RU2511417C2 - Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281 - Google Patents
Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2511417C2 RU2511417C2 RU2011142170/10A RU2011142170A RU2511417C2 RU 2511417 C2 RU2511417 C2 RU 2511417C2 RU 2011142170/10 A RU2011142170/10 A RU 2011142170/10A RU 2011142170 A RU2011142170 A RU 2011142170A RU 2511417 C2 RU2511417 C2 RU 2511417C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stem cells
- cord blood
- cells
- culture
- umbilical cord
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims description 65
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 title description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 127
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 84
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102100026316 Zinc finger protein 281 Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 101000785710 Homo sapiens Zinc finger protein 281 Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 98
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 26
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 25
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 16
- -1 CD31 Proteins 0.000 claims description 16
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 15
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 10
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 10
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 7
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 7
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 7
- 101710085500 C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 6
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 5
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 5
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 claims description 4
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 claims description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 4
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 claims description 4
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 claims description 4
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000947192 Rattus norvegicus C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010031372 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 4
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 claims description 4
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 2
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims 3
- 102000005354 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Human genes 0.000 claims 1
- 244000309466 calf Species 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 7
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 23
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 18
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 9
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 8
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 8
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 8
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 6
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 6
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 6
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 6
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(O)C(S(O)(=O)=O)=C2 JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100026262 Metalloproteinase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 4
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 3
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013948 Fatty acid-binding protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 108050003772 Fatty acid-binding protein 4 Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 3
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 3
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 3
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 2
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101000976618 Mus musculus Zinc finger protein 42 Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 2
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- HHGZUQPEIHGQST-RGVONZFCSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.OC(=O)[C@@H](N)CSSC[C@H](N)C(O)=O HHGZUQPEIHGQST-RGVONZFCSA-N 0.000 description 1
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 101150082143 CD24 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150018889 FABP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000645296 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000759255 Homo sapiens Zinc finger protein 148 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050006602 Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000192 Methionyl aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018210 Recoverin Human genes 0.000 description 1
- 108010076570 Recoverin Proteins 0.000 description 1
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010043540 Thromboangiitis obliterans Diseases 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 102100023442 Zinc finger protein 148 Human genes 0.000 description 1
- 101710143983 Zinc finger protein 281 Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000000411 amacrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001988 antibody-antigen conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 210000002592 gangliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001164 retinal progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- HMEYVGGHISAPJR-IAHYZSEUSA-N rolitetracycline Chemical compound O=C([C@@]1(O)C(O)=C2[C@@H]([C@](C3=CC=CC(O)=C3C2=O)(C)O)C[C@H]1[C@@H](C=1O)N(C)C)C=1C(=O)NCN1CCCC1 HMEYVGGHISAPJR-IAHYZSEUSA-N 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010381 tandem affinity purification Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Предложен способ выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, с культивированием в сосуде, содержащем фибронектин, и последующим получением стволовых клеток из культуры, а также среда для культивирования стволовых клеток, способ культивирования стволовых клеток, клеточное терапевтическое средство, и способ увеличения «стволовости» стволовых клеток, который характеризуется наличием сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток. Изобретение может быть использовано в медицине для целей трансплантологии. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл., 11 пр.
Description
Данное изобретение относится к способу выделения плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови, где способ характеризуется культивированием моноцитов, выделенных из пуповинной крови, в сосуде для культивирования, содержащем фибронектин, и последующим сбором стволовых клеток из культуры, с выделением, таким образом, происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток; и к клеточному терапевтическому средству, содержащему происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки или дифференцированные из них клетки. Данное изобретение также относится к новой среде для культивирования стволовых клеток, способу культивирования стволовых клеток, где способ характеризуется культивированием и пролиферацией стволовых клеток в среде для культивирования, и способу увеличения «стволовости» стволовых клеток, которая характеризуется сферичной или трехмерной культурой стволовых клеток.
Предшествующий уровень техники
Стволовые клетки, характеризующиеся тем, что являются самообновляющимися, подвергаются дифференцировке и являются иммортализованными, были предложены для решения проблем регенеративной медицины и тканевой реплантации, таким образом, их можно использовать для лечения различных дегенеративных заболеваний, так же как для предоставления возможности глубокого понимания клеточной биологии. Стволовые клетки взрослых, получаемые из различных тканей, являются более предпочтительными, чем эмбриональные стволовые клетки, вследствие того, что стволовые клетки взрослых можно получать из неограниченного числа источников, и этические соображения для использования человеческих эмбрионов в качестве источника клеток утрачивают свое значение. Кроме того, стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови, обладают преимуществами по сравнению с другими стволовыми клетками взрослых в том отношении, что доноры пуповинной крови не подвергаются травмированию, в отличие от доноров костного мозга или жировой ткани.
Происходящие из пуповинной крови мезенхимальные стволовые клетки успешно вводили in vitro в различные виды клеток, включающие нервные клетки, гепатоциты, остеоциты и т.д. (Sun, W. et al., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al., Tissue Engineering, 11:1407, 2005). Также сообщали об успешности in vivo трансплантации происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клеток при травмах, сахарном диабете и инфаркте миокарда (Nonome, K. et al., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., 25 Circulation, 112:96, 2005). Вследствие низкой вероятности заражения инфекционными заболеваниями и низкой вероятности возникновения реакции «трансплантат против хозяина», трансплантацию происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клеток все чаще применяют в отношении как пациентов детского возраста, так и взрослых пациентов (Claudio G. B. et al., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006). Несмотря на то что трансплантацию пуповинной крови применяли в качестве терапии некоторых заболеваний, а конкретно - заболеваний, связанных с дефектом в системе кроветворения (Grewal, SS. et al., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al., Blood, 103:489, 2004), количество исследований клинического применения происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клеток все еще ограничено. Например, существуют сообщения, что стволовые клетки используют для не полностью, но частично успешного лечения женщин с поражениями спинного мозга и пациентов с болезнью Бюргера (Kim, SW. et al., Stem cells, 2006; Kang, KS. et al., Cytotherapy, 7:368, 2005). Однако механизм развития или роста и пролиферации клеток все еще не известен.
Выделить мезенхимальные стволовые клетки из пуповинной крови трудно. Например, если способ, используемый для выделения происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, применяют для пуповинной крови, степень выделения остается на уровне приблизительно 20%. До 50% мезенхимальных стволовых клеток можно выделить из свежей крови, которую отобрали за 5 часов до выделения. Однако степень выделения снижается до 20% или менее, если кровь отобрали более чем за 5 часов до выполнения выделения, и клетки, хотя и выделены, но плохо пролиферируют.
Описание
Техническая проблема
В результате предпринятого авторами изобретения интенсивного и всестороннего исследования в области выделения и массовой пролиферации стволовых клеток из пуповинной крови, приведшего к настоящему изобретению, получили данные о том, что при культивировании в присутствии фибронектина, моноциты, выделенные из пуповинной крови человека, активно пролиферируют и образуют колонии, демонстрирующие веретенообразную морфологию, и даже после многочисленных пассажей сохраняют свойства, присущие стволовым клеткам. Таким образом, на основе полученных данных разработан эффективный способ выделения происходящих из пуповинной крови негематопоэтических плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток и способ их массовой пролиферации.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, содержащих культивируемые в присутствии фибронектина моноциты, выделенные из пуповинной крови и выделение стволовых клеток из культуры.
Другой задачей настоящего изобретения является предоставление происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, выделенных посредством способа выделения.
Дополнительной задачей настоящего изобретения является предоставление клеточного терапевтического средства, содержащего происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки или дифференцированные из них клетки.
Еще одной дополнительной задачей настоящего изобретения является разработка новой среды для культивирования стволовых клеток.
Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования стволовых клеток с использованием среды для культивирования.
Это способ увеличения «стволовости» стволовых клеток с использованием сферичной или трехмерной культуры стволовых клеток.
Техническое решение
В соответствии с аспектом изобретения, изобретение относится к способу выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, где способ характеризуется культивированием выделенных из пуповинной крови моноцитов в сосуде для культивирования, содержащем фибронектин, и получение клеток из культуры.
В одном из вариантов осуществления стадия получения стволовых клеток из культуры включает использование иммунологического свойства стволовых клеток для отделения стволовых клеток.
Выделение моноцитов из пуповинной крови можно осуществлять с использованием общепринятого способа. После смешивания пуповинной крови с Hetasep для удаления эритроцитов, выделяют моноциты, используя Фиколл-пак. В настоящем документе, Hetasep предпочтительно используют в количестве 0,5~2 мл на 5 мл Hetasep.
