RU2514667C2 - Способ получения токсина actinobacillus pleuropneumoniae apxi, используя культуральную среду, содержащую комплекс кальций-бороглюконат - Google Patents
Способ получения токсина actinobacillus pleuropneumoniae apxi, используя культуральную среду, содержащую комплекс кальций-бороглюконат Download PDFInfo
- Publication number
- RU2514667C2 RU2514667C2 RU2011125925/10A RU2011125925A RU2514667C2 RU 2514667 C2 RU2514667 C2 RU 2514667C2 RU 2011125925/10 A RU2011125925/10 A RU 2011125925/10A RU 2011125925 A RU2011125925 A RU 2011125925A RU 2514667 C2 RU2514667 C2 RU 2514667C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- borogluconate
- apxi
- medium
- calcium
- culture medium
- Prior art date
Links
- 101000657454 Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-I toxin determinant A from serotypes 1/9 Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims description 15
- 229940072020 calcium borogluconate Drugs 0.000 title claims description 8
- SSKRIDIHZLFJCG-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3-dihydroxy-3-[2-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-1,3,2-dioxaborolan-4-yl]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC1OB(O)OC1C(O)C(O)C([O-])=O.OCC1OB(O)OC1C(O)C(O)C([O-])=O SSKRIDIHZLFJCG-UHFFFAOYSA-L 0.000 title claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 41
- 229940072031 borogluconate Drugs 0.000 claims abstract description 25
- KJEUMRLAKARHEP-TXICZTDVSA-N (2r,3r)-2,3-dihydroxy-3-[(4s,5r)-2-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-1,3,2-dioxaborolan-4-yl]propanoic acid Chemical compound OC[C@H]1OB(O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O KJEUMRLAKARHEP-TXICZTDVSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 11
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 13
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 13
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 11
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 5
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043430 calcium compound Drugs 0.000 description 1
- 150000001674 calcium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229910052704 radon Inorganic materials 0.000 description 1
- SYUHGPGVQRZVTB-UHFFFAOYSA-N radon atom Chemical compound [Rn] SYUHGPGVQRZVTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области микробиологии и касается способа получения RTX-токсина ApxI. Представленный способ осуществляют путем культивирования бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в культуральной среде, которая обеспечивает рост бактерий, причем указанная культуральная среда содержит бороглюконат в концентрации менее 60 ммоль/л для образования в среде комплекса кальций-бороглюконат. Изобретение позволяет повысить выход RTX-токсина ApxI, что может быть применимо при производстве вакцин. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.
Description
Изобретение относится к способу получения RTX-токсина ApxI путем культивирования бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в культуральной среде, которая обеспечивает рост бактерий, к этой среде добавляют кальциевую соль для образования в среде ионов кальция.
Плевропневмония свиней, основное респираторное заболевание свиней, распространена во всем мире и обусловливает тяжелые экономические потери в свиноводстве вследствие молниеносных смертей, лечения тяжелобольных свиней и задержки в сбыте из-за хронически инфицированных животных. Этиологическим агентом является Actinobacillus pleuropneumoniae. Она передается в основном через прямой контакт между животными, и полученная инфекция приводит к течению болезни от молниеносного до хронического. Заболевание, главным образом, представляет собой инфекцию дыхательных путей, имеющую клинические признаки высокой лихорадки, тяжелой дыхательной недостаточности, кашля и анорексии. Начало заболевания быстрое, заболеваемость и смертность высоки. Один из способов контроля инфицирования бактериями Actinobacillus pleuropneumoniae (в дальнейшем также называемыми «АРР») представляет собой программы вакцинации. В таких программах были использованы пассивированные бактерины, но известно об их тяжелых побочных действиях. В настоящее время широко используются субъединичные вакцины на основе токсинов АРР.
