 ч	15 мин, 1, 2 ч	2 ч
2B(PO)	До введения дозы, 0-1, 1-2, 2-6 ч	До введения дозы, 0-6 ч	До введения дозы, 45 мин, 4, 6 ч	6 ч
2C (PO)	До введения дозы, 0-1, 1-2, 2-6, 6-24 ч	До введения дозы, 0-6, 6-24, ч	5, 30 мин, 10, 24 ч	24 ч

Соединение 1 [гуанил-8-¹⁴C] было получено от Moravek Biochemicals, Inc, Brea, CA, и оно имело следующие характеристики:

Название: Соединение 1 [гуанил-8-¹⁴C]-

Радиохимическая чистота: 98,4% (в виде изомеров)

Удельная активность: 54,8 мкКи/ммоль

Номер серии/партии: 448-108-0548

Молекулярная масса: 628,4 г/моль

Поставщик: Moravek Biochemicals, Inc, Brea, CA

Соединение 1 получали способами, описанными выше, или с помощью их обычных модификаций, и оно имело следующие характеристики:

Название: Соединение 1

Чистота ВЭЖХ: 98,9% по площади пика при 254 нм

Номер серии/партии: JW-210-112-01

Молекулярная масса: 626,619 г/моль

Поставщик: Idenix Pharmaceuticals

Эталонные соединения 2'-C-метилгуанозин, соединение 2, соединение 3, соединение 4, соединение 5 (2'-C-метилгуанозин-5'-MP), соединение 7 (2'-C-метилгуанозин-5'-TP), соединение 6 (2'-C-метилгуанозин-5'-DP, присутствующий в соединении 7) получали способами, описанными в настоящем документе, или с помощью их обычных модификаций.

Все химические реагенты, использованные для этого исследования, были химически чистыми или чище. Растворители были класса ВЭЖХ и их приобретали от Burdick and Johnson.

Способы анализа

Жидкостно-сцинтилляционное измерение (LSC)

Радиоактивность во всех образцах количественно определяли жидкостно-сцинтилляционным измерением (LSC). Для LSC использовали универсальный жидкостной сцинтилляционный счетчик Beckman Coulter LS6500 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Образцы разделяли на аликвоты по объему и анализировали в двух экземплярах. К каждому жидкому образцу добавляли жидкий сцинтилляционный коктейль EcoLite^TM (MP, Irvine, CA).

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Для анализов ВЭЖХ, радиоактивность в элюате определяли с использованием монитора радиоактивности, в котором использовалась ячейка для жидкостной сцинтилляции, как указано ниже. Проценты радиоактивности в отдельных компонентах количественно определяли путем интеграции пиков с использованием программного обеспечения ProFSA. Анализы ВЭЖХ проводили с использованием систем и условий, приведенных ниже.

Система 1: Agilent 1100 Series

- Автоматический пробозаборник Well Plate

- Термостат для 1100 Sampler

- Детектор с диодной матрицей

- Термостатированное отделение колонки

- Насос четверного действия

- Вакуумный газоотделитель

- Chemstation для LC3D Version A.10.02 (1757) (Agilent Technologies, Inc., DE)

- Проточный сцинтилляционный анализатор Radiomatic^TM 625TR

- Программное обеспечение ProFSA

(Perkin Elmer Life Sciences, MA)

Эту систему использовали для анализа составов доз и для определения профиля метаболитов в моче, экскрементах и плазме.

Система 2: Agilent 1100 Series

- Автоматический пробозаборник Well Plate

- Термостат для 1100 Sampler

- Детектор с диодной матрицей

- Термостатированное отделение колонки

- Насос четверного действия

- Вакуумный газоотделитель

- Chemstation для LC3D Version B.01.01 (164) (Agilent Technologies, Inc., DE)

- Проточный сцинтилляционный анализатор Radiomatic^TM 515TR

- Программное обеспечение Flo-One^TM

(Perkin Elmer Life Sciences, MA)

Эту систему использовали для анализа экстрактов печени.

Условия хроматографии

Способ 1

- Колонка: Phenomenex® Luna 5 мк C18 (2), 4,6×250 мм (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Защитная колонка: Security Guard Cartridge, Polar RP 4×2 мм (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Температура колонки: 35°C

- УФ-детекция: 252 нм

- Детекция радиоактивности: ячейка для жидкости объемом 500 мкл, Scintillant Flow Cocktail (Ultima Flow-AP, Perkin Elmer Life Sciences, CT) при 4,5 мл/мин

Время (мин)	Условия градиента ВЭЖХ - Метод 1
Время (мин)	%A	%B	Поток (мл/мин)
0	100	0	1,5
4	100	0	1,5
10	85	15	1,5
12	75	25	1,5
17	70	30	1,5
28	25	75	1,5
33	10	90	1,5
34	10	90	1,5
35	100	0	1,5
A = 20 мМ формиат аммония в воде.
B = 10 мМ формиат аммония в смеси метанол-вода (90:10).

Этот способ использовали для анализа аликвот составов до введения доз и после введения доз и для определения профилей в образцах мочи, экстрактах экскрементов и плазмы способом ВЭЖХ.

Способ 2

- Колонка: Phenomenex® Columbus 5 мк C18 (2), 4,6×250 мм (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Защитная колонка: Security Guard Cartridge, 4×2 мм (Phenomenex USA, Torrance, CA)

- Температура колонки: внешняя

- УФ-детекция: 252 нм

- Детекция радиоактивности: ячейка для жидкости объемом 500 мкл, Scintillant Flow Cocktail (Ultima Flow-AP, Perkin Elmer Life Sciences, CT) при 3 мл/мин

Время (мин)	Условия градиента ВЭЖХ - Метод 2
Время (мин)	%A	%B	Поток (мл/мин)
0	95	5	1,0
15	70	30	1,0
20	70	30	1,0
30	50	50	1,0
50	50	50	1,0
A = 25 мМ фосфат калия + 5 мМ диводородфосфат тетрабутиламмония pH 6,3. B = Метанол.

Этот способ использовали для анализа экстрактов печени.

На фигуре 4 представлена иллюстративная хроматограмма ВЭЖХ смеси эталонных стандартов и соединения 1 (диастереомеры 1 и 2), полученной способом 2.

Приготовление и анализ образца

Образцы печени и плазмы хранили в морозильной камере при -80°С, а все другие образцы хранили в морозильной камере при -20°С.

Составы доз для определения радиохимической чистоты

Готовили два состава доз (50 мг/мл для групп 1A-C внутривенной дозы и 100 мг/мл для групп 2A-C пероральной дозы) в PEG 200, содержавшем 5% ДМСО. До и после введения дозы отбирали части образцов составов доз. Аликвоту (10 мкл) каждой части образца разбавляли добавлением метанола (490 мкл) и 20 мМ формиата аммония в воде (1500 мкл). Разбавленные составы доз анализировали для определения радиохимической чистоты способом ВЭЖХ 1.

Моча

Для групп 1C и 2C готовили объединенные образцы мочи путем смешивания фиксированного процента общего объема для всех четырех животных в определенные моменты времени. Для группы 1C объединяли образцы, собранные в интервалы 1, 2, 6 и 24 ч. Для группы 2C готовили объединенные образцы от всех четырех животных, собранные только в интервале 24 ч. В случае интервалов сбора 1, 2 и 6 ч для анализа использовали образец мочи одного животного группы 2A или 2B. Все образцы доводили до комнатной температуры и кратковременно встряхивали. Образцы разбавляли при необходимости (от 2 до 20 раз) соответствующей водной подвижной фазой для выбранного способа ВЭЖХ. Объединенные и разбавленные образцы для интервала сбора 24 ч центрифугировали при 2040×g в течение 10 минут. Все другие образцы анализировали без центрифугирования. Для определения профиля ВЭЖХ использовали способ 1 ВЭЖХ. Выбранные образцы анализировали способом 2 ВЭЖХ для сравнения с профилем метаболитов, полученным путем инкубации с микросомами и гепатоцитами (примеры 14 и 15) и с профилем метаболитов в экстрактах печени.

Экскременты

Готовили объединенные образцы от групп 1C и 2C для временного интервала 24 ч путем объединения фиксированного процента общей массы гомогената образца каждого отдельного животного для каждой группы. Аликвоты объединяли в 15-мл полипропиленовой центрифужной пробирке. К объединенным образцам (каждый приблизительно по 3 г) добавляли 4,5 мл смеси MeOH-вода (70:30). Образец встряхивали в течение одной минуты, обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, а затем центрифугировали при 5700×g в течение 10 минут. Супернатант переносили в пробирку и измеряли общий объем супернатанта. Процедуру экстракции повторяли дополнительно два раза. Радиоактивность в каждом экстракте определяли посредством LSC дублированных аликвот (каждая по 20 мкл) для определения эффективности экстракции. Часть (10% общего объема) каждого экстракта объединяли для анализа посредством LSC и ВЭЖХ. Объединенные экстракты разбавляли (1:4) водной подвижной фазой и анализировали с использованием способа 1 ВЭЖХ для получения метаболического профиля. Для сравнения данных метаболизма in vitro с данными метаболизма in vivo, эти же образцы экскрементов анализировали способом 2 ВЭЖХ.

Экстракция плазмы для анализа ВЭЖХ

Готовили объединенные конечные образцы плазмы крыс для группы 1A, группы 1C и групп 2A-C. Объединенные образцы готовили объединением 1 мл плазмы от каждого из четырех животных. Части (каждая по 2 мл) от объединенных образцов переносили в 15-мл конические центрифужные пробирки для экстракции. В каждую часть образца добавляли 6 мл метанола и каждую смесь энергично встряхивали, а затем центрифугировали при 5700×g в течение 15 минут. Супернатант (экстракт 1) переносили в 15-мл пробирку. Осадок далее экстрагировали метанолом (2 мл). Каждый образец тщательно встряхивали для обеспечения перемешивания. Образцы центрифугировали, как описано выше. Супернатант (экстракт 2) удаляли. Общий объем каждого экстракта записывали. Пропорциональные части экстрактов 1 и 2 каждого объединенного образца плазмы объединяли, концентрировали в SpeedVac при температуре окружающей среды, и разбавляли добавлением метанола (50 мкл) и водной подвижной фазой способа 1 ВЭЖХ до конечного объема каждого образца 500 мкл. Готовили объединенную конечную плазму группы 1B и экстрагировали аналогичным образом, за исключением объема объединенного образца (3,8 мл) и объемов для экстракции (11,4 мл и 4 мл для первой и второй экстракции, соответственно). Все экстракты и разбавленные экстракты анализировали посредством LSC. Разбавленные экстракты, обладающие достаточной радиоактивностью, анализировали с помощью ВЭЖХ.

Экстракция печени для анализа ВЭЖХ

Гомогенаты готовили на сухом льду в смеси 70% метанол-30% вода, содержавшей 20 мМ ЭДТА и 20 мМ EGTA (приблизительно 1× (масс./об.) масса печени) и хранили замороженными. Для всех групп готовили объединенные образцы печени, объединяя фиксированный процент общей массы гомогената образца каждого отдельного животного для каждой группы. Каждый объединенный гомогенат печени (3,77-5,02 г) помещали в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку и добавляли 16,0 мл смеси метанол:вода (70:30). Образец встряхивали в течение одной минуты, а затем центрифугировали при 11200×g в течение 20 минут. Супернатант переносили в пробирку и измеряли общий объем. Процедуру экстракции повторяли три дополнительных раза. Радиоактивность каждого супернатанта определяли с помощью LSC дублированных аликвот (каждая по 100 мкл) для определения эффективности экстракции. Части каждого образца для всех четырех экстрактов отбирали для пропорционального объединения. Для группы 1 части образцов объединяли до концентрирования и для группы 2 каждую часть образца концентрировали отдельно, а затем объединяли вследствие вовлечения больших объемов. Каждый экстракт полностью сушили или уменьшали в объеме до приблизительно 100 мкл. Разбавление проводили метанолом (20 мкл) и достаточным объемом водной подвижной фазы способа 2 ВЭЖХ, так чтобы общий объем каждого разбавленного образца составлял 500 мкл. Дублированные аликвоты разбавленных образцов анализировали посредством LSC. Каждый образец анализировали способом 2 ВЭЖХ.

Вычисления мкг эквивалентов/г и процента введенной дозы

Процент от введенной дозы (% AD) исходного лекарственного средства и каждого метаболита в каждый период сбора = (% от общей радиоактивности в образце, присущей метаболиту) * (общее количество радиоактивных соединений, выраженное в качестве % от введенной дозы, выделенных в процессе соответствующего периода сбора).

Для этих вычислений коррекцию по эффективности экстракции не проводили.

Микрограмм-эквиваленты/г для исходного лекарственного средства или метаболита в каждый период сбора = (% радиоактивность для каждого метаболита) * (общие мкг-эквиваленты/г в процессе соответствующего периода сбора).

Вычисления PK-параметров

Данные концентрация в плазме-время, исходя из общей радиоактивности, анализировали с использованием Microsoft® Office Excel 2003 для получения площади по кривыми концентрация-время (AUC). AUC_0-24 (площадь под кривой концентрация-время от 0 до 24 ч после введения дозы) вычисляли с использованием линейного правила трапеции и номинального времени взятия образца. Для дозовой группы IV концентрацию в нулевой момент экстраполировали из данных о концентрации для первых двух моментов времени. Наблюдаемыми значениями были максимальные (пиковые) концентрации в плазме (C_max) и время до достижения пиковых концентраций (t_max). Описательную статистику подготавливали в Excel.