Для увеличения выхода, при выделении моноцитов из пуповинной крови, используемая в настоящем изобретении пуповинная кровь предпочтительно представляет собой такую пуповинную кровь, которую предпочтительно получают непосредственно после родов, хранят при комнатной температуре в течение 12~48 часов после получения или хранят при 3~5°C в течение 6~72 часов после получения.
Выделение стволовых клеток из происходящих из пуповинной крови моноцитов характеризуется использованием фибронектина. Как применяют в настоящем документе, термин «сосуд для культивирования, содержащий фибронектин», предназначен для обозначения условия, при котором моноциты могут подвергаться взаимодействию с фибронектином. Например, фибронектин можно наслаивать на сосуд для культивирования или фибронектин может содержаться в среде для культивирования в форме сфер или трехмерных структур. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, в случае, если сосуд для культивирования покрывают фибронектином, фибронектин может содержаться из расчета удельного содержания от 0,1 до 1 мг/мл.
Фибронектин, пригодный в настоящем изобретении, может быть животного происхождения, без ограничения, и предпочтительно человеческого происхождения. Также, фибронектин можно получать искусственным синтезом (например, химический синтез, синтез с использованием пептидного синтезатора и т.д.) или биосинтезом (например, технология рекомбинантных ДНК, культура фибробластов и т.д.) или можно выделять из плазмы крови животных, включая людей, из внеклеточных матриксов. Фибронектин может представлять собой фрагмент или пептидную последовательность фибронектина или может содержать фрагмент или пептид.
Никаких конкретных ограничений не предъявляют к среде при культивировании моноцитов в сосуде для культивирования, содержащем фибронектин. В качестве основной среды для культивирования моноцитов предпочтительно используют SNU-1 или EGM-2.
Среда SNU-1 содержит следующую композицию (Таблица 1).
| Таблица 1 | |||||
| SNU-1 (мг/л) | SNU-1 (мг/л) | SNU-1 (мг/л) | |||
| CaCl2 (безводный) | 200 | L-изолейцин | 78 | i-инозитол | 3 |
| KCL | 400 | L-лейцин | 78 | Рибофлавин | 0,15 |
| MgSO4 (безводный) | 97,67 | L-лизин HCL | 108,75 | Тиамин HCL | 1.5 |
| NaCl | 7635 | L-метионин | 22,5 | L-аланин | 17,8 |
| NaH2PO4 H2O | 140 | L-фенилаланин | 48 | L-аспарагин H2O | 30 |
| D-глюкоза | 1000 | L-серин | 21 | L-аспарагиновая кислота | 26.6 |
| Феноловый красный | 10 | L-треонин | 72 | L-глютаминовая кислота | 29,4 |
| Пируват натрия | 110 | L-триптофан | 15 | L-пролин | 23 |
| L-аргинин HCL | 189 | L-тирозин 2Na 2H2O | 54 | Никотинамид | 1,5 |
| L-цистин 2HCL | 36 | L-валин | 69 | Пиридоксин Hcl | 1,5 |
| L-глютамин | 292 | D-Ca пантотенат | 1,5 | NaHCO3 | 1000 |
| Глицин | 15 | Холинхлорид | 1,5 | ||
| L-гистидин HCL H2O | 63 | Фолиевая кислота | 1.5 | ||
В настоящем изобретении, основную среду предпочтительно обогащают FGF-B (Фактор роста фибробластов), аскорбиновой кислотой, EGF (эпидермальный фактор роста), гидрокортизоном, IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста-1) или VEGF (Фактор роста эндотелия сосудов) и гепарином и необязательно GA-1000 (Гентамицина сульфат, Амфотерицин-B), если необходимо.
Более предпочтительно, основную среду обогащают 20% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), bFGF (Фактор роста фибробластов) 1~40 нг/мл, аскорбиновой кислотой 0,1~5,0 мкг/мл, EGF (эпидермальный фактор роста) 1~40 нг/мл, гидрокортизоном 0,1~1 мкг/мл, IGF-I (инсулиноподобный фактор роста-1) 1~40 нг/мл или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) 1~5 нг/мл и гепарином 20~25 мкг/мл и необязательно GA-1000 (Гентамицина сульфат, Амфотерицин-B), если необходимо.
После культивирования в течение трех суток, моноциты, которые остались в суспензии, удаляли, и подвергали культивированию только прикрепленные клетки. Среди моноцитов, прикрепленных к сосуду, пролиферируют только стволовые клетки. Через 12-20 суток после выделения можно наблюдать быструю пролиферацию стволовых клеток. В связи с этим, предпочтительно заменять среду свежей каждые двое или трое суток.
Для получения из культуры происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток можно использовать FACS с использованием проточного цитометра с функцией сортировки (Int. Immunol., 10(3):275, 1998), магнитные шарики или способ пэннинга, основанный на специфичности антител к мезенхимальным стволовым клеткам (J. Immunol., 141(8):2797, 1998). Для получения плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток из массовой культуры можно использовать колонку, на которой по отдельности или в комбинации иммобилизованы антитела, специфичные для молекул, экспрессированных на клеточной поверхности (далее в настоящем документе, обозначаемые как «поверхностный антиген»).
Проточную цитометрию с сортировкой клеток можно выполнять посредством электростатической зарядки капель или «улавливания» клеток. В обоих процессах антитела, специфично распознающие поверхностный антиген, метят флуоресцентной меткой, после чего измеряют интенсивность флуоресценции меченого конъюгата антитело-антиген и сигнал переводят в электрические сигналы для определения уровня экспрессии антигена на поверхности клеток. Дополнительно, различные виды флуорофоров можно использовать в комбинации для разделения клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены. Среди флуорофоров представлены FITC (флуоресцеинизотиоцианат), PE (фикоэритрин), APC (алло-фикоцианин), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color и QuantumRed.
В FACS с использованием проточного цитометра, стволовые клетки, собранные из культуры, например, центрифугированием, могут подвергаться прямому иммуноокрашиванию с антителом или пролиферировать в подходящей среде перед иммуноокрашиванием с антителом. Для иммуноокрашивания образец клетки-мишени смешивают с первичным антителом, специфичным для поверхностного антигена, и инкубируют в течение 0,5-1 часа на льду. Если первичное антитело помечено флуорофором, клеточный образец промывают и разделяют в проточном цитометре. Если первичное антитело не помечено флуорофором, клеточный образец, обработанный первичным антителом, промывают и смешивают с флуоресцентно меченным вторичным антителом, которое может связываться с первичным антителом. Затем иммуноокрашенные клетки вновь инкубируют в течение от 0,5 до 1 часа на льду и промывают перед разделением посредством проточного цитометра.
Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки, выделенные по настоящему изобретению, обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:
(a) демонстрируют положительную иммунологическую характеристику по отношению к факторам транскрипции c-myc и ZNF281;
(b) прикрепляются к поверхности покрывающего внеклеточного матрикса и через 5-30 суток после прикрепления образуют клеточные колонии веретенообразной или сферической формы;
(c) демонстрируют CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) от 30 до 45;
(d) демонстрирует негативную иммунологическую характеристику в отношении CD14, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR;
(e) способность к дифференцировке в мезодермальные, эндодермальные и эктодермальные клетки;
(f) секретируют по меньшей мере один цитокин или хемокин, выбранный из группы, состоящей из TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, ЭОТАКСИН, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, лептин, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, и PFGF-bb.
Факт того, что полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению остаются недифференцированными, очевиден из наличия экспрессии Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc и ZNF281 в стволовых клетках.
Кроме того, демонстрирующие CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) от 30 до 45, полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению являются высоко пролиферативными. Анализ кариотипа показал, что клетки по настоящему изобретению активно пролиферируют, но обладают нормальной хромосомной структурой.
Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению являются иммунологически негативными в отношении CD14, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR, каждый из которых известен как маркер гематопоэтических стволовых клеток или связанный с иммунным отторжением маркер. Вследствие отсутствия подобных маркеров гемопоэза или маркеров, связанных с иммунным отторжением, полученные из пуповинной крови стволовые клетки по настоящему изобретению можно трансплантировать с минимальной васкуляризацией и иммунным отторжением и таким образом можно эффективно использовать в аллогенной трансплантации.
Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению также могут дифференцировать в гепатоциты из клеток, родственных мезодермальным клеткам, нейронам и клеткам сетчатой оболочки глаза из эктодермы, а также из мезодермы, в остеобласты, хондроциты и адипоциты. Таким образом, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению можно использовать для лечения различных заболеваний.