АРР продуцирует так называемые RTX-токсины (RTX обозначает повтор в токсине). Наличие этих RTX-токсинов вносит большой вклад в патогенную природу этой бактерии. RTX-токсины были подробно рассмотрены ранее и описаны в литературе. Как хорошо известно, не все серотипы АРР продуцируют все RTX-токсины. Например, серотипы 1, 5, 9 и 11 продуцируют ApxI и ApxII. Серотипы 2, 3, 4, 6 и 8 продуцируют ApxII и ApxIII. Серотип 10 продуцирует лишь ApxI, и серотипы 7 и 12 продуцируют лишь ApxII. Существующие на сегодняшний день коммерчески доступные вакцины против АРР основаны на токсинах ApxI, ApxII и ApxIII. Относительно недавно было обнаружено, что все серотипы АРР продуцируют четвертый RTX-токсин, в настоящее время называемый ApxIV (см. ЕР 0875574).
Широко известно, как продуцировать RTX-токсин ApxI посредством культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae в культуральной среде, в которую добавляют соль кальция (т.е. химическое соединение на основе кислоты, образованное замещением всех или части ионов водорода кислоты на один или несколько ионов кальция). В частности, ранее в ЕР 0453024 описан такой способ (см. «пример 2», абзац 2 «Очистка и характеристика гемолизина», подпункт «Способы»). Следует принять во внимание, что использованный ApxI должен обозначаться «HLY» (см. статью Frey et al. в журнале “J Gen Microbiol.”, август, 1993 г.; 139(8): 1723-8). Из этого ЕР патента известно о добавлении в среду соединения кальция (CaCl2). В действительности, в статье Microbiol Pathogenesis 37 (2004) 29-33 указано, что транскрипционная активность оперона ApxI усиливается при добавлении в ростовую среду кальция. Таким образом, могут быть обеспечены высокие уровни токсина ApxI. Среда должна поддерживать рост бактерий АРР. Хорошо известно, как составить среду, которая обеспечивает рост бактерий. Классические культуральные среды изначально разрабатывались Иглом, Хэмом и другими в 1950-60 гг. Они обнаружили, что среда, которая удовлетворяет основным потребностям роста, должна содержать неорганические соли, источник азота (например, в форме азотсодержащих соединений, таких как пептиды или белки), источник углерода и витамины. Среды преимущественно забуферивают для предотвращения их либо от закисления, либо от защелачивания. В этом основном рецепте доступно большое число различных составов. Например, для обеспечения аминокислотами можно выбрать компоненты животного происхождения, но также можно выбрать химически определенные аминокислоты. В отношении других соединений также возможно большое число вариантов. На самом деле, составить среду, которая обеспечивает рост бактерий, сравнительно просто. Тем не менее, оптимизация роста и/или получения метаболитов может потребовать некоторого времени на разработку, в частности, если предпочтительна среда, которая не содержит сыворотку или другие компоненты животного происхождения. Стратегии улучшения ферментационной среды, тем не менее, хорошо известны в данной области и подробно описаны в литературе (см., например, обзорную статью Kennedy и Krouse в журнале Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 23, 456-475). Такая оптимизация составляет часть рутинных экспериментов в лаборатории ферментации. В случае культивирования АРР, NAD (никотинамидадениндинуклеотид) по существу составляет часть среды, поскольку бактерия АРР является NAD-зависимой. В отсутствие NAD среда не будет поддерживать рост бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae и поэтому может не рассматриваться в качестве жидкой среды для поддержания роста АРР с точки зрения настоящей заявки и прилагаемой формулы изобретения. Среды для поддержания роста бактерий или компоненты для составления таких сред коммерчески доступны у большого числа фирм, таких как Sigma Aldrich, Quest International, Oxoid, Becton Dickinson, Pharmacia, VGD Inc, Mediatech, Invitrogen, Marcor, Irvin Scientific и т.д.
