RU2509155C1 - Способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии - Google Patents
Способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2509155C1 RU2509155C1 RU2012145337/10A RU2012145337A RU2509155C1 RU 2509155 C1 RU2509155 C1 RU 2509155C1 RU 2012145337/10 A RU2012145337/10 A RU 2012145337/10A RU 2012145337 A RU2012145337 A RU 2012145337A RU 2509155 C1 RU2509155 C1 RU 2509155C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- amyloid
- cellulose acetate
- protein
- acetate membrane
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 48
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 11
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 12
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 58
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 32
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 206010002023 Amyloidoses Diseases 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 101100298534 Mus musculus Prnp gene Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 3
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101150044568 PRNP gene Proteins 0.000 description 3
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 230000007082 Aβ accumulation Effects 0.000 description 2
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 108010057077 prion protein (90-231) Proteins 0.000 description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 102100026044 Biotinidase Human genes 0.000 description 1
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 1
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000005531 Immunoglobulin Light-chain Amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- -1 Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids Chemical class 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940071204 lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010086507 peptide-chain-release factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 1
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков. Также предложен набор для детекции белков в амилоидном состоянии. Изобретение может быть использовано в медицине для диагностики амилоидозов. 2 н. и 7 з. п. ф-лы, 6 ил., 7 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к молекулярной биологии и медицинской диагностике, в частности к способу диагностики амилоидозов, основанном на детекции амилоидов, в том числе их инфекционных вариантов - прионов, в биологических жидкостях животных и человека.
Предшествующий уровень техники
Амилоиды - это нерастворимые белковые агрегаты, имеющие фибриллярную структуру, и устойчивые к действию протеаз. Амилоидные фибриллы представляют собой линейные полимеры, состоящие из нековалентно связанных между собой молекул белка. Эти полимеры образуются за счет присоединения белковых мономеров к их концам; при этом процесс роста сопровождается обогащением присоединяемых мономеров β-слоями, которые располагаются перпендикулярно оси полимеров, связанной с конформационной перестройкой с формированием специфичной "кросс-β" структуры. Для амилоидов характерно взаимодействие с некоторыми красителями, прежде всего, с конго красным и тиофлавином Т (Chiti F., Dobson C.M. 2006. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366).
Классификация амилоидозов сложна и неоднозначна: выделяют системные амилоидозы (поражаются многие органы) и орган-специфичные амилоидозы, первичные амилоидозы (накопление амилоидов приводит к заболеванию) и вторичные (накопление амилоидов обусловлено каким-то другим заболеванием). Наконец, амилоидозы разделяют на неинфекционные и инфекционные (прионные) (Sipe J.D., Cohen A.S. 2000. History of the amyloid fibril. J. Struct. Biol. 130, 88-98).
Интерес к химической и физической природе амилоидов обусловлен, в первую очередь, их связью с обширной группой заболеваний человека и животных. Эти заболевания объединяют под общим названием амилоидозы. Некоторые из этих заболеваний, обусловленные особой разновидностью амилоидов, называемых прионами, трансмиссивны. Прионные амилоиды описаны не только у млекопитающих, но и у низших эукариот, у которых они выступают в роли нехромосомно наследуемых детерминант.
Инфекционный прионный белок животных, названный PrPSc, представляет собой особую конформационно-измененную изоформу клеточного белка PrPC, отличающуюся от него по своей пространственной структуре. Инфекционная форма белка PrPSc, попадая в организм извне или спонтанно в нем возникая, способна стимулировать превращение нормальной формы PrPC в патогенную аномальную форму PrPSc посредством белок-белковых взаимодействий. Таким образом обеспечивается автокаталитическое поддержание прионной изоформы белка (Prusmer, S.B., Scott, M.R., DeArmond,S.J., Cohen,F.E. (1998) Prion protein biology. Cell, 93, 337-348). К числу наиболее известных заболеваний животных этого типа относят так называемое «коровье бешенство».
К числу наиболее известных заболеваний человека, связанных с образованием амилоидов, относят амилоидозы центральной нервной системы (болезни Крейтцфельдта-Якоба, Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона), а также сахарный диабет типа 2 и некоторые формы спиноцеребральной атаксии и катаракты (Галкин А.П., Миронова Л.Н., Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Генетика (2006) 42, №11, 1558-1570).