Дополнительно, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению могут секретировать различные цитокины или хемокины, включающие TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, ЭОТАКСИН, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Лептин, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI и PFGF-bb. Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению, обладающие способностью к секреции таких цитокинов или хемокинов, можно использовать для лечения различных заболеваний.
Новая особенность происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению происходит из того, что эти клетки обладают перечисленными выше характеристиками.
Как описано выше, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению могут дифференцироваться в различные типы клеток, включающие остеобласты, хондроциты, адипоциты, гепатоциты и нейроны, и таким образом находить применения в терапии различных соответствующих заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение относится к средству клеточной терапии, включающему происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению или дифференцированные из них клетки. Средство клеточной терапии по настоящему изобретению можно применять для лечения различных заболеваний, включающих, например, заболевания нервной системы (например, дегенеративные заболевания нервной системы), остеоартрит (например, дегенеративный артрит, ревматоидный артрит), остеопороз (например, остеопороз), заболевания печени (например, цирроз печени), и сердечно-сосудистые заболевания.
Предпочтительно, средство клеточной терапии по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один разбавитель, который может защищать и поддерживать жизнеспособность клеток. В качестве разбавителей можно использовать буферные растворы, такие как физиологический раствор, PBS (фосфатно-солевой буфер), HBSS (уравновешенный солевой раствор Хэнка) и компоненты плазмы или сыворотки.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к среде для культивирования новых стволовых клеток. Среда основана на среде EGM-2 или SNU-1 и, если необходимо, обогащена 20% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), bFGF (фактор роста фибробластов) 1~40 нг/мл, аскорбиновой кислотой 0,1-5,0 мкг/мл, EGF (эпидермальный фактор роста) 1~40 нг/мл, гидрокортизоном 0,1~1 мкг/мл, IGF-I (инсулиноподобный фактор роста-1) 1~40 нг/мл или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) 1~5 нг/мл и гепарином 20~25 мкг/мл, и необязательно GA-1000 (гентамицина сульфат, амфотерицин-B).
Среда для культивирования стволовых клеток является новой и используется в способе выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению. Дополнительно, среда для культивирования по настоящему изобретению является пригодной для пролиферации всех стволовых клеток взрослых, включая происходящие из пуповинной крови стволовые клетки, и применима для культивирования стволовых клеток взрослых.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к способу культивирования стволовых клеток, где способ включает культивирование и пролиферацию стволовых клеток в среде по настоящему изобретению. Предпочтительно, стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки взрослых.
В одном из вариантов осуществления среду для культивирования стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для культивирования происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению. При культивировании в среде по настоящему изобретению, полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению можно подвергать пассированию предпочтительно через 3-5 суток после образования клеточных колоний веретенообразной формы. Культивирование предпочтительно осуществляют в условиях 5% CO2 и его можно проводить в течение 5~30 суток, но настоящее изобретение не ограничено этими условиями.
В соответствии с еще одним аспектом, настоящее изобретение относится к способу увеличения «стволовости» стволовых клеток, для которого характерно использование сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток, таким образом, культивируют стволовые клетки. Для трехмерной культуры предпочтительно используют MEF (эмбриональные клетки-фибробласты мыши). Дополнительно, стволовые клетки предпочтительно могут представлять собой взрослые стволовые клетки.
Как применяют в настоящем документе, термин «увеличение стволовости» обозначает образование колонии, подобной колонии эмбриональной стволовой клетки, или экспрессию на высоком уровне факторов транскрипции, таких как Oct4, Sox2 и т.д.
Полезные эффекты
При культивировании в присутствии фибронектина, как подробно описано выше, полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки человека по настоящему изобретению активно пролиферируют без дифференцировки в течение продолжительного периода времени, по сравнению с общепринятыми стволовыми клетками взрослых. Кроме того, обладающие способностью к дифференцировки в различные типы клеток, такие как хондроциты, остеобласты и адипоциты, плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению можно эффективно использовать для лечения традиционно неизлечимых заболеваний, а также заболеваний нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний костной системы.
Описание чертежей
На ФИГ.1 представлены фотографии, демонстрирующие колонии, образованные после того, как моноциты, выделенные из пуповинной крови человека, культивировали в течение 14, 15, 16, 17 и 18 суток (A, B, C, D и E соответственно) и клетки после 3 пассажа (F);
На ФИГ.2 представлен график, на котором изображен кумулятивный клеточный рост в зависимости от времени.
На ФИГ.3 представлены результаты кариотипического анализа после культивирования происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в течение длительного периода времени.
На ФИГ.4 представлены цитограммы проточного цитометра, демонстрирующие профили экспрессии различных маркеров на происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению.
На ФИГ.5 представлены профили экспрессии различных маркеров недифференцированных клеток на происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению, как измерено посредством проточной цитометрии и иммуноокрашивания (A: цитограмма проточной цитометрии клеток, экспрессирующих Oct4, B: изображение подвергнутого иммуноокрашиванию Oct4, C: изображение окрашенного ядра в клетках, экспрессирующих Oct4, D: совмещенное изображение экспрессии Oct4 и окрашивания ядер).
На ФИГ.6 представлена экспрессия ZNF281 в terra-1, hUCB-MSC, AD-MSC и AM (верхняя вставка) и в hUCB-MSC после 3~9 пассажей (нижняя вставка), как проанализировано посредством FACS.
На ФИГ.7 представлена экспрессия ZNF281, Oct4, Sox2, c-myc и Rex-1, каждый из которых важен для поддержания недифференцированного состояния, у происходящих из пуповинной крови человека плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению, как измерено посредством ОТ-ПЦР.
На ФИГ.8 представлены фотографии, показывающие дифференциацию происходящих из пуповинной крови человека плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в остеобласты, адипоциты, хондроциты и нейроны (A: индуцированный к неостеогенной дифференцировке контроль после окрашивания ализариновым красным S, B: индуцированные к остеогенной дифференцировке клетки после окрашивания ализариновым красным S, C: индуцированный к неадипогенной дифференцировке контроль после окрашивания масляным красным O, D: индуцированные к адипогенной дифференцировке клетки после окрашивания масляным красным O, E: индуцированные к хондрогенной дифференцировке клетки после окрашивания толуидиновым синим, F: сгусток индуцированных к хондрогенной дифференцировке клеток, G: клетки, подвергнутые иммуноокрашиванию на относящиеся к нервной системе маркеры Tuj-1 и MAP2 после нейрогенной дифференцировки).
На ФИГ.9 представлены уровни РНК в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках после индукции остеогенной дифференцировки и адипогенной дифференцировки, как измерено посредством RT-ПЦР (PPAR-γ и FABP-4 представляют собой маркеры адипогенной дифференцировки, и коллаген 1 типа представляет собой маркер остеогенной дифференцировки. PPAR-γ: γ-рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом, FABP-4: белок-4, связывающий жирные кислоты, GAPDH: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа).
На ФИГ.10 представлены профили экспрессии связанных с сетчаткой глаза белков в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках по настоящему изобретению.
На ФИГ.11 представлена секреция различных цитокинов в средах для культивирования происходящих из пуповинной крови человека плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, как проанализировано посредством микроматрицы антител (A: hUCB-MSC1, B: hUCB-MSC2, C: hUCB-MSC3, D: расположение антител, POS: положительный контроль, NEG: отрицательный контроль, GCSF: гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, GM-CSF: гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор, ICAM-1: внутриклеточная молекула адгезии, IFN-γ: интерферон-γ, IL: интерлейкин, MCP: моноцитарный белок-хемоаттрактант, M-CSF: моноцитарный колониестимулирующий фактор, MIG: монокин, индуцированный интерфероном-гамма, MIP: макрофагальный белок воспаления, RANTES: регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными T-клетками, TGF-β: трансформирующий фактор роста-β, TNF: Фактор некроза опухоли, sTNFR: растворимый рецептор фактора некроза опухоли, PDGF-BB: полученный из тромбоцитов фактор роста-BB, TIMP2: тканевой ингибитор металлопротеиназ-2).
На ФИГ.12 и 13 представлены фотографии, демонстрирующие трехмерные культуры происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, с использованием способа сферической культуры и клетки STO и профили экспрессии факторов транскрипции Oct4 и Sox2, как измерено посредством ОТ-ПЦР (фиг.12: трехмерная культура происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток посредством способа сферической культуры, ФИГ.13: трехмерная культура происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток на клетках STO).
