RU2518304C2 - ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ - Google Patents
ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2518304C2 RU2518304C2 RU2012125394/10A RU2012125394A RU2518304C2 RU 2518304 C2 RU2518304 C2 RU 2518304C2 RU 2012125394/10 A RU2012125394/10 A RU 2012125394/10A RU 2012125394 A RU2012125394 A RU 2012125394A RU 2518304 C2 RU2518304 C2 RU 2518304C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- agar
- helicobacter pylori
- phase
- incubator
- liquid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 title claims description 21
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 title claims description 21
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 title abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000007382 columbia agar Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000007259 schaedler broth Substances 0.000 claims abstract 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 26
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 21
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 18
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 12
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- XKVYZLLWKHGKMT-BEJOYRPXSA-N Gemin D Natural products O([C@@H]([C@@H](O)C=O)[C@@H]1[C@@H](O)COC(=O)c2c(c(O)c(O)c(O)c2)-c2c(O)c(O)c(O)cc2C(=O)O1)C(=O)c1cc(O)c(O)c(O)c1 XKVYZLLWKHGKMT-BEJOYRPXSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 claims description 3
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 claims description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930192479 gemin Natural products 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010054272 Helicobacter gastritis Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000007756 Ham's F12 Nutrient Mixture Substances 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001274961 Rubus repens Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000224526 Trichomonas Species 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 235000019220 whole milk chocolate Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине. Способ предусматривает предварительный посев исследуемого материала на Колумбия агар с добавлением 5% крови барана. Термостатируют в микроаэрофильных условиях в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности. Производят отбор колоний и пересевают их на чашки Петри с шоколадным агаром и термостатируют в микроаэрофильных условиях в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности. По завершении стадии термостатирования чашки Петри с шоколадным агаром заливают сверху жидкой питательной средой на основе бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота с последующим термостатированием их в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 72 часов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине.
Открытие H.pylori в 1982 году явилось отправной точкой в формировании новой концепции этиологии гастродуоденальных заболеваний. В настоящее время общепринятым фактом является роль Н. pylori в патогенезе хронического гастрита. В 1990 году эти бактерии официально включены в международную классификацию как хеликобактерный гастрит или гастрит, ассоциированный с хеликобактериозом, гастрит типа В. С инфицированием H.pylori ассоциировано около 70-80% случаев гастритов, более 70% случаев язвенной болезни желудка, 90% язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, повышен риск развития рака желудка и B-клеточной лимфомы. В научных докладах последних лет активно обсуждается вопрос о связи H.pylori с внежелудочными проявлениями (заболеваниями кишечника, гепатобилиарной системы, поджелудочной железы), а также поражениями сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата, кожи и т.д.
Для правильной и своевременной постановки диагноза хеликобактериоза разработано множество методов, сгруппированных с использованием нескольких параметров для классификации. В зависимости от цели, материала, техники исполнения их подразделяют на скрининговые и подтверждающие; инвазивные и неинвазивные; прямые и косвенные. Одним из методов лабораторной диагностики H.pylori-инфекции является бактериологическое исследование - выделение, идентификация, изучение биологических свойств возбудителя. Трудоемкость и сложность выделения культуры H.pylori ограничивают применение этого метода в практике практического здравоохранения, но он остается единственным для фенотипического определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам.
