RU2519765C1 - Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения - Google Patents
Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2519765C1 RU2519765C1 RU2012154532/15A RU2012154532A RU2519765C1 RU 2519765 C1 RU2519765 C1 RU 2519765C1 RU 2012154532/15 A RU2012154532/15 A RU 2012154532/15A RU 2012154532 A RU2012154532 A RU 2012154532A RU 2519765 C1 RU2519765 C1 RU 2519765C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peg
- plasma
- mixture
- human
- stage
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 22
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001494 anti-thymocyte effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 abstract 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 abstract 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 27
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N Acrinol Chemical compound CC(O)C(O)=O.C1=C(N)C=CC2=C(N)C3=CC(OCC)=CC=C3N=C21 IYLLULUTZPKQBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 2
- 208000021657 Birth injury Diseases 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 231100000355 lymphocytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001391 lymphocytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 229940116879 thymocyte immunoglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения, включающего иммунизацию животных клетками вилочковой железы человека, истощение полученной иммунной плазмы обработкой ее человеческой плазмой АВ(IV) группы, 3-этапное фракционирование белков плазмы полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), удаление из фракционированной смеси антител к нелимфоидным антигенам последовательной двукратной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и однократной обработкой концентратом тромбоцитов всех четырех групп крови, очистку целевого продукта путем осаждения ПЭГ-6000, растворение полученных иммуноглобулинов в физиологическом растворе, добавление глицина и осветляющую и стерилизующую фильтрацию. Изобретение обеспечивает улучшение качества готового продукта за счет максимального снижения примесей антител к нелимфоидным элементам крови, а также упрощение технологии за счет исключения дополнительного центрифугирования. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммунобиологических лекарственных препаратов, используемых для внутривенного введения при коррекции иммунодефицитных состояний различного генеза.
Известен способ извлечения иммуноглобулинов из биологических жидкостей путем их пропускания через макропористый сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий группы несимметричных диметилэтилен-бис-аммониевых оснований /SU 1121619, G01N 33/50, 1984/.
Недостатками указанного способа являются его трудоемкость и невысокая степень очистки конечного продукта.
Запатентованы способы получения антитимоцитарного иммуноглобулина из сыворотки крови иммунизированный животных, включающие анионообменную и аффинную хроматографию, осаждение сульфатом натрия, обессоливание и концентрирование с помощью диализа и диафильтрации /US 4541953, C07K 16/28, 1985/, /WO 2006/064373, A C07K 16/00, 2010/, /US 7528240, C07K 1/18, 2009/. При всех достоинствах методов они не лишены недостатков в виде необходимости приобретения дорогостоящего оборудования, введения дополнительных стадий (хроматография, диализ, диафильтрация), приводящих к значительному увеличению продолжительности производственного цикла, что может негативно влиять на сохранность специфической активности конечного продукта, и к существенным дополнительным финансовым затратам.
Известен способ приготовления антитимоцитарного глобулина, основанный на получении препарата из плазмы крови иммунизированных животных (коз, кроликов, лошадей) путем фракционирования ее риванолом (для освобождения от балластных белков) с последующей адсорбцией гетероагглютининов плазмы на эритроцитах человека и доочисткой полупродукта с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000 /RU 2178309, A61K 39/395, 2002/. Главными недостатками этого метода являются трудоемкость процесса фракционирования риванолом и необходимость дальнейшей очистки полупродукта от этого реагента. Кроме того, производство риванола в России прекращено, стоимость зарубежного реактива очень высока.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения из иммунной плазмы крови животных (например, коз, кроликов, лошадей) после иммунизации их клетками вилочковой железы эмбрионов человека /RU 2264826, A61K 39/395, 2005/. Метод основан на истощении иммунной плазмы белками плазмы АВ (1У) группы крови человека, последующем фракционировании с использованием ПЭГ-6000 и -20000, истощении полупродукта клеточными компонентами смеси всех четырех групп крови человека и очистки целевого продукта с помощью ПЭГ-6000.
Основными недостатками этого метода являются:
1) трудоемкость приготовления и нетехнологичность использования рабочих растворов ПЭГ-20000 ввиду их высокой вязкости и, следовательно, плохой текучести;
2) длительность фракционирования на этапе осаждения высокомолекулярных белков;
3) отсутствие коммерческого реагента ПЭГ-20000 в больших дозировках, необходимых для промышленного использования.