Значащие цифры и округление чисел

Для значащих цифр не использовали общего правила. Вследствие того что в исследовании использовали общие способы анализа, величины, представленные с большим количеством значащих цифр, не подразумевают, что эти величины являются более точными. Для ввода в программу табличных вычислений или калькулятор вводили полученные с помощью оборудования величины, за исключением LSC, где использовали целые округленные числа. Данные в таблицах представлены в качестве округленных чисел.

Анализ дозы и введение дозы

Анализ составов доз

Готовили два состава доз (50 мг/мл для групп 1A-C внутривенной дозы и 100 мг/мл для групп 2A-C пероральной дозы) следующим способом. Оба состава готовили в PEG 200, содержавшем 5% ДМСО. Требуемое количество радиоактивного материала взвешивали и измельчали в тонкий порошок с помощью шпателя. 30% конечного объема PEG 200 и взвешенное тестируемое изделие добавляли во флакон для состава при перемешивании путем магнитных возмущений до получения однородного состава. Конечный объем доводили посредством PEG 200. Состав обрабатывали ультразвуком при комнатной температуре в течение 15 минут или более с получением гомогенной суспензии. Циклы обработки ультразвуком/перемешивания проводили до тех пор, пока состав не становился гомогенным. Тройные аликвоты отбирали для определения гомогенности (CV). Определяли концентрацию радиоактивного вещества в составе и вычисляли удельную активность.

Аликвоты доз анализировали способом 1 ВЭЖХ после разбавления 10 мкл каждого состава 490 мкл метанола и 1,5 мл водной подвижной фазы.

Радиохимическая чистота тестируемого изделия в составах доз до и после введении доз представлена в следующей таблице.

Таблица 41 Радиохимическая чистота тестируемого изделия в составах доз
Дозовая группа	Радиохимическая чистота¹
1A-C 2A-C	До введения дозы 99,0% 98,6%	После введения дозы 99,1% 98,9%
¹ Определены в качестве общего значения для двух изомеров.

Данные показали, что составы доз были стабильны во время введения дозы.

Введение дозы

Заданные уровни доз для групп 1 и 2 составляли 50 мг/кг (IV) и 100 мг/кг (PO) соответственно. Средние данные по дозам обобщенно представлены в следующей таблице.

Таблица 42 Усредненные данные по введению доз
Группа	мкКи/кг	мг/кг
1A	270 (±4)	50,3 (±0,7)
1B	267 (±2)	49,7 (±0,4)
1C	269 (±3)	50,1 (±0,6)
2A	254 (±4)	100 (±2)
2B	254 (±3)	99,7 (±1,2)
2C	253 (±2)	99,5 (±0,6)

Фармакокинетика

Фармакокинетика, исходя из общей радиоактивности

Проводили анализ радиоактивности образцов плазмы. Данные о концентрации в плазме по общей радиоактивности, выраженные в качестве мкг-эквивалентов/мл, обобщенно представлены ниже.

Общие концентрации радиоактивных соединений в плазме после внутривенного введения [ ¹⁴ C]-соединения 1 крысам группы 1 в заданной дозе 50 мг/кг

мкг-эквиваленты/мл
Группа 1A	Время (часы)	Крыса 1	Крыса 2	Крыса 3	Крыса 4	Среднее значение	SD
	0,25 1 2	10,883 1,371 2,202	9,006 1,358 1,861	7,913 1,600 2,545	8,978 1,267 2,092	9,195 1,399 2,175	1,235 0,142 0,285
мкг-эквиваленты/мл
Группа 1B	Время (часы)	Крыса 5	Крыса 6	Крыса 7	Крыса 8	Среднее значение	SD
	0 0,75 4 6	0,000 1,576 0,755 2,376	0,000 1,600 0,713 2,233	0,000 1,710 0,938 2,160	0,000 2,454 0,790 3,837	0,000 1,835 0,799 2,652	0,000 0,417 0,098 0,795
мкг-эквиваленты/мл
Группа 1C	Время (часы)	Крыса 9	Крыса 10	Крыса 11	Крыса 12	Среднее значение	SD
	0,083 0,5 10 24	50,653 4,824 0,566 0,515	45,178 4,036 0,675 0,759	35,246 4,072 0,573 0,553	37,600 3,857 0,562 0,453	43,692 4,311 0,605 0,570	7,067 0,428 0,054 0,133

Общие концентрации радиоактивных соединений в плазме после перорального введения [ ¹⁴ C]-соединения 1 крысам группы 2 в заданной дозе 100 мг/кг

Группа 2А	Время, часы	мкг-эквиваленты/мл
Группа 2А	Время, часы	Крыса 13	Крыса 14	Крыса 15	Крыса 16	Среднее значение	SD
	0,25	0,216	0,433	0,474	0,260	0,346	0,127
	1	0,305	0,439	0,470	0,401	0,404	0,072
	2	0,634	0,877	1,086	0,879	0,869	0,185
Группа 2В	Время, часы	мкг-эквиваленты/мл

		Крыса 17	Крыса 18	Крыса 19	Крыса 20	Среднее значение	SD
	0	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000
	0,75	0,346	0,327	0,331	0,256	0,315	0,040
	4	0,578	0,618	0,675	0,630	0,625	0,040
	6	1,157	1,163	1,522	1,480	1,331	0,198

Группа 2С	Время, часы	мкг-эквиваленты/мл
		Крыса 21	Крыса 22	Крыса 23	Крыса 24	Среднее значение	SD
	0,083	0,228	0,394	0,228	0,596	0,283	0,175
	0,5	0,236	0,335	0,378	0,408	0,316	0,075
	10	0,806	0,555	0,506	0,511	0,622	0,143
	24	0,450	0,303	0,458	0,384	0,399	0,072

Средние (SD) концентрации радиоактивных соединений в плазме после внутривенного введения [ ¹⁴ C]-соединения 1 крысам группы 1 в заданной дозе 50 мг/кг и перорального введения доз крысам группы 2 при заданной дозе 100 мг/кг

Концентрация в плазме
(мкг-эквиваленты/мл)
Время, часы	IV		PO
Время, часы	Среднее значение	SD	Среднее значение	SD
0	0,000	0,000	0,000	0,000
0,0833	43,692	7,067	0,283	0,175
0,25	9,195	1,235	0,346	0,127
0,5	4,311	0,428	0,316	0,075
0,75	1,835	0,417	0,315	0,040
1	1,399	0,142	0,404	0,072
2	2,175	0,285	0,869	0,185
4	0,799	0,098	0,625	0,040
6	2,652	0,795	1,331	0,198
10	0,605	0,054	0,622	0,143
24	0,570	0,133	0,399	0,072
AUC_0-24 (мкг-эквиваленты/мл)	36,000			15,445

Для группы внутривенной дозы концентрация всех радиоактивных соединений быстро снижалась вплоть до 1 ч, а затем вновь возрастала через 2 ч. После снижения через 4 ч наблюдали вторичное повышение концентрации через 6 ч. Аналогично, повышенные концентрации наблюдали через 2 и 6 ч для групп пероральной дозы. Этот паттерн указывает на кишечно-печеночную рециркуляцию и повторное всасывание радиоактивного соединения.

Величины AUC вычисляли из данных по средней концентрации для каждой дозовой группы. Концентрацию в нулевой момент времени (C₀) вычисляли из концентраций в моменты времени 0,08 и 0,25 ч путем экстраполяции. Величины AUC_0-24 составляли 36,0 и 15,4 ч·мкг-эквивалент/мл для внутривенной и пероральной дозовых групп, соответственно. Нормализованное к дозе всасывание, исходя из общей радиоактивности составляло приблизительно 22%.

Концентрации в плазме соединения 1 и 2'-C-метилгуанозина определяют способом LC-MS.

Общая радиоактивность в печени

Образцы в печени собирали через 2, 6 и 24 ч после введения дозы от животных как внутривенной, так и пероральной дозовых групп. Образцы после получения быстро замораживали и держали на льду в процессе гомогенизации. Гомогенизацию проводили на сухом льду в смеси 70% метанол-30% вода, содержавшей 20 мМ ЭДТА и 20 мМ EGTA (приблизительно 1× (масс./об.) масса печени). По три взвешенные аликвоты (приблизительно 500 мг) сжигали в устройстве для окисления Packard Sample Oxidizer, а затем проводили анализ LSC для определения радиоактивности 9100 мкл Spec-Chec®). Средние данные для уровней общей радиоактивности в печени обобщенно представлены ниже.

Таблица 43
Группа	Общая радиоактивность в качестве % AD¹	Концентрация всех радиоактивных соединений в мкг-эквивалентах/грамм
1A	15,5±0,7	206±24
1B	10,1±1,0	137±12
1C	1,76±0,11	23,2±3,1
2A	0,20±0,04	5,09±0,78
2B	0,37±0,05	10,3±1,2
2C	0,17±0,03	4,08±1,10
¹ AD = Вводимая доза.

Данные для внутривенной дозовой группы указывает на то, что экстракция из печени лекарственного средства происходила очень рано (в пределах 2 ч от введения дозы) и была высокоэффективной.

Экскреция вводимой дозы

Мочу и экскременты каждого животного анализировали в отношении содержания радиоактивной метки. Данные в качестве суммарной экскреции с мочой и экскрементами обобщенно представлены ниже.

Таблица 44
Уровень дозы, (мг/кг)	Время завершения, (ч)	Экскреция с мочой и калом (%AD)¹
1A	2	26,0±2,3
1B	6	27,8±4,9
1C	24	86,0±4,8
2A	2	0,05±0,06
2B	6	0,36±0,18
2C	24	94,1±8,9
¹ Среднее значение для данных от четырех животных и сумма для всех моментов времени сбора образцов.

Данные по экскреции с мочой для всех дозовых групп обобщенно представлены в следующей таблице.

Таблица 45
Уровень дозы, (мг/кг)	Время завершения, (ч)	Экскреция с мочой (%AD)¹
1A	2	25,9±2,4
1B	6	27,7±4,9
1C	24	46,9±4,1
2A	2	0,05±0,06
2B	6	0,36±0,18
2C	24	2,84±0,82
¹ Среднее значение для данных от четырех животных и сумма для всех моментов времени сбора образцов.

Низкая экскреция с мочой радиоактивного соединения в группе пероральной дозы указывает на низкое всасывание, и это наблюдение согласуется с фармакокинетическими данными.

Данные экскреции с экскрементами обобщенно представлены ниже:

Таблица 46
Уровень дозы, (мг/кг)	Время завершения, (ч)	Экскреция с экскрементами (%AD)¹
1A	2	0,05±0,08
1B	6	0,13±0,12
1C	24	39,0±4,0
2A	2	0,001±0,001
2B	6	0,006±0,005
2C	24	91,3±8,7
¹ Среднее значение для данных от четырех животных и сумма для всех моментов времени сбора образцов.

Данные для группы 1C указывают на экстенсивную секрецию с желчью, поскольку 39% внутривенной дозы было выделено из экскрементов. Для группы пероральной дозы экскреция с фекалиями была главным способом выведения. Приблизительно 91% всех введенных радиоактивных соединений выводили через фекалии. Величину перорально введенной дозы, выделенной в моче и экскрементах, нельзя использовать для оценки степени всасывания, поскольку секреция с желчью представляет собой важный путь выведения.

Количественное определение и распределение метаболитов

Экстракты мочи, экскрементов, плазмы и печени готовили для анализа ВЭЖХ с радиохимической детекцией, как описано выше. Эффективность экстракции растворителем для экстрактов экскрементов, печени и плазмы представлена в таблице 47. Время удержания эталонных стандартов, анализированных способом 1 и способом 2 ВЭЖХ, приведена в таблице 48.

Таблица 47
Образец	Эффективность экстракции
Экскременты (Группа 1C, 24 ч)	109,3%
Экскременты (Группа 2C, 24 ч)	96,7%
Печень (Группа 1A, 2 ч)	96,5%
Печень (Группа 1B, 6 ч)	103,7%
Печень (Группа 1C, 24 ч)	82,1%
Печень (Группа 2A, 2 ч)	83,3%
Печень (Группа 2B, 6 ч)	93,1%
Печень (Группа 2C, 24 ч)	71,4%
Конечная плазма (Группа 1A, 2 ч)	86,6%
Конечная плазма (Группа 1B, 6 ч)	77,8%
Конечная плазма (Группа 1C, 24 ч)	87,5%
Конечная плазма (Группа 2A, 2 ч)	52,5%
Конечная плазма (Группа 2B, 6 ч)	59,1%
Конечная плазма (Группа 2C, 24 ч)	34,9%

Таблица 48 Типичное время удержания в ВЭЖХ (минуты) эталонных стандартов
Эталонные стандарты	Способ 1 ВЭЖХ	Способ 2 ВЭЖХ
Соединение 1	28,6 и 28,3	45,2 и 42,3
Соединение 3 (диастереомер 1 и диастереомер 2)	22,7 и 21,6	24,3 и 27,2
Соединение 2	20,4	31,6
Соединение 4	19,5	30,1
2'-С-метилгуанозин	11,3	9,4
Соединение 7	na¹	25,9
Соединение 6	na	22,6
Соединение 5	na	16,2
¹na = не применим.