Для культивирования H.pylori предложены различные питательные среды, обязательными компонентами которых являются базовый агар, ростовые добавки, а для селективных - ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры. Большинство базовых агаров удовлетворяют требованиям, предъявляемым для культивирования H.pylori, например колумбийский агар, эритрит агар, сердечно-мозговой агар. H.pylori очень прихотливый микроорганизм, требующий дополнительных факторов роста (витаминов, микроэлементов) [1]. Обязательным компонентом среды должна быть добавка 5-10% крови или сыворотки животных (лошади, барана). Использование крови человека ограничено наличием у большинства взрослого населения защитных антител, способных ингибировать рост H.pylori [2]. При этом эритроциты могут быть лизированы, чтобы ростовые вещества могли быть использованы быстрее, что достигается при применении шоколадного агара. Разработана питательная среда, не содержащая сыворотку и ткани животных -SATFM (serum - animal tissue - free medium), которая может быть использована как для выделения чистой культуры (плотная), так и для транспортировки (полужидкая) с разницей в процентном содержании агара [3]. Н.В.Сафоновой и А.Б.Жебруном (1995) предложена среда, приготовленная на основе эритрит-агара, в которую ех tempore вносят кровь, гемин и селективную добавку [4]. М.М.Меджидовым и коллегами (2000) разработан хеликобактер-агар, содержащий селективную добавку, состоящую из антибактериальных и противогрибковых препаратов, и кровь, вносимые ex tempore [5]. А.Б.Жебрун с коллективом авторов (2002) рекомендуют использовать в качестве основы питательной среды колумбийский агар или сердечно-мозговой агар с добавлением 5-7% лошадиной сыворотки или 5-7% дефибринированной лошадиной крови и 1% раствора изовиталекса [6]. Наиболее близким к заявляемому является способ культивирования H.pylori на шоколадном агаре, приготовленном на основе среды Колумбия агар с добавлением 2,5% донорской крови. Затем к охлажденной до 50°С питательной среде авторы предлагают добавлять 2,5% гемолизированной донорской крови. Способ обеспечивает более быстрое культивирование на более дешевой среде, но не лишен ряда недостатков [7]. Недостатком прототипа на взгляд авторов является использование донорской крови, что может снижать частоту высеваемости из-за наличия в донорской крови антител к H.pylori, оказывающих ингибирующее действие. Особенно остро стоит проблема при получении чистой культуры, когда после пересева изолированных колоний для выделения чистой культуры вырастают единичные колонии, и биологического материала оказывается недостаточно для идентификации и постановки антибиотикограммы.
Недостатком способов культивирования на твердых питательных средах является:
- невысокая эффективность высеваемости хеликобактеров при первичной изоляции,
- при дальнейших пересевах для получения чистых культур штаммы теряются, всхожесть ослабевает и утрачивается,
- скудность роста чистых культур приводит к невозможности определения чувствительности выделенного штамма к антибиотикам и химиопрепаратам.
Проблему накопления культуры можно решить с помощью использования жидких сред. Сходный с твердыми средами состав (основы, ростовые и селективные добавки) используется и в жидких средах, хотя процесс культивирования более трудоемок и в практических лабораториях не нашел широкого применения [8]. Предложены различные основы жидких сред: Brucella - бульон, сердечно-мозговой бульон, соевый бульон с ростовыми добавками (сыворотка, дрожжевой экстракт, циклодекстрин и другие) и антимикробными препаратами (ванкомицин, налидиксовая кислота, амфотери[9; 10]. Предложена среда, имеющая постоянный состав витаминов и микроэлементов без добавления сыворотки - serum - free Ham's F-12 [11]. При росте на жидких питательных средах бактерии имеют типичную извитую форму, подвижны и биохимически активны, полноценны в антигенном отношении [12]. H.pylori растет в микроаэрофильной атмосфере, состоящей из 5% О2, 5-10% СО2, 85-90% N2. Различные системы могут быть использованы для создания микроаэрофильных условий. Среди них - микроаэробный бокс или инкубатор, в котором адекватная атмосфера поддерживается автоматически. Такую атмосферу можно создать в микроанаэростате типа GasPac 100 или GasPac 150 Anaerobic Systems фирмы BBL с использованием газогенераторных пакетов типа СатруРас фирмы BBL или Oxoid, которые начинают продуцировать газовые смеси при добавлении воды, которая также создает необходимую для роста H.pylori влажность. Но при культивировании в жидкой среде сложность может представлять создание и поддержание микроаэрофильных условий. Эта задача может быть решена постоянным контролированием микроаэробной атмосферы в пробирках путем перемешивания на специальных платформах под углом 20° со скоростью вращения 120 оборотов в минуту [13] или культивирования во флаконах с отверстиями для доступа газов, для чего разработаны мини-биореакторы для принудительного введения в атмосферу культивирования углекислого газа через трубки, погруженные во флаконы с жидкой питательной средой [14].
Недостатки способов культивирования на жидких питательных средах:
- сложность создания и поддержания микроаэрофильных условий в жидких питательных средах,
- необходимость использования дополнительного оборудования (шейкеров, вращательных платформ, биореакторов и т.д.) для принудительного введения углекислого газа.
Задачей изобретения является разработка способа тонкослойного культивирования Helicobacter pylori с использованием двухфазной питательной среды, доступного для бактериологических лабораторий, не оснащенных специальным оборудованием. Достигаемый технический результат заключается в отсутствии необходимости использования дополнительного оборудования для поддержания микроаэрофильных условий в жидкой фазе среды, использовании стандартных питательных сред (Колумбия агара и бульона Шедлера) и в том, что происходит накопление чистой культуры H.pylori в количестве, достаточном для морфологической, биохимической идентификации и постановки антибиотикограммы.
Некоторые микроорганизмы с трудом удается выращивать на твердых или жидких питательных средах, но они гораздо более активно растут и размножаются в двухфазных питательных средах, состоящих из комбинации твердой и жидкой фаз. Возможным объяснением может быть то, что подобные питательный среды создают условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть жизненного цикла микроба требует твердой питательной среды, а другие стадии жизненного цикла проходят в жидкой питательной среде. Это, в частности, свойственно эпителиальным патогенам, к которым относится H.pylori, частично размножающимся к клетках слизистых оболочек, а частично - на поверхности слизистой в просвете органа. При этом состав компонентов жидкой и твердой фазы питательной среды определяется особенностями биологии конкретного микроорганизма.
Так, патентом РФ №2272834 (15) защищена питательная двухфазная среда для выделения одноклеточных микроорганизмов - трихомонад. Патентом РФ №2412991(16) защищена двухфазная питательная среда для культивирования криптоспоридий, а патент РФ №2346052 (17) предлагает двухфазную питательную среду для выделения бруцелл.
Авторы заявляемого изобретения предлагают следующий состав питательной среды. Двухфазная питательная среда состоит из двух фаз: твердой и жидкой. Твердая фаза представляет собой шоколадный агар, приготовленный на основе Колумбия агара с 5% крови барана.
Состав Колумбия агара:
| Ингредиенты | грамм/лит Р |
| Биопептон | 20,00 |
| Триптический перевар говяжьего сердца | 3,00 |
| Крахмал кукурузный | 1,00 |
| Натрия хлорид | 5,00 |
| Агар-агар | 15,00 |
| Конечное значение рН (при 25°С) 7,3±0,2 |
Приготовление:
Размешать 44,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50°С и асептично внести стерильную дефибринированную кровь барана (5% от общего объема). Агар слегка подогревают на слабом огне, не доводя до кипения. Тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри по 14 мл. При приготовлении шоколадного агара следует обратить особое внимание на правильный подогрев: правильно приготовленный агар имеет светло-коричневую окраску схожую с цветом молочного шоколада. При слишком слабом подогреве агар будет иметь кирпично-красный цвет, а при сильном - темно-коричневый.
Преимущества используемой твердой фазы
Колумбия агар отличается разнообразием включенных в рецептуру среды источников белкового питания. Комбинация пептонов обеспечивает на ней быстрый и обильный рост очень прихотливых микроорганизмов. В результате приготовления шоколадного агара из эритроцитов экстрагируются гемин, НАД, и ростовые факторы гемофильными и прихотливыми бактериями, в том числе и H.pylori, используются быстрее.
Жидкая фаза представляет собой бульон Шедлера, обогащенный 10% сывороткой крупного рогатого скота.
Состав бульона Шедлера:
| Ингредиенты | грамм/лит Р |
| Гидролизат казеина | 5,67 |
| Протеозопептон | 5,00 |
| Папаиновый перевар соевой муки | 1,00 |
| Дрожжевой экстракт | 5,00 |
| Глюкоза | 5,83 |
| Натрия хлорид | 1,67 |
| Калия гидрофосфат | 0,83 |
| Трис (гидроксиметиламинометан) | 3,00 |
| L-Цистин | 0,40 |
| Гемин | 0,01 |
| Конечное значение рН (при 25°С) 7,6±0,2 |
Приготовление:
Размешать 28,41 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить с частым помешиванием для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить и асептично добавить до 10% от общего объема стерильной сыворотки крупного рогатого скота. Перед розливом среду тщательно перемешать. Избегать перегревания среды или ее окисления на свету, так как это приводит к задержке роста бактерий.