Задачей данного изобретения является получение высокоочищенного ареактогенного препарата антитимоцитарного иммуноглобулина (АТГ) для внутривенного введения лишенного указанных недостатков.
Технический результат заключается в улучшении качества готового продукта за счет максимального снижения примесей антител к нелимфоидным элементам крови, а также в упрощении технологии за счет исключения дополнительного центрифугирования.
Для решения поставленной задачи, а также для достижения заявленного технического результата предлагается способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения, включающий иммунизацию животных клетками вилочковой железы человека, истощение полученной иммунной плазмы обработкой ее человеческой плазмой АВ (1У) группы, 3-этапное фракционирование белков плазмы полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), удаление из фракционированной смеси антител к нелимфоидным антигенам последовательной двукратной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и однократной обработкой концентратом тромбоцитов всех четырех групп крови, очистку целевого продукта путем осаждения ПЭГ-6000, растворение полученных иммуноглобулинов в физиологическом растворе, добавление глицина и осветляющую и стерилизующую фильтрацию. Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что на втором этапе фракционирования удаление высокомолекулярных белков производят осаждением их ПЭГ-6000, а на стадии удаления антител к нелимфоидным элементам крови производят двухкратную абсорбцию полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1:0,125-0,15 с первой экспозицией 18-23 минуты и второй экспозицией 28-33 минуты с последующей абсорбцией тромбоцитами в соотношении 2,5-3,0 мл на 1 литр исходной плазмы.
Дополнительно предлагается удаление высокомолекулярных белков плазмы проводить при рН 5,4-5,6.
Также дополнительно предлагается на стадии удаления высокомолекулярных белков использовать ПЭГ-6000 в конечной концентрации 2,5-2,6 об/об.
Применение ПЭГ-6000 для удаления высокомолекулярных белков, наряду с использованием двухкратной абсорбции полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1:0,125-0,15 с первой экспозицией 18-23 минуты и второй экспозицией 28-33 минуты с последующей абсорбцией тромбоцитами в соотношении 2,5-3,0 мл на 1 литр исходной плазмы позволяет, с одной стороны, практически полностью исключить примеси антител к нелимфоидным элементам крови, а с другой стороны, упростить технологию получения готового продукта за счет исключения дополнительного центрифугирования. Таким образом, достигается основной технический результат. В качестве дополнительного технического результата можно указать на то, что предлагаемый способ позволяет получить АТГ, полностью соответствующий требованиям, предъявляемым к аналогичным препаратам для внутривенного введения в промышленных масштабах для последующего применения при предупреждении и лечении кризов отторжения трансплантатов органов, в частности почек, печени, для лечения апластической анемии, аутоиммунных заболеваний, а также в качестве иммуномодулятора (в ультранизких дозах) для лечения гнойно-воспалительных состояний.
Способ осуществляется следующим образом. Многократно иммунизируют животных, например коз, кроликов, лошадей, взвесью клетками вилочковой железы человека, взятой от плода человека, погибшего в результате асфиксии или родовой травмы. При первой иммунизации используют полный адъювант Фрейнда. Спустя 2 недели после последней иммунизации, проводят эксфузию крови животных-продуцентов в контейнеры с гемоконсервантом для предотвращения гемолиза эритроцитов и последующее отделение иммунной плазмы, содержащей антитимоцитарный иммуноглобулин, центрифугированием. Плазму хранят при температуре -20°С и ниже до дальнейшего использования. На стадии фракционирования замороженную плазму оттаивают и добавляют к ней плазму донорской крови человека АВ (IV) группы в соотношении 20-25:1-1,5, соответственно. Затем проводят 3-этапное фракционирование плазмы крови ПЭГ-6000 в следующих условиях:
- на 1 этапе осаждают целевой продукт с помощью ПЭГ-6000, вносимого до конечной концентрации 10-12% (вес/об) при рН 7,0-7,2, с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут на центрифуге;
- на 11 этапе осадок, полученный на первом этапе, суспендируют в дистиллированной воде, доводят рН взвеси до 5,4-5,6, добавляют ПЭГ-6000 до концентрации 2,5-2,6% и отделяют осадок высокомолекулярных белков центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, осадок выбрасывают;
- на 111 этапе к надосадочной жидкости при рН в 7,0-7,2 добавляют ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугируют, растворяют осадок иммуноглобулинов в физиологическом растворе.
