RU2503002C1 - Differential diagnostic technique for haemorrhagic and ischemic strokes - Google Patents
Differential diagnostic technique for haemorrhagic and ischemic strokes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2503002C1 RU2503002C1 RU2012123712/15A RU2012123712A RU2503002C1 RU 2503002 C1 RU2503002 C1 RU 2503002C1 RU 2012123712/15 A RU2012123712/15 A RU 2012123712/15A RU 2012123712 A RU2012123712 A RU 2012123712A RU 2503002 C1 RU2503002 C1 RU 2503002C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stroke
- hours
- onset
- acute
- ischemic
- Prior art date
Links
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 title abstract description 8
- 208000016988 Hemorrhagic Stroke Diseases 0.000 title abstract description 5
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 title abstract 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 8
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и нейрохирургии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики геморрагического и ишемического типов инсультов.The invention relates to medicine, in particular to neurology and neurosurgery, and can be used for the differential diagnosis of hemorrhagic and ischemic types of strokes.
Согласно определению ВОЗ /1973/, мозговой инсульт - быстро возникающие очаговые или общемозговые нарушения функций мозга с продолжительностью симптомов 24 часа и более или приводящие к смерти в отсутствие явных других причин, кроме сосудистых. По характеру поражения выделяют 2 основные типа инсульта: ишемический - инфаркт определенного участка мозга в результате внезапного нарушения его кровоснабжения, и геморрагический - спонтанное /нетравматическое/ кровоизлияние в мозг. Медико-социальная значимость инсультов определяется высоким уровнем смертности заболевших, значительной инвалидизацией и социальной дезадаптацией выживших больных. Исход развившегося инсульта во многом определяется своевременностью и адекватностью лечения, которое включает комплекс неотложных лечебных мероприятий, кардинально различающихся у больных с ишемическим и геморрагическим инсультом. Для проведения адекватной дифференцированной терапии исключительно важна ранняя точная дифференциальная диагностика ишемического и геморрагического инсультов в острейшем периоде - первые часы и 3-5 дней с момента заболевания.According to the definition of WHO / 1973 /, cerebral stroke is a rapidly occurring focal or cerebral dysfunction of the brain with a duration of symptoms of 24 hours or more, or leading to death in the absence of obvious other causes other than vascular. By the nature of the lesion, 2 main types of stroke are distinguished: ischemic - a heart attack of a certain part of the brain as a result of a sudden violation of its blood supply, and hemorrhagic - spontaneous / non-traumatic / cerebral hemorrhage. The medical and social significance of strokes is determined by the high mortality rate of patients, significant disability and social maladaptation of surviving patients. The outcome of a developed stroke is largely determined by the timeliness and adequacy of treatment, which includes a set of urgent treatment measures that are radically different in patients with ischemic and hemorrhagic stroke. To conduct adequate differential therapy, early accurate differential diagnosis of ischemic and hemorrhagic strokes in the acute period is extremely important - the first hours and 3-5 days from the moment of illness.