Метаболиты в моче

Анализы ВЭЖХ объединенных образцов мочи для всех моментов времени проводили для группы 1C. Данные, выраженные в качестве процентного распределения площадей пиков ВЭЖХ и в качестве процента введенной дозы, обобщенно представлены в таблице 49. Метаболиты R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 охарактеризовывали исходя из времени удержания.

Таблица 49 Профиль метаболитов: моча группы 1C (внутривенная доза)
Время сбора		1 ч¹		2 ч¹		6 ч¹		24 ч¹		Всего
Процент AD (среднее значение)		22,9		5,11		2,33		16,6		46,9
Соединение	Время удержания, (минуты)	% HPLC²	% AD	% HPLC	% AD	% HPLC	% AD	% HPLC	% AD	% AD	% от общей экскреции с мочой
Соединение 1	28,6 и 28,3	93,5	21,39	48,9	2,50	30,5	0,71	9,09	1,51	26,1	55,6
U3³	26,5	nd⁴	nd	0,24	0,01	nd	nd	nd	nd	0,01	0,03
U1³	25,2	nd	nd	0,18	0,01	nd	nd	nd	nd	0,01	0,02
Соединение 3 Диастереомер 1	22,7	0,24	0,05	1,01	0,05	0,37	0,01	nd	nd	0,12	0,25
Соединение 3 Диастереомер 2	21,6	1,00	0,23	2,69	0,14	1,19	0,03	nd	nd	0,39	0,84
Соединение 2	20,4	2,29	0,52	2,57	0,13	1,40	0,03	0,45	0,07	0,76	1,62
R8	17,1	nd	nd	0,95	0,05	0,52	0,01	nd	nd	0,06	0,13
R7	13,1	nd	nd	0,59	0,03	0,68	0,02	0,63	0,10	0,15	0,32
R6	12,4	nd	nd	1,01	0,05	0,90	0,02	nd	nd	0,07	0,15
2'-C-метилгуанозин	11,3	2,12	0,48	35,1	1,79	57,7	1,35	86,7	14,4	18,0	38,4
R5	10,9	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R4	9,4	nd	nd	1,03	0,05	0,91	0,02	nd	nd	0,07	0,16
R3	8,0	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R2	6,2	nd	nd	0,58	0,03	0,94	0,02	nd	nd	0,05	0,11
R1	2,1	0,83	0,19	5,12	0,26	4,90	0,11	3,09	0,51	1,08	2,30
Всего		100	22,9	100	5,11	100	2,33	100	16,6	46,9	100
¹ Объединенную мочу от всех животных группы 1С получали пропорциональным смешиванием по объему. ² Процент в ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ³ Метаболит in vitro, наблюдаемый в примере 15. ⁴ nd = не определено.

Все образцы мочи также анализировали способом 2 ВЭЖХ. Этот способ использовали для экспериментов по метаболизму in vitro, описанных выше, и для анализа экстрактов печени. Этот способ также обеспечил дополнительные данные для идентификации метаболитов путем сравнения времени удержания с эталонными стандартами.

Для пероральной дозовой группы анализировали объединенные образцы мочи, собранные в течение 24 ч. Для времени сбора 1, 2 и 6 ч большую часть образцов использовали для анализа радиоактивности. Оставшиеся образцы были недостаточными для пропорционального объединения. Таким образом, для определения профиля в ВЭЖХ использовали образцы отдельных животных групп 1A или 1B. Данные в качестве процента распределения в ВЭЖХ и в качестве процента от введенной дозы обобщенно представлены в таблице 50. Метаболиты R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 охарактеризовывали исходя из времени удержания.

Таблица 50 Профиль метаболитов: моча группы 2C (пероральная доза)
Время сбора Процент AD		1 ч¹ 0,08		2 ч¹		6 ч¹		24 ч²
Время сбора Процент AD		1 ч¹ 0,08		0,10		0,28		2,32
Соединение	Типичное время удержания (мин)	% HPLC³	%AD	% HPLC	%AD	% HPLC	%AD	%HPLC	%AD
Соединение 1	28,6 и 28,3	74,8	0,06	6,57	0,01	nd	nd	0,30	0,01
U3⁴	26,5	nd⁵	nd	4,31	0,004	nd	nd	nd	nd
U1⁴	25,2	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 3 (диастереомер 1)	22,7	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 3 (диастереомер 2)	21,6	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 2	20,4	nd	nd	1,81	0,002	nd	nd	nd	nd
R8	17,1	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R7	13,1	nd	nd	8,39	0,01	1,33	0,004	0,85	0,02
R6	12,4	4,39	0,004	nd	nd	nd	nd	nd	nd
2'-C-метилгуанозин	11,3	5,33	0,004	56,2	0,06	86,18	0,24	92,1	2,14
R5	10,9	nd	nd	nd	nd	3,01	0,001	2,85	0,07
R4	9,4	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R3	8,0	nd	nd	2,95	0,003	1,51	0,004	0,46	0,01
R2	6,2	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R1	2,1	15,5	0,01	19,7	0,02	7,97	0,02	3,41	0,08
Всего		100	0,08	100	0,10	100	0,28	100	2,32
¹ Образец отдельного животного (#15, группа 2A для 1 ч и #20, группа 2B, для 2 ч и 6 ч). ² Объединенную мочу от всех животных группы 1С получали пропорциональным смешиванием по объему. ³ % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ⁴ Метаболит in vitro, наблюдаемый в примере 15. ⁵ nd = Не определено.

Таблица 50 содержит данные для образцов отдельных животных и объединенных образцов. Для оценки общего распределения метаболитов в моче было сделано допущение, что профиль у отдельного животного отражает общий средний профиль метаболитов. Таким образом, данные распределения в ВЭЖХ от отдельных животных использовали для вычисления процента введенной дозы, экскретированного в качестве различных метаболитов в течение интервалов сбора 1, 2 и 6 ч. Оценочные данные обобщенно представлены в таблице 51. Метаболиты R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 охарактеризовывали исходя из времени удержания.

Таблица 51 Оцененный профиль метаболитов: моча группы 2C (пероральная доза)
Время сбора		1 ч		2 ч		6 ч		24 ч		Всего
% AD (среднее значение)		0,02		0,04		0,46		2,32		2,84
Код метаболита	Типичное время удержания, (мин)	% HPLC¹	%AD	% HPLC	%AD	% HPLC	%AD	% HPLC	%AD		% от общей экскреции с мочой
Соединение 1	28,6 и 28,3	74,8	0,01	6,57	0,003	nd	nd	0,30	0,01	0,02	0,73
U3³	26,5	Nd³	nd	4,31	0,002	nd	nd	nd	nd	0,002	0,06
U1³	25,2	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 3 (Диастереомер 1)	22,7	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 3 (Диастереомер 2)	21,6	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 2	20,4	nd	nd	1,81	0,001	nd	nd	nd	nd	0,001	0,03
R8	17,1	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R7	13,1	nd	nd	8,39	0,003	1,33	0,01	0,85	0,02	0,02	0,81
R6	12,4	4,39	0,001	nd	nd	nd	nd	nd	nd	0,001	0,02
2'-C-метилгуанозин	11,3	5,33	0,001	56,2	0,02	86,18	0,40	92,1	2,14	2,56	90,4
R5	10,9	nd	nd	nd	nd	3,01	0,01	2,85	0,07	0,08	2,83
R4	9,4	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R3	8,0	nd	nd	2,95	0,001	1,51	0,01	0,46	0,01	0,02	0,67
R2	6,2	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R1	2,1	15,5	0,002	19,7	0,01	7,97	0,04	3,41	0,08	0,13	4,46
Всего		100	0,02	100	0,04	100	0,460	100	2,32	2,84	100
¹ % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ³ Метаболит in vitro, наблюдаемый в примере 15. ⁴ nd = не определено.

Два образца мочи (образец животного номер 19 в момент времени 6 ч и объединенная моча, собранная в течение 24 ч) анализировали способом 2 ВЭЖХ.

Данные анализов ВЭЖХ с использованием способа 1 использовали для вычисления распределения метаболитов. Соединение 1 было главным компонентом в моче внутривенной дозовой группы. Оно составляло 26,1% от введенной дозы и 55,6% от общей экскреции с мочой. 2'-C-метилгуанозин был главным метаболитом (18,0% AD, 38,4% от общей экскреции с мочой). Один полярный метаболит (обозначенный как R1) соответствовал 1,0% AD и 2,3% общей экскреции с мочой. Все другие метаболиты присутствовали в количестве менее 0,2% AD.

Для пероральной дозовой группы 2'-C-метилгуанозин был основным компонентом мочи, присутствующим на оцененном уровне 2,6% AD и составлял 90,4% от общей экскреции с мочой (таблица 51). Полярный метаболит R1 был выявлен на уровне 0,1% AD и составлял 4,5% от общей экскреции с мочой. Соединение 1 составляло только 0,02% AD. Оно представляло собой компонент с наиболее высоким содержанием только в момент времени 1 ч, составляя 74,8% от общей радиоактивности, выведенной с мочой в течение одного часа. К 6 ч оно составляло только 6,6% от общей экскреции с мочой.

Соединение 2 и соединение 3 присутствовали на очень низких уровнях, и они были идентифицированы исходя из сравнимого времени удержания с соответствующими эталонными стандартами с использованием обоих способов ВЭЖХ, 1 и 2.

Метаболиты в экскрементах

Объединенные образцы экскрементов экстрагировали и подготавливали для анализа ВЭЖХ, как описано выше. Анализировали образцы экскрементов, собранные только через 24 ч. Вследствие низкой общей радиоактивности и размера образца анализы образцов, собранных через 6 ч, не проводили.

Образцы анализировали посредством ВЭЖХ с радиохимической детекцией. Распределение метаболитов в этих анализах получали в качестве % от введенной дозы. Данные анализа ВЭЖХ объединенных экстрактов экскрементов как внутривенной, так и пероральной дозовой групп, приведены в таблице 52. Оба объединенных экстракта экскрементов также анализировали способом 2 ВЭЖХ. Метаболиты R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8 охарактеризовывали исходя из времени удержания.

Таблица 52 Профиль метаболитов: экстракты экскрементов групп 1C (внутривенная) и 2C (пероральная доза)
Дозовая группа Время сбора % AD (среднее значение)		1C (IV)		2C (PO)
		24 ч¹		24 ч¹
		39,0		91,2
Код метаболита	Типичное время удержания, (мин)	% HPLC²	%AD	% HPLC	%AD
Соединение 1	28,6 и 28,3	50,6	19,7	71,9	65,6
U3³	26,5	4,97	1,90	nd⁴	nd
U1³	25,2	3,37	1,31	nd	nd
Соединение 3 (диастереомер 1	22,7	nd	nd	nd	nd
Соединение 3 (диастереомер 2)	21,6	nd	nd	nd	nd
Соединение 2	20,4	nd	nd	nd	nd
R8	17,1	nd	nd	nd	nd
R7	13,1	nd	nd	nd	nd
R6	12,4	nd	nd	nd	nd
2'-C-метилгуанозин	11,3	41,0	16,0	28,1	25,6
R5	10,9	nd	nd	nd	nd
R4	9,4	nd	nd	nd	nd
R3	8,0	nd	nd	nd	nd
R2	6,2	nd	nd	nd	nd
R1	2,1	nd	nd	nd	nd
Всего		100	39,0	100	91,2
¹ Объединенные экскременты от всех животных получали пропорциональным смешиванием по массе. ² % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ³ Метаболиты in vitro, наблюдаемые в примере 14. ⁴ nd = Не определено.

Данные анализов ВЭЖХ с использованием способа 1 использовали для вычисления распределения метаболитов. Соединение 1 представляло собой компонент экскрементов с наиболее высоким содержанием для обоих дозовых групп. Оно составляло 19,7% и 65,6% AD (50,6% и 71,9% от общей экскреции с экскрементами) для внутривенной и пероральной дозовой групп соответственно (таблица 52). 2'-C-метилгуанозин был основным метаболитом для внутривенной группы, составляя 16,0% AD (41,0% от общей экскреции с экскрементами). Для пероральной дозовой группы единственным метаболитом был 2'-C-метилгуанозин (25,6% AD, 28,1% от общей экскреции с экскрементами). Для внутривенной дозовой группы было выявлено два второстепенных метаболита, обозначенных как R11 и R10, на уровне 1,9 и 1,3% AD (5,0% и 3,4% от общей экскреции с экскрементами) соответственно. Метаболиты R11 и R12 были хроматографически идентичны метаболитам U3 и U1, соответственно полученным инкубациями с микросомами и гепатоцитами в примерах 14 и 15.