На IV этапе проводят сорбцию - антитела к эритроцитам и тромбоцитам в полупродукте удаляют двукратно смесью эритроцитов (в соотношении 1:0,125-0,15 об/об) и однократно смесью тромбоцитов (в соотношении 2,5-3,0 мл/л полупродукта) четырех групп крови человека и центрифугируют.
На V этапе окончательную очистку целевого продукта производят с помощью ПЭГ-6000, добавляя его до конечной концентрации 10-12% (вес/об) при рН 7,0-7,2. Взвесь центрифугируют при 3000-3500 об/мин в течение 10-15 минут.
На VI этапе осадок белков, представляющий собой иммуноглобулины (не менее 90%) класса G и М, растворяют в физиологическом растворе и добавляют в качестве стабилизатора глицин (15-25 г/л растворенного белка), затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, разлив и последующую лиофилизацию. Целевой продукт перед использованием растворяют в физиологическом растворе.
Пример 1. Здоровых коз обоего пола в возрасте 1-3 года весом 18-30 кг 6-кратно иммунизируют взвесью клеток, полученных из вилочковых желез трупов новорожденных детей, погибших в результате асфиксии или родовой травмы. При первой иммунизации животных антиген вводят одновременно с полным адьювантом Фрейнда. Смесь, состоящую из 2 мл взвеси клеток вилочковой железы человека в концентрации 3×108 и 2 мл адьюванта, вводят козам внутримышечно по 1 мл в четыре точки. Через две недели проводят 5 последующих иммунизаций с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови в контейнеры с гемоконсервантом, что исключает гемолиз эритроцитов. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием и хранят в морозильнике при -20°С и ниже до использования. Перед стадией фракционирования размороженную плазму обрабатывают плазмой крови человека АВ (IV) группы, добавляя последнюю в соотношении 25:1,5. Смесь непрерывно перемешивают в течение не менее 30 минут.
Затем проводят фракционирование иммунной козьей плазмы с применением ПЭГ-6000 в следующих условиях:
- доведение рН смеси до 7,0-7,2, осаждение полупродукта с помощью ПЭГ-6000, вносимого до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием при 3000 об/мин;
- суспендирование осадка в дистиллированной воде;
- снижение рН до 5,5, добавление ПЭГ-6000 до конечной концентрации 2,6%, центрифугирование при тех же условиях для удаления высокомолекулярных белков;
- доведение в надосадочной жидкости рН до 7,0-7,2, добавление ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугирование, удаление надосадочной жидкости с полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов в физиологическом растворе, доведение рН до 7,2-7,4.
Проводят сорбцию полупродукта для освобождения от антител к нелимфоидным антигенам. В полупродукт вносят смесь донорских отмытых эритроцитов четырех групп крови человека. Суспензию отмытых эритроцитов добавляют к полупродукту в соотношении 0,125:1 (об/об), непрерывно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре, смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10°С, осадок клеточной суспензии выбрасывают, затем повторно к надосадочному раствору добавляют отмытые эритроциты в том же соотношении, в течение 30 минут производят тщательное непрерывное перемешивание и центрифугируют при тех же условиях. К раствору полупродукта добавляют тромбоциты человека из расчета 2,5 мл/л исходной плазмы, оставляют на 45-минутный контакт при комнатной температуре и периодическом перемешивании, после чего центрифугируют 20 мин при 3900 об/мин при температуре 7±3°С. Надосадочную жидкость собирают в стерильную посуду и проводят очистку и выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят до конечной концентрации 11% при непрерывном перемешивании в течение 30 мин. Потом смесь центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, надосадочный раствор удаляют, а к осадку белка добавляют при перемешивании физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. Содержание общего белка в полупродукте, определяемое, например, биуретовым методом, составляет 15-50 мг/мл. На следующем этапе добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 25 г/л растворенного белка, доводят рН до 7,3-7,5, а затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата через мембранные фильтры типа "Миллипор" с соответствующими размерами пор, разлив препарата в ампулы или флаконы, его лиофилизацию и последующую укупорку.
В одной ампуле целевого продукта объемом 3-5 мл содержится 50-250 мг белка, который при контроле методом электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках на 90% и более состоит из иммуноглобулинов (преимущественно IgG и IgM). Такая степень очистки соответствует национальным и международным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Препарат не содержит консервантов и антибиотиков, его активность в лимфоцитотоксическом тесте составляет не менее 1:1024.