С целью уточнения характера развившегося мозгового инсульта в острейшем периоде заболевания кроме традиционного анализа клинико-анамнестических данных применяются компьютерная томография, а также лабораторные исследования спинномозговой жидкости /ликвора/ и крови больных: спектрофотометрирование ликвора /Скочий П.Г., Андриюк Л.В./. Диагностическое значение спектрофотометрии спинномозговой жидкости больных при острых нарушениях мозгового кровообращения //Журнал неврологии и психиатрии. - 1987, - №1. - С.39-42/, определение активности некоторых ферментов в эритроцитах крови больных / Бердический М.Я., Сторожук П.Г., Иманаха К.К./. Значение исследований некоторых эритроцитарных ферментов в определении характера инсульта в острейшем периоде // Журнал невропатологии и психиатрии. - 1990, - N 7. - С.29-31/.In order to clarify the nature of the developed cerebral stroke in the acute period of the disease, in addition to the traditional analysis of clinical and medical history data, computed tomography and laboratory tests of the cerebrospinal fluid / cerebrospinal fluid and blood of patients are also used: spectrophotometry of cerebrospinal fluid / Skochiy P.G., Andriyuk L.V. . Diagnostic value of spectrophotometry of cerebrospinal fluid in patients with acute cerebrovascular accident // Journal of Neurology and Psychiatry. - 1987, - No. 1. - S.39-42 /, determination of the activity of certain enzymes in the red blood cells of patients / Berdichny M.Ya., Storozhuk P.G., Imanakha K.K. /. The importance of studies of some red blood cell enzymes in determining the nature of stroke in the acute period // Journal of Neuropathology and Psychiatry. - 1990, -
Известен способ дифференциальной диагностики ишемического и геморрагического инсульта в острейшем периоде (Патент на изобретение RU №2175446 МПК G01N 33/52). Способ заключается в том, что проводят инфракрасную спектроскопию крови больных, определяют коэффициенты пропускания и при значениях коэффициентов пропускания в диапазоне длин волн 2120- 1610 см-1 от 0,2 до 0,4% диагностируют ишемический инсульт, а при значениях 44,4-53,1% - геморрагический.A known method for the differential diagnosis of ischemic and hemorrhagic stroke in the acute period (Patent for invention RU No. 2175446 IPC G01N 33/52). The method consists in conducting infrared spectroscopy of the blood of patients, transmittance is determined, and for transmittance values in the wavelength range of 2120-1610 cm-1 from 0.2 to 0.4%, ischemic stroke is diagnosed, and at 44.4- 53.1% are hemorrhagic.
Недостатком известных способов является то, что они представляют собой довольно длительный и дорогостоящий процесс, являющийся самостоятельным стоятельным научным исследованием, не позволяющим оперативно решать актуальный для клинической практики вопрос идентификации характера развившегося мозгового инсульта с целью проведения неотложной дифференцированной терапии.A disadvantage of the known methods is that they are a rather lengthy and expensive process, which is an independent worthwhile scientific research that does not allow to quickly solve the urgent clinical practice of identifying the nature of the developed cerebral stroke in order to conduct emergency differentiated therapy.
Цель изобретения ускорить и удешевить процесс диагностики, расширить арсенал средств дифференциальной диагностики,The purpose of the invention to speed up and reduce the cost of the diagnostic process, to expand the arsenal of differential diagnostics,
Цель достигается тем, что определяют количество низкомолекулярной фракции ДНК, сравнивая в течение суток электрофореграммы, полученные из плазмы крови больных, со стандартами известной концентрации, и при выявлении количества 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через 3 часа после начала острого инсульта диагностируют геморрагический тип инсульта, при обнаружении 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через сутки после начала острого инсульта - диагностируют ишемический тип инсульта.The goal is achieved by determining the amount of low molecular weight fraction of DNA, comparing electrophoregrams obtained from the blood plasma of patients with standard known concentrations during the day, and if a quantity of 80-87 ng / ml of low molecular weight DNA is detected 3 hours after the onset of an acute stroke, hemorrhagic type is diagnosed stroke, if 80-87 ng / ml of low molecular weight DNA is detected one day after the onset of acute stroke, the ischemic type of stroke is diagnosed.
