RU2506270C2 - Пептид-антагонист активности интерлейкина-15 - Google Patents
Пептид-антагонист активности интерлейкина-15 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2506270C2 RU2506270C2 RU2011117356/04A RU2011117356A RU2506270C2 RU 2506270 C2 RU2506270 C2 RU 2506270C2 RU 2011117356/04 A RU2011117356/04 A RU 2011117356/04A RU 2011117356 A RU2011117356 A RU 2011117356A RU 2506270 C2 RU2506270 C2 RU 2506270C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- seq
- interleukin
- acid sequence
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 128
- 229940124124 Interleukin 15 antagonist Drugs 0.000 title 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 8
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 229940083963 Peptide antagonist Drugs 0.000 claims 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 102000009270 Tumour necrosis factor alpha Human genes 0.000 abstract 1
- 108050000101 Tumour necrosis factor alpha Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical group C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 4
- HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N Cys-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- -1 Thr amino acid Chemical class 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 108010024607 phenylalanylalanine Chemical group 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 125000000972 4,5-dimethylthiazol-2-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C1=C(N=C(*)S1)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical group SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical group NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001003140 Homo sapiens Interleukin-15 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N Leu-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001019594 Mus musculus Interleukin-15 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Chemical group 0.000 description 1
- 208000005775 Parakeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- HSRXSKHRSXRCFC-WDSKDSINSA-N Val-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSRXSKHRSXRCFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 201000007241 cutaneous T cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 208000025638 primary cutaneous T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5443—IL-15
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2086—IL-13 to IL-16
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/04—Antipruritics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной фармакологии и, в частности, к пептиду, представляющему собой производное последовательности интерлейкина-15 (IL-15), оптимизированное для ингибирования биологической активности этого соединения. В изобретении показано, что пептид при связывании с субъединицей alfa рецептора (IL-15Rα) ингибирует пролиферацию Т-клеток, индуцированную IL-15, индукцию фактора опухолевого некроза α (TNFα), вызываемую IL-15, и экспрессию IL-8 и IL-6, вызываемую IL-15Rα. Также изобретение относится к применению пептида при лечении патологий, при которых аномальная экспрессия IL-15 или IL-15Rα связана с течением заболевания, такого как ревматоидный артрит (AR) и рак предстательной железы. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной фармакологии и, в частности, к пептиду, представляющему собой производное интерлейкина-15 (IL-15), которое препятствует связыванию цитокина с субъединицей alfa рецептора (IL-15Rα) и вследствие этого является полезным для лечения заболеваний, связанных с аномальной экспрессией IL-15 и/или IL-15Rα в течение заболевания.
Предшествующий уровень техники
Цитокин, известный как IL-15, представляет собой гликопротеин с массой 14-15 кДа, который был идентифицирован одновременно для двух групп в качестве фактора, активирующего T-клетки (Grabstein, K.H. et al., Science, 1994, 264, 965-968; Burton, J.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4935-4939). Информационная рибонуклеиновая кислота (иРНК) IL-15 присутствует в широкой гамме клеток и тканей, однако белок редко встречается в супернатанте культур клеток, экспрессирующих транскрипт, так как существует сильный посттранкрипционный контроль его экспрессии на уровне трансдукции и внутриклеточного трафика (Bamford R.N. et al., J. Immunol. 1998, 160: 4418-4426; Kurys G. et al., J. Biol. Chem. 2000, 275: 30653-30659). Кроме того, описано, что IL-15 может существовать в активной в форме в качестве белка мембраны (Musso et al., Blood, 1999, 93: 3531-3539), и совсем недавно отмечено, что он может функционировать в качестве лиганда или в качестве рецептора. IL-15, экспрессируемый в качестве белка, присущего мембранам, действует в качестве рецептора и при связывании с растворимой субъединицей alfa рецептора индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8, активацию киназ, называемых MAPK и FAK, и стимулирует миграцию в клетках карциномы простаты (PC-3), экспрессирующих IL-15 в клеточной мембране (Budalgian et al., J. Biol. Chem. 2004, 40: 42192-42201).
Биологические эффекты IL-15 в качестве лиганда опосредованы через связывание IL-15 с рецептором в клеточной мембране, состоящим из трех субъединиц, называемых α, β и γ. Три субъединицы могут коэкспрессироваться в одной и той же клетке, или может происходить так, что IL-15, связанный с субъединицей alfa, присутствует в клетках, которые экспрессируют только субъединицы β и γ, и индуцирует в данной клетке сигнализацию, известную как феномен транс-сигнализации (Burkett et al., J. Exp. Med. 2004, 200: 825-834). Субъединица β рецептора взаимодействует также с IL-2, представляющим собой цитокин, относительно которого IL-15 проявляет большую структурную гомологичность, а субъединица γ взаимодействует также с другими цитокинами, такими как IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-21. IL-15Rα специфична к IL-15, с которым связывается с очень высоким сродством (Kd=10-11), и может находиться в виде рецептора мембраны или в растворимой форме (Budagian V. et al., J. Biol. Chem. 2004, 24: 40368-75; Mortier et al., J. of Immunology, 2004, 173: 1681-1688).