Доступные в настоящее время методы диагностики прионных заболеваний основаны на исследовании инфекционности образцов тканей заболевшей особи или на иммунодетекции патогенной формы белка PrP. Первый метод потенциально может быть весьма чувствительным, однако его недостатком является длительное время, проходящее между инокуляцией инфекционного материала подопытному животному и развитием у него заболевания. Возможности детекции патогенной формы белка могут быть ограничены ее низким содержанием в тканях и жидкостях (кровь, моча, лимфа, слюна).
Получены моноклинальные антитела, различающие патогенную и нормальную формы белка PrP (Korth, С., Stierii, В., Streit, P., Moser, M., Schaller, О., Fisher, R., Schultz-Schaeffer, W., Kretzschmar, H., Raeber, A., Braun, U., Ehrensperger, F., Homemann, S., Glockshuber, R., Riek, R., Billeter, M., Wuthrich, K. and Oesch, B. (1997) Prion PrPSc-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature, 390, 74-77; O'Nuallain, В., Wetzel, R. (2002) Conformational Abs recognizing a generic amyloid fibril epitope. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 1485-1490). Тем не менее, практикуемые ныне методы диагностики основаны на исследовании аутопсийных образцов тканей мозга.
В последнее время появились попытки разработать новые методы диагностики прионных заболеваний, основанные на иных принципах. Один из таких подходов основан на способности прионных белков переходить в патогенную форму in vitro. В подобных экспериментах смешивают в пробирке белок, находящийся в прионном состоянии, с его неприонным вариантом и наблюдают превращение нормального белка в прионную форму. Как мы уже отмечали выше, такое превращение проходит эффективно для белка Sup35 дрожжей, но не для белка PrP млекопитающих. Был разработан способ увеличения скорости превращения белка PrP в прионную форму. Этот метод основан на периодическом ультразвуковом дроблении прионных агрегатов (Saborio, G.P., Permanne, В. and Soto, С. (2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature, 411, 810-813).
Многообещающей альтернативой существующим подходам для диагностики прионных заболеваний, а также для создания принципиально новых препаратов с возможным терапевтическим действием является процедура конструирования и селективного отбора коротких олигонуклеотидов (аптамеров) ДНК-ового или РНК-ового происхождения из огромного набора исходной смеси химически синтезированных фрагментов со случайной последовательностью ("SELEX" - Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), Klug S.J., Famulok M. (1994) All you wanted to know about SELEX. Molecular Biology Reports, 20, 97-107).
Так в патентной заявке РСТ W02006138676 описаны группа полинуклеотидов (аптамеров), обладающих способностью к связыванию с белком PrP, и способ детекции белка PrP с использованием указанных аптамеров.
Однако до сих пор не существует метода определения концентрации патогенного прионного белка в биологических жидкостях и тканях (кроме мозга) больных животных вследствие его очень маленьких количеств. Одной из основных проблем создания метода выявления патогенного прионного белка является концентрирование прионного белка до детектируемых количеств.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является создание быстрого, эффективного и надежного способа детектирования белков в амилоидном состоянии.
В результате тщательного исследования авторами настоящего изобретения был разработан способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей, ткани или биологической жидкости млекопитающего, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров или антител. Размер пор мембраны выбирается таким, чтобы задерживать прионные полимеры, но пропускать все остальные вещества с более низкой молекулярной массой.
Достоинствами и преимуществами настоящего изобретения являются простота, доступность, экономичность, возможность быстрого и одновременного анализа большого количества образцов и высокая чувствительность способа за счет неограниченной возможности концентрирования белков в амилоидном состоянии за счет пропускания неограниченного количества тестируемого образца через мембрану.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ неинвазивной диагностики белков в амилоидном состоянии в биологических жидкостях млекопитающего, в частности человека, аналогов которому в настоящее время нет.
Для детекции белков в амилоидном состоянии могут быть использованы аптамеры и антитела, специфичные к белкам в амилоидном состоянии.
Так, например, ранее авторы настоящего изобретения в результате тщательного скрининга отобрали аптамеры, обладающие способностью эффективно и специфически связываться с белком Sup35 дрожжей S. cerevisiae в фибриллярном амилоидном состоянии и не связываться с его мономерной формой, показана возможность использования указанных аптамеров для детектирования прионных форм белков млекопитающих, в частности белка PrP, в инфекционном материале животных, а также полиглутаминовых белков, например Q70, являющегося аналогом белка гентингтина, и разработан способ детектирования указанных прионных форм белков с использованием указанных аптамеров (российская патентная заявка 2010125875).