Способ реализуют следующим образом. Определяют количество низкомолекулярной фракции ДНК, сравнивая в течение суток электрофореграммы, полученные из плазмы крови больных, со стандартами известной концентрации, и при выявлении количества 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через 3 часа после начала острого инсульта диагностируют геморрагический тип инсульта, при обнаружении 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через сутки после начала острого инсульта - диагностируют ишемический тип инсульта.The method is implemented as follows. The amount of low molecular weight fraction of DNA is determined by comparing electrophoregrams obtained from the blood plasma of patients with known concentration standards during the day, and when detecting the amount of 80-87 ng / ml of low
Одним из простых объяснений появления внеклеточных нуклеиновых кислот в крови могут быть постоянно идущие в организме процессы отмирания клеток и деградации их хроматина. Таким образом, в первую очередь источником внеклеточной ДНК крови может быть некроз [Rainer Т.Н., Lo Y.M., Chan L.Y... et al. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001; 945: 211-220] или апоптоз ядросодержащих клеточных элементов крови или эндотелиальных клеток [Jahr S., Hentze Н., Englisch S., et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancel Res. 2001; 61: 1659-1665]. Апоптоз - наиболее широко представленная форма программируемой клеточной смерти, которая приводит к ежедневной гибели части клеток. Примерный подсчет показывает, что в организме человека в результате апоптоза деградирует 1-10 г ДНК в сутки. Апоптотические клетки и апоптотические тельца поглощаются и перевариваются макрофагами, дендритными или эндотели-альными клетками [Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell. Res. 2000; 256: 12-28]. Возможно, часть апоптотических телец избегает этой участи и попадает в кровь.One of the simple explanations for the appearance of extracellular nucleic acids in the blood can be the processes of cell death and degradation of their chromatin that are constantly going on in the body. Thus, necrosis may be the primary source of extracellular blood DNA [Rainer T.N., Lo Y.M., Chan L.Y. et al. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001; 945: 211-220] or apoptosis of nucleated blood cells or endothelial cells [Jahr S., Hentze N., Englisch S., et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancel Res. 2001; 61: 1659-1665]. Apoptosis is the most widely represented form of programmed cell death, which leads to the daily death of some cells. An approximate calculation shows that in the human body as a result of apoptosis, 1-10 g of DNA per day degrades. Apoptotic cells and apoptotic bodies are absorbed and digested by macrophages, dendritic or endothelial cells [Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell. Res. 2000; 256: 12-28]. Perhaps part of the apoptotic Taurus avoids this fate and enters the bloodstream.
Известен способ исследования внеклеточной ДНК нуклеосом в сыворотке крови [Holdenrieder S., Stieber P., Bodenmuller H., Fertig G., Furst H., Schmeller N., Untch M, Seidel D. Nucleosomes in serum as a marker for cell death. Clin. Chem. Lab. Med. 2001. V.39. N.7. C.596-605], который предполагает использование набора для определения Cell Death Detection-ELISAplus фирмы Roche Diagnostics (Манхейм, Германия) (№1774425) и включает инкубацию образцов сыворотки с иммунореагентами в панелях, покрытых стрептовидином. В течение инкубации антитела, выработанные на гистоны, реагируют с гистоновым компонентом нуклеосом. Комплекс связывается с биотиновым компонентом панели. Кроме того, антитела к ДНК, меченные пероксидазой, связывают ДНК нуклеосом. Несвязавшиеся за время инкубации компоненты отмываются, количество нуклеосом учитывается по восстановлению перок-сидазы в иммунокомплексе. Добавляется субстрат, реагирующий с пероксидазой, в результате развивается окраска, количество которой оценивается фотометрически при длине волны 405 нм.A known method for the study of extracellular DNA nucleosomes in serum [Holdenrieder S., Stieber P., Bodenmuller H., Fertig G., Furst H., Schmeller N., Untch M, Seidel D. Nucleosomes in serum as a marker for cell death. Clin. Chem. Lab. Med. 2001. V.39. N.7. C.596-605], which involves the use of the Cell Death Detection-ELISAplus determination kit from Roche Diagnostics (Manheim, Germany) (No. 1774425) and includes the incubation of serum samples with immunoreagents in streptovidin coated panels. During incubation, antibodies generated by histones react with the histone component of nucleosomes. The complex binds to the biotin component of the panel. In addition, antibodies to DNA labeled with peroxidase bind DNA to nucleosomes. Unbound components during the incubation period are washed off, the number of nucleosomes is taken into account to restore peroxidase in the immunocomplex. A substrate reacting with peroxidase is added, as a result, a color develops, the amount of which is evaluated photometrically at a wavelength of 405 nm.