Пример 2. Кроликов весом 2,5-3 кг иммунизируют 6-кратно взвесью клеток вилочковой железы человека в концентрации 1,5×108, как описано в примере 1. Через две недели после первой иммунизаций проводят 5 последующих иммунизации с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному внутримышечно вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови с гемоконсервантом. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием в условиях стерильного бокса. Затем полученную плазму обрабатывают плазмой крови человека в соотношении 20:1. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для контакта. Затем проводят фракционирование плазмы крови ПЭГ-6000 в следующих условиях:
- рН 7,0-7,2, осаждение полупродукта с помощью ПЭГ-6000, вносимого в объемном соотношении до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием;
- суспендирование осадка в дистиллированной воде;
- снижение рН до 5,6, добавление ПЭГ-6000 до объемной концентрации 2,5%, центрифугирование и отделение осадка высокомолекулярных белков;
- доведение в надосадочной жидкости рН до 7,0-7,2, добавление ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугирование, удаление надосадочной жидкости с полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов в физиологическом растворе. Для освобождения полупродукта от антител к нелимфоидным антигенам вносят донорскую эритроцитарную массу и концентраты тромбоцитов четырех групп крови человека. Смесь отмытых эритроцитов добавляют к полупродукту в соотношении 0,15:1 (об/об). После непрерывного перемешивания в течение 20 мин при комнатной температуре смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10°С, осадок выбрасывают. Проводят повторную сорбцию полупродукта смесью эритроцитов в таком же соотношении с экспозицией 30 мин. Затем к надосадочному раствору добавляют смесь тромбоцитов четырех групп крови человека из расчета 3 мл на 1 л исходной иммунной плазмы. Смесь инкубируют при периодическом перемешивании и комнатной температуре в течение 45 мин, после чего центрифугируют. Надосадочный раствор собирают в стерильную посуду, производят очистку и выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят до конечной концентрации 11% (вес/об), проводят непрерывное перемешивание в течение 30 мин и потом центрифугируют. Надосадочный раствор удаляют, а к осадку белка при непрерывном перемешивании добавляют физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. На следующем этапе к растворенному осадку добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 20 г/л растворенного осадка и доводят рН до 7,3-7,5, а затем проводят операции, как описано в примере 1. Активность целевого продукта в ЛЦТТ составляет не менее 1:1024.
Пример 3. Лошадей в возрасте 1-2 лет иммунизируют 6-кратно взвесью клеток вилочковой железы человека в концентрации 1×1010, как описано в примере 1. Иммунную плазму заготавливают, как описано в примерах 1, 2, и истощают плазмой крови человека в соотношении 20:1. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для контакта.
Затем проводят фракционирование плазмы крови ПЭГ-6000 в следующих условиях:
- рН 7,0-7,2, осаждение полупродукта с помощью ПЭГ-6000, вносимого в объемном соотношении до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием;
- растворение осадка в дистиллированной воде;
- снижение рН до 5,4, добавление ПЭГ-6000 до объемной концентрации 2,5%, центрифугирование и отделение осадка высокомолекулярных белков;
- доведение в надосадочной жидкости рН до 7,0-7,2, добавление ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугирование, удаление надосадочной жидкости с полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов в физиологическом растворе.
Для освобождения полученного полупродукта от антител к нелимфоидным антигенам вносят последовательно донорские отмытые эритроциты и затем концентраты тромбоцитов смеси четырех групп крови человека. Проводят двухкратную абсорбцию полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1:0,15 (об/об) при условиях, указанных в примерах 1 и 2. К полученному после второй абсорбции надосадочному раствору добавляют тромбоциты человека из расчета 3,5 мл на 1 л исходной плазмы. Смесь инкубируют при комнатной температуре 45 мин, после чего проводят центрифугирование в течение 10 мин при 3900 об/мин при 10°С. Надосадочный раствор собирают в стерильную посуду и затем проводят выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят до конечной концентрации 12%. После непрерывного перемешивания в течение 30 мин проводят центрифугирование в течение 10 мин при 3000 об/мин. К осадку белка добавляют физиологический раствор и перемешивают до полного растворения осадка. На следующем этапе к растворенному белку добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 25 г/л и доводят рН до 7,3-7,5. Все последующие операции проводят, как описано в примерах 1 и 2. Активность целевого продукта в ЛЦТТ составляет не менее 1:1024.