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление способа детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего или образец биологической жидкости млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров или антител.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором биологической жидкостью является кровь, лимфа, слюна или моча млекопитающего.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором концентрирование белков в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране осуществляют пропусканием образца лизата через ацетатцеллюлозную мембрану.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором используют ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 0,1-0,4 мкм.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором детектирование белков в амилоидном состоянии, адсорбированных на ацетатцеллюлозной мембране, осуществляют с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфических к белкам в амилоидном состоянии.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанный конъюгат содержит метку, узнаваемую антителами.
Также целью настоящего изобретения является предоставление набора для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащего ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии с описанным выше способом.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше набора, в котором ацетатцеллюлозная мембрана имеет размер пор 0,1-0,4 мкм.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше набора, в котором указанным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).
Более детально настоящее изобретение описано ниже.
Подробное описание настоящего изобретения
Концентрирование белков в амилоидном состоянии в способе согласно настоящему изобретению осуществляют путем пропускания тестируемого образца через мембрану. Размер пор мембраны выбирается таким, чтобы задерживать прионные полимеры, но пропускать все остальные вещества с более низкой молекулярной массой. Авторами настоящего изобретения было показано, что предпочтительно использование ацетатцеллюлозной мембраны с размером пор 0,1-0,4 мкм, наиболее предпочтительно 0,2 мкм.
Образцом культуры ткани млекопитающего может быть как необработанный лизат клеток, так и лизат, предварительно обработанный с целью его очистки от белков, не образующих амилоиды, для уменьшения фона неспецифического связывания аптамера с такими белками из изучаемого образца. Однако способ согласно настоящему изобретению является достаточно эффективным и обладает высокой чувствительностью за счет возможности неограниченного концентрирования при отсутствии необходимости очистки от белков, не образующих амилоиды, так что предварительная обработка лизата перед пропусканием через мембрану не является обязательной.
Исследуемыми образцами также могут быть растворы веществ, выделенных из биологических жидкостей или тканей животного или человека, в том числе предназначенные для производства лекарственных препаратов, биологических добавок или косметических средств.
Исследуемыми образцами также могут быть биологические жидкости млекопитающего, в частности человека. Биологические жидкости, которые могут быть использованы в способе согласно настоящему изобретению, включают кровь, лимфу, слюну, мочу, но не ограничиваются ими.
Возможность пропускания неограниченного количества тестируемого образца через мембрану предоставляет неограниченные возможности концентрирования белков в амилоидном состоянии на указанной мембране, что обеспечивает высокую чувствительность способа детекции согласно настоящему изобретению и предоставляет возможность анализа биологических жидкостей с очень малыми количествам PrPSc. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ неинвазивной диагностики белков в амилоидном состоянии в биологических жидкостях млекопитающего, в частности человека, аналогов которому в настоящее время нет.
Тестирование наличия в образцах белков в амилоидном состоянии, сорбированных на мембране, проводят с использованием аптамеров или антител, специфичных к белкам в амилоидном состоянии.
Термин "аптамер", используемый в настоящем изобретении, означает одноцепочечный олигонуклеотид, обладающий способностью к связыванию с другой молекулой (молекулой-мишенью) и образованию с ней относительно устойчивого комплекса. При этом такое связывание происходит не за счет стандартного связывания между парами оснований по Уотсону-Крику за счет водородных связей, а за счет других типов нековалентных связей. Такие типы связей включают нековалентные водородные связи, электростатическое взаимодействие, связывание по Ван дер Вальсу, гидрофобные взаимодействия или их комбинации. При этом такой аптамер связывается с целевой молекулой с гораздо более высокой аффиностью, чем с остальными молекулами, присутствующими в образце.
Способы конструирования и определения характеристик связывания аптамеров с целевыми молекулами хорошо известны из уровня техники (см., например, Lorsch and Szostak (1996) или патенты США №5,582,981, 5,595,877, 5,637,459). Сами аптамеры могут быть получены любым известным методом, включая химический синтез, методы рекомбинантных ДНК, с использованием стандартных методов очистки. Также термин «аптамер» относится и к вторичным аптамерам, содержащим так называемую «консенсусную» последовательность, полученную путем анализа двух или нескольких аптамеров, связывающихся с одной и той же целевой молекулой. Как правило, длина аптамера может варьироваться от 10 до 40 или более нуклеотидов, необходимых для связывания с целевой молекулой.