Замечены высокие уровни экспрессии IL-15, связанные с патогенезом аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как болезнь Крона (Kirman I., Am. J. Gastroenterol. 1996, 91: 1789-1794), псориаз (Rückert R., J. Immunol. 2000, 165: 2240-2250), лейкемии (Yamada Y., Leukemia and Limphoma, 1999, 35: 37-45) и ревматоидный артрит (AR) (McInnes I.B., Immunology Today, 1998, 19: 75-79).
McInnes и соавт. в случае AR нашли аномальность экспрессии IL-15, высокие концентрации в синовиальной жидкости и экспрессию цитокина в клетках синовиальной мембраны. Они предположили, что IL-15 предшествует фактору опухолевого некроза α (TNFα) в каскаде цитокинов, предложив механизм, зависящий от клеточного контакта, по которому T-клетки, активированные IL-15, индуцируют синтез TNFα макрофагами. Кроме того, предложено, что IL-15 действует как важный фактор в миграции T-клеток к синовиальной жидкости (McInnes et al., Nat. Med. 1997, 3: 189-195). Ziolkowska и соавт. сообщили, что IL-15 индуцирует экспрессию IL-17 в суставе больных AR, при этом известно, что данный цитокин стимулирует высвобождение синовиоцитами медиаторов воспаления, таких как IL-6, IL-8, фактор стимуляции колоний гранулоцитов-макрофагов, и простагландина E2, предполагая важную роль IL-15 в патогенезе AR (Ziolkowska et al., J. Immunology 2000, 164: 2832-2838). Недавно было доказано, что IL-15 обостряет артрит, индуцированный коллагеном (по-английски collagen induced artritis, сокращенно CIA) у мыши, трансгенно инфицированной данным цитокином (Yoshihara et al., Eur. J. Immunol. 2007, 37: 2744-2752). Все упомянутые факты приводят к мысли, что действие антагониста IL-15 имеет терапевтический потенциал при лечении AR и других аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Ранее описано, что остаток аспарагиновой кислоты в положении 56 молекулы IL-15 играет важную роль в связывании с субъединицей β рецептора, а остаток глутамина в положении 156 играет важную роль в связывании с субъединицей γ рецептора. Мутеины (измененные белки) этих аминокислот ведут себя как соединения-антагонисты IL-15, которые связываются с субъединицей α рецептора и препятствуют трансдукции сигнала через субъединицы β и γ. Антитела, которые распознают данные аминокислоты, также действуют как антагонисты IL-15 (патенты US 6177079, US 6168783, US 6013480, US 6001973, US 9706931, международная заявка WO 9741232).
Использование антагонистов цитокина было эффективным в моделях на животных в случае псориаза (Villadsen L.S. et al., J. Clin. Invest. 2003, 112: 1571-1580) и в случае AR (Ferrari-Lacraz S. et al., J. Immunol. 2004, 173: 5818-5826).
Ruchatz и соавт. воспроизвели растворимый фрагмент IL-15Rα мыши и показали, что введение данного фрагмента ингибирует артрит, индуцированный коллагеном у мышей DBA/1 (Ruchatz H., J. Immunology, 1998, 160: 5654-5660). Позже, было обнаружено, что IL-15Rα может действовать как мощный агонист биологической функции IL-15 (Mortier E., J. Biol. Chem. 2006, 281: 1612-1619; Rubinstein M.P., PNAS, 2006, 103: 9166-9171).
Genmab подал заявку на антитела человека, специфичные к IL-15 (WO 03017935), в которой описаны четыре антитела. Два из них, обозначаемые 146B7 и 146H5 и связывающиеся с IL-15 в области, взаимодействующей с субъединицей γ рецептора, ингибируют клеточную пролиферацию, индуцированную IL-15, клеточной линии CTLL-2 и в одноядерных клетках периферической крови (по-английски peripheral blood mononuclear cells, сокращенно PBMC), а антитела, обозначаемые 404A8 и 404E4, пролиферацию не ингибируют. Из этих антител антитело 146B7 под наименованием AMG714 находится в стадии II клинических испытаний по лечению AR, проводимых компанией Amgen.