Несмотря на то, что способы предшествующего уровня техники достаточны для получения экономически значимого выхода токсина ApxI, заявитель понимал, что существует возможность улучшения. Именно в процессе ферментации среда становится мутной. Заслугой заявителей было осознание того, что это может быть следствием преципитации одной (или нескольких) солей кальция. Именно АРР продуцирует углекислый газ, который в среде превращается в ионы карбоната. Карбонат кальция представляет собой соль с крайне низкой растворимостью. Вследствие этого могут возникнуть некоторые проблемы. Во-первых, полагают, что преципитация отбирает вовлеченные ионы кальция, делая их недоступными для бактерий АРР. Во-вторых, преципитированные соли кальция вызывают проблемы, связанные с обработкой. В частности, фильтры имеют тенденцию забиваться. Поэтому заявитель добавил в среду большое число комплексообразующих агентов, чтобы посмотреть, могут ли они предотвратить преципитацию соли. На самом деле, например, при добавлении EDTA среда может оставаться более или менее прозрачной. Тем не менее, применение таких комплексообразующих агентов негативно влияет на получение ApxI. Таким образом предположение, по всей видимости, ошибочно или неполно. Однако все-таки есть потребность в улучшении продукции ApxI.
Неожиданно было обнаружено, что при использовании бороглюконата (например, в форме 2,3-дигидрокси-3-[2-гидрокси-5-(гидроксиметил)-1,3,2-диоксаборолан-4-ил]пропаноата; см. также статью Herbert Taylor MacPherson и James Stewart из института Моредун в Biochemical Journal: “Investigations on the nature of calcium borogluconate”, изданном 16 ноября 1937 г.) для образования комплекса с ионами кальция можно получать ApxI на высоком уровне по сравнению со способами предшествующего уровня техники, в которых не применяются (не добавляются) комплексообразующие агенты или которые основаны на других комплексообразующих агентах. Очевидно, что при использовании этого конкретного комплексообразующего агента так, что среда содержит комплекс кальций-бороглюконат (например, доступный в виде D-глюконовой кислоты, циклический 4,5-сложный эфир с борной кислотой, кальциевая соль 2:1), может быть предотвращена значительная преципитация ионов кальция с другими отрицательными ионами, в то же время ионы кальция остаются способными усиливать транскрипционную активность оперона ApxI бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae. По всей видимости, ионы кальция остаются "захваченными" в комплекс соли, где связи «захвата» с одной стороны достаточно сильны, чтобы предотвратить образование ионами кальция преципитата, например, с карбонатом или другими отрицательными ионами, но с другой стороны позволяют самой бактерии использовать ионы кальция, если они находятся в свободном растворе (т.е. образуют комплекс лишь с молекулами воды). По всей видимости, бороглюконат полностью удовлетворяет критическому равновесию, которое необходимо для продукции ApxI бактерией АРР.
В одном из вариантов осуществления концентрация бороглюконата составляет меньше 60 ммоль/л. Свыше этой концентрации обнаруживается, что продукция ApxI падает до низких уровней. Даже если это возможно, предпочтительно, чтобы концентрация оставалась ниже этой цифры. Более предпочтительно, чтобы концентрации находились в диапазоне от 25 до 45 ммоль/л, в частности 40 ммоль/л, что представляется оптимальным для некоторых сред.