Способ изобретения
Лучшего понимания сущности изобретения можно достичь посредством следующих примеров, которые представлены для иллюстрации, но которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.
ПРИМЕР 1: Культивирование, пролиферация и кариотипический анализ плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови
Образцы UCB доношенных детей (n=20) отбирали непосредственно после получения от матерей информированного согласия на проведение отбора. Образцы UCB доношенных детей смешивали с HetaSep (Stem cells Technologies INC, Vancouver, BC) для уменьшения количества эритроцитов. Далее получали моноциты посредством общепринятого центрифугирования в градиенте плотности Фиколла. Моноциты высевали из расчета плотности 1×105~8 клеток/лунку на 6-луночные планшеты, покрытые 0,1 мг/мл - 1 мг/мл фибронектина и сохраняли в SNU-1 или EGM-2 (Lonza), обогащенными EGM-2 SingleQuots, содержащим 20% FBS. EGM-2 SingQouts содержал гепарин, аскорбиновую кислоту, rhEGF, гидрокортизон, VEGF, rhFGF-B, R3-IGF-1 и GA-1000. Моноциты, которые через трое суток культивирования все еще оставались неприкрепленными, удаляли, кроме того, среду заменяли свежей каждые двое или трое суток.
Прикрепленные клетки, как наблюдали, образуют колонии, демонстрирующие веретенообразную морфологию через 5~30 суток после культивирования в условиях с 5% CO2 (фиг.1A). Образовавшись, колонии быстро пролиферировали. Клетки суспендировали в 0,125% Трипсин-ЭДТА через 3~7 суток после образования колоний и переносили в новые планшеты, где продолжали поддерживание культуры клеток (ФИГ.1B, 1C, 1D, 1E и 1F). На ФИГ.1 представлены фотографии, демонстрирующие рост культивируемых клеток. Как видно из ФИГ.1, клеточная колония увеличивается с течением времени. Кроме того даже после пассажа морфология клеток оставалась одинаковой (ФИГ.1. выделение и пролиферация происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток. Колонии, образованные после того, как моноциты культивировали в течение 14 суток (A), 15 суток (B), 16 суток (C), 17 суток (D) и 18 суток (E) и клетки после 3 пассажа (F)).
Так как культивирование клеток продолжалось, то анализировали способность к пролиферации выделенных плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови, измеряя CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) (Cristofalo et al., Proc.) Natl. Acad. Sci., USA 95, 1998). Клетки размножали делением надвое. Таким образом, уровень роста клеток можно определять периодом времени, которое необходимо одной клетке для разделения надвое, называемое временем удвоения. CDPL 10 обозначает 10 делений одной клетки, что приводит в результате к пролиферации одной клетки до приблизительно 1000 клеток. Одной из самых важных проблем традиционных происходящих из пуповинной крови стволовых клеток является то, что они имеют существенно более низкую способность к пролиферации по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из жировой ткани или из костного мозга. Так как при клиническом применении требуется большое количество стволовых клеток, способность к пролиферации у стволовых клеток является важным параметром. Измерение проводили, как указано далее. Во-первых, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки трех типов выделяли из различных образцов пуповинной крови и высевали на 100 планшетов из расчета плотности 2×105 клеток и подвергали пассажам через равные промежутки времени от трех до четырех суток, так как клетки подлежали подсчету с использованием цитометра. Подсчет клеток проводили до прекращения роста клеток. На основе измерений количества клеток получали значения CPDL, согласно следующей математической формуле 1
[Математическая формула 1]
Nн/NI=2X или [log(NH)-log(NI)]/log(2)=X
где NI обозначает количество клеток в первоначальной культуре; NH обозначает количество клеток в условии насыщения при пассаже.
Значения CPDL рассчитывали, пока продолжали поддерживать культуру клеток. В качестве контроля для сравнения использовали hUCB-EPC (эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из пуповинной крови человека). Результаты представлены на ФИГ.2. Как можно видеть из графика на ФИГ.2, для hUCB-EPC значение CPDL составляет приблизительно 20 в течение двух месяцев, в то время как значения CPDL всех происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток из трех различных образцов, как наблюдали, варьирует между 40 и 45. Эти численные значения показывают, что клетки могут теоретически расти до значения 1012 в одной колонии.
В итоге, клетки со способностью к быстрой пролиферации могут стать злокачественными, демонстрирующими бурный рост. Став злокачественными, клетки, по-видимому, пролиферируют независимо от различных регуляторных сигналов в организме, и таким образом не могут быть использованы в качестве средства клеточной терапии и являются несовместимыми с целью исследования. Таким образом, необходимо определять, является ли нормальным хромосомный набор плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови и выделенных по настоящему изобретению. В связи с этим, для исследования хромосом клеток проводили кариотипический анализ. Как можно видеть на ФИГ.3, обнаружили, что даже после 10 пассажа клетки обладают нормальной хромосомной структурой.
ПРИМЕР 2: Анализ поверхностного антигена происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток
Для анализа характеристик клеток, суспендированных в среде, осуществляли способ проточной цитометрии. Для фенотипирования поверхностных клеточных антигенов клетки, собранные после 3~4 пассажей, окрашивали антителом, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или фикоэритрином (PE), и анализировали FACSAria (Becton Dickinson, NY).
Для анализа характеристик происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток (в частности, плюрипотентная/мультипотентная стволовая клетка), выделенных в настоящем изобретении, использовали поверхностные антигены, которые включали CD10 (маркер T-клеток), CD14 (маркер моноцитов), CD24 (маркер эпителиальных клеток), CD29 (маркер моноцитов), CD31 (маркер эндотелиальных клеток), CD34 (маркер гематопоэтических стволовых клеток), CD44 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD45 (маркер негематопоэтических стволовых клеток), CD51/61 (маркер остеокластов), CD73 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD90 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD105 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD133 (маркер гематопоэтических стволовых клеток) и HLA-DR (маркер иммунного отторжения) и анализировали с использованием проточного цитометра. Результаты суммированы в таблице 2 и графически представлены на ФИГ.4.
| Таблица 2 | |
| Антиген CD на поверхности плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток | Количество положительно окрашенных клеток/суммарное количество клеток (%) |
| CD10 | 0,2±0,1 |
| CD14 | 2,0±1,0 |
| CD24 | 68,7±2,9 |
| CD29 | 100±0,0 |
| CD31 | 0,4±0,7 |
| CD34 | 3,5±3,4 |
| CD44 | 100±0,1 |
| CD45 | 0,0±0,1 |
| CD51/61 | 6,4±10,8 |
| CD73 | 99,6±0,5 |
| CD90 | 99,7±0,3 |
| CD105 | 99,5±0,8 |
| CD133 | 0,1±0,1 |
| HLA-DR | 2,0±3,2 |
ПРИМЕР 3: Профиль экспрессии ZNF281 и основного фактора транскрипции в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках
ZNF281 (белок 281 «цинковые пальцы») является одним из основных факторов транскрипции ESC (Wang J et al. (2006) Nature 444, 364-368). ZNF281, также называемый ZBP-99, содержит четыре Kruppel-подобных «цинковых пальца», которые в совокупности разделяют 91% сходности аминокислотной последовательности и 79% идентичности последовательности с Kruppel-подобными «цинковыми пальцами», найденными в ZBP-89. Кроме того, существуют высококонсервативные аминокислотные последовательности в карбоксиконцевых сегментах двух генов. Предполагаемая открытая рамка считывания кДНК ZNF281 кодирует белок массой 99 кДа. EMSA (анализ сдвига электрофоретической подвижности) показал, что белок ZNF281 специфически связывается с богатыми GC последовательностями промоторными элементами генов GASTRIN и ОРНИТИН-ДЕКАРБОКСИЛАЗЫ (Law DJ et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 262, 113-120; Lisowsky T et al. (1999) FEBS Lett 453, 369-374). ZNF281 идентифицировали как белок, связанный с c-MYC посредством техники масс-спектрометрической многомерной белковой идентификации и тандемной аффинной очисткой (Koch HB et al. (2007) Cell Cycle 6, 205-217.).
Как известно, гены Oct3/4, такие как семейство факторов транскрипции POU, не присутствуют в дифференцированных тканях, но экпрессируются, в частности, в недифференцированных стволовых клетках, которые обладают высокой пролиферативной способностью (Tai M-H. et al., Carcinogenesis 26:4 95, 2005; Tondreau T. et al., Stem cells, 23:1105, 2005). Таким образом, Oct3/4 в основном используют в качестве маркеров для эмбриональных стволовых клеток и также в качестве маркеров, указывающих на недифференцированные клетки. Клеточные колонии окрашивали, используя Oct4 как маркер «стволовости». В результате было обнаружено, что многие клетки имели Oct4, окрашиваемый вокруг ядра. Проточная цитометрия также показала экспрессию Oct4 в клетках.