Bernard и соавт. в 2004 году идентифицировали две последовательности связи IL-15 с субъединицей α рецептора. Эти последовательности находятся между аминокислотами (aa) от 44 до 52 и от 64 до 68 зрелого белка и описывают мутеины, которые могут действовать как агонисты или антагонисты IL-15 (Bernard J. et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 24313-24322).
Santos и соавт. описали пептид-антагонист IL-15 (WO 2006/029578). Применение пептида малого размера (10 aa) в качестве антагониста IL-15 обладает преимуществом, заключающимся в селективном блокировании связывания IL-15 с субъединицей α рецептора и в посредничестве или препятствовании действию IL-15, обусловленному взаимодействием с упомянутой субъединицей рецептора.
Однако идентификация пептидных последовательностей антагонистов IL-15, обладающих растворимостью и биологической активностью, большей, чем упомянутый белок, представляет собой единственный значимый факт.
Описание изобретения
Это изобретение предназначено для решения ранее упомянутой проблемы получения пептида, более растворимого и более активного, чем пептид, описанный в WO 2006/029578, за счет уменьшения ингибирующей концентрации 50 или концентрации, вызывающей 50%-е ингибирование (IC50) со 130 до 8 мкМ продукта замещения вторичного Lys аминокислотой Thr и получения димерной формы. Упомянутая последовательность (SEQ ID No. 12), синтезированная в виде линейного пептида, содержащего 10 аминокислот, взаимодействует с субъединицей α рецептора и проявляет антагонистическую способность по отношению к IL-15.
Оптимизация состояла в осуществлении точечного замещения аминокислот упомянутого пептида с целью идентификации аминокислот, являющихся существенными для его антагонистической активности по отношению к IL-15. При замещении, предусматривавшем изменение заряда, в частном случае вторичного лизина упомянутого пептида треонином с нейтральным зарядом или глутаминовой кислотой, несущей отрицательный заряд, получено увеличение антагонистической активности пептид более чем в 10 раз. Кроме того, было найдено, что димерная форма данного пептида, образованная двумя молекулами пептида при посредстве свободного цистеина, является в 7 раз более активной, чем мономерная форма.
В результате было обнаружено, что, в отношении специфичности, ранее упомянутое замещение позволяет получить пептид, являющийся в 10 раз более активным в испытании на зависящую от IL-15 пролиферацию клеточной линии CTLL-2. Этот пептид сохраняет способность связывания с субъединицей α рецептора относительно IL-15.
Образующийся пептид, составляющий сущность настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID No. 12 в перечне последовательностей. Это увеличение активности пептида как результат упомянутого замещения Lys аминокислотой Thr оказалось неожиданным. На основании доступной информации специалисты в данной области техники не могли ожидать, что указанное изменение первичной структуры пептида породит настолько заметное увеличение биологической активности пептида, такое как показанное в примерах осуществления настоящего изобретения.
Полученный при посредстве свободного Cys химическим синтезом димер пептида, соответствующий последовательности SEQ ID No. 12 в перечне последовательностей, является в 7 раз более активным, чем мономерная форма, и в 15 раз более активным, чем первоначальный пептид, описанный в WO 2006/029578.
Пептид с аминокислотной последовательностью, зарегистрированной как SEQ ID No. 12, присоединяемый к растворимой цепи alfa соответственно описанному в настоящем изобретении, может ингибировать эффект обратной сигнализации посредством IL-15 мембраны, описанный Budalgian и соавт. в 2004 году (Budalgian et al., J. Biol. Chem. 2004, 40: 42192-42201).
В настоящем изобретении предусмотрено применение упомянутого пептида при лечении AR индивидуально или в комбинации с любым другим приемлемым соединением, таким как, например, стероидные противовоспалительные лекарственные средства (такие как кортикостероиды) и лекарственные средства, изменяющие течение заболевания (например, метотрексат).
Объектом настоящего изобретения является также наружное применение этого пептида при лечении заболеваний, проявляющихся на коже, и в очагах поражения которых обнаруживается экспрессия IL-15 в течение заболевания, таких как псориаз и кожная лимфома Т-клеток.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид применяют для ингибирования связывания растворимой субъединицы α рецептора с IL-15, экспрессируемым в мембране опухолевой клетки, и ингибирования ее миграции.
Пептид, являющийся объектом настоящего изобретения, может иметь линейную структуру или может быть димеризован и отличается в основном своей антагонистической способностью по отношению к IL-15. С другой стороны, доказан эффект in vitro, вызываемый пептидом по настоящему изобретению в испытании на пролиферацию клеток линии CTLL-2 мыши и линии KiT225 человека лимфоцитарной лейкемии.