Общая экскреция соединения 1 и его основного метаболита 2'-C-метилгуанозина

Общую экскрецию соединения 1 и его основного метаболита 2'-C-метилгуанозина вычисляли в качестве суммы общей экскреции с мочой и общей экскреции с экскрементами для каждого компонента. Для группы C оцененные данные использовали при вычислении выделения из мочи. Данные представлены в таблице 53. Общая экскреция соединения 1 составила 45,9% и 65,6% от введенной дозы для внутривенной и пероральной дозовых групп соответственно. Экскреция 2'-C-метилгуанозина составляла 34,0% и 28,2% соответствующих доз.

Таблица 53 Общая экскреция (% AD) соединения 1 и 2'-C-метилгуанозина
Дозовая группа	Соединение	Моча	Фекалии	Всего
Внутривенно (1C)	Соединение 1	26,1	19,7	45,9
	2'-C-метилгуанозин	18,0	16,0	34,0
Перорально (2C)	Соединение 1	0,02	65,6	65,6
	2'-C-метилгуанозин	2,56	25,6	28,2
Приведена оценка данных о концентрациях в моче от группы 2С.

Метаболиты в плазме

Конечные образцы плазмы объединяли, экстрагировали и готовили для анализа ВЭЖХ, как описано выше. Для группы 1 конечные образцы плазмы (2, 6, и 24 ч) объединяли и анализировали посредством ВЭЖХ, как описано выше. Для группы 2 только образец, полученный через 6 ч, имел достаточную радиоактивность для анализа. Единственным выявленным поддающимся детекции метаболитом во всех образцах плазмы был 2'-C-метилгуанозин. В плазме через 2 ч был показан полярный пик с элюированием через 2,1 минуты, который мог представлять собой 2'-C-метилгуанозин. Было выявлено, что 2'-C-метилгуанозин взаимодействовал с компонентами матрицы, что вызывало частичное элюирование метаболита во фронте растворителе (приблизительно 2 минуты). Когда образец повторно анализировали после разбавления водной подвижной фазой, этот компонент исчезал.

Профиль метаболитов в печени

Гомогенаты печени объединяли для каждого момента времени для обеих дозовых групп путем пропорционального смешивания по массе образцов от отдельных животных. Объединенные образцы экстрагировали и готовили для анализа ВЭЖХ, как описано выше. Содержание метаболитов определяли в качестве % от введенной дозы и в качестве мкг-эквивалентов/г. Данные представлены в таблице 54, таблице 55, таблице 56 и таблице 57 соответственно. Метаболиты R1, R8 и R9 охарактеризовывали исходя из времени удержания.

Таблица 54 Профиль метаболитов (выраженный в качестве % AD): печень группы 1 (внутривенная доза)
Время сбора		2 ч		6 ч		24 ч
% AD (среднее значение)		15,5		10,1		1,76
Код метаболита	Время удержания (мин)	% HPLC¹	%AD	% HPLC	%AD	% HPLC	%AD
R1	4,1	0,65	0,10	nd²	nd	nd	nd
2'-C-метил-гуанозин	9,6	13,8	2,14	14,6	1,48	23,9	0,42
Соединение 5	15,0	62,6	9,73	63,1	6,39	59,9	1,05
R9	16,4	0,70	0,11	0,89	0,09	nd	nd
R8	17,2	0,40	0,06	0,92	0,09	nd	nd
Соединение 6	22,5	21,6	3,35	20,1	2,04	16,2	0,29
Соединение 7	26,0	0,29	0,05	0,35	0,04	nd	nd
Всего		100	15,5	100	10,1	100	1,76
¹ % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ² nd = Не определено.

Таблица 55 Профиль метаболитов (выраженный в качестве % AD): печень группы 2 (пероральная доза)
Время сбора % AD (среднее значение)		2 ч		6 ч		24 ч
Время сбора % AD (среднее значение)		0,20		0,37		0,17
Код метаболита	Время удержания (мин)	%HPLC¹	%AD	%HPLC	%AD	%HPLC	%AD
R1	4,1	nd²	nd	nd	nd	nd	nd
2'-C-метилгуанозин	9,6	77,5	0,15	85,0	0,32	53,9	0,09
Соединение 5	15,0	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R9	16,4	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R8	17,2	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 6	22,5	22,6	0,04	15,0	0,06	46,1	0,08
Соединение 7	26,0	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Всего		100	0,20	100	0,37	100	0,17
¹ % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ² nd = Не определено.

Таблица 56 Профиль метаболитов: печени группы 1 (внутривенная доза)
Время сбора (среднее значение) мкг-эквивалентов/г		2 ч		6 ч		24 ч

		206		137		23,2
Код метаболита	Время удержания (мин)	%HPLC¹	в качестве мкг-эквив./г	%HPLC	в качестве мкг-эквив./г	%HPLC	в качестве мкг-эквив./г
R1	4,1	0,65	1,34	nd²	nd	nd	nd
2'-C-метил-гуанозин	9,6	13,8	28,4	14,6	20,0	23,9	5,56
2'-C-метил-гуанозин
Соединение 5	15,0	62,6	129	63,1	86,2	59,9	13,9
R9	16,4	0,70	1,44	0,89	1,22	nd	nd
R8	17,2	0,40	0,82	0,92	1,26	nd	nd
Соединение 6	22,5	21,6	44,4	20,1	27,5	16,2	3,77
Соединение 7	26,0	0,29	0,60	0,35	0,48	nd	nd
Всего		100	206	100	137	100	23,2
¹ % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ² nd = Не определено.

Таблица 57 Профиль метаболитов: печени группы 2 (пероральная доза)
Время сбора (среднее значение) мкг-эквивалентов/г		2 ч		6 ч		24 ч

		5,09		10,3		4,08
Код метаболита	Время удержания (мин)	% HPLC¹	в качестве мкг-эквив./г	% HPLC	в качестве мкг-эквив./г	% HPLC	в качестве мкг-эквив./г
R1	4,1	nd²	nd	nd	nd	nd	nd
2'-C-метил-гуанозин	9,6	77,5	3,94	85,0	8,76	53,9	2,20
Соединение 5	15,0	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R9	16,4	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R8	17,2	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Соединение 6	22,5	22,6	1,15	15,0	1,55	46,1	1,88
Соединение 7	26,0	nd	nd	nd	nd	nd	nd
Всего		100	5,09	100	10,3	100	4,08
¹ % ВЭЖХ = Содержание каждого метаболита, выраженное в качестве процента площади пика ВЭЖХ в экстракте образца. ² nd = Не определено.

В способе радиохимической детекции с помощью ВЭЖХ 2'-C-метилгуанозин-5'-TP наблюдали при низких уровнях только в двух экстрактах печени внутривенных дозовых групп (образец через 2 ч от группы 1A и образец через 6 ч от группы 1B). Он составлял 0,05% AD в печени из группы 1A и 0,04% в печени из группы 1B (таблица 54). Концентрация соединения 7 составила 0,60 мкг-эквивалентов соединения 1/г печени для группы 1A и 0,48 мкг-эквивалентов соединения 1/г печени для группы 1B (таблица 56).

Основным метаболитом в экстрактах печени внутривенной дозовой группы было соединение 5, составляющее 9,7%, 6,4% и 1,1% дозы через 2, 6 и 24 ч. Эти величины соответствуют 60-63% от общей радиоактивности в образцах (таблица 54). Соединение 5 не выявлялось способом ВЭЖХ ни в одной печени из группы пероральной дозы. Соединение 6 присутствовало на уровне 3,4%, 2,0% и 0,29% дозы в образцах внутривенной группы. Эти уровни соответствовали приблизительно 16-22% от общей радиоактивности в печени (таблица 54). Для образцов пероральной дозовой группы соединение 6 было выявлено на уровне 0,04%, 0,06% и 0,08% от введенной дозы через 2, 6 и 24 ч соответственно, что соответствует 15-46% общей радиоактивности в печени (таблица 55).

2'-C-метилгуанозин составлял приблизительно 14-24% от общей радиоактивности в печени для внутривенной дозовой группы и приблизительно 54-85% от общей радиоактивности в пероральной дозовой группе. В образцах внутривенной дозовой группы было выявлено три второстепенных неидентифицированых метаболита.

Предварительное исследование экстрактов показало присутствие всех трех фосфорилированных соединений в образцах пероральной дозовой группы. Вследствие их низких концентраций и низкой удельной активности лекарственного [¹⁴C]-соединения 1 монофосфат и трифосфат не выявлялись в этих образцах анализом радиоактивности с помощью ВЭЖХ.

Сравнительный профиль метаболитов для мочи, экскрементов и кала после времени экспозиции 24 ч представлен в таблице 58. Метаболиты R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R9 были охарактеризованы исходя из времени удержания.

Таблица 58 Сравнение профиля метаболитов в моче, экскрементах и печени крыс через 24 ч после введения [¹⁴C]-соединения 1
	Процент дозы Моча 0-24 ч
	Процент дозы Моча 0-24 ч		Экскремен- ты	0-24 ч	Печень	24 ч	Всего
Код соединения	Перорал.	Внутривен.	Перорал.	Внутривен.	Перорал.	Внутривен.	Перорал.	Внутривен.
Соединение 1	0,02	26,1	65,6	19,7	nd²	nd	65,6	45,9
U3¹	0,002	0,01	nd	1,94	nd	nd	0,002	1,95
U1¹	nd	0,01	nd	1,31	nd	nd	nd	1,32
Соединение 3 (диастереомер 1)	nd	0,12	nd	nd	nd	nd	nd	0,12


Соединение 3 (диастереомер 2)	nd	0,39	nd	nd	nd	nd	nd	0,39
Соединение 2	0,001	0,76	nd	nd	nd	nd	0,001	0,76
U81	nd	0,06	nd	nd	nd	nd	nd	0,06
R9	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R7	0,02	0,15	nd	nd	nd	nd	0,02	0,15
R6	0,001	0,07	nd	nd	nd	nd	0,001	0,07
2'-C-метилгуанозин	2,56	18,0	25,6	16,0	0,09	0,42	28,3	34,5
Соединение 5	nd	nd	nd	nd	nd	1,05	nd	1,05
Соединение 6	nd	nd	nd	nd	0,08	0,29	0,08	0,29
Соединение 7	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd
R5	0,08	nd	nd	nd	nd	nd	0,08	nd
R4	nd	0,07	nd	nd	nd	nd	nd	0,07
R3	0,02	nd	nd	nd	nd	nd	0,02	nd
R2	nd	0,05	nd	nd	nd	nd	nd	0,05
R1	0,13	1,08	nd	nd	nd	nd	0,13	1,08
Всего	2,84	46,9	91,2	nd	0,17	1,76	94,2	87,7
¹ in vitro метаболиты, наблюдаемые в примере 14. ² nd = не определено.

Заключение

У крыс, которым вводили однократные дозы [¹⁴C]-соединения 1, общее выделение радиоактивных соединений с мочой и экскрементами составило 86% внутривенной дозы и 94% пероральной дозы в течение 24 ч. Основным путем выведения в группе перорального введения была экскреция с экскрементами (91% дозы). Для внутривенной дозы выделялись практически равные количества радиоактивных соединений в моче (47% дозы) и экскрементах (39% дозы).

После внутривенного дозирования неизмененное соединение 1 было главным радиоактивным компонентом (26% дозы), а 2'-C-метилгуанозин был главным метаболитом (18% дозы), выявленным в моче. Второй более полярный метаболит составлял 1,1% от внутривенной дозы. Все другие метаболиты присутствовали в количестве 0,2% введенной дозы. Свыше 91% радиоактивных соединений, экскретированных в экскрементах, было выделено в качестве неизмененного соединения 1 и 2'-C-метилгуанозина. Выделение из экскрементов этих двух соединений составляло 20 и 16% от внутривенной дозы и 66 и 26% от пероральной дозы.

После перорального введения 2'-C-метилгуанозин был основным связанным с дозой компонентом в моче (2,6% дозы). Полярный метаболит R1 составлял 0,1% и неизмененное соединение 1 составляло только 0,02% пероральной дозы. Предполагаемые метаболиты, соединение 2 и соединение 3, были выявлены на очень низких уровнях.

Соединение 1 было компонентом экскрементов с наиболее высоким содержанием для обеих дозовых групп (20% от внутривенной дозы и 66% от пероральной дозы). 2'-C-метилгуанозин был основным метаболитом, наблюдаемым в экскрементах группы внутривенного введения (16,0% дозы) и единственным метаболитом, выявленным в экскрементах пероральной дозовой группы (26% дозы). Для внутривенной дозовой группы было выявлено два второстепенных метаболита, обозначенных R11 и R10 на уровне 1,9% и 1,3% от введенной дозы соответственно.

У крыс нормализованные к дозе величины AUC_0-24 указывают на то, что пероральная биодоступность радиоактивной дозы составила 22%. Эти данные отражают комбинированную биодоступность соединения 1, его главного метаболита 2'-C-метилгуанозина и различных других второстепенных метаболитов. Степень всасывания пероральной дозы, вероятно превышает 22%, однако поскольку с фекалиями экскретируется значительная часть внутривенной дозы (39%), это является признаком экстенсивной секреции с желчью.

После внутривенного введения [¹⁴C]-соединения 1 уровни от общей радиоактивности в печени соответствуют 16% от введенной дозы через 2 ч и 10% через 6 ч. Общая радиоактивность в печени снижалась до 1,8% дозы через 24 ч. Эти уровни радиоактивности соответствуют 206, 137 и 23 мкг-эквивалентам соединения 1/г печени.