Метод широко применяется в клинике [Holdenrieder S., Stieber P. Clinical use of circulating nucleosomes. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2009. V.46. P.10-24] при различных заболеваниях, в механизм патогенеза которых вовлечен процесс апоптоза: позволяет исключить получение ложноположительных результатов и, в значительной мере, ложноотрицательных результатов. Метод применяется для определения повышения концентрации циркулирующих нуклеосом при различных видах рака, при острых состояниях, таких как инсульт, травма, сепсис, при иммунных заболеваниях, при цитотоксической терапии рака, особенно для оценки эффективности терапии.The method is widely used in the clinic [Holdenrieder S., Stieber P. Clinical use of circulating nucleosomes. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2009. V.46. P.10-24] for various diseases, the apoptosis process is involved in the pathogenesis mechanism of which: it allows to exclude the receipt of false positive results and, to a large extent, false negative results. The method is used to determine the increase in the concentration of circulating nucleosomes in various types of cancer, in acute conditions, such as stroke, trauma, sepsis, in case of immune diseases, in cytotoxic cancer therapy, especially to evaluate the effectiveness of therapy.
Недостатком способа является необходимость приобретать дорогостоящие наборы для определения Cell Death Detection-ELISAplus фирмы Roche Diagnostics (Манхейм, Германия) (№1774 425). Кроме того, способ не позволяет объективно визуализировать результаты исследования, тем самым допуская ошибки персонала, проводящего исследование. Следует отметить, что способ требует построения калибровочной кривой, позволяя фиксировать результаты только заданного диапазона различий, и не дает возможности фиксировать результаты, отличающиеся от ожидаемых, что также может привести к ошибкам. Перечисленные недостатки снижают диагностическую ценность метода.The disadvantage of this method is the need to purchase expensive kits for determining Cell Death Detection-ELISA plus firm Roche Diagnostics (Manheim, Germany) (No. 1774,425). In addition, the method does not allow to objectively visualize the results of the study, thereby allowing the errors of the personnel conducting the study. It should be noted that the method requires the construction of a calibration curve, allowing you to record the results of only a given range of differences, and does not allow you to record the results that differ from the expected, which can also lead to errors. These shortcomings reduce the diagnostic value of the method.
Приводим пример конкретной реализации способа.We give an example of a specific implementation of the method.
В таблице представлена динамика содержания фракции низкомолекулярной ДНК плазмы крови больных в остром периоде инсульта (нг/мл) у больных с геморрагическим и ишемическим типами инсульта.The table shows the dynamics of the content of the fraction of low molecular weight DNA of the blood plasma of patients in the acute period of stroke (ng / ml) in patients with hemorrhagic and ischemic types of stroke.
На рис.1 представлена электрофореграмма препаратов ДНК плазмы крови больных с инсультами.Figure 1 shows the electrophoregram of DNA preparations from the blood plasma of patients with strokes.