Для идентификации пептида, описанного в настоящем изобретении, осуществляли аланиновое картирование пептида, описанного в WO 2006/029578. Каждый измененный пептид синтезировали химическим путем способом синтеза в твердой фазе. Затем очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (по-английски High Performance Liquid Chromatography, сокращенно HPLC (ВЭЖХ)) и анализировали масс-спектрометрически, получая во всех случаях чистоту более 95%. Каждый пептид оценивали относительно его эффективности ингибировать биологическую активность IL-15.
Пептид, являющийся объектом настоящего изобретения, ингибирует экспрессию IL-8, индуцируемую IL-15Rα. Тот же самый пептид ингибирует экспрессию IL-6 и высвобождение TNF-alfa (TNFα), индуцируемые IL-15Rα.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид получали генетической манипуляцией или химическим синтезом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид получали в виде димера, образованного двумя молекулами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12. В особом варианте осуществления димер получали, исходя из двух молекул пептида, димеризуемого при посредстве свободного цистеина.
Объектом настоящего изобретения является также дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая пептид с последовательностью SEQ ID No. 12, причем ее продукт экспрессии способен связываться с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 или с ее растворимой фракцией и ингибирует биологическую активность интерлейкина-15. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор, содержащий упомянутую последовательность ДНК, может быть использован как альтернатива для экспрессии пептидной последовательности.
Полученные результаты предполагают применение заявленного пептида по настоящему изобретению в качестве терапевтического средства при лечении заболеваний, связанных со сверхэкспрессией IL-15 соответственно упомянутому ранее и в случае которых оправдано использование антагонистов IL-15. Таким образом, объектом настоящего изобретения является также терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, отличающаяся тем, что она включает в себя пептид, содержащий аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтическая фармацевтическая композиция содержит димеризованный пептид. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит мономерный или димерный конъюгированный пептид, или пептид, смешанный с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В другом варианте осуществления терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, содержит цепь нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид (SEQ ID No. 12).
Объектом настоящего изобретения является также применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, псориаза и для лечения рака предстательной железы.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Действие пептида в различных концентрациях на пролиферацию клеток линии CTLL-2, индуцированную IL-15. Клетки CTLL-2 инкубированы с 300 пг/мл IL-15 в комбинации с серийными разведениями пептидов. Пролиферация определена при использовании митохондриального окрашивания посредством 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-бромуродифенилтетразолия (MTT). Фиг.1A: Оценка пептидов SEQ ID No. 4 и SEQ ID No. 5. Фиг.1B: Оценка пептидов SEQ ID No. 2 и SEQ ID No. 3. Фиг.1C: Оценка пептидов SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 и SEQ ID No. 9.
Фиг.2. График, отображающий связывание IL-15Rα человека с пептидами. Способом ELISA оценена способность пептидов замещать IL-15 в связи с IL-15Rα.
Фиг.3. Действие пептида в различных концентрациях на пролиферацию клеток линии KiT225, индуцированную IL-15. Клетки KiT225 инкубированы с 300 пг/мл IL-15 в комбинации с серийными разведениями пептидов. Пролиферация определена при использовании митохондриального окрашивания посредством MTT.
Фиг.4. Действие пептида на пролиферацию клеток линии CTLL-2, индуцированную IL-15 с различными концентрациями при фиксированной концентрации пептида. Использованные концентрации IL-15: 75 пг/мл (1), 150 пг/мл (2), 300 пг/мл (3).
Фиг.5. График, отображающий ингибирующее действие пептида на индукцию иРНК посредством IL-8 (фиг.5A) и IL-6 (фиг.5B) в клетках клеточной линии PC-3 при инкубации с IL-15Rα.
Фиг.6. Ингибирование высвобождения TNF-alfa, индуцированного посредством IL-15, при инкубации клеток синовиальной жидкости с пептидом. Клетки синовиальной жидкости больных AR инкубированы с IL-15 (100 нг/мл) в комбинации с пептидом с концентрацией 65 мкМ в течение 48 ч. Количество TNF-alfa определено способом ELISA. Показаны данные анализов излияния синовиальной жидкости вследствие травмы.
Подробное описание вариантов осуществления/Примеры осуществления
Настоящее изобретение пояснено приведенными далее примерами осуществления.
Пример 1. Оптимизация пептида IL-15, связывающегося с IL-15Rα и ингибирующего биологическую функцию IL-15
Планирование эксперимента
Исходя из пептида, заявленного в WO 2006/029578, составляют серию пептидов, в которых каждая аминокислота замещена аланином (Ala). В другой группе пептидов осуществляют замены цистеина (Cys) на Ser и Lys на Thr или Glu.