Claims (3)
1. Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения, включающий иммунизацию животных клетками вилочковой железы человека, истощение полученной иммунной плазмы обработкой ее человеческой плазмой АВ(IV) группы, 3-этапное фракционирование белков плазмы полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), удаление из фракционированной смеси антител к нелимфоидным антигенам последовательной двукратной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и однократной обработкой концентратом тромбоцитов всех четырех групп крови, очистку целевого продукта путем осаждения ПЭГ-6000, растворение полученных иммуноглобулинов в физиологическом растворе, добавление глицина и осветляющую и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что на втором этапе фракционирования удаление высокомолекулярных белков производят осаждением их ПЭГ-6000, а на стадии удаления антител к нелимфоидным элементам крови производят двухкратную абсорбцию полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1 : 0,125 - 0,15 с первой экспозицией 18-23 минуты и второй экспозицией 28-33 минуты с последующей абсорбцией тромбоцитами в соотношении 2,5-3,0 мл на 1 литр исходной плазмы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление высокомолекулярных белков плазмы проводят при рН 5,4-5,6.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии удаления высокомолекулярных белков используют ПЭГ 6000 в конечной концентрации 2,5-2,6 об/об.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012154532/15A RU2519765C1 (ru) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012154532/15A RU2519765C1 (ru) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2519765C1 true RU2519765C1 (ru) | 2014-06-20 |
Family
ID=51216819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012154532/15A RU2519765C1 (ru) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2519765C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2178309C2 (ru) * | 2000-01-12 | 2002-01-20 | Российский научно-исследовательский институт геронтологии | Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения |
| RU2264826C1 (ru) * | 2004-12-30 | 2005-11-27 | Голубева Вера Леонидовна | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения |
-
2012
- 2012-12-17 RU RU2012154532/15A patent/RU2519765C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2178309C2 (ru) * | 2000-01-12 | 2002-01-20 | Российский научно-исследовательский институт геронтологии | Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения |
| RU2264826C1 (ru) * | 2004-12-30 | 2005-11-27 | Голубева Вера Леонидовна | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARSH JC., et al., The role of antilymphocyte globulin in the treatment of chronic acquired bone marrow failure. Blood Rev. 1988 Sep;2(3):141-8. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2735139C2 (ru) | Полученные из лизата тромбоцитов человека внеклеточные везикулы для применения в медицине | |
| US4136094A (en) | Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin | |
| US4216205A (en) | Process of preparing a serum protein composition for intravenous application | |
| DK175473B1 (da) | Antiinflammatorisk faktor, fremgangsmåde til isolation og anvendelse heraf | |
| US20080299212A1 (en) | Pharmaceutical Composition for Treating Avellino Cornea Dystrophy Comprising Blood Plasma or Serum | |
| CN115768789A (zh) | 用于获得包含人血浆来源的免疫球蛋白m的组合物的方法 | |
| RU2519765C1 (ru) | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения | |
| RU2178309C2 (ru) | Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения | |
| ES2474740T3 (es) | Sistema para obtener inmunoglobulina a partir de sangre | |
| JPH0585529B2 (ru) | ||
| NO137861B (no) | Fremgangsm}te til fremstilling av meget l¦selig gafremgangsmaate til fremstilling av meget loeselig mmaglobulin gammaglobulin | |
| RU2264826C1 (ru) | Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения | |
| US4541953A (en) | Preparation of anti-T-lymphocyte globulin | |
| CN116322920A (zh) | 使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii | |
| RU2158137C1 (ru) | Способ получения иммуноглобулинового препарата | |
| RU2348429C2 (ru) | Иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения | |
| CN110787187B (zh) | 一种增强记忆力和提高认知功能的血浆混合物及其制备方法和应用 | |
| CN114249812A (zh) | 一种降低vWF制品中IgM含量的方法 | |
| RU2255766C2 (ru) | Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций, иммуноглобулиновый препарат для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций (варианты) и суппозитории на основе иммуноглобулинового препарата | |
| RU2000100565A (ru) | Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения | |
| RU2287345C2 (ru) | Средство для стимуляции выработки фактора viii свертывания крови | |
| RU2799637C1 (ru) | Способ получения биологически активного пептидно-аминокислотного препарата на основе плазмы крови человека | |
| US20250281530A1 (en) | Methods of preparing cohn pool concentrate from blood plasma through ultrafiltration | |
| RU2324495C1 (ru) | Способ получения препарата фактора свертывания viii крови человека | |
| EA043526B1 (ru) | Способ получения иммуноглобулина g для внутривенного введения |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191218 |