Пример:Example:
Методом венепункции в пробирки, содержащие в качестве детергента 0,5 М ЭДТА (pH 7,3) взяли по 3 мл крови у 2 человек:By venipuncture, in test tubes containing 0.5 M EDTA (pH 7.3) as detergent, 3 ml of blood was taken from 2 people:
1 - больная Ш., 77 лет, 3 ч после начала острого инсульта;1 - patient Sh., 77 years old, 3 hours after the onset of an acute stroke;
2 - больной Г., 68 лет, 3 ч после начала острого инсульта. Плазму крови получают центрифугированием 900 g в течение 10 мин. при комнатной температуре. Для полного удаления форменных элементов кровь центрифугируют дважды при 2200 g. Нуклеиновые кислоты выделяют методом фенольной депротеинизации [Маниатис Т., 1982]. Для этого к отмеренному объему плазмы крови приливают 10 мл свежеперегнанного водонасыщенного фенола. Затем пробирку помещают в ротационную качалку и в течение 10 мин. покачивают в мягком режиме, после чего добавляют 1 мл хлороформа и процедуру покачивания повторяют. Экстракты нуклеиновых кислот отбирают пипеткой и центрифугируют 15 мин. при 12000 g и 4°C. Верхнюю (водную) фазу отделяют и к ней добавляют смесь 80% раствор фенола (из расчета 0,5 объема фенола на 1 мл плазмы). Смесь покачивают 10 мин. при комнатной температуре, а затем центрифугируют в течение 10 мин. при 12000 g и 4°C. Процедуру депротеинизации проделывают дважды. Нуклеиновые кислоты осаждаются двойным объемом охлажденного (до - 20°C), перегнанного и подкисленного 95% этанола (0,4 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л этанола) в течение ночи при - 20°C. Осадок уплотняют центрифугированием в течение 15 мин. при 12000g и 4°C. Над осадочную жидкость (этанол) аккуратно сливают, удаляя хроматографической бумагой остатки спирта с верхней части пробирок. Осадки подсушивают в течение 5 мин., нуклеиновые кислоты растворяют в деионизированной воде, из расчета 2 мкл на 1 мл плазмы крови. Перед проведением электрофореза в каждую исследуемую пробу вносят 1 мкл раствора панкреатической РНКазы для удаления РНК и инкубируют в течение 15 мин. при 37°С. Раствор панкреатической РНКазы для инактивации возможных примесей ДНКазы предварительно прогревают в течение 15 мин. при 100°C, а затем медленно охлаждают до комнатной температуры. Электрофорез проводят в пластинах градиентного 2/16% полиакриламидного геля размером 80×80×3 мм3. Перед нанесением проб пластины с гелем подвергают предварительному электрофорезу при комнатной температуре в течение 2 ч, силе тока 20 мА на пластину и напряжении не более 100 В. В каждую лунку наносят по 15 мкл исследуемого материала. В качестве стандартов для проведения электрофореза используют рестрикты PBR322/BSPR1 и лямбда/Alul, наносимые в количестве 1 мкг/мл, они служат стандартами не только для определения величины молекул, но и для определения концентрации исследуемой фракции ДНК. После завершения электрофореза гели окрашивают бромидом этидия. Гели фотографируют в проходящем УФ на пленку микрат 300 при диафрагме 4, выдержке 10-30 с и красном светофильтре. Слайды сканируют, содержание ДНК определяют путем сравнения со стандартами.2 - patient G., 68 years old, 3 hours after the onset of an acute stroke. Blood plasma is obtained by centrifugation of 900 g for 10 min. at room temperature. To completely remove the shaped elements, the blood is centrifuged twice at 2200 g. Nucleic acids are isolated by phenol deproteinization [Maniatis T., 1982]. For this, 10 ml of freshly distilled water-saturated phenol is added to the measured volume of blood plasma. Then the tube is placed in a rotary shaker and for 10 minutes shake in soft mode, after which 1 ml of chloroform is added and the shaking procedure is repeated. Nucleic acid extracts were pipetted and centrifuged for 15 minutes. at 12000 g and 4 ° C. The upper (aqueous) phase is separated and a mixture of 80% phenol solution is added to it (based on 0.5 volume of phenol per 1 ml of plasma). The mixture is shaken for 10 minutes. at room temperature and then centrifuged for 10 minutes at 12000 g and 4 ° C. The deproteinization procedure is done twice. Nucleic acids are precipitated by a double volume of chilled (up to -20 ° C), distilled and acidified with 95% ethanol (0.4 ml of glacial acetic acid per 1 liter of ethanol) overnight at -20 ° C. The precipitate was compacted by centrifugation for 15 minutes. at 12000g and 4 ° C. Above the sedimentary liquid (ethanol), it is carefully drained, removing the residual alcohol from the top of the tubes by chromatographic paper. Precipitation is dried for 5 minutes, nucleic acids are dissolved in deionized water, at the rate of 2 μl per 1 ml of blood plasma. Before electrophoresis, 1 μl of pancreatic RNase solution is added to each test sample to remove RNA and incubated for 15 minutes. at 37 ° C. A solution of pancreatic RNase to inactivate possible DNAse impurities is preheated for 15 minutes. at 100 ° C and then slowly cooled to room temperature. Electrophoresis is carried out in plates of a gradient of 2/16% polyacrylamide gel with a size of 80 × 80 × 3 mm 3 . Before applying the samples, the gel plates are subjected to preliminary electrophoresis at room temperature for 2 hours, a current of 20 mA per plate and a voltage of not more than 100 V. 15 μl of the test material is applied to each well. The standards PBR322 / BSPR1 and lambda / Alul, applied in an amount of 1 μg / ml, are used as standards for electrophoresis; they serve as standards not only for determining the size of molecules, but also for determining the concentration of the studied DNA fraction. After electrophoresis, the gels were stained with ethidium bromide. The gels are photographed in a UV-pass film of Mikrat 300 at a diaphragm of 4, a shutter speed of 10-30 s and a red filter. The slides are scanned, the DNA content is determined by comparison with standards.
У больной Ш. было выявлена следующая динамика количества низкомолекулярной ДНК в сыворотке крови (нг/мл): через 3 часа - 46, через 6 часов 36; через 12 часов - 40; через 24 часа 80, 3; через 48-58, через 72-22.Patient Sh. Revealed the following dynamics of the amount of low molecular weight DNA in blood serum (ng / ml): after 3 hours - 46, after 6 hours 36; after 12 hours - 40; after 24
Пик количества низкомолекулярной ДНК - через 24 часа. Диагноз -ишемический тип инсульта.The peak amount of low molecular weight DNA is after 24 hours. The diagnosis is an ischemic type of stroke.
У больного Г. была выявлена следующая динамика количества низкомолекулярной ДНК в сыворотке крови (нг/мл): через 3 часа - 87, через 6 часов 56; через 12 часов - 34; через 24 часа 28; через 48 часов - 28, через 72 часа - 5.Patient G. revealed the following dynamics of the amount of low molecular weight DNA in blood serum (ng / ml): after 3 hours - 87, after 6 hours 56; after 12 hours - 34; after 24 hours 28; after 48 hours - 28, after 72 hours - 5.
Пик количества низкомолекулярной ДНК - через 3 часа. Диагноз - геморрагический тип инсульта.The peak amount of low molecular weight DNA is after 3 hours. The diagnosis is a hemorrhagic type of stroke.
На рис.1 представлен пример электрофореграммы. В таблице представлена динамика количества низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови у больных ишемического и гемморагического типа инсультов.Figure 1 shows an example of an electrophoregram. The table shows the dynamics of the amount of low molecular weight DNA fraction in blood plasma in patients with ischemic and hemorrhagic type of strokes.
На электрофореграммах представлены:On electrophoregrams are presented:
Дорожка 1 - стандарт λ/Hind III;Lane 1 - λ / Hind III standard;
Дорожка 2 - через 3 часа после начала заболевания больной Г., 68 лет. Lane 2 - 3 hours after the onset of the disease, patient G., 68 years old.
Дорожка 3 - через 3 часа после начала заболевания больная Ш., 77 лет. Lane 3 - 3 hours after the onset of the disease, patient Sh., 77 years old.
Дорожка 4 - через 3 часа после начала заболевания больная В., 53 года.Lane 4 - 3 hours after the onset of the disease, patient V., 53 years old.
Дорожка 5 - через 6 часов после начала заболевания больной Б., 73 года.Lane 5 - 6 hours after the onset of the disease, patient B., 73 years old.
6 - проба плазмы здорового человека.6 - a plasma sample of a healthy person.
в пробах 2, 3, 4, 5 видна низкомолекулярноая фракция ДНК. В контроле - пробе 6 у здорового, эта фракция не видна. Стандартом является дорожка 1 - λ/Hind III в количестве 1 мкг/мл. Содержание низкомолекулярной ДНК на дорожке 2 составляет 42 нг/мл, 3 - 34 нг/мл, 4 - 37 нг/мл, 5 - 83 нг/мл, 6 - 0 нг/мл. 7 - 574 пн; 8 - 125 пн; 9 - низкомолекулярная фракция ДНК.in
Данные таблицы свидетельствуют о высокой диагностической ценности предложенного показателя и необходимости использования их как объективный критерий, позволяющий различать типы инсульта.The data in the table indicate the high diagnostic value of the proposed indicator and the need to use them as an objective criterion that allows distinguishing types of stroke.
Преимуществом предложенного способа количественного определения содержания внеклеточной низкомолекулярной ДНК представляется существенное снижение затрат по сравнению с прототипом. В комплект оборудования для предлагаемого метода входят реактивы и приборы (камера для вертикального электрофореза, низкоскоростная и высокоскоростная центрифуги), присутствующие в обычной клинической лаборатории. Предложен прямой метод определения внеклеточной ДНК, организованной в виде нуклеосом, позволяющий видеть результаты исследования на электрофореграмме, тем самым избегая ошибок персонала и неточностей при определении. Предложенный метод позволяет расширить возможность определения предложенного показателя для случаев не только увеличения, но и снижения содержания низкомолекулярной ДНК до уровня ниже фонового. В отличие от прототипа способ применим не только для клинических целей, но и для научно-исследовательских.The advantage of the proposed method for the quantitative determination of extracellular low molecular weight DNA is a significant cost reduction compared with the prototype. The set of equipment for the proposed method includes reagents and devices (a chamber for vertical electrophoresis, low-speed and high-speed centrifuges), which are present in an ordinary clinical laboratory. A direct method for determining extracellular DNA organized in the form of nucleosomes is proposed, which allows one to see the results of the study on an electrophoregram, thereby avoiding personnel errors and inaccuracies in the determination. The proposed method allows you to expand the ability to determine the proposed indicator for cases of not only increasing, but also reducing the content of low molecular weight DNA to a level below the background. Unlike the prototype, the method is applicable not only for clinical purposes, but also for research.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012123712/15A RU2503002C1 (en) | 2012-06-07 | 2012-06-07 | Differential diagnostic technique for haemorrhagic and ischemic strokes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012123712/15A RU2503002C1 (en) | 2012-06-07 | 2012-06-07 | Differential diagnostic technique for haemorrhagic and ischemic strokes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2503002C1 true RU2503002C1 (en) | 2013-12-27 |
Family
ID=49817793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012123712/15A RU2503002C1 (en) | 2012-06-07 | 2012-06-07 | Differential diagnostic technique for haemorrhagic and ischemic strokes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2503002C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2767929C1 (en) * | 2021-07-07 | 2022-03-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва» | Method for diagnosing the severity of ischemic stroke |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1324646A1 (en) * | 1985-12-03 | 1987-07-23 | Львовский государственный медицинский институт | Method of differential diagnosis of ischemic and hemorrhagic insult |
| RU2175446C1 (en) * | 2000-12-21 | 2001-10-27 | Тверская государственная медицинская академия | Method for setting differential diagnosis of ischemic and hemorrhagic insult in the utmost acute period |
-
2012
- 2012-06-07 RU RU2012123712/15A patent/RU2503002C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1324646A1 (en) * | 1985-12-03 | 1987-07-23 | Львовский государственный медицинский институт | Method of differential diagnosis of ischemic and hemorrhagic insult |