Синтез пептидов
Пептиды синтезировали по стратегии Fmoc/tBu в шприцах. Использовали смолу Fmoc-AM-MBHA с концентрацией 0,54 ммоль/г, осуществляя синтез при механическом перемешивании. После обработки трифторуксусной кислотой пептиды лиофилизовали и анализировали способами ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Все пептиды были получены с чистотой более 95% при соответствии полученной массы массе, ожидаемой для соответствующей аминокислотной последовательности.
Пример 2. Действие описанных пептидов на пролиферацию клеточных линий CTLL-2 и KiT225
Клетки линий CTLL-2 и KiT225 зависят от IL-15 и пролиферируют в присутствии цитокина. Соединения, которые связываются с IL-15 и препятствуют трансдукции сигнала через рецептор, ингибируют пролиферацию клеток данных линий.
Для оценки нейтрализующей способности пептидов по настоящему изобретению готовили серийные разведения пептидов в 96-луночных культуральных планшетах (Costar, США) в объеме 25 мкл среды RPMI (Gibco), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco). Прибавляли клетки CTLL-2 или KiT225 (предварительно промытые) в количестве 5·103 клеток на лунку и инкубировали в течение 30 мин, затем в каждую из лунок вносили достаточное количество IL-15 до концентрации 300 пг/мл.
Также оценивали антагонистическую способность пептидов, изменяя концентрацию IL-15 при фиксированной концентрации пептида 260 мкМ. Инкубацию осуществляли в течение 72 ч при 37°C в атмосфере с 5% CO2. Для определения пролиферации использовали митохондриальное окрашивание посредством MTT (Cosman et al., Nature, 1984, 312: 768-771). MTT восстанавливали митохондриальной дегидрогеназой живой клетки до пурпурного формазана. Определяли IC50 каждого пептида при концентрации IL-15 300 пг/мл.
|
Таблица 1
Перечень испытуемых пептидов и значения IC 50 , полученные в испытании на пролиферацию клеток линии CTLL-2 |
|
| Пептид | IC 50 (мкМ) |
| KVTAMKCFLL | 130 |
| KVTAMKCFLA | 260 |
| KVTAMKCFAL | 200 |
| KVTAMKCALL | 0 |
| KVTAMKAFLL | 0 |
| KVTAMACFLL | н/о |
| KVTAAKCFLL | 130 |
| KVAAMKCFLL | 130 |
| KATAMKCFLL | 130 |
| AVTAMKCFLL | н/о |
| KVTAMKSFLL | 0 |
| KVTAMTCFLL | 24,6 |
| KVTAMECFLL | 0 |
| KVTAMTCYLL | 57,7 |
| н/о: не определено | |
Данное испытание осуществляли для оценки всех пептидов, что позволило получить значения IC50, приведенные в таблице 1. Значения IC50 показывают снижение ингибирующего действия пептида в случае пептидов с заменами Cys-Ala, Cys-Ser, Phe-Ala и Gly-Glu и улучшение данного эффекта почти на 50% в случае пептидов с заменой Leu-Ala. Была достигнута ингибирующая активность в 5 раз больше в случае пептида с заменой Lys-Thr и в 15 раз больше в случае димерной формы пептида с заменой Lys-Thr.
На фиг.1A, 1B и 1C представлено изменение оптической плотности (DO) при 576 нм, полученной для различных концентраций пептида с заменами Phe-Ala, Cys-Ala, Leu1-Ala, Leu2-Ala, Met-Ala, Thr-Ala, Val-Ala. На фиг.3 показано изменение оптической плотности в случае пептида с заменой Lys-Thr в мономерной и димерной форме, при этом видно, что ингибирующее действие зависит от концентрации пептида, а наибольшее ингибирующее действие относится к димерной форме пептида с заменой Lys-Thr.
Также оценивали антагонистическую способность пептидов, изменяя концентрацию IL-15 при фиксированной концентрации пептида. На фиг.4 видно, что антагонистическое действие пептида с заменой Lys-Thr зависит от концентрации IL-15.
Пример 3. Способ конкурентного анализа ELISA для изучения способности пептидов выступать в качестве заместителя в связи с IL-15Rα
Пептиды были охарактеризованы в отношении связывания с IL-15Rα способом ELISA. Согласно краткому описанию методики 96-луночные планшеты покрывали раствором очищенного IL-15 в PBS и блокировали 1%-м раствором бычьего альбумина в буферном фосфатно-солевом растворе (по-английски Phosphate Buffered Saline, сокращенно PBS). Разведения каждого пептида вносили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Планшет промывали смесью PBS-Tween 20 и инкубировали с IL-15Rα-Fc в течение 1 часа при 37°C. Затем промывку повторяли и инкубировали с конъюгатом "anti-Fc-IgG человека-пероксидаза" в течение 1 часа при 37°C. Далее снова промывали и определяли степень прохождения реакции "антиген-антитело" в присутствии субстрата и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB), осуществляя измерение DO при 450 нм. Результаты показаны на фиг.2, при этом видно, что пептид с заменой Cys-Ala (SEQ ID No. 5) не замещает IL-15 в связи с IL-15Rα, а пептид с заменой Phe-Ala (SEQ ID No. 4) замещает только в 10% случаев связи.