Уровни в печени были значительно более низкими после перорального введения, составляя 0,2%, 0,4% и 0,2% от дозы через 2, 6 и 24 ч соответственно. Тем не менее эти уровни соответствуют 5, 10 и 4 мкг-эквивалентам соединения 1/г печени.

Основным метаболитом в экстрактах печени внутривенной дозовой группы был монофосфат 2'-C-метилгуанозина, который составлял 9,7%, 6,4% и 1,1% от введенной дозы через 2, 6 и 24 ч соответственно. Эти величины соответствуют 60-63% от общей радиоактивности в печени. Уровни дифосфата составляли 16-22% от радиоактивности в печени и соответствуют 3,4, 2,0 и 0,3% от внутривенной дозы через три соответствующих момента времени. Радиоактивно меченный 2'-C-метилгуанозин-5'-TP выявлялся на низких уровнях в анализе ВЭЖХ в двух объединенных экстрактах печени в моменты времени взятия образов 2 ч и 6 ч в группе внутривенной дозы, и он соответствует 0,04-0,05% от введенной дозы. 2'-C-метилгуанозин составлял приблизительно 14-24% от общей радиоактивности в печени внутривенной дозовой группы.

После перорального введения [¹⁴C]-соединения 1 ни соединение 5, ни соединение 7 не выявлялись способом анализа радиоактивности с помощью ВЭЖХ ни в одном из образцов печени. Дифосфат соответствовал 0,04, 0,06 и 0,08% радиоактивной дозы в моменты времени 2, 6 и 24 ч соответственно. Эти уровни соответствовали 15-46% от общей радиоактивности в печени в эти моменты времени взятия образцов, и они равны 1,1, 1,6 и 1,9 мкг-эквивалентам соединения 1/г печени соответственно. 2'-C-метилгуанозин составлял 54-85% радиоактивных соединений в печени пероральной дозовой группы.

Это исследование демонстрирует, что соединение 5 является преобладающим связанным с дозой компонентом, находящимся в печени крыс, когда путем внутривенного введения доставляют относительно высокое количество соединения 1. После перорального введения в печени выявляются значительно более низкие уровни связанного с дозой материала, причем соединение 6 является преобладающей молекулярной формой.

ПРИМЕР 17

Исследование in vitro комбинации соединения 1 и рибавирина (RBV) на репликоне HCV

Противовирусную активность соединения 1 в комбинации с рибавирином (RBV) на репликоне HCV в клетках GS4.1 (Zhu et al., 2003, J. Virol., 77:9204-9210) измеряли, как описано ниже.

Клеточная линия GS4.1 содержит репликон HCV генотипа 1b (Lohmann 1999, Science 285 (5424): 110-3). Соединение 1 и RBV разбавляли до 4X маточных растворов в среде для анализа. Проводили четыре дополнительных 1,25-кратных разведения из исходных 4X маточных растворов в среде для анализа для титрования из 5 точек. Разведения лекарственного средства на основе соединения 1 добавляли горизонтально, а разведения RBV добавляли вертикально в 96-луночные планшеты в шахматном порядке 5×5. Эту систему анализировали в двух экземплярах в каждом планшете. Конечные концентрации лекарственного средства находились в диапазоне от 1,5× до 0,6× соединения 1 и величины EC₅₀ для RBV эмпирически определяли в экспериментах по титрованию с одним лекарственным средством; EC₅₀ соединения 1 составляла 0,4±0,09 мкМ и EC₅₀ RBV составляла 21,8±3,6 мкМ. После обработки лекарственным средством в течение трех суток измеряли ингибирование репликации HCV путем количественного определения вирусного белка NS4A с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Разработка и проверка анализа ELISA репликона HCV подробно описаны в отчете исследования [IDIX-08-106].

Поскольку цитотоксичность тестируемого соединения могла исказить анализ взаимодействия лекарственное средство-лекарственное средство в этих способах анализа, анализы цитотоксичности проводили параллельно с использованием способов, описанных ниже (Mosmann 1983 J. Immunol. Meth, 65, 55-63). Данные анализа измеряли по биологическому восстановлению желтого соединения тетразолия MTS в фиолетовый продукт формазана. Это превращение опосредуется NADPH или NADH в метаболически активных клетках, и, таким образом, оно прямо пропорционально количеству живых клеток в культуре. Планшеты готовили, как описано выше.

Анализ данных для комбинации in vitro проводили с использованием программы MacSynergyTM II (модель независимости Bliss) и программного обеспечения CombiTool (модель аддитивности Loewe). Кроме того, использовали программу CalcuSyn для вычисления CI при вычисленной EC₅₀.

Контроли

1. Контроль без лекарственного средства: клетки с репликоном HCV (GS4.1) в среде для анализа.

2. Контроль с одним лекарственным средством: клетки репликона HCV (GS4.1), обработанные соединением 1 отдельно.

3. Контроль в виде одного лекарственного средства: клетки репликона HCV (GS4.1), обработанные RBV отдельно.

4. Положительный контроль для NS4A ELISA: клетки репликона HCV (GS4.1) в среде для анализа.

5. Отрицательный контроль для NS4A ELISA: клетки Huh-7 в среде для анализа.

6. Положительный контроль цитотоксичности: среда для анализа.

7. Отрицательный контроль цитотоксичности: клетки репликона HCV (GS4.1) в среде для анализа.

Клеточные линии

Каждую клеточную линию тестировали и определяли, что они являются отрицательными по микоплазме, путем детекции по окрашиванию ДНК и способами прямой ПЦР в культуре в ATCC Mycoplasma Testing Services.

Клеточную линию Huh-7 получали из клеток гепатомы человека (Nakabayashi, 1982, Cancer Res. 42:3858-3863). Клетки Huh-7 поддерживали в 75-см² флаконах Corning в среде для роста Huh-7 при 37°C с 5% CO₂ и разбавляли смесью трипсин-ЭДТА при смыкании монослая приблизительно 80%.

Клеточная линия GS4.1 получена из линии клеток печени человека Huh-7, и она стабильно обладает бицистронным реплеконом HV. Клетки поддерживали в 75-см² флаконах Corning в среде для роста GS4.1 при 3°С с 5% CO₂ и разбавляли смесью трипсин-ЭДТА при приблизительно 80% смыкании монослоя.

Реагенты

Реагенты, использованные в этом исследовании, приобретали из следующих источников:

Трипсин-ЭДТА, источник: Cellgro; метанол, источник: Burdick & Jackson; ацетон, источник: J.T. Baker; моноклональные антитела мыши против NS4A гепатита C (mAb), источник: Virogen; концентрированный раствор для промывания (20X), источник: KPL; конъюгированное с HRP антитело козы против IgG мыши (H+L), источник: Zymed; орто-фенилендиамин (таблетка OPD), источник: Zymed; 30% раствор пероксида водорода (H₂O₂), источник: EMD; серная кислота (H₂SO₄), источник: Mallinckrodt Chemicals; раствор для анализа пролиферации клеток CellTiter 96® AQueous One Solution (на основе MTS), источник: Promega; лимонная кислота, соль тринатрия, дигидрат, источник: Sigma-Aldrich; фосфат натрия, двухосновный (Na₂HPO₄), источник: Fisher Chemical; раствор гидрохлорида Trizma® (Tris-HCl), источник: Sigma-Aldrich; 5,0 M раствор хлорида натрия (NaCl), источник: Applied Biosystem, 0,5 M раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), источник: Sigma-Aldrich; диметилсульфоксид (ДМСО), источник: Sigma-Aldrich; Geneticin® (G418), 100X, источник: Cellgro; модифицированная способом Дульбекко среда Игла (DMEM), источник: Cellgro; эмбриональная телячья сыворотка (FBS), инактивированная нагреванием, источник: Cellgro; раствор пенициллина/стрептомицина (10000 МЕ на мл/10000 мкг на мл), источник: Cellgro; GlutaMAX, дипептид L-глутамина (200 мМ), источник: Gibco; и заменимые аминокислоты MEM, источник: Cellgro.

Среды и буферы

1. Полная среда для роста клеток Huh-7: 1X DMEM (содержащая глюкозу, L-глутамин и пируват натрия), дополненная 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ GlutaMAX и 1% заменимыми аминокислотами MEM.

2. Полная среда для роста/селекции клеток GS4.1: 1× DMEM (содержащая глюкозу, L-глутамин и пируват натрия), дополненная 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ GlutaMAX, 1% заменимыми аминокислотами MEM и 0,5 мг/мл генетицина (G418).

3. Среда для анализа: полная среда для роста Huh-7 с 1% ДМСО.

4. Раствор для промывания ELISA: раствор для промывания KPL, разбавленный до 1X в dH₂O.

5. 10% FBS-TNE: 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5; Sigma), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА с 10% FBS.

6. Цитрат/фосфатный буфер: 16 мМ лимонная кислота, 27 мМ Na₂HPO₄.

7. раствор OPD: 1 таблетка OPD+12 мл цитрат/фосфатного буфера + 5 мл 30% H₂O₂ на планшет.

Обработка лекарственным средством

В 96-луночные планшеты высевали клетки GS4.1 (ряды A-G) и Huh-7 (ряд H) соответственно с плотностью 7,5×10³ клеток на лунку в 50 мкл полной среды для роста.

Соединение 1 и RBV разбавляли в среде для анализа до маточных растворов 4X. Из 4X маточных растворов готовили четыре дополнительных 1,25-кратных серийных разведения каждого соединения в среде для анализа.

Клетки инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение по меньшей мере четырех часов, а затем начинали обработку лекарственным средством путем добавления 25 мкл серийных разведений лекарственного средства на основе соединения 1 горизонтально и 25 мкл серийных разведений RBV вертикально в шахматном порядке 5×5. Данную систему анализировали в двух экземплярах в каждом 96-луночном планшете. Конечные концентрации обоих лекарственных средств находились в диапазоне от 1,5× до 0,6× от их соответствующих величин EC₅₀.

Клетки инкубировали с ингибиторами в течение трех суток при 37°C/5% CO₂.

ELISA для репликона HCV

После обработки лекарственным средством в течение трех суток среду удаляли из планшетов путем осторожного постукивания и клетки фиксировали к планшетам с помощью 100 мкл/лунка смеси 1:1 ацетон:метанол.

После инкубации в течение одной минуты при комнатной температуре планшеты промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA, а затем блокировали 150 мкл/лунка 10% FBS-TNE.

После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре планшеты промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA, а затем добавляли 100 мкл/лунка mAb мыши против NS4A гепатита C (маточный раствор 1 мг/мл, разбавленный 1:4000 в 10% FBS-TNE).

После инкубации при 37°C в течение 2 часов планшеты промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA, а затем добавляли 100 мкл/лунка конъюгированного с HRP антитела козы против антител мыши (разбавленного 1:3500 в 10% FBS-TNE).

После инкубации в течение одного часа при 37°C каждый планшет промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA. Затем инициировали проявление цвета с помощью 100 мкл/лунка раствора OPD.

После инкубации в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре реакции останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл 2 N H₂SO₄.

Поглощение измеряли при 490 нм на устройстве для подсчета Victor³V 1420 multilabel counter (Perkin Elmer). Процентное ингибирование репликации репликона HCV вычисляли для каждого лекарственного средства и комбинации лекарственных средств с использованием среднего значения для дублированных лунок. Величину 50% эффективной концентрации (EC₅₀) вычисляли для соединения 1 отдельно и RBV отдельно из результирующих уравнений наилучшего соответствия, определенных с помощью программного обеспечения XLfit 4.1. Анализ данных для комбинации in vitro проводили с использованием модели независимости Bliss (MacSynergy^TM II) и модели аддитивности Loewe (CombiTool). Кроме того, использовали программу CalcuSyn для вычисления среднего значения CI при вычисленной EC₅₀.

Определение цитотоксичности соединения 1 и RBV на клетках GS4.1 с использованием анализа MTS

Клетки высевали и обрабатывали ингибиторами с использованием растворов лекарственных средств, описанных выше.

После обработки лекарственным средством в течение трех суток в каждую лунку добавляли 20 мкл MTS, а затем планшеты инкубировали при 37°C/5% CO₂.

После инкубации в течение 3 часов измеряли поглощение при 490 нм в устройстве для подсчета Victor³V 1420 multilabel counter (Perkin Elmer). Величину 50% цитотоксической концентрации (CC₅₀) для каждого лекарственного средства и комбинации лекарственных средств определяли из результирующих уравнений наилучшего соответствия, определенных с помощью программного обеспечения XLfit 4.1.

В экспериментальных условиях, использованных в этом исследовании, не наблюдали признаков цитотоксичности in vitro в клетках, обработанных соединением 1 и RBV отдельно или в комбинации.