Аптамеры содержат нуклеотидную последовательность, определяющую специфичность связывания с целевой молекулой, но при этом также могут содержать участки, фланкирующие эту последовательность, которые необходимы, например, для амплификации всего аптамера методом ПЦР, или содержат сайты эндонуклеаз рестрикции для лигирования аптамера в плазмиды, клонирования и т.п. Такие фланкирующие последовательности обычно содержат от 10 до 30 нуклеотидов, при этом часть из этих нуклеотидов может иметь случайный состав.
Также аптамеры согласно настоящему изобретению могут содержать различные ковалентно связанные функциональные модификации и дополнительные лиганды, необходимые для детектирования связывания аптамера с целевой молекулой, например флуоресцентные красители, биотин или различные ферменты, активность которых легко детектировать (пероксидазы, люциферазы, щелочной фосфатазы и подобные им). Такие модифицированные аптамеры могут быть получены стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники, например, в ходе твердофазного синтеза олигонуклеотидов или в растворе с использованием фосфотриэфирного метода.
Примером аптамеров, специфически связывающихся с белками в амилоидном состоянии, являются аптамеры S1-S4, содержащие нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1-4, полученные авторами настоящего изобретения ранее с использованием процедуры SELEX (Systematic Evolution ofLigands by Exponential enrichment) и описанные в российской патентной заявке 2010125875. Аптамер S4 (SEQ ID NO:4) является предпочтительным. Указанные олигонуклеотиды обладают способностью связываться с белками, образующими амилоиды, с высокой специфичностью и эффективностью. Также указанные олигонуклеотиды могут быть использованы для детектирования белков, образующих амилоиды, в частности, прионных белков.
Для детектирования связывания олигонуклеотидов (аптамеров) согласно настоящему изобретению с белками, образующими амилоиды, могут использоваться любые методы, известные специалистам в данной области техники. Могут быть применены методы с использованием радиоактивных изотопов, когда для связывания с целевой молекулой используются радиоактивно меченные олигонуклеотиды, например 32Р-меченные олигонуклеотиды, а степень связывания определяют после отмывки образца по остаточной радиоактивности. Могут быть использованы методы количественной ПЦР, например ПЦР в реальном времени, когда определяют количество олигонуклеотидов, связавшихся с целевой молекулой и оставшихся в составе комплекса аптамер - целевая молекула, после денатурации такого комплекса.
Также могут быть использованы функциональные модификации олигонуклеотидов (аптамеров) или дополнительные лиганды, необходимые для детектирования связывания аптамера с целевой молекулой, например флуоресцентные красители, например карбоксифлуоресцеин (FAM), биотин или различные ферменты, активность которых легко детектировать (пероксидазы, люциферазы, щелочной фосфатазы и подобные им). В случае использования биотинилированного производного олигонуклеотида используют пероксидазу, люциферазу и щелочную фосфатазу слитую со стрептовидином или авидином, при этом стрептовидин и авидин связывается с биотином, а пероксидазу, щелочную фосфатазу и люциферазу используют для детектирования связывания.
Также могут быть использованы конъюгаты аптамера с меткой, например FAM, а в качестве молекулы, позволяющей детектировать связывание указанного аптамера с амилоидами, используют антитела к такой метке.
Один из вариантов воплощения настоящего изобретения предоставляет набор для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащий ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Ацетатцеллюлозная мембрана в указанном наборе имеет размер пор 0,1-0,4 мкм, предпочтительно 0,2 мкм. Наиболее предпочтительным ионным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).
Краткое описание рисунков
На Фиг.1 приведена карта плазмиды pL-prnP.
На Фиг.2 приведена карта плазмиды pL-moPnP.
На Фиг.3 показаны результаты сравнительного анализа адсорбции белков лизатов дрожжей при прохождении растворов через ацетатцеллюлозную или нитроцеллюлозную мембрану. Белки окрашивали неспецифическим красителем Понсо.
На Фиг.4 показано влияние детергентов SDS и саркозила на эффективность адсорбции амилоидов PrP на ацетатцеллюлозную мембрану. В первой точке исходный лизат разведен в 10 раз, в каждой следующей - последовательные разведения в 4 раза.