Пример 4. Оценка действия пептида (SEQ ID No. 12) на экспрессию IL-8 и IL-6 в клетках рака предстательной железы линии PC-3
Оценивали действие пептида (SEQ ID No. 12) на экспрессию IL-8 и IL-6, которая опосредуется в отношении связывания IL-15Rα с IL-15, присутствующим в мембране клеток PC-3 (Budagian V. et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 42192-42201). Эксперимент осуществляли в 24-луночных планшетах, инкубируя 1,5·106 клеток с пептидами SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 12 с концентрацией 100 мкг/мл и IL-15Rα (1 нг/мл) и с комбинациями IL-15Rα с пептидами SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 12.
РНК выделяли способом TriReagent (Sigma) и анализировали посредством измерения DO при 260/280 нм и электрофореза в геле агарозы. Осуществляли обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, используя набор Quantitect Reverse Transcription Kit и QuantiTect SYBR Green PCR (QUIAGEN) на установке Rotor Gene 6000.
На фиг.5A и 5B видно, что пептид SEQ ID No. 12 ингибирует транскрипцию провоспалительных цитокинов IL-8 и IL-6, индуцированную IL-15Rα.
Пример 5. Ингибирование продуцирования TNF-alfa, индуцированного IL-15, димеризованным пептидом SEQ ID No. 12 в клетках синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом (AR)
После получения информированного согласия отбирали синовиальную жидкость больных AR и инкубировали с гиалуронидазой в количестве 10 мкг на мл жидкости в течение 45 мин при 37°C. После центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 мин получали клетки синовиальной жидкости.
В 96-луночном планшете инкубировали 2·105 клеток на лунку с 50 мкг/мл пептида, 60 нг/мл IL-15 и комбинацией пептида в количестве, превышающем количество IL-15. После инкубации в течение 48 часов отбирали супернатант и хранили при -70°C для последующей его оценки. Количество TNFα определяли способом ELISA (R&D DTA50).
На фиг.6 показано, что пептид SEQ ID No. 12 ингибирует секрецию TNFα в клетках синовиальной жидкости больного AR.
Пример 6. Модель на мышах SCID ксенотрансплантата псориаза человека
Мышам SCID (в возрасте 2-3 месяцев) трансплантировали участок кожи размером 1,5×1,5 см, полученный от больного псориазом. Через три недели после трансплантации мышей разделили на три группы, получавшие плацебо, получавшие пептид SEQ ID No. 12 с дозой 10 мг/кг массы и получавшие циклоспорин A с дозой 10 мг/кг через день в течение 2 недель. Через неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и производили биопсию диаметром 4 мм из каждого ксенотрансплантата. Биопсийный материал фиксировали в формалине, покрывали парафином и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E).
Как результат эксперимента отмечено, что на коже, полученной от больных псориазом, после лечения пептидом SEQ ID No. 12 или его димерной формой наблюдается уменьшение тяжести заболевания, значительное уменьшение плотности эпидермиса, числа воспаленных клеток и колец кератиноцитов, а также степени паракератоза в очагах псориатических поражений.
Claims (18)
1. Пептид-антагонист активности интерлейкина-15, отличающийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 12.
2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он связывается с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 (IL-15Rα) или с ее растворимой фракцией.
3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует биологическую активность интерлейкина-15, зависящую от субъединицы alfa рецептора (IL-15Rα).
4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует экспрессию IL-8, индуцированную IL-15Rα.
5. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует экспрессию IL-6, индуцированную IL-15Rα.
6. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует высвобождение TNF-alfa (TNFα), индуцированное IL-15.
7. Пептид по пп.1-6, причем пептид получают генетической манипуляцией или химическим синтезом.
8. Пептид по п.7, причем пептид получают в виде димера, образованного двумя молекулами пептида, и причем указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 12.
9. Пептид по п.8, причем димер получают, исходя из двух молекул пептида, димеризуемого при посредстве свободного цистеина.
10. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид с SEQ ID No. 12, причем пептид связывается с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 или с ее растворимой фракцией и ингибирует биологическую активность интерлейкина-15.