Хотя это не существенно для настоящего изобретения, среда может не содержать компонентов животного происхождения. Недостаток многих способов предшествующего уровня техники заключается в том, что они основаны на применении сред, содержащих компоненты животного происхождения, таких как колумбийская питательная среда. Другие компоненты животного происхождения, упоминаемые в предшествующем уровне техники, представляют собой, например, модифицированную колумбийскую питательную среду или сердечно-мозговую инфузионную среду. Как хорошо известно, применение компонентов животного происхождения имеет несколько существенных недостатков. Во-первых, химический состав может заметно варьировать между партиями продукции. Кроме того, добавки животного происхождения могут быть контаминированы инфекционными агентами. Самое опасное - это присутствие прионов, вызывающих TSE у людей или животных. Можно просто выбрать среду, которая не содержит компонентов животного происхождения (часто обозначаемую как среда «ACF»). «Компонент животного происхождения» в этом смысле означает любой компонент, который присутствует как таковой в животном (например, кровь или белок) или происходит из такого компонента (например, модифицированная сыворотка, полученная из крови, или аминокислоты, полученные из белка). Заявитель, тем не менее, обнаружил, что эффективность продукции ApxI значительно ниже при использовании таких сред ACF по сравнению со средами, содержащими компоненты животного происхождения, даже если концентрация кальция находится на достаточном уровне. Не касаясь теории, возможно, что при использовании сыворотки проблема преципитации кальциевой соли станет не настолько тяжелой благодаря наличию агентов, которые образуют растворимые комплексы ионов кальция. В любом случае при использовании бороглюконата для образования комплекса с ионами кальция в этих средах также может быть получено существенное повышение выхода ApxI.
В другом варианте осуществления кальциевая соль представляет собой бороглюконат кальция. Хотя возможно еще, например, применение хлорида кальция в качестве источника кальция и добавление бороглюконатной соли для образования комплекса с ионами кальция, предпочтительно, чтобы кальций добавлялся в виде бороглюконатной соли. Таким образом, нет необходимости дожидаться равновесия между большим числом физических реакций (преципитацией, растворением, разрушением комплекса, образованием комплекса), которые происходят в среде. Это сберегает время и поэтому экономически выгодно.
В еще одном варианте осуществления в процессе культивирования через жидкую среду пропускают воздух, причем воздух содержит углекислый газ выше атмосферного уровня. Неожиданно было показано, что углекислый газ повышает объем продукции ApxI еще больше. Отмечено, что в основном известно о применении повышенного уровня углекислого газа во время культивирования колоний бактерий на чашках (см., например, патент США 6019984: ПРИМЕРЫ «Бактериальные штаммы и условия роста»). Тем не менее, это относится и к культивированию колоний бактерий, которые затем используются для инокуляции ферментеров. На этой стадии продукция RTX-токсинов незначительна. Еще точнее, в целом понятно (см., например, Microbial Pathogenesis 37 (2004) 29-33), что максимальная продукция Apx имеет место при высокой плотности клеток в ферментерах, то есть в конце экспоненциальной фазы роста. Понятно, что на этой стадии углекислый газ уже не подходит в качестве стимулирующего фактора. Поэтому ранее не делалось попыток повысить продукцию Apx за счет применения повышенных уровней углекислого газа. В частности, заявитель обнаружил, что при содержании в воздухе 5 об.% углекислого газа (объем чистого углекислого газа к объему обычного воздуха) продукция ApxI находится на очень высоком уровне. Отмечено, что в данном варианте осуществления для пропускания воздуха через среду могут быть использованы многие техники, обычно с помощью устройства, которое позволяет пузырькам воздуха просачиваться где-либо в среду (т.е. под поверхность среды). Под «воздухом» в контексте настоящего изобретения понимают газообразную среду, содержащую один или несколько газообразных компонентов, которые обычно присутствуют в атмосферном воздухе, таких как кислород, азот, углекислый газ, гелий, неон, аргон, ксенон, радон и т.д.