На Фиг.5 приведены результаты анализа специфичности связывания аптамера S4 с амилоидами прионного белка (PrP), образованными его укороченной (90-231) или полноразмерной (23-231) формами. В первой точке исходный лизат разведен в 10 раз, в каждой следующей - последовательные разведения в 4 раза.
На Фиг.6 показано влияние присутствия ДНК и РНК на специфичность связывания аптамеров с амилоидным прионным белком. «+» - образцы, обработанные ферментами ДНКазой и РНКазой; «-» - образцы, не обработанные этими ферментами. В первой точке исходный лизат разведен в 10 раз, в каждой следующей - последовательные разведения в 4 раза.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды для получения полноразмерного белка мыши PrP (23-231) и его укороченного варианта PrP (90-231).
Многокопийная плазмида pL-PrnP, содержащая последовательность полноразмерного гена PrnP(23-231) мыши, кодирующую аминокислоты с 23 по 231, под контролем промотора CUP1 была создана на основе вектора pRS425 (Christianson T.W., Sikorski R.S., Dante M., Shero J.H., Hieter P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992. 110, P.119-122). Плазмида была получена в два этапа: последовательность промотора CUP1 из плазмиды pRS316CG [Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate "protein-only" inheritance in yeast // Nature. 1999. Vol.400. P.573-576] была встроена в вектор pRS425 по сайтам XhoI-BamHI. Затем в полученную конструкцию по сайтам BamHI и SacI была встроена последовательность гена PrnP (23-231) мыши. Последовательность, кодирующую фрагмент белка PrP мыши с 23 по 231 аминокислоту, амплифицировали методом ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pcDNA3-l-3F4 (Narwa R. & Harris DA. Prion proteins carrying pathogenic mutations are resistant to phospholipase cleavage of their glycolipid anchors // Biochemistry. 1999. 38(27) P: 8770-7), содержащей ген РrnР мыши, модифицированный для распознавания моноклональными антителами 3F4, и праймеров PrnP (23-231) BamHI-F (SEQ ID NO:5) и PrnP SacI-R (SEQ ID NO:6). Использовали термостабильную полимеразу Pfu «Силекс M» (Россия).
Была использована следующая программа для амплификации фрагментов мышиного гена PrnP: 94°С в течение 2 минут; 2 цикла 94°С в течение 40 секунд, 49°С в течение 40 секунд; 72°С в течение 40 секунд; 24 цикла 94°С в течение 40 секунд, 60°С в течение 40 секунд; 72°С в течение 40 секунд; и в конце 72°С в течение 5 минут.
Правильность последовательности нуклеотидов в полученной плазмиде проверяли секвенированием с использованием стандартных праймеров 21M13F (SEQ ID NO: 7) и 29M13R (SEQ ID NO:8). Карта полученной плазмиды pL-PrnP показана на Фиг.1.
Многокопийная плазмида pL-moPrP (90-231), содержащая последовательность гена PrnP (90-231) мыши, кодирующую аминокислоты с 90 по 231, под контролем промотора GPD была создана на основе вектора pRS425 (Christianson T.W., Sikorski R.S., Dante M., Shero J.H., Hieter P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992. 110, P.119-122). Плазмида была сконструирована путем замещения фрагмента BamHI-Sad, содержащего PrP(90-231)-GFP (1,2 т.п.н.), из плазмиды PGPD-PrP-GFP(LEU2) [Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне // Мол. биол. 2008. Т.42. №1. С.123-130], на фрагмент SacII-SacI, содержащий последовательность PrP (90-231). Последовательность, кодирующую фрагмент белка PrP мыши с 90 по 231 аминокислоту, амплифицировали методом ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиду pcDNA3-1-3F4 (Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне // Мол. биол. - 2008. - Т.42. - №1. - С.123-130) и праймеров PmP (90-231)BamHI-F (SEQ ID NO:9) и PmP SacI-R (SEQ ID NO:6). Использовали программу для амплификации, описанную выше. Правильность последовательности нуклеотидов в полученной плазмиде также определяли, как описано выше. Карта полученной плазмиды pL-moPrP показана на Фиг.2.
Пример 2. Трансформация дрожжей Saccharomyces cerevisiae и получение лизатов, содержащих белок PrP.