11. Вектор экспрессии, отличающийся тем, что он содержит последовательность нуклеиновой кислоты по п.10.
12. Терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, причем указанная композиция включает по меньшей мере 50 мкг/мл пептида, состоящего из SEQ ID No. 12, и 10% сахарозы.
13. Терапевтическая фармацевтическая композиция по п.12, содержащая пептид с SEQ ID No. 12 в форме димера.
14. Терапевтическая фармацевтическая композиция по п.12, содержащая пептид с SEQ ID No. 12 в форме мономера или конъюгированного димера.
15. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита.
16. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения болезни Крона.
17. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения псориаза.
18. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения рака предстательной железы.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU20080184A CU23716A1 (es) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15 |
| CU2008-0184 | 2008-09-30 | ||
| PCT/CU2009/000006 WO2010037351A1 (es) | 2008-09-30 | 2009-09-30 | Péptido antagonista de la actividad de la interleucina - 15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011117356A RU2011117356A (ru) | 2012-11-10 |
| RU2506270C2 true RU2506270C2 (ru) | 2014-02-10 |
Family
ID=41611190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011117356/04A RU2506270C2 (ru) | 2008-09-30 | 2009-09-30 | Пептид-антагонист активности интерлейкина-15 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8431524B2 (ru) |
| EP (1) | EP2354152A1 (ru) |
| JP (1) | JP2012503976A (ru) |
| KR (1) | KR20110095238A (ru) |
| CN (1) | CN102203118B (ru) |
| AU (1) | AU2009298304A1 (ru) |
| CA (1) | CA2738744A1 (ru) |
| CU (1) | CU23716A1 (ru) |
| MX (1) | MX2011003366A (ru) |
| RU (1) | RU2506270C2 (ru) |
| WO (1) | WO2010037351A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201102330B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819307C2 (ru) * | 2018-06-22 | 2024-05-17 | Куджин Инк. | Биологически активируемые лекарственные средства на основе цитокинов и способы их применения |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170034948A (ko) * | 2009-04-07 | 2017-03-29 | 바스프 에스이 | 무공극 서브미크론 특징부 충전을 위한 억제제를 포함하는 금속 도금용 조성물 |
| CN102365396B (zh) * | 2009-04-07 | 2014-12-31 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含抑制剂的无空隙亚微米结构填充用金属电镀组合物 |
| PL404174A1 (pl) | 2013-05-31 | 2014-12-08 | Warszawski Uniwersytet Medyczny | Zastosowanie pochodnych aminowych jako inhibitorów aktywności interleukiny 15 |
| PL404138A1 (pl) | 2013-05-31 | 2014-12-08 | Warszawski Uniwersytet Medyczny | Pochodne kwasu benzoesowego jako inhibitory receptora IL-15Rα |
| PL405506A1 (pl) | 2013-09-30 | 2015-04-13 | Warszawski Uniwersytet Medyczny | Zastosowanie pochodnej kwasu 7-aminocefalosporanowego jako inhibitora aktywności biologicznej IL-15 i IL-2 |
| PL405505A1 (pl) | 2013-09-30 | 2015-04-13 | Warszawski Uniwersytet Medyczny | Zastosowanie pochodnej kwasu diaminodikarboksylowego jako inhibitora aktywności biologicznej IL-15 I IL-2 |
| US20160039876A1 (en) | 2014-03-28 | 2016-02-11 | Claresa Levetan | Insulin independence among patients with diabetes utilizing an optimized hamster reg3 gamma peptide |
| CU24546B1 (es) * | 2016-12-30 | 2021-09-07 | Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia | Composición vacunal que comprende un mutante de la interleucina-15 humana |
| CU24545B1 (es) | 2017-12-29 | 2021-09-07 | Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia | Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001002003A1 (en) * | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Bulfone Paus Silvia | Method of treating psoriasis with il-15 antagonist |
| US20040253587A1 (en) * | 1995-02-22 | 2004-12-16 | Immunex Corporation | Antagonists of interleukin-15 |
| WO2005085282A1 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-15 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Il-15 binding site for il15-ralpha and specific il-15 mutants having agonists/antagonists activity |
| RU2396276C2 (ru) * | 2004-09-17 | 2010-08-10 | Сентро Де Инженьериа Генетика И Биотекнологиа | Пептидный антагонист интерлейкина-15 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5795966A (en) | 1995-02-22 | 1998-08-18 | Immunex Corp | Antagonists of interleukin-15 |