Изобретение далее дополнительно разъяснено с использованием следующих неограничивающих примеров.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Бактериальный штамм и среды
Исследования осуществляли, используя штамм Actinobacillus pleuropneumoniae, продуцирующий ApxI, серотип 10, далее в данном документе называемый АРР 10. Во всех случаях рабочий посевной материал этого штамма восстанавливали, используя чашки с основой колумбийского кровяного агара (BAB) (продукция фирмы Becton, Dickinson USA). Использованные жидкие среды представляли собой либо колумбийскую питательную среду (продукция фирмы Becton, Dickinson USA), поддерживаемую при величине рН 7,3, используя NaOH и уксусную кислоту, либо среду, не содержащую компонентов животного происхождения (называемую «средой ACF»). Последняя среда содержит MgSO4 (0,75 г/л), цистеин·HCl (0,1 г/л), FeCl3 (0,1 г/л), NaNO3 (0,1 г/л), KCl (0,1 г/л), следовые элементы (например, 2,5 мл раствора SL-10, указанного в руководстве Handbook of Microbiological Media, 3rd rdition, Ronald Atlas, CRC press, 2004), 50% раствор глюкозы (10 мл) и 10 мМ раствор аминокислот (содержащий все 20 аминокислот, за исключением триптофана), буфер HEPES (6 г/л; например, доступный от фирмы Sigma Aldrich) и дрожжевой экстракт (10 г/л; например, доступный от Becton, Dickinson).
Эти среды использовали в прекультивировании и ферментации. Никотинамидадениндинуклеотид (0,01%) и кальций (в различных концентрациях) использовали в прекультурах и ферментациях. Все среды стерилизовали фильтрацией с диаметром пор 0,22 мкм. Перед использованием в ферментациях среды нагревали при 85°С в течение одной минуты.
Культивирование
Рабочий посевной материал штамма АРР 10 высевали на чашку с колумбийским агаром ВАВ и инкубировали в течение приблизительно 24 часов при 37°С. Несколько колоний отбирали для инокуляции сосуда объемом 500 мл, содержащего 75 мл колумбийской питательной среды. Сосуд инкубировали в течение приблизительно 6 часов при 37°С при встряхивании для образования прекультуры. Посредством этой прекультуры осуществляли несколько ферментаций. Некоторые из них осуществляли в сосудах объемом 500 мл. В этом случае 75 мл среды инокулировали 1 мл прекультуры. Сосуды инкубировали при 37°С при встряхивании. Альтернативно культивирование осуществляли в ферментерах SIXFORS (продукция фирмы Infors AG, Switzerland), содержащих приблизительно 400 мл культуральной среды, в которую добавляли 20 мл прекультуры в качестве инокулята. Температура культивирования также составляет 37°С.
Анализы
Рост клеток определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 660 нм. Концентрацию антигена ApxI измеряли с помощью принятого анализа ELISA.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Первый эксперимент проводили для определения, доступен ли еще кальций, несмотря на образование комплекса с бороглюконатом, для бактерий АРР. Этот эксперимент осуществляли в сосудах, как описано в данном документе выше. Результаты представлены ниже в таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Среда | Антиген ApxI (Ед/мл) |
| Колумбийская среда без добавления Са | 0 |
| Колумбийская среда с добавлением 25 мМ Са-бороглюконата | 7 |
Как указывают данные таблицы 1, при образовании комплекса ионов кальция с бороглюконатом может быть получен хороший выход ApxI. Важное преимущество образования этого комплекса состоит в том, что преципитация кальциевой соли больше не влияет в значительной степени на течение процесса.
Второй эксперимент осуществляли, чтобы понять, какое влияние оказывает бороглюконат в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. Для этого авторы сравнили добавление 20 мМ раствора CaCl2 с добавлением 20 мМ раствора Са-бороглюконата. Результаты представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | |
| Среда | Антиген ApxI (Ед/мл) |
| ACF, добавлен 20 мМ CaCl2 | 1 |
| ACF, добавлен 20 мМ Са-бороглюконат | 24 |
Получены два результата. Во-первых, понятно, что при использовании хлорида кальция получение достаточных количеств ApxI в среде ACF затруднительно даже при создании нормальных уровней кальция. При образовании комплекса кальция с бороглюконатом может быть получен высокий выход ApxI. Сопоставимые результаты могут быть получены в других средах. Авторы осуществили такой эксперимент в среде, которая не содержала ни хлорида железа, ни сульфата магния («ACF-alt»), но в остальном представляла собой ту же среду, что и среда ACF, описанная в данном документе выше. И на этот раз при образовании комплекса кальция с бороглюконатом получали повышенные в значительной степени уровни.