Преимущества используемой жидкой фазы:
Данная среда является прекрасной основой, в которую для выделения прихотливых анаэробных, в том числе и капнофильных бактерий, можно добавлять кровь или другие обогатительные добавки. Комбинация гидролизата казеина, протеозопептона, папаинового перевара соевой муки, дрожжевого экстракта и L-цистина обеспечивает присутствие азотистых питательных веществ, витаминов и других факторов, необходимых для роста микроорганизмов. Глюкоза является источником энергии. Гемин и витамин К стимулируют рост прихотливых микроорганизмов.
Авторы предлагают следующий способ тонкослойного культивирования H.pylori на двухфазной питательной среде.
1 этап. Первичный посев исследуемого материла (биоптаты слизистой оболочки желудка) производят на колумбийский агар с добавлением 5% крови барана. Термостатирование в микроаэрофильных условиях (СО2-инкубаторе) при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности.
2 этап. Оценка результатов посева. Выявление подозрительных колоний (мелкие, прозрачные диаметром 1-2 мм сходные с «капельками росы»). Пересев отобранной колонии на шоколадный агар для получения чистой культуры. Инкубирование в микроаэрофильных условиях при 37°С в течение 3-5 дней.
3 этап. Накопление чистой культуры. В случае скудного роста единичные колонии рассеивают петлей по поверхности плотной среды и заливают жидкой питательной средой, приготовленной на основе бульона Шедлера, обогащенным 10% сывороткой крупного рогатого скота. Оптимальное количество жидкой среды, наливаемой в чашку Петри диаметром 90 мм, составляет 3,5 мл (соотношение твердой и жидкой фаз 4:1). Инкубирование в микроаэрофильных условиях 37°С в течение 3 дней.
4 этап. Идентификация выделенной культуры, выросшей в жидкой фазе.
Изучение морфологических свойств. Из культуральной жидкости готовят фиксированные мазки, окрашивают по Граму и препарат «раздавленная» или «висячая капля» для определения подвижности.
Изучение биохимических свойств. Постановка тестов на каталазу, оксидазу, уреазу.
Постановка антибиотикограммы.
Таким образом, заявляемый авторами изобретения способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori предполагает использование преимущества жидкой фазы по сравнению с твердой фазой для накопления культуры, а ее тонкослойное распределение поддерживает микроаэрофильные условия в толще жидкости без дополнительного оборудования.
Литература
1. Jiang X., Doyle M.P. Growth supplements for Helicobacter pylori. // J Clin Microbiol. - 2000. - Vol.38. - P.1984-1987.
2. Westblom T.U., Madan E., Riff B.R. Improved growth of Helicobacter pylori using a liquid medium supplemented with human serum. // Ital. J. Gastroenterol. - 1991. - Vol.29(Suppl. 2). - P.48.
3. Dierikx C.M., Martodihardjo J., Kuipers E.J. et al. Serum and animal tissue free medium for transport and growth of Helicobacter pylori. // Immunol. Med. Microbiol. - 2007. - Vol.50. - P.239-243.
4. Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз. - Реком. для врачей. - Спб. - 1995.
5. Меджидов М.М., Темирханова З.У., Алиева Х.М. и др. Оценка питательной среды для выделения и культивирования Helicobacter pylori. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 2000. - №2. - С.25-29.
6. Жебрун А.Б., Александрова В.А., Гончарова Л.Б. др. Диагностика, профилактика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori-инфекцией. (Пособие для врачей). Спб., 2002.
7. Червинец В.М., Червинец Л.Ф. Патент на изобретение РФ №2145975 «Способ культивирования Helicobacter pylori». - 2000.
8. Shahamat M., Mai U.E., Paszko-Kolva С. et al. Evaluation of liquid media for growth of Helicobacter pylori. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol.29. - P.2835-2837.
9. Morshed M.G., Karita M., Konishi H. et al. Growth medium containing cyclodextrin and low concentration of horse serum for cultivation of Helicobacter pylori. // Microbiol. Immunol. - 1994. - Vol.38(11). - P.897-900.
10. Murano A., Miyake M., Kato J. et al. Enhancement of the growth of Helicobacter pylori in Brucella broth by hydrogen peroxide. // Microbiol. Immunol. - 1999. - 43(11). - P.1009-15.