Для окрашивания внутриклеточных белков, клетки фиксировали при 4°C в течение ночи с 4% формальдегидом и увеличивали проницаемость мембран в течение 10 мин с 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Предметные стекла и планшеты инкубировали в течение одного часа с первичным антителом мыши против Oct4 человека (1:200), промывали PBS (фосфатно-солевой буфер; Gibco), подвергали иммуноокрашиванию в течение одного часа с конъюгированным с Alexa 594 вторичным антителом козы к IgG мыши (Invitrogen), в то время как ядро окрашивали DAPI.
Как видно из Фиг.5 и 6, показано, что множество происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток экспрессируют Oct4 (фиг.5A: цитограмма проточной цитометрии клеток, экспрессирующих Oct4, B: изображение иммуноокрашенного Oct4, C: изображение окрашенного ядра клеток, экспрессирующих Oct4, D: совмещенное изображение экспрессии Oct4 и окрашивания ядер).
Гены, такие как Oct4, тесно связаны со «стволовостью» стволовых клеток. По существу, недавно были предприняты попытки индуцировать наличие у взрослых стволовых клеток плюрипотентности, схожей с плюрипотентностью эмбриональных стволовых клеток, придавая им способность к сверхэкспрессии генов, таких как Oct4, Sox2 и т.п. (Takahashi et al, Cell, 131(5), 861-872, 2007). Таким образом, экспрессия этих генов в стволовых клетках является очень важной для сохранения стволовых клеток в недифференцированном состоянии без потери «стволовости». Таким образом, для исследования профилей экспрессии ZNF281, Oct-4 и Sox2 в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках, изолированных по способу настоящего изобретения, проводили ОТ-ПЦР.
Для достижения этой цели конструировали праймеры, как представлено в таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| Ген-мишень | Направление | Последовательность | SEQ ID NO: |
| OCT-4 | смысловой праймер |
|
1 |
| антисмысловой праймер |
|
2 | |
| SOX2 | смысловой праймер |
|
3 |
| антисмысловой праймер |
|
4 | |
| C-MYC | смысловой праймер |
|
5 |
| антисмысловой праймер |
|
6 | |
| ZNF281 | смысловой праймер |
|
7 |
| антисмысловой праймер |
|
8 | |
| REX-1 | смысловой праймер |
|
9 |
| антисмысловой праймер |
|
10 | |
Как видно на ФИГ.7, Oct-4, Sox2, c-myc, ZNF281 и REX-1 экспрессируются, демонстрируя, что полученные из пуповинной крови стволовые клетки по настоящему изобретению обладают плюрипотентностью.
ПРИМЕР 4: Дифференцировка происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в остеобласты
Клетки индуцировали к дифференцировке в остеобласты. В связи с этим, клеткам позволяли прикрепиться к культуральному планшету и инкубировали до смыкания монослоя приблизительно 70-80%. Затем среду для культивирования замещали средой, индуцирующей остеогенную дифференцировку. Среду, индуцирующую остеогенную дифференцировку, получали посредством обогащения среды DMEM с низким содержанием глюкозы 10% FBS и 10 мМ бета-глицерофосфатом (Sigma-Aldrich), 0,1 мкМ D экзаметазоном (Sigma-Aldrich) и 50 мкМ аскорбатом (Sigma-Aldrich). Среду заменяли свежей каждые трое суток, пока в течение приблизительно двух недель индуцировали дифференцировку.
Через две недели кальциевую минерализацию, связанную с остеогенной дифференцировкой, исследовали посредством окрашивания с ализариновым красным S. Окрашивание выполняли следующим образом. После удаления среды, клетки дважды промывали дистиллированной водой и фиксировали при 4°C в течение одного часа в холодном 70% EtOH. Затем клетки вновь дважды промывали дистиллированной водой и окрашивали при комнатной температуре в течение 10 мин с 40 мМ ализаринового красного S, с последующим пятикратным промыванием дистиллированной водой.
Как видно на ФИГ.8A и 8B, на ФИГ.8A посредством окрашивания с ализариновым красным S в отсутствие дифференцировки кальция не обнаружили, в то время как на ФИГ.8B кальций окрашивался красным красителем при индукции клеток к дифференцировке в остеобласты, что показывает, что дифференцированные в остеобласты происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки высвобождают кальций.
ПРИМЕР 5: Дифференцировка происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в адипоциты
Клетки индуцировали к дифференцировке в адипоциты. В связи с этим, клеткам позволяли прикрепляться к культуральным планшетам и культивировали до смыкания монослоя приблизительно 70-80%. Затем среду заменяли средой, индуцирующей дифференцировку в адипоциты. Среду, индуцирующую дифференцировку в адипоциты, получали посредством обогащения среды DMEM с низким содержанием глюкозы 10% FBS и 1 мкМ дексаметазоном, 10 мкг/мл инсулина (Sigma-Aldrich), 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma-Aldrich) и 0,2 мМ индометацином (Sigma-Aldrich). Среду для дифференцировки заменяли свежей один раз в трое суток, пока в течение приблизительно 2-3 недель индуцировали дифференцировку.
Через 2~3 недели, дифференцировку в адипоциты исследовали посредством окрашивания масляным красным О. Для этой цели удаляли среду и клетки промывали в PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин в 10% формалине. Формалин заменяли на тот же объем свежего формалина, с последующей фиксацией клеток при комнатной температуре в течение по меньшей мере одного часа. После удаления формалина клетки промывали 60% изопропанолом. Перед окрашиванием клеток при комнатной температуре в течение 10 мин масляным красным О спирт полностью выпаривали. Сразу после окончания времени окрашивания краситель удаляли, клетки промывали дистиллированной водой.
Адипоциты окрашиваются в красный цвет при обработке масляным красным, так как краситель окрашивает липидные капли в красный цвет. Как можно видеть на ФИГ.8C и 8D, на ФИГ.8C не обнаружили ни липидных капель, ни окрашивание в красный цвет в отсутствие дифференцировки в адипоциты, в то время как на ФИГ.8D, на котором показаны результаты по индуцированию дифференцировки в адипоциты, наблюдали клетки, которые содержат множество липидных капель и, таким образом, красное окрашивание).
ПРИМЕР 6: Дифференцировка происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в хондроциты
Для индукции дифференцировки клеток в хондроциты, клетки в течение трех недель обрабатывали средой для дифференцировки в хондроциты, содержащей rTGF-бета 3 (PT-3003) от Lonza, кроме того, среду заменяли свежей два раза в неделю. Процесс хондрогенеза оценивали раз в неделю.
Для исследования хондрогенной дифференцировки выполняли окрашивание толуидиновым синим. Клетки фиксировали в течение 10 часов 4% формальдегидом и затем дополнительно в течение 10 часов пикриновой кислотой. После изготовления криосрезов, клетки окрашивали в течение 3 мин толуидиновым синим и докрашивали в течение 3 сек гематоксилином.
Группа хондроцитов не разрушается, но сохраняет постоянную морфологию и окрашивается в синий цвет при обработке толуидиновым синим. Как можно видеть на ФИГ.8E и 8F, обнаружили, что клетки, подверженные хондрогенной дифференцировке, окрашивались в синий цвет и сохраняли свою морфологию.
ПРИМЕР 7: Изменение в уровне экспрессии генов после дифференцировки происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в остеобласты и адипоциты
У стволовых клеток наблюдали значительное изменение в профиле экспрессии генов, во время прохождения процесса дифференцировки. Как правило, уровень экспрессии PPAR-γ (рецептор γ, активирующий пролиферацию пероксисом) или FABP4 (белок 4, связывающий жирные кислоты) увеличивается при дифференцировке стволовых клеток в адипоциты, в то время как уровень экспрессии коллагена 1 типа увеличивается при дифференцировке стволовых клеток в остеобласты (Mat hews et al., J Am Acad Dermatol, 56(3), 472-492, 2007; Cho et al., J. Cell. Biochem., 96, 533-542, 2005). Таким образом, после индукции дифференцировки уровень экспрессии гена, который экспрессируется в клетках определенного типа, напрямую показывает, дифференцированы ли стволовые клетки в клетки определенного вида. Эксперименты выполняли, как указано далее.
Через две или три недели после дифференцировки в остеобласты и адипоциты, из клеток выделяли суммарную РНК, используя Trizol (Invitrogen). Синтезировали кДНК, используя AccuPower RT Premix (Bioneer), с последующим ПЦР с использованием Maxime PCRPreMix Kit (Intronbio).
Для этой цели сконструировали праймеры, как представлено в таблице 4 ниже.
| Таблица 4 | |||
| Ген-мишень | Направление | Последовательность | SEQ ID NO: |
| PPAR-γ | смысловой праймер |
|
11 |
| антисмысловой праймер |
|
12 | |
| FABP4 | смысловой праймер |
|
13 |
| антисмысловой праймер |
|
14 | |
| Коллаген 1 типа | смысловой праймер |
|
15 |
| антисмысловой праймер |
|
16 | |
Как ясно из данных, представленных на ФИГ.9, уровень экспрессии PPAR-γ и FABP4, которые представляют собой маркеры дифференцировки в адипоциты, значительно повышены в случае, если клетки индуцировали к дифференцировке в адипоциты. Также, уровень экспрессии коллагена 1, маркера остеогенной дифференцировки, значительно повышался в клетках, проходящих процесс дифференцировки. При этом детектировали одинаковый уровень нанесенного для контроля GAPDH как в клетках, которые прошли через дифференцировку, так и в клетках, которые не прошли дифференцировку, что подтверждает обоснованность эксперимента.
ПРИМЕР 8: Дифференцировка происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в нейроны
Клетки индуцировали к дифференцировке в нейроны.
Во-первых, клетки подвергали предварительной инкубации в течение 24 часов в DMEM, обогащенной 5% FBS и 10 нг/мл bFGF (основной фактор роста фибробластов). После чего клетки обрабатывали в течение 24 часов DMEM, содержащей 1% ДМСО, 100 мкМ BHA, 0,5 мМ VPA, 10 мМ KCl и 10 нг/мл NGF и B27 для индукции дифференцировки в нейроны. Для исследования дифференцировки в нейроны, клетки фиксировали 4% параформальдегидом и подвергали иммуноокрашиванию на маркеры нейронов Tuj-1, MAP-2, GFAP и нейрофиламент-160. В результате обнаружили, что экспрессируются четыре маркера (фиг.8G).
ПРИМЕР 9: Экспрессия специфичных для сетчатки глаза белков в происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клетках
С использованием иммунофлуоресценции исследовали характеристики происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, ассоциированных с сетчаткой глаза.
Исследовали профили экспрессии в клетках специфичных для сетчатки глаза белков.
На ФИГ.10 представлены фотографии, демонстрирующие профили экспрессии специфичных для сетчатки глаза белков, как измерено посредством иммунофлуоресценции. Профили экспрессии PAX6 и белка Hu представлены на ФИГ.10A. PAX6 известен как маркер клеток-предшественников сетчатки глаза, белок Hu специфично экспрессируется в ганглиоцитах и амакринных клетках, которые являются составными компонентами сетчатки глаза. Они не обнаружены в контрольной культуре.
На ФИГ.10B детектируется опсин и родопсин. Опсин специфически экспрессируется в колбочковидных клетках, в то время как родопсин является специфичным для палочковидных клеток. В контрольной культуре опсин не детектировали, но наблюдали экспрессию родопсина.
На ФИГ.10C представлены профили экспрессии CRX и рековерина. CRX известен как пан-фоторецепторный маркер, а рековерин известен как фоторецепторный маркер. Эти маркеры не детектируют в контрольной культуре (увеличение ×400, измерительная линейка = 50 мкм).
ПРИМЕР 10: Анализ цитокинов, высвобождающихся из происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток
Терапевтический потенциал стволовых клеток является, в значительной степени, связанным с двумя эффектами: во-первых, с прямой дифференцировкой стволовых клеток в поврежденные клетки; и во-вторых, способностью секретировать различные цитокины или факторы роста, индуцирующие положительные изменения, которые приводят к терапевтическому воздействию на уже существующие клетки. Известно, что стволовые клетки, как правило, секретируют различные цитокины или факторы роста, демонстрируя так называемые паракринные эффекты (Kim et al. Cytokine. 2005). Для исследования профилей секреции происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, выделенных по настоящему изобретению, использовали микрочип с антителами к цитокинам человека (RaybioTech. Norc ross, USA).
Во-первых, клетки стабилизировали в течение 24 часов в среде без FBS и добавок, после чего среду в количестве 1 мл отбирали через равные двухчасовые интервалы. Каждый из образцов среды отбирали в количестве 100 мкл для получения пула образцов, в котором количественно анализировали уровень белков, с последующим исследованием на микрочипах.
Как показано на ФИГ.11, для всех происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, выделенных из трех различных образцов, обнаружили наличие секреции IL-8 и TIMP-2. Кроме того, также наблюдали секрецию различных цитокинов, включая TGF-β, RANTES, CINC-3, ЭОТАКСИН, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Лептин, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI и PFGF-bb (на фиг.11 представлены результаты анализа микрочипа с hUCB-MSC1(A), hUCB-MSC2 (B) и hUCB-MSC3 (C) и распределение антител (D)).
ПРИМЕР 11: 3-мерная культура происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток
Как правило, взрослые стволовые клетки растут, образуя монослой в культуральном планшете. Однако эксперименты показали, что «стволовость» взрослых стволовых клеток увеличивалась в случае, когда взрослым стволовым клеткам позволяли расти не в 2-мерной структуре, а в виде сферы в 3-мерной структуре. В связи с этим, во-первых, культуральные планшеты покрывали 0,7% агарозой толщиной 5 мм или более, для того чтобы клетки не могли прикрепляться к дну планшета, а могли образовывать сферу. Клетки высевали из расчета плотности менее чем 2000 клеток/см2 для предотвращения адгезии между отдельными клетками. Образованные таким образом сферы отделяли от одиночных клеток, используя 40 мкм сито. Как можно видеть на ФИГ.12, стволовые клетки не подвергаются гибели, а при культивировании в системе для сферической культуры образуют сферы, сохраняющие характеристики стволовых клеток. Как представлено на ФИГ.12A-D, наблюдали, что уровни экспрессии эмбриональных маркеров, таких как OCT4, SOX2 и т.п. в клетках, которые поддерживали в сферической культуре, являлись значительно более высокими по сравнению с уровнями экспрессии эмбриональных маркеров в клетках, которые поддерживали в виде монослоя.
Эмбриональные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое клеток - эмбриональных фибробластов мыши, так как кемокины, такие как LIF, из клеток-эмбриональных фибробластов мыши участвуют в поддержании морфологии клеток ES и предотвращают дифференцировку клеток ES. При культивировании на слое клеток - эмбриональных фибробластов мыши, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки не росли в плоской форме, подобно типичным взрослым стволовым клеткам, а формировали 3-мерные колонии. Затем пролиферацию подавляли посредством обработки 0,1 мг/мл митомицина C, клетки STO высевали из расчета плотности 2×105 клетки/мл на покрытые 0,1% желатином планшеты и инкубировали в течение 24 часов, с последующим высеванием происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток на слой клеток STO. Как представлено на ФИГ.13, на клетках STO для клеток наблюдали картину пролиферации, которая была похожа, с течением времени, на картину пролиферации эмбриональной стволовой клетки.
Промышленная применимость
По настоящему изобретению, при культивировании в присутствии фибронектина происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки человека активно пролиферируют без дифференцировки в течение более долгого периода времени, по сравнению с традиционными взрослыми стволовыми клетками. Кроме того, по настоящему изобретению обладающие способностью к дифференцировке в различные виды клеток, такие как хондроциты, остеобласты и адипоциты, плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки можно эффективно применять для лечения некурабельного заболевания, а также заболевания нервной системы, сердечно-сосудистой системы и заболевания костной системы.
Claims (15)
1. Способ выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, из пуповинной крови, где способ включает культивирование выделенных из пуповинной крови моноцитов в культуральном сосуде, содержащем фибронектин, и получение из культуры стволовых клеток, где моноциты культивируют в среде EGM-2 или SNU-1, обогащенной эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 1-40 нг/мл bFGF, аскорбиновой кислотой 0,1-5,0 мкг/мл, 1-40 нг/мл EGF, гидрокортизоном 0,1-1 мкг/мл, 1-40 нг/мл IGF-I или 1-5 нг/мл VEGF и гепарином 20-25 мкг/мл.