Третий эксперимент осуществляли для изучения влияния концентрации бороглюконата. Авторы использовали три различных концентрации, а именно 20, 40 и 60 мМ бороглюконата кальция. Результаты представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | |
| Среда | Антиген ApxI (Ед/мл) |
| ACF, добавлен 20 мМ Са-бороглюконат | 4 |
| ACF, добавлен 40 мМ Са-бороглюконат | 31 |
| ACF, добавлен 60 мМ Са-бороглюконат | 1 |
Как становится понятно из таблицы 3, оптимальна концентрация около 40 мМ.
В четвертом эксперименте авторы изучили влияние повышенных уровней углекислого газа на получение ApxI. Для этого авторы использовали среду ACF-alt, описанную в данном документе выше, и повысили уровень нитрата натрия до 0,5 г/л. Концентрацию бороглюконата варьировали между 40, 50 и 70 мМ. Повышенную концентрацию СО2 получали, поддерживая постоянный поток воздуха в ферментере 1 vvm (объем газа на объем среды в минуту) для смеси воздух/СО2 95/5 об./об. Эксперименты осуществляли в ферментере SIXFORS, как описано в данном документе выше. Результаты представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | |
| Среда | Антиген ApxI (Ед/мл) ELISA |
| ACF-alt, добавлен 40 мМ Са-бороглюконат, 5% СО2 | 520 |
| ACF-alt, добавлен 50 мМ Са-бороглюконат, 5% СО2 | 357 |
| ACF-alt, добавлен 70 мМ Са-бороглюконат, 5% СО2 | 222 |
Исходя из данных результатов, можно сделать вывод, что углекислый газ положительно влияет на продукцию ApxI: даже при концентрации 70 мМ бороглюконата кальция могут быть получены приемлемые уровни ApxI. И в данном случае оптимальна концентрация 40 мМ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Заявитель обнаружил, что в жидкой культуральной среде, которая поддерживает рост бактерий АРР, бороглюконат может обеспечивать предельное равновесие между предотвращением преципитации ионов кальция с отрицательно заряженными ионами, с одной стороны, и сохранением ионов кальция, доступных для стимуляции Actinobacillus pleuropneumoniae к продукции ApxI, с другой стороны. Это может быть использовано преимущественно в любой среде для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae, содержащей отрицательные ионы, которые образуют преципитат с ионами кальция. В действительности, в зависимости от выбранной среды и оптимизации ее компонентов бактерии АРР сами будут продуцировать более высокие или более низкие уровни ApxI. Но поскольку экранирующее действие бороглюконата будет работать независимо от реальной скорости продукции самих бактерий, этот раствор может быть успешно использован для всех сред, в частности поскольку, по сути, все среды содержат карбонатные ионы, которые представляют собой ионы, способные образовывать преципитат с ионами кальция.
Claims (5)
1. Способ получения RTX-токсина ApxI путем культивирования бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в культуральной среде, которая обеспечивает рост бактерий, причем к этой среде добавляют кальциевую соль для образования в среде ионов кальция, отличающийся тем, что культуральная среда содержит бороглюконат в концентрации менее 60 ммоль/л для образования в среде комплекса кальций-бороглюконат.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация бороглюконата находится в диапазоне от 25 до 45 ммоль/л, предпочтительно 40 ммоль/л.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что кальциевая соль представляет собой бороглюконат кальция.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования через жидкую среду пропускают воздух, причем воздух содержит углекислый газ выше атмосферного уровня.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что воздух содержит 5 об.% углекислого газа.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08105881 | 2008-11-27 | ||
| EP08105881.0 | 2008-11-27 | ||
| US11877008P | 2008-12-01 | 2008-12-01 | |
| US61/118,770 | 2008-12-01 | ||
| PCT/EP2009/065798 WO2010060917A1 (en) | 2008-11-27 | 2009-11-25 | Process for the production of the actinobacillus pleuropneumonias toxin apxi employing a culture medium comprising calcium-borogluconate complex |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011125925A RU2011125925A (ru) | 2013-01-10 |
| RU2514667C2 true RU2514667C2 (ru) | 2014-04-27 |
Family
ID=40546012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011125925/10A RU2514667C2 (ru) | 2008-11-27 | 2009-11-25 | Способ получения токсина actinobacillus pleuropneumoniae apxi, используя культуральную среду, содержащую комплекс кальций-бороглюконат |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8586331B2 (ru) |
| EP (1) | EP2370590B1 (ru) |
| JP (1) | JP5698672B2 (ru) |
| CN (1) | CN102171361B (ru) |
| ES (1) | ES2458095T3 (ru) |
| RU (1) | RU2514667C2 (ru) |
| TW (1) | TWI461529B (ru) |
| WO (1) | WO2010060917A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2824493C1 (ru) * | 2023-12-18 | 2024-08-08 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр биотехнологической обработки продуктов питания при институте микроэкологии" (ООО "ЦБО Микроэкологии") | Штамм бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae 8 серотипа, предназначенный для получения моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику актинобациллезной плевропневмонии свиней |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2351360C2 (ru) * | 2002-11-20 | 2009-04-10 | Лабораториос Ипра, С.А. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ НЕГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ ВИДА Actinobacillus pleuropneumoniae, БАКТЕРИЯ ВИДА Actinobacillus pleuropneumoniae, ВАКЦИНА ПРОТИВ СВИНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ (ВАРИАНТЫ), ИММУНОГЕННЫЙ И НЕГЕМОЛИТИЧЕСКИЙ ШТАММ Actinobacillus pleuropneumoniae (ВАРИАНТЫ) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2075325T3 (es) * | 1990-04-20 | 1995-10-01 | Akzo Nobel Nv | Subunidad de vacuna contra el actinobacillus pleuropneumoniae. |
| CA2170839A1 (en) * | 1995-03-01 | 1996-09-02 | Janet Macinnes | Bacterial preparations, method for producing same, and their use as vaccines |
| EP0875574A3 (en) | 1997-04-10 | 2000-03-22 | Akzo Nobel N.V. | Live attenuated bacteria of the species Actinobacillus pleuropneumoniae |
| CN1511844A (zh) * | 2002-07-31 | 2004-07-14 | 张甘楠 | 猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗 |
| ES2474643T3 (es) * | 2005-09-28 | 2014-07-09 | Ipsen Pharma | Análogos de grelina |
| TWI392737B (zh) * | 2008-11-27 | 2013-04-11 | Intervet Int Bv | 產製ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘIII 之方法 |
-
2009
- 2009-11-09 TW TW098137947A patent/TWI461529B/zh not_active IP Right Cessation
- 2009-11-25 JP JP2011537959A patent/JP5698672B2/ja active Active