В качестве модели использовали штамм 74-D694ΔRNQ1 [psi-] MATa ade1-14 his3Δ200 leu3-112 trp1-289 ura3-52 rnq1::HIS3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Salnikova, A.B., Kryndushkin D.S., Smimov V.N., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids // J Biol Chem. 2005, 280, P.8808-8812).
В этом штамме дрожжей экспрессировали плазмиду, содержащую последовательности, кодирующие PrP 23-231 или PrP 90-231, или в качестве отрицательного контроля плазмиду PRS425, на основе которой были созданы указанные плазмиды.
Для трансформации дрожжей использовали стандартный протокол (Gietz, R.D., Schiesti, R.Н., Willems, А.R., and Woods, R.A. (1995) Yeast 11, 355-360).
Пример 3. Получение лизатов, содержащих белок PrP
Культуру дрожжей растили в 10 мл минимальной среды с соответствующими добавками (аденин, урацил, необходимые аминокислоты и, по необходимости, сульфат меди в качестве индуктора) до стационарной фазы. Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл дистиллированной воды, разливали по 1 мл в пробирки "Эппендорф" и осаждали центрифугированием, в результате чего в каждой пробирке находилось 50-100 мкл клеток. Далее клетки замораживали и хранили на -70°С. Для получения лизата размораживали одну пробирку, добавляли 3-кратный объем стеклянных бус, 100 мкл трис-солевого буфера TBS (30 мМ Tris-HCl pH 7,4,150 мМ NaCl), содержащего 10 мМ ЭДТА, 10 мМ фенилметилсульфонил флуорида (PMSF), 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) и коктейля ингибиторов протеаз (Complete®, Roche Applied Science), в количестве, рекомендованном протоколом изготовителя. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием при 1500 g в течение 4-х минут и осветленный лизат, содержащий полимеры белка PrP, расфасовывали по пробиркам.
Пример 4. Концентрирование белков на мембранах
Ацетатцеллюлозную мембрану (0,2 мкм, Whatman GmbH OE66) смачивали дистиллированной водой и помещали в ячейку вакуумного дот-блоттера БиоРад. Лизаты клеток дрожжей, содержащие белок PrP, разводили до нужной концентрации в буфере TBS с ионным детергентом, делали последовательные разведения этих растворов тем же буфером и вносили в ячейки блоттера по 50 мкл полученных растворов лизатов. С помощью вакуумного (водоструйного) насоса растворы прокачивали через мембрану. Затем в эти ячейки добавляли по 100 мкл буфера TBS с ионным детергентом (SDS - додецилсульфат натрия или саркозил - лаурилсаркозинат натрия), инкубировали 10 минут, после чего буфер удаляли и промывали ячейки еще 2 раза по 100 мкл аналогичным буфером, затем 2 раза по 100 мкл буфером TBS без детергента. После этого мембрану окрашивали раствором красителя Понсо-С для оценки количества белка осевшего на мембране. Для сравнения лизаты дрожжей аналогичным образом пропускали через нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Macherey-Nagel, Германия), адсорбирующую белки. На Фиг.3 показано, что основная масса белков лизатов дрожжей хорошо адсорбируется на нитроцеллюлозной мембране и легко проходит через ацетатцеллюлозу даже при небольших разведениях лизатов.
Пример 5. Изучение связывания аптамеров и антител с белком PrP.
Мембрану инкубировали в течение часа в растворе казеина (4 мг/мл) в TBS буфере, рН 7.4 с 0,05% Твина-20. После этого мембрану погружали в раствор меченого аптамера или антител к прионному белку. Аптамер, меченный флуоресцентной меткой FAM, в количестве 8 пикограмм разводили в 0,5 мл 5 мМ фосфатного буфера (PBS) рН 6,0, содержащем 0,05% Твина-20 и 200 мМ мочевины. Аптамер подвергали денатурации путем кипячения полученного раствора на водяной бане в течение 5 минут. Затем раствор охлаждали при комнатной температуре в течение 5 минут, выдерживали еще 30 минут при комнатной температуре и далее разводили в 8 мл того же фосфатного буфера, содержащего 0,4% казеина. Антитела разводили в буфере TBS рН 7.4 с 0,05% Твина-20 и 4 мг/мл казеина. После часовой инкубации при комнатной температуре мембрану ополаскивали два раза дистиллированной водой и обрабатывали следующим раствором. В случае антител - раствором вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой в том же буфере. В случае аптамеров - вторым раствором служили антитела к FAM в буфере TBS. Далее после часовой инкубации с антителами к FAM и однократной промывки мембраны к мембране приливали раствор вторичных антител в TBS. После инкубации с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, мембрану промывали 3 раза по 15 минут буфером TBS с 0.05% раствором Твина-20 и затем 2 раза по 15 минут буфером TBS. Связывание аптамеров или антител с прионным белком фиксировали на приборе для детекции хемилюминесценции фирмы Vilber Lourmat с использованием смеси проявляющих растворов ECL West Dura system (Thermo Scientific).