Анализ данных о комбинациях лекарственных средств

Для оценки данных о противовирусной эффективности согласно модели независимости Bliss использовали программу MacSynergy^TM II версии 1.0 (Prichard, Aseltine, Shipman; University of Michigan, Michigan, USA). MacSynergy^TM II вычисляет теоретическую аддитивную поверхность эффекта дозы исходя из кривых доза-эффект для каждого лекарственного средства, титрованного индивидуально. Вычисленная поверхность аддитивного взаимодействия затем вычитается из экспериментально полученной поверхности взаимодействия, выявляя области неаддитивного взаимодействия. Пики выше плоскости при 0% ингибировании указывают на области более чем аддитивного взаимодействия или синергизма. Напротив, пики ниже плоскости при 0% ингибировании указывают на менее чем аддитивное взаимодействие или антагонизм. Группы данных статистически оцениваются в области экспериментальной поверхности доза-эффект с помощью доверительных интервалов. Вычисляются объемы пиков, количественно определяющие степень синергии или антагонизма, которая лежит за пределами доверительного интервала; предоставляются объемы синергии и антагонизма и log-объемы (корректирующие на разведения лекарственных средств). В этом исследовании группы данных оценивали при 99,9% доверительном интервале; объемы <25 мкМ 2% (log-объемы <2) считали аддитивными, объемы >25, но <50 мкМ 2% (log-объемы >2 и <5) считали слабыми синергией или антагонизмом, величины >50, но <100 мкМ 2% (log-объемы >5 и <9) считали умеренными синергией или антагонизмом и величины >100 мкМ % (log-объемы >9) считали сильными синергией или антагонизмом (Prichard, et al. 2004, Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 37(3): 540-545).

Для вычисления различий между предсказанными эффектами (согласно модели аддитивности Loewe) и наблюдаемыми эффектами (экспериментальные данные) использовали программу CombiTool версии 2.001 (Dressler, Muller, and Suhnel; Institute of Molecular Biotechnology, Jena, DE). Когда отличия от предсказанных эффектов представляют графически, получают визуальное представление взаимодействия соединений. Линия на нулевом уровне соответствует аддитивной плоскости нулевого взаимодействия. Точки выше или ниже плоскости нулевого взаимодействия соответствуют областям синергии или антагонизма соответственно. Отклонения более 0,25 от предсказанных эффектов считали значимыми (Dressler et al. 1999, Computers and Biomedical Research; 32: 145-160).

Программу CalcuSyn версии 2.1 (BIOSOFT, Cambridge, UK) использовали для определения характеристик взаимодействия лекарственное средство-лекарственное средство исходя из уравнения индекса комбинации, предложенного Chou and Talalay (1984) Adv. Enz. Regul. 22: 27-55. Индекс комбинации при вычисленной EC₅₀ для комбинации лекарственных средств описан; описание и степень взаимодействия лекарственных средств исходя из величины CI являются такими, как рекомендовано в руководстве к программному обеспечению CalcuSyn для Windows (таблица 59).

Таблица 59 Описание степени взаимодействия при анализе способом определения индекса комбинации
Диапазон CI	Описание
<0,1	очень сильный синергизм
0,1-0,3	сильный синергизм
0,3-0,7	синергизм
0,7-0,85	умеренный синергизм
0,85-0,90	небольшой синергизм
0,90-1,10	аддитивное
1,10-1,20	небольшой антагонизм
1,20-1,45	умеренный антагонизм
1,45-3,3	антагонизм
3,3-10	сильный антагонизм
>10	очень сильный антагонизм

Анализ MacSynergy ^TM II (независимость Bliss)

Пять индивидуальных групп экспериментальных данных анализировали с использованием программного обеспечения MacSynergy^TM II при 99,9% доверительном интервале.

Результат этого анализа представлен на фигуре 5. Синергическое взаимодействие локализовано в области наиболее низкой концентрации RBV (0,6×EC₅₀) и концентрации соединения 1 на уровне его EC₅₀ или выше (от 1× до 1,5×EC₅₀), указаны небольшим пиком при этих концентрациях на фигуре 5. Все другие экспериментальные точки, представленные на фигуре 5, группируются вблизи аддитивной плоскости нулевого взаимодействия, указывая на то, что два лекарственных средства при этих концентрациях ингибируют репликон HCV in vitro аддитивно.

Вычисленный объем взаимодействия 56,7 мкМ 2% указывает на умеренную синергию. После коррекции по разведениям лекарственных средств получают log-объем взаимодействия 0,53 мкМ 2%, что снова указывает на аддитивное взаимодействие соединения 1 и RBV.

В целом в одном варианте осуществления объединенный эффект соединения 1 и RBV является слабо синергичным, когда ≥0,4 мкМ соединение 1 комбинируют с низкими концентрациями (0,6×EC₅₀) RBV. В другом варианте осуществления комбинация соединения 1 и RBV является аддитивной.

Анализы CombiTool (аддитивность Loewe)

Различия между вычисленным аддитивным эффектом и экспериментальными данными количественно определяли и наносили на график для каждой комбинации лекарственных средств. На фигуре 6 представлены различия между вычисленными аддитивными и наблюдаемыми эффектами против HCV для всех комбинаций лекарственных средств в 5 независимых экспериментах, полученные с помощью программного обеспечения CombiTool с использованием модели аддитивности Loewe. На фигуре 6 LA-EXP = различия между наблюдаемыми эффектами в 5 экспериментах и предсказанными эффектами при определении с помощью модели аддитивности Loewe с использованием программного обеспечения CombiTool. Линия на нулевом уровне соответствует плоскости аддитивного нулевого взаимодействия. Точки выше или ниже плоскости нулевого взаимодействия соответствуют областям синергии или антагонизма соответственно. Отклонения более 0,25 от предсказанных эффектов считали значимыми.

Аналогично анализу MacSynergy^TM II, CombiTool демонстрирует, что комбинации лекарственных средств, вовлекающие высокие концентрации соединения 1 и низкие концентрации RBV являются слабо синергичными, как можно видеть по экспериментальным данным, группирующимся в области плоскости -0,25 на графике CombiTool. Все другие экспериментальные данные для комбинации лекарственных средств попадают выше плоскости -0,25, указывая на то, что два лекарственных средства ингибируют репликон HCV аддитивно при этих концентрациях лекарственных средств. Согласно модели аддитивности Loewe, исследованной с помощью программы CombiTool, в одном варианте осуществления взаимодействие соединения 1 и RBV, по-видимому, является слабо синергичным, когда высокие концентрации соединения 1 комбинируют с низкими концентрациями RBV; все другие комбинации приводят к аддитивным взаимодействиям.

Анализ CalcuSyn (индекс комбинации)

Программа CalcuSyn определила, что средний CI при вычисленной EC₅₀ составил 0,37±0,12, что согласуется с интерпретацией синергизма при этом уровне эффекта.

В клетках, обработанных соединением 1 и RBV отдельно или в комбинации, не наблюдали признаков цитотоксичности in vitro, что указывает на то, что комбинированная взаимосвязь активности является следствием ингибирования репликации HCV, а не клеточной цитотоксичности.

В определенных вариантах осуществления комбинация рибавирина и соединения 1 имела усиленную противовирусную эффективность по сравнению с каждым средством, протестированным отдельно. В определенных вариантах осуществления комбинация является синергичной. Это противоположно сообщениям в литературе, что существует антагонизм между 2'-C-метилнуклеозидами и рибавирином, см. Coelmont et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2006, 50, 3444-3446.

Без связи с какой-либо теорией полагают, что в клетках, подвергнутых воздействию рибавирина, образуются значительное количество рибавиринтрифосфата, которое вызывает истощение уровней клеточного GTP - природного субстрата для синтеза РНК HCV - через механизм обратной связи в синтезе нуклеотидов. Результатом этого является то, что количество природного субстрата GTP для конкуренции с 2'-C-метилгуанозин-5'-трифосфатом является меньшим и, таким образом, он является более эффективным ингибитором.

Также следует отметить, что эффекта обратной связи у рибавирина можно ожидать на первой стадии фосфорилирования, в которой гуанозин конвертируется в гуанозинмонофосфат. Поскольку соединение 1 обходит эту стадию путем доставки 2'-C-метилгуанозин-5'-монофосфата, можно ожидать, что рибавирин не имеет отрицательного воздействия на конверсию соединения 1 в 2'-C-метилгуанозин-5'-трифосфат.

ПРИМЕР 18

Чувствительность in vitro HCV с заменой S282T к рибавирину и соединению 1

В этом эксперименте чувствительность in vitro вируса гепатита C (HCV) с заменой S282T к рибавирину (RBV) и соединению 1 оценивали в двух тест-системах: стандартный биохимический анализ и тест-система для репликона генотипа 1b. Противовирусную эффективность 5'-трифосфата рибавирина и соединения 7 сначала определяли с использованием стандартного ферментного анализа in vitro, в котором измеряют опосредуемое NS5B включение радиоактивно меченного гуанозин-5'-монофосфата (GMP) в олигомерную рибонуклеиновую кислоту-матрицу (РНК) в присутствии или в отсутствие лекарственного средства. Ферменты дикого типа и мутантные ферменты с сайт-направленной мутацией S282T анализировали в присутствии трифосфата рибавирина (RBV-TP) или соединения 7, которое является активным метаболитом соединения 1 в клетках.

Контроли

1. Контроль без лекарственного средства (положительный) для биохимического анализа HCV: полимераза в реакционном буфере без лекарственного средства.

2. Фоновый (отрицательный) контроль для биохимических анализов HCV: тот же, что и положительный контроль вместе с 100 мМ ЭДТА.

3. Контроль без лекарственного средства (положительный) для анализа репликона HCV: клетки репликона HCV (GS4.1) в среде для анализа.

4. Положительный контроль для NS5A ELISA: необработанные клетки с репликоном HCV (GS4.1) в среде для анализа.

5. Отрицательный контроль для NS5A ELISA: клетки Huh-7 в среде для анализа.

7. Отрицательный контроль цитотоксичности: необработанные клетки репликона HCV (GS4.1) в среде для анализа.

Полимеразы HCV

Полимеразные ферменты, использованные в этом исследовании, экспрессировали и очищали следующим образом. Конструкция дикого типа кодирует белок NS5B HCV массой 65 кДа генотипа 1b (штамм Con-1) в стандартной бактериальной экспрессирующей системе, использованной для получения рекомбинантного фермента полимеразы. Мутантную полимеразу HCV, имеющую одну замену серина на треонин в остатке 282 гена NS5B получали сайт-направленным мутагенезом конструкции дикого типа с использованием коммерческого набора для мутагенеза согласно рекомендациям изготовителя. Экспрессирующие конструкции, использованные в этом исследовании, представляли собой следующее:

1. Полимераза HCV генотипа 1b дикого типа (с делецией 21 С-концевой аминокислоты), клонированная в участки рестрикции NheI/XhoI экспрессирующего вектора pET21a (Ampr). Клон номер 9-15.

2. Полимераза HCV 1b S282T содержит одну замену серина на треонин в положении 282 в B-домене гена NS5B в том же экспрессирующем векторе.

Клеточные линии с репликоном HCV

1. Клеточную линию Huh-7 получали из клеток гепатомы человека (Nakabayashi H., 1982, Cancer Res. 42:3858-3863). Клетки Huh-7 поддерживали в 75-см² флаконах Corning в среде для роста Huh-7 при 37°C с 5% CO₂ и разбавляли смесью трипсин-ЭДТА при смыкании монослоя приблизительно 80%.

Источник: Dr. Christoph Seeger, Fox Chase Cancer; Philadelphia, PA.

2. Клеточная линия GS4.1 (Zhu et al. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells, J. Virol; 2003, 77:9204-9210) получена из линии клеток печени человека Huh-7, и она стабильно обладает бицистронным репликоном HCV. Клетки поддерживали в 75-см² флаконах Corning в среде для роста GS4.1 при 37°С с 5% CO₂ и разбавляли смесью трипсин-ЭДТА при приблизительно 80% смыкании монослоя.

Источник: Dr. Christoph Seeger, Fox Chase Cancer; Philadelphia, PA.

3. Клеточная линия 184R-A получена культивированием клеток с репликоном дикого типа в присутствии от 1 до 5 мкМ соединения 1 в течение >100 суток. Популяционное секвенирование показало, что вариант S282T перерос дикий тип к 103 суткам.

4. Клеточная линия 184R-D2 также получена культивированием клеток с репликоном дикого типа в присутствии возрастающих концентраций соединения 1, начиная с 0,9 мкм и заканчивая 3,6 мкМ. Мутация S282T появлялась в репликоне после селекции в течение 69 суток, и он перерастал вариант дикого типа по S282 после селекции в течение 80 суток. В клеточной линии с репликоном 184R-D было выявлено две дополнительных мутации, S189P и Y586C. При селекции эти мутации не отбирались в каких-либо других устойчивых к соединению 1 репликонах, и они не вовлечены в устойчивость к нуклеотидным(нуклеозидным) аналогам против HCV.

Реагенты для биохимического анализа

Не содержащая РНКазу вода, источник: Applied Biosystems (№ по каталогу: AM9932); хлорид магния, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: M1028); хлорид марганца, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: M1787); дитиотреитол (DTT), источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: 43815); α-[³³P]GTP, источник: Perkin Elmer Life Sciences (№ по каталогу: NEG 606H); гибкая крышка для 96-луночного планшета, источник: BD Falcon (№ по каталогу: 353913); гибкий 96-луночный U-образный планшет, источник: BD Falcon (№ по каталогу: 353911); синтилляционная жидкость Microscint-O, источник: Perkin Elmer Life Sciences (№ по каталогу: 6013611); бычий сывороточный альбумин UltraPure (BSA) 50 мг/мл, источник: Applied Biosystems (№ по каталогу: AM2616); планшеты Unifilter-96 GF/B, источник: Perkin Elmer Life Sciences (№ по каталогу: 6005177); этанол (EtOH), чистота 200, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: E7023-4L); декагидрат пирофосфата натрия, источник: EMD Chemicals (№ по каталогу: SX0740-1); Triton X-100, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: T8787); ингибитор РНКазы SUPERase-In, источник: Applied Biosystems (№ по каталогу: AM2696); моногидрат мононатриевой соли глутаминовой кислоты, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: G2834); трихлоруксусная кислота (TCA), источник: EMD Chemicals (№ по каталогу: TX1045-1), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 0,5 M, pH 8,0, источник: Applied Biosystems (№ по каталогу: AM9260G); аденозинтрифосфат (ATP), источник: GE Healthcare Life Sciences (№ по каталогу: 27-2056-01); цитидинтрифосфат (CTP), источник: GE Healthcare Life Sciences (№ по каталогу: 27-2066-01); гуанозинтрифосфат (GTP), источник: GE Healthcare Life Sciences (№ по каталогу: 27-2076-01); уридинтрифосфат (UTP), источник: GE Healthcare Life Sciences (№ по каталогу: 27-2086-01); и синтетические РНК-олигонуклеотиды, источник: Dharmacon (№ по каталогу: синтез на заказ).

Реагенты для анализа репликона и ELISA

75 см² флаконы, источник: Corning Costar (№ по каталогу: 430641); 96-луночные планшеты, источник: Corning Costar (№ по каталогу: 3595); трипсин-ЭДТА, источник: Cellgro (№ по каталогу: 25-053-CI); метанол, источник: Burdick & Jackson (№ по каталогу: AH230-4); ацетон, источник: J.T. Baker (№ по каталогу: 9006-03); моноклональные антитела мыши NS5 A гепатита C (mAb), источник: Virogen (№ по каталогу: 256-A); концентрат раствора для промывания (20X), источник: KPL (№ по каталогу: 50-63-00); конъюгированное с HRP антитело козы против IgG мыши (H+L), источник: Zymed (№ по каталогу: 81-6520); орто-фенилендиамин (таблетка OPD), источник: Zymed (№ по каталогу: 00-2003); 30% раствор пероксида водорода (H₂O₂), источник: EMD (№ по каталогу: HXO635-1); серная кислота, источник: Mallinckrodt Chemicals (№ по каталогу: 2876-05); раствор для анализа пролиферации клеток CellTiter 96® AQueous One Solution (на основе MTS), источник: Promega (№ по каталогу: G3582); лимонная кислота, соль тринатрия, дегидрат, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: C-8532); фосфат натрия, двухосновный, источник: Fisher Chemical (№ по каталогу: S373-3); Trizma® раствор гидрохлорида (Tris-HCl), источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: T2663-1L); хлорид натрия, раствор 5,0 M, источник: Applied Biosystem (№ по каталогу: AM9759); раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 0,5 M, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: E7889-100 мл); диметилсульфоксид, источник: Sigma-Aldrich (№ по каталогу: D2650); Geneticin® (G418), 100X, источник: Cellgro (№ по каталогу: 30-324-CI); модифицированная способом дульбекко среда Игла (DMEM), источник: Cellgro (№ по каталогу: 10-013-CV); эмбриональная телячья сыворотка (FBS), инактивированная нагреванием, источник: Cellgro (№ по каталогу: 35-016-CV); раствор пенициллин/стрептомицина (10000 МЕ на мл/10000 мкг на мл), источник: Cellgro (№ по каталогу: 30-001-CI); GlutaMAX, дипептид L-глутамина (200 мМ), источник: Gibco (№ по каталогу: 35050-061); и заменимые аминокислоты MEM, источник: Cellgro (№ по каталогу: 25-025-CI).

Среды и буферы

В этом эксперименте использовали следующие среды и буферы.

2. Полная среда для роста/селекции клеток дикого типа и клеток с репликоном 184R: 1X DMEM (содержащая глюкозу, L-глутамин и пируват натрия), дополненная 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ GlutaMAX, 1% заменимыми аминокислотами MEM и 0,5 мг/мл генетицина (G418).

7. Раствор OPD: 1 таблетка OPD + 12 мл цитрат/фосфатного буфера + 5 мл 30% H₂O₂ на планшет.

I: Анализы полимеразы HCV in vitro

В этом эксперименте проводили оценку ингибирования активности in vitro полимеразы HCV дикого типа и мутантных полимераз S282T с помощью RBV-TP и соединения 7.

Получение полимераз дикого типа и мутантных S282T полимераз HCV 1b

Меченные на С-конце гексагистидином полимеразные ферменты дикого типа и S282T HCV экспрессировали и очищали до чистоты 85-90% из клеток E. coli BL21 (DE3) с использованием одностадийного способа аффинной хроматографии с никелем.

Приготовление растворов соединений

Маточные растворы соединения 7 и рибавирина-TP готовили в качестве 10 мМ растворов в не содержащей нуклеазы воде и хранили небольшими аликвотами при -20°С.

Готовили восемь свежих разведений RBV-TP и соединения 7 в 5 мкМ водном растворе ATP с получением конечных тестируемых концентраций лекарственного средства 1000 - 0,46 мкМ (RBV-TP) и 100 - 0,05 мкМ (соединение 7).

Биохимический анализ полимеразы HCV для определения IC ₅₀

Этот анализ проводили для измерения ингибиторного эффекта лекарственного средства на включения α-[³³P]GMP в материал, поддающийся преципитации в трихлоруксусной кислоте (TCA). Меченный радиоактивной меткой продукт собирали фильтрацией на 96-луночных фильтрационных планшетах и количественно определяли жидкостно-сцинтилляционным измерением. В качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи РНК использовали синтетический РНК-олигонуклеотид.

- 96-луночные гибкие планшеты, содержащие тестируемые изделия, готовили следующим образом: 10 мкл серийно разбавленного RBV-TP или соединения 7 в 5 мкМ ATP переносили в трех экземплярах в лунки в соседних столбцах. Перед добавлением фермента планшеты держали на льду.

- Десять мкл 500 мМ ЭДТА добавляли в столбец 1 планшета для анализа для определения фоновой радиоактивности.

- Десять мкл 5 мкМ ATP добавляли в столбцы 2 и 3 планшета для анализа для контроля без лекарственного средства.

- Реакционную смесь получали в общем объеме на льду; для начала реакций 40 мкл реакционной смеси добавляли в каждую лунку для анализа. Таким образом, конечный объем реакционной смеси составил 50 мкл. Конечные концентрации всех реагентов в реакционных смесях представлены ниже в таблице 60:

Таблица 60

Реагент	Концентрация
Глутамат натрия	20 мМ
Хлорид магния	4 мМ
Хлорид марганца	1 мМ
Дитиотреитол	10 мМ
Triton X-100	0,1%
Ингибитор РНКазы	5 единиц/реакционная смесь
Бычий сывороточный альбумин	50 мкг/мл
ATP	1 мкМ
CTP	1 мкМ
UTP	1 мкМ
GTP	50 нМ
α-[³³P]GTP	0,1 мкКи/реакционная смесь
РНК-матрица	30 нМ
Полимераза HCV 1b	60 нМ
Соединение 7 или RBV-TP	переменное, как описано
Не содержащая нуклеазы вода	до конечного объема 50 мкл

- Реакционные смеси инкубировали при 30°C в течение 2 ч.

- Реакции останавливали добавлением 50 мкл раствора для преципитации (22,5% TCA, 25 мМ пирофосфат натрия, ледяной) с последующей инкубацией на льду в течение по меньшей мере 20 минут.

- Проводили сбор с планшетов на сборщике Packard Unifilter Harvester (Perkin Elmer Life Sciences) с использованием фильтрационных планшетов GF/B (Perkin Elmer Life Sciences), предварительно ополоснутых 0,1 M пирофосфатом натрия. Планшеты тщательно промывали деионизированной водой, а затем этанолом для способствования высыханию.

- Планшетам позволяли высохнуть на воздухе, а затем добавляли MicroScint-O (35 мкл на лунку; Perkin Elmer Life Sciences). Планшеты подсчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике Packard TopCount (Perkin Elmer Life Sciences).

- Величины IC₅₀ вычисляли из однопозиционных кривых доза-эффект с помощью уравнений наилучшего соответствия с помощью программного обеспечения XLfit 4.1.

Ингибирование in vitro NS5B HCV дикого типа (генотип 1b) рибовирином-TP и соединением 7 представлено в таблице 61 ниже (величины IC₅₀ в мкМ)

Таблица 61
ID Соединения	N	Дикого типа	S282T
Рибавирин-TP (Moravek M1593)	3	883,4±378	45,9±16,2
Соединение 7	3	0,27±0,06	2,61±0,72

Как видно из таблицы 61, RBV-TP проявлял незначительное ингибирование NS5B генотипа 1b дикого типа и был в >3000 раз менее активным, чем соединение 7 in vitro. Мутантный фермент S282T был в 9,73±1,79 раз менее чувствительным к ингибированию соединением 7, как видно из средней величины IC₅₀ 2,61±0,72 мкМ. Напротив, RBV-TP проявлял усиленную активность in vitro против мутантной полимеразы S282T, как видно по в 19,2 раз более низкой IC₅₀, составляющей 45,9±16,2 мкМ.

Эти данные указывают на отличающийся профиль перекрестной устойчивости мутантного фермента S282T in vitro для RBV-TP и соединения 7, и это подразумевает, что рибавирин может противодействовать появлению определяющей устойчивость мутации S282T при использовании в комбинации с соединением 1.

В определенных вариантах осуществления интерферон может противодействовать появлению определяющей устойчивость мутации S282T при применении в комбинации с соединением 1.

В таблице 62 представлено изменение в количестве раз для мутанта S282T по сравнению с диким типом.

Таблица 62
ID Соединения	N	Дикого типа	S282T
Рибавирин-TP (Moravek M1593)	3	1	0,06±0,02
Соединение 7	3	1	9,73±1,79

Мутантный фермент S282T был в 9,73±1,79 раз менее чувствительным к ингибированию соединением 7, как можно видеть по среднему значению IC₅₀ 2,61±0,72 мкМ (таблица 61, таблица 62). Напротив, RBV-TP проявлял усиленную активность in vitro против мутантной полимеразы S282T, как можно видеть по в 19,2 раз более низкой IC₅₀ 45,9±16,2 мкМ (таблица 61).

II: A. Противовирусная активность рибавирина в отношении стабильных клеточных линий с репликоном HCV дикого типа или с S282T

В этом исследовании определяли активность рибавирина и соединения 1 против HCV in vitro в стабильных клеточных линиях, несущих репликоны дикого типа или устойчивые к соединению 1 репликоны S282T генотипа 1b.

Анализ репликона HCV с обработкой RBV и соединением 1

Лечение лекарственным средством

Использовали следующий протокол:

1. В столбцы 2-12 96-луночных планшетов высевали клетки с репликоном либо дикого типа (GS4.1), либо S282T (184R-A и 184R-D2) с плотностью 7,5×10³ клеток на лунку в 50 мкл полной среды для роста. Клетки Huh-7 высевали в столбец 1 каждого планшета со сходной плотностью.

2. Соединение 1 и RBV разбавляли в среде для анализа до 2X маточных растворов. Из 2X маточного раствора готовили восемь дополнительных 3-кратных разведений каждого соединения в среде для анализа. Конечные концентрации лекарственного средства находились в диапазоне от 100 до 0,015 мкМ.

3. Клетки инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение по меньшей мере четырех часов, а затем начинали обработку лекарственным средством путем добавления 50 мкл серийных разведений RBV и лекарственного средства на основе соединения 1. Анализ проводили в двух экземплярах в каждом 96-луночном планшете.

4. Клетки инкубировали с ингибиторами в течение трех суток при 37°C/5% CO₂.

ELISA репликона HCV

Для анализа репликона HCV использовали следующий протокол:

1. После обработки лекарственным средством в течение трех суток среду удаляли из планшетов путем осторожного постукивания и клетки фиксировали к планшетам с помощью 100 мкл/лунка смеси 1:1 ацетон:метанол.

2. После инкубации в течение одной минуты при комнатной температуре планшеты промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA, а затем блокировали 150 мкл/лунка 10% FBS-TNE.

3. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре планшеты промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA, а затем добавляли 100 мкл/лунка mAb мыши против NS5A гепатита C (маточный раствор 1 мг/мл, разбавленный 1:4000 в 10% FBS-TNE).

4. После инкубации при 37°C в течение 2 часов планшеты промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA, а затем добавляли 100 мкл/лунка конъюгированного с HRP антитела козы против антител мыши (разбавленного 1:4000 в 10% FBS-TNE).

4. После инкубации в течение одного часа при 37°C каждый планшет промывали три раза 100 мкл/лунка раствора для промывания для ELISA. Затем инициировали проявление цвета с помощью 100 мкл/лунка раствора OPD.

5. После инкубации в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре реакции останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл 2 N H₂SO₄.

6. Поглощение измеряли при 490 нм на устройстве для подсчета Victor³ V 1420 multilabel counter (Perkin Elmer). Процентное ингибирование репликации репликона HCV вычисляли для каждого лекарственного средства и комбинации лекарственных средств с использованием среднего значения для дублированных лунок. Величину 50% эффективной концентрации (EC₅₀) вычисляли для соединения 1 отдельно и RBV отдельно из результирующих уравнений наилучшего соответствия, определенных с помощью программного обеспечения XLfit 4.1.

Определение цитотоксичности RBV и соединения 1 на клетках GS4.1 с использованием анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолия, внутренней соли (MTS)

Клетки высевали и обрабатывали ингибиторами, как описано выше.

После обработки лекарственным средством в течение трех суток в каждую лунку добавляли 20 мкл MTS, а затем планшеты инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение 3 часов.

Поглощение измеряли при 490 нм на устройстве для подсчета Victor³ V 1420 multilabel counter (Perkin Elmer). Величину 50% цитотоксической концентрации (CC₅₀) вычисляли для каждого лекарственного средства и комбинации лекарственных средств из результирующих уравнений наилучшего соответствия, определенных с помощью программного обеспечения XLfit 4.1.

В экспериментальных условиях, использованных в этом исследовании, не выявлено признаков цитотоксичности in vitro в клетках с репликоном дикого типа или S282T, обработанных вплоть до 100 мкМ соединением 1 или RBV, см. таблицу 63. Соединение 1 проявляло ожидаемую противовирусную активность в клетках GS4.1, содержащих репликон HCV дикого типа, и в клетках с мутантным репликоном S282T. Средние величины EC₅₀, определенные для 3 независимых групп экспериментальных данных, представлены в таблице 63. В таблице 64 представлено изменение в количестве раз для мутанта S282T по сравнению с диким типом.

Таблица 63 Противовирусная активность и цитотоксичность рибавирина и соединения 1 в клеточных линиях HCV с репликоном дикого типа и S282T
Соединение	N^a	GS4.1^d (дикого типа)		184R-A⁶ (S282T)		184R-D2^e (S282T)
	N^a	EC₅₀ ^b (мкМ)	CC₅₀ ^c (мкМ)	EC₅₀ (мкМ)	CC₅₀ (мкМ)	EC₅₀ (мкМ)	CC₅₀ (мкМ)
Рибавирин	3	38±2,8	>100	12,3±1,9	>100	17±3,5	>100
Соединение 1	3	0,3±0,06	>100	9±0,9	>100	39±10	>100
^a N= количество независимых экспериментов. ^b EC₅₀ = 50% эффективная концентрация ± стандартное отклонение. ^c CC₅₀ = цитотоксическая концентрация, которая снижает жизнеспособность клеток на 50% в клеточной культуре, при определении в анализе MTS. ^d GS4.1 = Клеточная линия гепатомы человека, содержащая репликон HCV con1 дикого типа. ^e 184R-A & 184R-D2 = Отобранные на соединении 1 клеточные линии с репликоном, содержащие характерную мутацию S282T.

Таблица 64 Изменение в количестве раз относительно дикого типа
Соединение	GS4.1 (Дикого типа)	184R-A(S282T)	184R-D2 (S282T)
Рибавирин	1	0,32	0,45
Соединение 1	1	30	130
Кратность изменения определяли путем деления EC₅₀, полученной в клеточных линиях, устойчивых к соединению 1, на EC₅₀, полученную в клетках дикого типа.

Рибавирин имел поддающуюся измерению активность против HCV со средней EC₅₀ 38±2,8 мкМ в клетках GS4.1 с репликоном дикого типа и, таким образом, он был приблизительно в 126 раз менее активным, чем соединение 1. Однако при тестировании в двух устойчивых к соединению 1 клеточных линиях с репликонами, 184R-A и 184R-D2, рибавирин продемонстрировал более высокую активность в от 2 до 3 раз, на которую указывали более низкие величины средней EC₅₀, составляющие 12,3±1,9 мкМ (184R-A) и 17±3,5 мкМ (184R-D2) (таблица 63).

Эти данные для репликона HCV, по-видимому, подтверждают тот факт, что RBV действительно является более активным против мутанта S282T репликона HCV, чем против репликона дикого типа, где активность RBV очень трудно измерить, поскольку она перекрывается с цитотоксичностью соединения.

Повышенная активность RBV против мутантной полимеразы S282T, по-видимому, согласуется с тем, что RBV является прямым противовирусным средством против мутантного штамма HCV, хотя не исключены другие механизмы действия RBV. В общем, оказалось, что рибавирин и его активный метаболит RBV-TP продемонстрировали усиленную противовирусную активность in vitro против варианта S282T и показали отсутствие признаков перекрестной устойчивости и/или антагонизма с соединением 1 и соединением 7 в отношении репликона HCV, содержащего характерную мутацию S282T устойчивости HCV к соединению 1 (2'-C-метилнуклеозиду).

Все публикации и патентные заявки, цитированные в настоящем документе, включены в настоящий документ в качестве ссылок, как если бы было конкретно и индивидуально указано, что каждая индивидуальная публикация или патентная заявка включена в качестве ссылки. Хотя заявленный объект описан с помощью различных вариантов осуществления, специалисту понятно, что можно проводить различные модификации, замены, исключения и изменения без отклонения от его сущности. Таким образом, подразумевается, что объем объекта ограничивается только прилагаемой формулой изобретения, в том числе ее эквивалентами.

Claims

1. Диастереомерно чистое соединение формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Очищенное соединение формулы:

или его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомерная форма, где R¹ представляет собой гидроксил, амино или бензиламино; и R² представляет собой водород,

,

или

, так что когда R¹ представляет собой гидроксил, R² отличен от водорода,

и,

.

3. Очищенное соединение по п.2 формулы II:

или его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомерная форма, где R² представляет собой водород,

,

или

.

4. Очищенное соединение по п.2 формулы III:

,

или

.

5. Очищенное соединение по п.2 формулы IV:

или его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомерная форма, где R² представляет собой

или

6. Очищенное соединение по п.2 формулы V:

или его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомерная форма, где R¹ представляет собой гидроксил или амино.

7. Очищенное соединение по п.2, выбранное из

и

8. Очищенное соединение по п.2, выбранное из

и

9. [С¹⁴]-изотопно обогащенное соединение формулы I:

или его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомерная форма, где [С¹⁴]-изотоп находится в С-8 положении соединения формулы I и где R¹ представляет собой гидроксил, амино или бензиламино; и R² представляет собой водород,

,

или

и

.

10. Изотопно обогащенное соединение по п.9, где соединение представляет собой изотопно обогащенное соединение 2

изотопно обогащенное соединение 2а

изотопно обогащенное соединение 2b

изотопно обогащенное соединение 3

изотопно обогащенное соединение 3а

изотопно обогащенное соединение 3b

изотопно обогащенное соединение 4

изотопно обогащенное соединение 5

изотопно обогащенное соединение 6

изотопно обогащенное соединение 7

изотопно обогащенное соединение 8

изотопно обогащенное соединение 9

изотопно обогащенное соединение 9а

изотопно обогащенное соединение 9b

изотопно обогащенное соединение 10

изотопно обогащенное соединение 10а

изотопно обогащенное соединение 10b

изотопно обогащенное соединение 11

изотопно обогащенное соединение 11а

или
изотопно обогащенное соединение 11b

11. Изотопно обогащенное соединение по п.9, выбранное из группы, состоящей из изотопно обогащенного соединения 1

изотопно обогащенного соединения 1а

и
изотопно обогащенного соединения 1b

12. Способ лечения хозяина, инфицированного вирусом Flaviviridae, включающий введение эффективного для лечения количества соединения по любому из пп.1-11.

13. Способ по п.12, где вирус представляет собой вирус гепатита С.

14. Способ по п.13, где хозяином является человек.

15. Способ по п.12, где указанное введение направляет существенное количество указанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера в печень указанного хозяина.

16. Способ по п.12, где соединение или его фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер вводят в комбинации или поочередно со вторым противовирусным средством, выбранным из группы, состоящей из интерферона, рибавирина, интерлейкина, ингибитора протеазы NS3, ингибитора цистеиновой протеазы, фенантренхинона, производного тиазолидина, тиазолидина, бензанилида, ингибитора хеликазы, ингибитора полимеразы, нуклеотидного аналога, глиотоксина, церуленина, антисмыслового фосфоротиоатного олигодезоксинуклеотида, ингибитора IRES-зависимой трансляции и рибозима.

17. Способ по п.16, где второе средство выбрано из группы, состоящей из пегилированного интерферона-альфа 2а, интерферона альфакона-1, природного интерферона, альбуферона, интерферона бета-1a, омега-интерферона, интерферона-альфа, интерферона-гамма, интерферона-тау, интерферона-дельта и интерферона-γ-1b.

18. Способ по п.16, где второе средство представляет собой рибавирин.

19. Способ по п.12, где хозяином является человек.

20. Фармацевтическая композиция для лечения хозяина, инфицированного вирусом Flaviviridae, содержащая соединение по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.

21. Композиция по п.20, где композиция представляет собой пероральный состав для лечения Flaviviridae вирусной инфекции.

22. Соединение формулы VI:

или его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомер, где R^a и R^b выбраны следующим образом:
i) R^a представляет собой водород; и R^b представляет собой алкил, карбоксиалкил, циклоалкил, алкоксикарбонилалкил или диалкиламиноалкил; или
ii) R^a и R^b вместе с атомом азота, на котором они являются заместителями, образуют 3-7-членное гетероциклическое кольцо, необязательно замещенное одной или двумя алкильными группами.

23. Соединение по п.22, где R^a и R^b выбраны следующим образом:
i) R^a представляет собой водород; и R^b представляет собой изопропил, трет-бутил, циклогексил, этоксикарбонилметил, трет-бутилоксикарбонилметил, карбоксиметил или диметиламиноэтил; или
ii) R^a и R^b вместе с атомом азота, на котором они являются заместителями, образуют 4-метилпиперазиновое или морфолиновое кольцо.

24. Соединение по п.22, выбранное из

и

или
его фармацевтически приемлемая соль, или стереоизомер.

25. Соединение по п.22, где соединение представляет собой

или

26. Соединение по п.22, где соединение представляет собой

и

27. Способ лечения хозяина, инфицированного вирусом Flaviviridae, включающий введение эффективного для лечения количества соединения по любому из пп.22-26.

28. Способ лечения хозяина, инфицированного вирусом Flaviviridae, включающий введение соединения 1 в количестве от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 150 мг/сутки.

29. Способ по п.28, где количество составляет от приблизительно 5 мг/сутки до приблизительно 100 мг/сутки.

30. Способ по п.28, где количество составляет приблизительно 5, 10, 25, 50, 75 или 100 мг/сутки.

31. Способ по любому из пп.27-30, дополнительно включающий введение второго противовирусного средства, выбранного из группы, состоящей из интерферона, рибавирина, интерлейкина, ингибитора протеазы NS3, ингибитора цистеиновой протеазы, фенантренхинона, производного тиазолидина, тиазолидина, бензанилида, ингибитора хеликазы, ингибитора полимеразы, нуклеотидного аналога, глиотоксина, церуленина, антисмыслового фосфоротиоатного олигодезоксинуклеотида, ингибитора IRES-зависимой трансляции и рибозима.

32. Способ по п.31, где второе средство выбрано из группы, состоящей из пегилированного интерферона-альфа 2а, интерферона альфакона-1, природного интерферона, альбуферона, интерферона бета-1a, омега-интерферона, интерферона-альфа, интерферона-гамма, интерферона-тау, интерферона-дельта и интерферона-γ-1b.

33. Способ по п.32, где второе средство представляет собой рибавирин.

34. Способ по п.33, где соединение 1 вводят в количестве от приблизительно 1 мг/сутки до приблизительно 150 мг/сутки и вводимое количество рибавирина составляет от приблизительно 800 мг до приблизительно 1400 мг.

35. Способ по п.34, где вводимое количество рибавирина составляет приблизительно 800 мг, 1000 мг, 1200 мг или 1400 мг.

36. Способ по любому из пп.27-35, где вирус представляет собой вирус гепатита С.

37. Способ по любому из пп.27-36, где хозяином является человек.

38. Фармацевтическая композиция для лечения хозяина, инфицированного вирусом Flaviviridae, содержащая соединение по любому из пп.22-26 и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.

39. Композиция по п.38, где композиция представляет собой оральный состав.

40. Фармацевтическая композиция для лечения хозяина, инфицированного вирусом Flaviviridae, содержащая соединение 1 в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 150 мг.

41. Фармацевтическая композиция по п.40, где количество составляет приблизительно 5 мг или 25 мг.

42. Композиция по п.41, где композиция представляет собой оральную капсулу.

43. Способ получения соединения 1, включающий i) реакцию 2'-С-метилгуанозина с сульфатом натрия и бензолбороновой кислотой с получением соединения формулы 10-2

ii) реакцию соединения формулы 10-2 с фосфонатом формулы 10-3

с последующей реакцией с бензиламином с получением соединения 10-4 и

iii) удаление защитной группы из соединения 10-4 с получением соединения 1.