| RU2175446C1 (en) * | 2000-12-21 | 2001-10-27 | Тверская государственная медицинская академия | Method for setting differential diagnosis of ischemic and hemorrhagic insult in the utmost acute period |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HOLDENRIEDER S., STIEBER P. Clinical use of circulating nucleosomes. Crit Rev Clin Lab Sci. 2009; 46(1): 1-24. * |
| HOLDENRIEDER S., STIEBER P. Clinical use of circulating nucleosomes. Crit Rev Clin Lab Sci. 2009; 46(1): 1-24. ТУАЕВА H.O., АБРАМОВА З.И. Внеклеточная ДНК в кровотоке человека. I. Происхождение внеклеточной ДНК. Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. 2007; 149(2): 24-32. * |
| ТУАЕВА H.O., АБРАМОВА З.И. Внеклеточная ДНК в кровотоке человека. I. Происхождение внеклеточной ДНК. Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. 2007; 149(2): 24-32. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2767929C1 (en) * | 2021-07-07 | 2022-03-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва» | Method for diagnosing the severity of ischemic stroke |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tonhajzerova et al. | Inflammatory activity in autism spectrum disorder | |
| Ershova et al. | Quantification of cell-free DNA in blood plasma and DNA damage degree in lymphocytes to evaluate dysregulation of apoptosis in schizophrenia patients | |
| Jensen et al. | Macrophage subpopulations and the acute inflammatory response of elderly human skeletal muscle to physiological resistance exercise | |
| Loría et al. | Frataxin knockdown in human astrocytes triggers cell death and the release of factors that cause neuronal toxicity | |
| RU2122739C1 (en) | Method of diagnosing gravity of endogenous intoxication in cases of acute purulo-septic diseases in children | |
| Amer-Wåhlin et al. | Brain-specific NSE and S-100 proteins in umbilical blood after normal delivery | |
| RU2503002C1 (en) | Differential diagnostic technique for haemorrhagic and ischemic strokes | |
| Emanuele et al. | Increased serum levels of high mobility group box 1 protein in patients with autistic disorder | |
| RU2310850C1 (en) | Method for predicting postoperative wound suppuration | |
| CN115710313B (en) | Antibody combination for detecting interferon-γ and its application | |
| RU2033614C1 (en) | Method of pyelonephritis diagnosis | |
| RU2141668C1 (en) | Method for predicting course and outcome of bacterial purulent meningitis in children | |
| Shatilo et al. | Quercetin effect on endogenous factors of cardiovascular risk and ageing biomarkers in elderly people | |
| Durhuus et al. | EX-vivo whole blood stimulation with A2E does not elicit an inflammatory cytokine response in patients with age-related macular degeneration | |
| Norden et al. | Bilharzia and bladder cancer. An investigation of urinary β-glucuronidase associated with S. haematobium infection | |
| Humble et al. | Aquaporin-4 positive extracellular vesicles and cytokines in cerebrospinal fluid in schizophrenia and obsessive-compulsive disorder, and associations with peripheral cytokines | |
| RU2764355C1 (en) | Method for predicting neurological recovery from the 14th to the 90th days of ischemic stroke of the brain | |
| de Brito Toscano et al. | Peripheral levels of SST2 are increased in patients with temporal lobe epilepsy: additional evidence of low-grade inflammation | |
| CN116064768B (en) | CircRNA kit for the diagnosis of optic neuritis associated with neuromyelitis optica spectrum disorder and its application | |
| RU2822966C1 (en) | Method for prediction of risk of unfavourable outcome for patients in chronic critical condition due to cerebral accidents complicated by pneumonia | |
| RU2827183C1 (en) | Method for diagnosing severity of ischemic-hypoxic lesions of central nervous system based on establishing integrity of genomic dna | |
| DE10040904A1 (en) | Methods and means to demonstrate the likelihood of future vascular disease progression | |
| RU2743453C1 (en) | Method of predicting infectious complications of critical condition | |
| RU2642723C2 (en) | Method for identification of patients with first attacks of acute porphyria | |
| RU2549458C1 (en) | Method of determining efficiency of multiple myeloma treatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140608 |