Пример 6. Влияние детергентов SDS и саркозила на эффективность адсорбции амилоидов PrP на ацетатцеллюлозной мембране.
На Фиг.4 представлены результаты экспериментов по концентрированию амилоидов PrP на ацетатцеллюлозную мембрану в присутствии детергентов SDS или саркозила (натрий лауроилсаркозина). Из Фиг.2 видно, что амилоиды PrP растворяются в SDS и не адсорбируются на ацетатцеллюлозной мембране. Для концентрирования амилоидов PrP в качестве детергента следует использовать саркозил.
Пример 7. Доказательство специфичности связывания аптамеров с прионным белком.
Для доказательства специфичности связывания аптамеров с прионным белком, сконцентрированным на ацетатцеллюлозной мембране, аналогичный эксперимент проводили с раствором аптамера, полученного к урокиназе и имеющего тот же размер (70 нуклеотидов), что и аптамер к прионному белку (Skrypina NA, Savochkina LP, Beabealashvilli RSh. In vitro selection of single-stranded DNA aptamers that bind human pro-urokinase. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004; 23:891-3). Как видно из Фиг.5, аптамер к урокиназе не связывается как с полноразмерным, так и укороченным прионным белком. Также видно, что чувствительность аптамеров к прионному белку может быть выше, чем у моноклональных антител к этому же белку. Несмотря на то что используемый аптамер показывает некоторое неспецифическое связывание с контрольным лизатом, его взаимодействие с прионным белком не менее чем в 10 раз превышает фоновое связывание.
Для того чтобы выяснить, происходит ли на мембране неспецифическое связывание аптамера с ДНК и РНК, присутствующими в лизате дрожжей, которые могут частично задерживаться на мембране, был проведен эксперимент по удалению ДНК и РНК из лизатов путем обработки их ДНКазой и РНКазой (в концентрации 0,1 мг/мл каждая) в течение 30 минут при комнатной температуре. Как видно из Фиг.6, присутствие или отсутствие ДНК и РНК в лизате практически никак не влияло на эффективность связывания аптамера с прионным белком.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения и включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.
Claims (9)
1. Способ детекции белков в амилоидном состоянии, включающий следующие стадии:
- получение образца лизата культуры дрожжей, или ткани млекопитающего, или биологической жидкости млекопитающего;
- добавление к образцу ионного детергента;
- концентрирование белков в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране; и
- детектирование белков в амилоидном состоянии, адсорбированных на ацетатцеллюлозной мембране, с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.
- получение образца лизата культуры дрожжей, или ткани млекопитающего, или биологической жидкости млекопитающего;
- добавление к образцу ионного детергента;
- концентрирование белков в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране; и
- детектирование белков в амилоидном состоянии, адсорбированных на ацетатцеллюлозной мембране, с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологической жидкостью является кровь, лимфа, слюна или моча млекопитающего.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование белков в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране осуществляют пропусканием образца через ацетатцеллюлозную мембрану.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 0,1-0,4 мкм.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный конъюгат содержит метку, узнаваемую антителами.
7. Набор для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащий:
ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии со способом по п.1.
ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии со способом по п.1.
8. Набор по п.7, отличающийся тем, что ацетатцеллюлозная мембрана имеет размер пор 0,1-0,4 мкм.