2. Способ по п.1, где моноциты выделяют, смешивая пуповинную кровь с Hetasep для удаления эритроцитов, и затем используют Фиколл-пак.
3. Способ получения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, включающий культивирование моноцитов, выделенных из пуповинной крови, в культуральном сосуде, содержащем фибронектин, и выделение происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, из культуры, где моноциты культивируют в среде EGM-2 или SNU-1, обогащенной эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 1-40 нг/мл bFGF, аскорбиновой кислотой 0,1-5,0 мкг/мл, 1-40 нг/мл EGF, гидрокортизоном 0,1-1 мкг/мл, 1-40 нг/мл IGF-I или 1-5 нг/мл VEGF и гепарином 20-25 мкг/мл.
4. Способ по п.1, где стволовые клетки получают из клеточных колоний, образованных после 5-30 суток после начала культивирования.
5. Способ по п.1, где фибронектин наслаивают на культуральный сосуд или где фибронектин содержится в среде для культивирования в форме сфер или трехмерных структур.
6. Способ по п.5, где культуральный сосуд покрыт фибронектином, фибронектин содержится из расчета плотности от 0,1 до 1 мг/мл.
7. Способ по п.3, где клетки, экспрессирующие ZNF281, культивируют в сферической культуре или трехмерной культуре.
8. Способ по п.1, где стадия получения стволовых клеток из культуры включает использование иммунологических свойств стволовых клеток для разделения стволовых клеток.
9. Происходящие из пуповинной крови стволовые клетки, экспрессирующие ZNF281, где стволовые клетки обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:
(а) демонстрируют положительные иммунологические характеристики по отношению к фактору транскрипции c-myc;
(b) прикрепляются к поверхности, покрытой внеклеточным матриксом, и образуют через 5-30 суток после прикрепления клеточные колонии веретенообразной или сферической формы;
(с) демонстрируют CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) со значением от 30 до 45;
(d) демонстрируют негативную иммунологическую характеристику по отношению CD14, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR;
(е) способны дифференцироваться в мезодермальные, эндодермальные и эктодермальные клетки; и
(f) секретируют по меньшей мере один цитокин или хемокин, выбранный из группы, состоящей из TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, ЭОТАКСИНА, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL-13, IL-16, IP-10, Лептина, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI и PFGF-bb.
(а) демонстрируют положительные иммунологические характеристики по отношению к фактору транскрипции c-myc;
(b) прикрепляются к поверхности, покрытой внеклеточным матриксом, и образуют через 5-30 суток после прикрепления клеточные колонии веретенообразной или сферической формы;
(с) демонстрируют CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) со значением от 30 до 45;
(d) демонстрируют негативную иммунологическую характеристику по отношению CD14, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR;
(е) способны дифференцироваться в мезодермальные, эндодермальные и эктодермальные клетки; и
(f) секретируют по меньшей мере один цитокин или хемокин, выбранный из группы, состоящей из TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, ЭОТАКСИНА, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL-13, IL-16, IP-10, Лептина, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI и PFGF-bb.
10. Происходящие из пуповинной крови стволовые клетки по п.9, которые представляют собой плюрипотентные или мультипотентные стволовые клетки.
11. Клеточное терапевтическое средство, содержащее происходящие из пуповинной крови стволовые клетки, экспрессирующие ZNF281, по п.9 или дифференцированные из них клетки.
12. Среда для культивирования выделенных из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, включающая среду EGM-2 или SNU-1, обогащенную эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 1-40 нг/мл bFGF, аскорбиновой кислотой 0,1-5,0 мкг/мл, 1-40 нг/мл EGF, гидрокортизоном 0,1-1 мкг/мл, 1-40 нг/мл IGF-I или 1-5 нг/мл VEGF и гепарином 20-25 мкг/мл.
13. Среда для культивирования по п.12, где стволовые клетки представляют собой взрослые стволовые клетки.
14. Способ культивирования выделенных из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, где способ включает использование среды для культивирования по п.12 или п.13.
15. Способ увеличения «стволовости» выделенных из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, включающий культивирование происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, в сферической культуре или трехмерной культуре.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2009-0023821 | 2009-03-20 | ||
| KR1020090023821A KR100950195B1 (ko) | 2009-03-20 | 2009-03-20 | Ｚｎｆ281을 발현하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법 |
| PCT/KR2010/001338 WO2010107192A2 (ko) | 2009-03-20 | 2010-03-03 | Ｚｎｆ281을 발현하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011142170A RU2011142170A (ru) | 2013-04-27 |
| RU2511417C2 true RU2511417C2 (ru) | 2014-04-10 |
Family
ID=42183944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011142170/10A RU2511417C2 (ru) | 2009-03-20 | 2010-03-03 | Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10584312B2 (ru) |
| EP (1) | EP2410046B1 (ru) |
| JP (2) | JP5995720B2 (ru) |
| KR (1) | KR100950195B1 (ru) |
| CN (1) | CN102395673B (ru) |
| AU (1) | AU2010225612B2 (ru) |
| ES (1) | ES2722930T3 (ru) |
| MY (1) | MY160164A (ru) |
| PL (1) | PL2410046T3 (ru) |
| RU (1) | RU2511417C2 (ru) |
| WO (2) | WO2010107159A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645255C1 (ru) * | 2016-12-16 | 2018-02-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100950195B1 (ko) | 2009-03-20 | 2010-03-29 | 서울대학교산학협력단 | Ｚｎｆ281을 발현하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법 |
| JP5833126B2 (ja) | 2010-09-08 | 2015-12-16 | カンステム バイオテック カンパニー リミテッド | ウマ科動物の羊水由来の多分化能幹細胞及びそれを製造する方法 |
| US8940294B2 (en) | 2012-03-02 | 2015-01-27 | Tissuetech, Inc. | Methods of isolating and culturing stem cells |
| CN103396995B (zh) * | 2013-07-16 | 2015-09-23 | 广州赛哲生物科技有限公司 | 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法 |
| HRP20200701T1 (hr) * | 2013-11-01 | 2020-12-11 | Bbhc Co. Ltd. | Postupak za stvaranje pluripotentne matične stanice inducirane od mezenhimalne matične stanice i inducirana pluripotentna matična stanica stvorena postupkom |
| ES2871252T3 (es) * | 2015-07-14 | 2021-10-28 | Medimmune Llc | Método para detectar células madre cancerosas |
| US10384207B2 (en) | 2015-07-21 | 2019-08-20 | Neuro Probe Incorporated | Assay apparatus and methods |
| US20210355437A1 (en) | 2015-09-02 | 2021-11-18 | Restem Llc | Factor rich product from umbilical cord mesenchymal stem cells |
| WO2017123312A2 (en) | 2015-09-02 | 2017-07-20 | Regeneration Worldwide Company, Inc. | Composition and methods of using umbilical cord lining stem cells |
| CN105087494A (zh) * | 2015-09-11 | 2015-11-25 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种乳腺癌干细胞的培养方法 |
| WO2017094879A1 (ja) * | 2015-12-03 | 2017-06-08 | タカラバイオ株式会社 | 間葉系幹細胞の製造方法 |
| JP6912789B2 (ja) * | 2016-03-16 | 2021-08-04 | 株式会社日本触媒 | 神経幹細胞の培養方法、およびニューロスフェロイドの形成方法 |
| CN109152800A (zh) * | 2016-08-01 | 2019-01-04 | 胚胎发育私人有限公司 | 皮肤护理制剂 |
| KR101798217B1 (ko) | 2016-10-21 | 2017-11-15 | 차의과학대학교 산학협력단 | 만능줄기세포로부터 유래된 중간엽줄기세포를 선별하는 방법 |
| CN109666630A (zh) * | 2017-10-17 | 2019-04-23 | 澳门大学 | 多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及其培养基和应用 |
| CN109112099A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-01-01 | 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 | 一种提高单核细胞向多潜能细胞转化的无血清培养基 |
| CN111424014B (zh) * | 2019-11-22 | 2022-03-29 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基 |