11. Testerman T.L., McGee D.J., Mobley H.L.T. Helicobacter pylori growth and urease detection in the chemically defined medium Ham's F-12 nutrient mixture. // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39. - P.3842-3850.
12. Lin Y.L., Lee N., Chan E.C. Determination of optimal liquid medium for enzyme expression by Helicobacter pylori. // J. Clin. Pathol. - 1996. - Vol.49. - P.818-820.
13. Xia H.X, English L., Keane C.T. et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media. // J. Clin. Pathol. - 1993. - Vol.46(8). - P.750-753.
14. Secker D.A., Tompkins D.S., Alderson G. Gas-permeable life cell tissue culture flasks give improved growth of Helicobacter pylori in a liquid medium. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol.29. - P.1060-1061.
15. Патент РФ №2272834.
16. Патентом РФ №2412991.
17. Патент РФ №2346052.
Claims (4)
1. Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori, содержащая твердую фазу, представленную шоколадным агаром, изготовленным на основе Колумбия агара с 5% крови барана, и жидкую фазу, представляющую собой бульон Шедлера, обогащенный 10% сывороткой крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что соотношение твердой фазы к жидкой составляет 4:1 (14 мл агара и 3,5 мл бульона).
2. Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori по п.1, отличающаяся тем, что Колумбия агар содержит следующие ингредиенты в г/литр:
Ингредиенты грамм/литр
Биопептон 20,00
Триптический перевар говяжьего сердца 3,00
Крахмал кукурузный 1,00
Натрия хлорид 5,00
Агар-агар 15,00
Конечное значение рН (при 25°С) 7,3±0,2
3. Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori по п.2, отличающаяся тем, что бульон Шедлера содержит следующие ингредиенты в г/литр:
Ингредиенты грамм/литр
Гидролизат казеина 5,67
Протеозопептон 5,00
Папаиновый перевар соевой муки 1,00
Дрожжевой экстракт 5,00
Глюкоза 5,83
Натрия хлорид 1,67
Калия гидрофосфат 0,83
Трис (гидроксиметиламинометан) 3,00
L-Цистин 0,40
Гемин 0,01
Конечное значение рН (при 25°С) 7,6±0,2
4. Способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori с использованием двухфазной питательной среды по п.1, предусматривающий первичный посев исследуемого материала на Колумбия агар с добавлением 5% крови барана, термостатирование в микроаэрофильных условиях в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности, пересев отобранных колоний чашки Петри с шоколадным агаром, последующее термостатирование в микроаэрофильных условиях в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности, отличающийся тем, что после термостатирования чашки Петри с шоколадным агаром заливают сверху жидкой питательной средой на основе бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота согласно п.1 и окончательно термостатируют их в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 72 часов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012125394/10A RU2518304C2 (ru) | 2012-06-20 | 2012-06-20 | ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012125394/10A RU2518304C2 (ru) | 2012-06-20 | 2012-06-20 | ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012125394A RU2012125394A (ru) | 2013-12-27 |
| RU2518304C2 true RU2518304C2 (ru) | 2014-06-10 |
Family
ID=49785766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012125394/10A RU2518304C2 (ru) | 2012-06-20 | 2012-06-20 | ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2518304C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2678123C1 (ru) * | 2017-10-13 | 2019-01-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук | Питательная среда для восстановления численности анаэробных бактерий после низкотемпературного хранения |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114958954A (zh) * | 2018-04-18 | 2022-08-30 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 幽门螺杆菌药敏检测试剂盒和检测方法 |
| CN108424867B (zh) * | 2018-04-18 | 2021-11-26 | 深圳市伯劳特生物制品有限公司 | 组合物及含有该组合物的培养基 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2145975C1 (ru) * | 1999-07-19 | 2000-02-27 | Тверская медакадемия | Способ культивирования helicobacter pylori |