- 2009-11-25 US US13/131,129 patent/US8586331B2/en active Active
- 2009-11-25 ES ES09756520.4T patent/ES2458095T3/es active Active
- 2009-11-25 EP EP09756520.4A patent/EP2370590B1/en active Active
- 2009-11-25 WO PCT/EP2009/065798 patent/WO2010060917A1/en not_active Ceased
- 2009-11-25 CN CN200980138625.1A patent/CN102171361B/zh active Active
- 2009-11-25 RU RU2011125925/10A patent/RU2514667C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2351360C2 (ru) * | 2002-11-20 | 2009-04-10 | Лабораториос Ипра, С.А. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ НЕГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ ВИДА Actinobacillus pleuropneumoniae, БАКТЕРИЯ ВИДА Actinobacillus pleuropneumoniae, ВАКЦИНА ПРОТИВ СВИНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ (ВАРИАНТЫ), ИММУНОГЕННЫЙ И НЕГЕМОЛИТИЧЕСКИЙ ШТАММ Actinobacillus pleuropneumoniae (ВАРИАНТЫ) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Jarma E e al., Anaerobiosis, growth phase and Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxin production, Microb Pathog. 2004 Jul, Vol.37, No.1, p.p.29-33. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2824493C1 (ru) * | 2023-12-18 | 2024-08-08 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр биотехнологической обработки продуктов питания при институте микроэкологии" (ООО "ЦБО Микроэкологии") | Штамм бактерии Actinobacillus pleuropneumoniae 8 серотипа, предназначенный для получения моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику актинобациллезной плевропневмонии свиней |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8586331B2 (en) | 2013-11-19 |
| CN102171361A (zh) | 2011-08-31 |
| TW201031748A (en) | 2010-09-01 |
| RU2011125925A (ru) | 2013-01-10 |
| EP2370590A1 (en) | 2011-10-05 |
| CN102171361B (zh) | 2014-05-07 |
| JP5698672B2 (ja) | 2015-04-08 |
| WO2010060917A1 (en) | 2010-06-03 |
| JP2012509682A (ja) | 2012-04-26 |
| EP2370590B1 (en) | 2014-03-12 |
| US20110229935A1 (en) | 2011-09-22 |
| ES2458095T3 (es) | 2014-04-29 |
| TWI461529B (zh) | 2014-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Campani et al. | Recombinant protein production by engineered Escherichia coli in a pressurized airlift bioreactor: a techno-economic analysis | |
| Liu et al. | CsrA regulates swarming motility and carbohydrate and amino acid metabolism in Vibrio alginolyticus | |
| RU2514667C2 (ru) | Способ получения токсина actinobacillus pleuropneumoniae apxi, используя культуральную среду, содержащую комплекс кальций-бороглюконат | |
| US20160053221A1 (en) | Methods and compositions for increasing toxin production | |
| CN109536427A (zh) | 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌 | |
| RU2507267C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСИНОВ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE ApxI ИЛИ ApxIII В ЖИДКОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ, ДОПОЛНЕННОЙ ВОЗДУХОМ, ОБОГАЩЕННЫМ УГЛЕКИСЛЫМ ГАЗОМ | |
| Hottle et al. | Growth and survival of Mycoplasma neurolyticum in liquid media | |
| JP5119435B2 (ja) | 光学純度の高いポリ−γ−グルタミン酸の製造方法 | |
| JP2006288272A (ja) | システイン含有培地を用いる微生物の取得方法 | |
| JP2011205979A (ja) | 組換えタンパク質の生産方法 | |
| JP2005295815A (ja) | ニトリルヒドラターゼの安定化または活性化方法 | |
| SU1102270A1 (ru) | Штамм Е. @ @ 1651,содержащий плазмиду @ @ 307-продуцент термолабильного токсина | |
| CA2138178A1 (en) | Control of ph during bordetella growth | |
| RU2596405C1 (ru) | СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas | |
| JPS63173596A (ja) | Ｄ−乳酸の製法 | |
| SU497335A1 (ru) | Питательна среда дл вырашивани бактерий рожи | |
| KAWASAKI et al. | THE GROWTH-STIMULATING ACTIVITY OF THIAMINE-8-(METHYL-6-ACETYL-DIHYDROTHIOCTATE)-DISULFIDE ON THIAMINE-REQUIRING MICROORGANISMS | |
| JPH02231079A (ja) | プトレッシンオキシダーゼの製造方法 | |
| BRESLOVE | INFLUENCE OF SOME PYRIDINE COMPOUNDS AND RELATED SUBSTANCES ON GROWTH OF PROTEUS | |
| JPS6486873A (en) | Thermostable and halotolerant glutaminase |