| ATE298367T1 (de) | 1996-04-26 | 2005-07-15 | Beth Israel Hospital | Interleukin-15 antagoniste |
| KR100224383B1 (ko) * | 1996-09-09 | 1999-10-15 | 윤덕용 | 거머린에서 유도된 단백질분해효소 억제활성을지닌 펩타이드 |
| JP3951676B2 (ja) * | 2001-11-13 | 2007-08-01 | 住友電気工業株式会社 | オリゴペプチド |
| EP1425389B1 (en) | 2001-08-23 | 2011-11-02 | Genmab A/S | Human antibodies specific for interleukin 15 (il-15) |
| CA2491135A1 (en) * | 2002-07-02 | 2004-01-15 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Thrombin peptide derivative dimers |
-
2008
- 2008-09-30 CU CU20080184A patent/CU23716A1/es not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-09-30 RU RU2011117356/04A patent/RU2506270C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-09-30 AU AU2009298304A patent/AU2009298304A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-30 WO PCT/CU2009/000006 patent/WO2010037351A1/es not_active Ceased
- 2009-09-30 MX MX2011003366A patent/MX2011003366A/es active IP Right Grant
- 2009-09-30 JP JP2011528178A patent/JP2012503976A/ja active Pending
- 2009-09-30 KR KR1020117008431A patent/KR20110095238A/ko not_active Withdrawn
- 2009-09-30 US US13/120,855 patent/US8431524B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-09-30 EP EP09748938A patent/EP2354152A1/en not_active Withdrawn
- 2009-09-30 CN CN200980141683XA patent/CN102203118B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-09-30 CA CA2738744A patent/CA2738744A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-03-29 ZA ZA2011/02330A patent/ZA201102330B/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040253587A1 (en) * | 1995-02-22 | 2004-12-16 | Immunex Corporation | Antagonists of interleukin-15 |
| WO2001002003A1 (en) * | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Bulfone Paus Silvia | Method of treating psoriasis with il-15 antagonist |
| WO2005085282A1 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-15 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Il-15 binding site for il15-ralpha and specific il-15 mutants having agonists/antagonists activity |
| RU2396276C2 (ru) * | 2004-09-17 | 2010-08-10 | Сентро Де Инженьериа Генетика И Биотекнологиа | Пептидный антагонист интерлейкина-15 |
Non-Patent Citations (5)
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819307C2 (ru) * | 2018-06-22 | 2024-05-17 | Куджин Инк. | Биологически активируемые лекарственные средства на основе цитокинов и способы их применения |
| RU2851710C1 (ru) * | 2020-02-05 | 2025-11-28 | Новартис Аг | Экспрессируемый клетками cho гетеродимер il-15 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011117356A (ru) | 2012-11-10 |
| CA2738744A1 (en) | 2010-04-08 |
| CN102203118A (zh) | 2011-09-28 |
| KR20110095238A (ko) | 2011-08-24 |
| WO2010037351A1 (es) | 2010-04-08 |
| JP2012503976A (ja) | 2012-02-16 |
| CN102203118B (zh) | 2013-07-10 |
| US8431524B2 (en) | 2013-04-30 |
| US20110251140A1 (en) | 2011-10-13 |
| EP2354152A1 (en) | 2011-08-10 |
| CU23716A1 (es) | 2011-10-05 |
| AU2009298304A1 (en) | 2010-04-08 |
| MX2011003366A (es) | 2011-07-29 |
| ZA201102330B (en) | 2011-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2506270C2 (ru) | Пептид-антагонист активности интерлейкина-15 | |
| CN102665754B (zh) | 衍生自il-2的免疫调节多肽及其在治疗癌症和慢性感染中的用途 | |
| CN100556450C (zh) | Il-18抑制剂在治疗或预防脓毒症中的应用 | |
| JP5761831B2 (ja) | 癌及び慢性感染の治療のための作動薬活性を有するｉｌ−２由来のポリペプチド | |
| JP2009536170A (ja) | 治療用の抗体標的指向サイトカイン | |
| JP2004525076A5 (ru) | ||
| WO2021262985A1 (en) | Cytokine conjugates | |
| CN111788217B (zh) | 白介素-15活性的拮抗剂肽 | |
| IL167769A (en) | Use of il-1f7b that links il-18r with il-1bp in the preparation of drugs | |
| AU2002309887B2 (en) | Use of IL-18 inhibitors for the treatment or prevention of sepsis | |
| HK1169961B (en) | Immunomodulatory polypeptides derived from il-2 and their use thereof in the therapeutic of cancer and chronic infections | |
| Ghiara et al. | The Interleukin-1 System: Physiopathology and New Insights for its Therapeutical Potential | |
| AU2002309887A1 (en) | Use of IL-18 inhibitors for the treatment or prevention of sepsis | |
| HK1066723B (en) | Use of il-18 inhibitors for the treatment or prevention of sepsis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141001 |