| US20020026035A1 (en) * | 1997-04-01 | 2002-02-28 | Harold Kleanthous | Helicobacter ghpo 1360 and ghpo 750 polypeptides and corresponding polynucleotide molecules |
-
2012
- 2012-06-20 RU RU2012125394/10A patent/RU2518304C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020026035A1 (en) * | 1997-04-01 | 2002-02-28 | Harold Kleanthous | Helicobacter ghpo 1360 and ghpo 750 polypeptides and corresponding polynucleotide molecules |
| RU2145975C1 (ru) * | 1999-07-19 | 2000-02-27 | Тверская медакадемия | Способ культивирования helicobacter pylori |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| (параграф 0111). SCHAEDLER BROTH (7154), Rev 06, Nov. 2010, Acumedia. [найдено онлайн] [найдено 13.02.2013 по адресу http://www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7154 PI.pdf] (весь документ). NEDENSKOV P: "Nutritional requirements for growth of Helicobacter pylori", Appl Environ Microbiol. 1994 Sep;60(9):3450-3. (стр.3452). Микробиологическая диагностика дисбактериоза кишечника. Методические рекомендации. ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Москва-2007. [найдено онлайн] [найдено 13.02.2013 по адресу http://www.himedialabs.ru/download/%C4%E8%F1%E1%E0%EA%F2%E5%F0%E8%EE%E7.%20%D0%E5%EA%EE%EC%E5%ED%E4%E0%F6%E8%E8%20%CD%C8%C8%DD%CC%20%E8%EC.%C3%E0%EC%E0%EB%E5%E8.pdf] (стр.52). * |
| (цитирован в описании изобретения) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2678123C1 (ru) * | 2017-10-13 | 2019-01-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук | Питательная среда для восстановления численности анаэробных бактерий после низкотемпературного хранения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012125394A (ru) | 2013-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101333505B (zh) | 一种干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用 | |
| CN104651268B (zh) | 一种植物乳杆菌及其应用 | |
| CN105567669B (zh) | 益生菌微胶囊制剂及其制备方法 | |
| Rouf et al. | An overview of microbial cell culture | |
| CN109321505A (zh) | 一种调节水产动物肠道的复合微生物制剂 | |
| Iheukwumere et al. | Exploring the impact of Lactobacillus-fermented chicken feather on organ weights and functions in albino Wistar rats | |
| RU2518304C2 (ru) | ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| CN101153316B (zh) | 一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测方法 | |
| Prima et al. | Isolation, Characterization and Identification of Molecular Lactic Acid is Isolated from Bilih Fish (Mystacoleucuspadangensis) Lake Singkarak Potential as a Probiotic | |
| Kusugal et al. | Coculture method for in vitro cultivation of uncultured oral bacteria | |
| RU2441907C1 (ru) | Способ приготовления лечебно-профилактического препарата из живых штаммов микроорганизмов лакто- и бифидобактерий "lb-комплекс л" | |
| WO2023273019A1 (zh) | 培养基及其制备方法、用其培养脆弱拟杆菌的方法 | |
| CN112481188A (zh) | 一种高效产β-葡萄糖醛酸酶混合菌剂的制备方法 | |
| CN104293879A (zh) | 一种发酵乳制品中菌落总数的检测方法 | |
| RU2540022C2 (ru) | Способ получения бактериального концентрата бифидобактерий в жидкой форме | |
| Zhumakayeva et al. | Microbial composition of livestock buildings is the basis for the creation of a biological preparation to stabilize the microbial background | |
| RU2660708C1 (ru) | Способ получения питательной среды для выделения гемокультуры при диагностике инфекции кровотока | |
| TW202124705A (zh) | 鏈球菌之無動物產物培養 | |
| RU2678123C1 (ru) | Питательная среда для восстановления численности анаэробных бактерий после низкотемпературного хранения | |
| CZ2018101A3 (cs) | Kmeny mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, výrobek obsahující tyto kmeny | |
| Siddhi et al. | Studies on Lactic Acid Bacteria Isolate Sr 13 From Bali Cattle Gastric | |
| CN107998153A (zh) | 基于乳酸菌和光合菌共生作用的微生态制剂及生产方法 | |
| CN117487664B (zh) | 双歧杆菌分离培养方法 | |
| CN109355226A (zh) | 用于军团菌的增菌培养和分离培养的双相培养基及其制备方法 | |
| Mousa Alobaidy et al. | Comparison between the Effect of Secondary Metabolic Products of Nutrient Medium and Modified Medium of Yeast Saccharomyces boulardii Against Different Bacterial Species. |