| TW202208613A (zh) * | 2020-05-05 | 2022-03-01 | 美商加速生物科學有限公司 | 非永生的多潛能幹細胞 |
| CN112430626A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-03-02 | 成都康景生物科技有限公司 | 一种基因修饰的脐间充质干细胞、制备方法及应用 |
| US20230406897A1 (en) * | 2020-12-04 | 2023-12-21 | PRIMORIS THERAPEUTICS Co., Ltd. | Method for isolating and culturing cord blood stem cells expressing gdf-3 at high level, and use of gdf-3 |
| US11674090B1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-13 | Honeywell International Inc. | Energy optimization in fluid catalytic cracking and dehydrogenation units |
| EP4484554A1 (en) | 2022-02-25 | 2025-01-01 | Kangstem Biotech Co., Ltd. | Method for culturing stem cells using microcarrier |
| CN118891359A (zh) | 2022-02-25 | 2024-11-01 | 康干细胞生物科技有限公司 | 使用无血清培养基的干细胞培养方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030224411A1 (en) * | 2003-03-13 | 2003-12-04 | Stanton Lawrence W. | Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells |
| US20040005559A1 (en) * | 2000-07-24 | 2004-01-08 | Loring Jeanne F. | Markers of neuronal differentiation and morphogenesis |
| US20040136967A1 (en) * | 2002-02-25 | 2004-07-15 | Kansas State University Research Foundation | Cultures, products and methods using stem cells |
| RU2343928C1 (ru) * | 2007-04-03 | 2009-01-20 | Открытое акционерное общество "Институт стволовых клеток человека" | Способ получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020013480A (ko) * | 1998-12-04 | 2002-02-20 | 추후기재 | 사람 뇌의 내피세포 및 성장배지 및 원시 ｃｄ34+ｃｄ38-골수 간세포의 증가방법 |
| US6610535B1 (en) * | 2000-02-10 | 2003-08-26 | Es Cell International Pte Ltd. | Progenitor cells and methods and uses related thereto |
| EP1367899A4 (en) * | 2001-02-14 | 2004-07-28 | Leo T Furcht | TOTIPOTENT ADULT STEM CELLS, SOURCES OF SUCH CELLS, METHODS FOR OBTAINING AND MAINTAINING SAME, METHODS FOR DIFFERENTIATING THESE CELLS, METHODS OF USING SAME, AND CELLS DERIVED FROM THE ABOVE-MENTIONED CELLS |
| TWI288779B (en) * | 2002-03-28 | 2007-10-21 | Blasticon Biotech Forschung | Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use |
| WO2004033396A2 (en) * | 2002-10-08 | 2004-04-22 | American National Red Cross | Method for enriching adherent monocyte populations |
| US20060223177A1 (en) * | 2003-06-27 | 2006-10-05 | Ethicon Inc. | Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same |
| WO2005056778A1 (ja) * | 2003-12-11 | 2005-06-23 | Riken | 造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法 |
| WO2006012404A2 (en) * | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Case Western Reserve University | Novel cell populations and uses thereof |
| KR100697326B1 (ko) * | 2005-12-02 | 2007-03-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Ｏｃｔ４ 발현능을 가지는 제대혈 유래 다분화능 성체줄기세포 및 그의 제조방법 |
| WO2008110570A1 (en) | 2007-03-13 | 2008-09-18 | Medizinische Universität Graz | Method to study proliferation of endothelial progenitor cells and the potential influence of compounds on their proliferation behaviour |
| WO2008149129A1 (en) | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Nova Thera Limited | Cell expansion |
| KR100950195B1 (ko) | 2009-03-20 | 2010-03-29 | 서울대학교산학협력단 | Ｚｎｆ281을 발현하는 제대혈 유래 만능 줄기세포의 분리방법 |
-
2009
- 2009-03-20 KR KR1020090023821A patent/KR100950195B1/ko active Active
- 2009-05-01 WO PCT/KR2009/002333 patent/WO2010107159A1/ko not_active Ceased
-
2010
- 2010-03-03 AU AU2010225612A patent/AU2010225612B2/en active Active
- 2010-03-03 EP EP10753642.7A patent/EP2410046B1/en active Active
- 2010-03-03 PL PL10753642T patent/PL2410046T3/pl unknown
- 2010-03-03 US US13/257,961 patent/US10584312B2/en active Active
- 2010-03-03 ES ES10753642T patent/ES2722930T3/es active Active
- 2010-03-03 CN CN201080016872.7A patent/CN102395673B/zh active Active
- 2010-03-03 WO PCT/KR2010/001338 patent/WO2010107192A2/ko not_active Ceased
- 2010-03-03 MY MYPI2011004459A patent/MY160164A/en unknown
- 2010-03-03 RU RU2011142170/10A patent/RU2511417C2/ru active
- 2010-03-03 JP JP2012500708A patent/JP5995720B2/ja active Active
-
2015
- 2015-01-05 JP JP2015000016A patent/JP6038962B2/ja active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040005559A1 (en) * | 2000-07-24 | 2004-01-08 | Loring Jeanne F. | Markers of neuronal differentiation and morphogenesis |
| US20040136967A1 (en) * | 2002-02-25 | 2004-07-15 | Kansas State University Research Foundation | Cultures, products and methods using stem cells |
| US20030224411A1 (en) * | 2003-03-13 | 2003-12-04 | Stanton Lawrence W. | Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells |
| RU2343928C1 (ru) * | 2007-04-03 | 2009-01-20 | Открытое акционерное общество "Институт стволовых клеток человека" | Способ получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645255C1 (ru) * | 2016-12-16 | 2018-02-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5995720B2 (ja) | 2016-09-21 |
| MY160164A (en) | 2017-02-28 |
| WO2010107192A2 (ko) | 2010-09-23 |
| ES2722930T3 (es) | 2019-08-20 |
| JP6038962B2 (ja) | 2016-12-07 |
| JP2012520671A (ja) | 2012-09-10 |
| CN102395673A (zh) | 2012-03-28 |
| WO2010107192A3 (ko) | 2011-02-24 |
| EP2410046B1 (en) | 2019-01-23 |
| WO2010107159A1 (ko) | 2010-09-23 |
| RU2011142170A (ru) | 2013-04-27 |
| JP2015091254A (ja) | 2015-05-14 |
| KR100950195B1 (ko) | 2010-03-29 |
| US10584312B2 (en) | 2020-03-10 |
| PL2410046T3 (pl) | 2019-10-31 |
| EP2410046A4 (en) | 2013-02-27 |
| CN102395673B (zh) | 2015-07-22 |
| AU2010225612A1 (en) | 2011-11-10 |
| EP2410046A2 (en) | 2012-01-25 |
| AU2010225612B2 (en) | 2014-06-26 |
| US20120021509A1 (en) | 2012-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2511417C2 (ru) | Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281 | |
| Montesinos et al. | Human mesenchymal stromal cells from adult and neonatal sources: comparative analysis of their morphology, immunophenotype, differentiation patterns and neural protein expression | |
| US20100105132A1 (en) | Human Mesenchymal stem cells and preparation thereof | |
| Mimuma et al. | Growth factor-defined culture medium for human mesenchymal stem cells | |
| JP6812003B2 (ja) | 肝細胞及び肝非実質細胞、並びにそれらの調製方法 | |
| KR20080056182A (ko) | 간엽 줄기 세포의 유도 방법 | |
| Koo et al. | Isolation and characterization of chorionic mesenchymal stromal cells from human full term placenta | |
| AU2009343787A1 (en) | Isolation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells | |
| Sreejit et al. | Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow | |
| JP7660899B2 (ja) | ナイーブ型多能性幹細胞からの栄養外胚葉誘導方法 | |
| CN108138137A (zh) | 增强的脐带来源的粘着干细胞、其制备方法及其用途 | |
| US20150329827A1 (en) | Muse cells isolation and expansion | |
| KR20210044749A (ko) | 무혈청 배지 조성물 | |
| JP7761881B2 (ja) | 類似間葉系幹細胞の製造方法及びこれにより製造された類似間葉系幹細胞 | |
| KR100802011B1 (ko) | 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법 | |
| Chen et al. | The biological characteristics of sheep umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| KR101627907B1 (ko) | Ｚｎｆ２８１을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포의 대량 배양방법 | |
| JP2025538784A (ja) | 馴化培地及びその使用 | |
| CN1961068A (zh) | 骨髓基质细胞培养神经干细胞的方法和组合物 | |
| JP2019076008A (ja) | 骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または神経細胞に分化可能な前駆細胞、その作製方法、およびその使用方法 | |
| Ma et al. | Identification and multilineage potential research of a novel type of Adipose-Derived mesenchymal stem cells from goose inguinal groove | |
| KR101158664B1 (ko) | Ｚｎｆ２８１을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포의 대량 배양방법 | |
| WO2020040293A1 (ja) | 間葉系幹細胞の製造方法 | |
| CN1920010A (zh) | 一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法 | |
| KR20120030515A (ko) | Ｚｎｆ２８１을 발현하는 제대혈 유래 줄기세포의 대량 배양방법 |