10. Набор по п.8, отличающийся тем, что указанным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012145337/10A RU2509155C1 (ru) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012145337/10A RU2509155C1 (ru) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2509155C1 true RU2509155C1 (ru) | 2014-03-10 |
Family
ID=50192149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012145337/10A RU2509155C1 (ru) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2509155C1 (ru) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995013084A1 (en) * | 1992-05-11 | 1995-05-18 | Miles Inc. | Cathepsin d is an amyloidogenic protease in alzheimer's disease |
| EA005582B1 (ru) * | 1999-12-29 | 2005-04-28 | Уайт Холдингз Корпорейшн | Способы детекции амилоидогенных белков |
| EP1821103A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-22 | Cellzome Ag | Methods for the identification of gama-secretase modulators |
| RU2379300C2 (ru) * | 2004-04-05 | 2010-01-20 | Носкира, С.А. | Ингибиторы gsk-3 |
| EA015654B1 (ru) * | 2006-03-30 | 2011-10-31 | Глаксо Груп Лимитед | Антитела против бета-амилоидного пептида |
-
2012
- 2012-10-25 RU RU2012145337/10A patent/RU2509155C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995013084A1 (en) * | 1992-05-11 | 1995-05-18 | Miles Inc. | Cathepsin d is an amyloidogenic protease in alzheimer's disease |
| EA005582B1 (ru) * | 1999-12-29 | 2005-04-28 | Уайт Холдингз Корпорейшн | Способы детекции амилоидогенных белков |
| RU2379300C2 (ru) * | 2004-04-05 | 2010-01-20 | Носкира, С.А. | Ингибиторы gsk-3 |
| EP1821103A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-22 | Cellzome Ag | Methods for the identification of gama-secretase modulators |
| EA015654B1 (ru) * | 2006-03-30 | 2011-10-31 | Глаксо Груп Лимитед | Антитела против бета-амилоидного пептида |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2023160981A (ja) | 膜タンパク質を使用する治療用エクソソームの調製 | |
| US7371833B1 (en) | Nucleic acid molecules with specific recognition of native PrPSc, production and use | |
| Teng et al. | Identification and characterization of DNA aptamers specific for phosphorylation epitopes of tau protein | |
| Adler et al. | Small, highly structured RNAs participate in the conversion of human recombinant PrPSen to PrPRes in vitro | |
| Carlomagno et al. | Casein kinase II induced polymerization of soluble TDP-43 into filaments is inhibited by heat shock proteins | |
| EP0914614B1 (en) | CHARPERONES CAPABLE OF BINDING TO PRION PROTEINS AND DISTINGUISHING THE ISOFORMS PrPc AND PrPsc | |
| Manuelidis | Nuclease resistant circular DNAs copurify with infectivity in scrapie and CJD | |
| Bibby et al. | Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins | |
| Hmila et al. | A novel method for detection of H9N2 influenza viruses by an aptamer-real time-PCR | |
| US6426409B1 (en) | Nucleic acid molecules that bind prion proteins and processes for the production thereof | |
| JP5048522B2 (ja) | 誤って折り畳まれたタンパク質およびプリオンを検出する方法 | |
| Hmila et al. | Inhibition of α-synuclein seeding-dependent aggregation by ssDNA aptamers specific to C-terminally truncated α-synuclein fibrils | |
| RU2509155C1 (ru) | Способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии | |
| Zhu et al. | Nucleolin interacts with the rabbit hemorrhagic disease virus replicase RdRp, nonstructural proteins p16 and p23, playing a role in virus replication | |
| KR102554337B1 (ko) | 인플루엔자 a h5n1 바이러스에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 | |
| JP5191028B2 (ja) | 異常型プリオン蛋白質由来の原繊維に結合するｒｎａアプタマー | |
| CN115927346B (zh) | 一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT-Tan及其应用 | |
| WO2010151169A1 (ru) | Олигонуклеотид и его конъюгат для детекции белков в амилоидном состоянии и способ детекции белков в амилоидном состоянии | |
| Talib et al. | Aptamer validation by western blot–an overview | |
| CN114634936B (zh) | 一种结合β淀粉样蛋白42的核酸适配体及其应用 | |
| CN115960884B (zh) | 靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT-Tan的筛选方法 | |
| US20060257904A1 (en) | Agglomeration protein cascades, compositions and methods regarding the same | |
| US7754865B2 (en) | Compositions and methods for enhancing the identification of prion protein PrPSc | |
| US20050261486A1 (en) | Compositions and methods for binding agglomeration proteins | |
| Dehkordi et al. | Bio-Membrane SELEX as a new approach for selecting ss-DNA aptamers that bind to the hydatid cyst laminated layer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |