RU2502805C1 - СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae - Google Patents
СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae Download PDFInfo
- Publication number
- RU2502805C1 RU2502805C1 RU2012139788/10A RU2012139788A RU2502805C1 RU 2502805 C1 RU2502805 C1 RU 2502805C1 RU 2012139788/10 A RU2012139788/10 A RU 2012139788/10A RU 2012139788 A RU2012139788 A RU 2012139788A RU 2502805 C1 RU2502805 C1 RU 2502805C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- yeast
- cerevisiae
- leader
- pro
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 68
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title claims description 6
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 26
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 101150079981 HSP150 gene Proteins 0.000 description 16
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 11
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 11
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 11
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 11
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 11
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 101000598907 Homo sapiens Olfactory receptor 6C3 Proteins 0.000 description 6
- 102100037743 Olfactory receptor 6C3 Human genes 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 4-(3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic acid Chemical compound OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101001086426 Homo sapiens Olfactory receptor 1J2 Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032722 Olfactory receptor 1J2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 101100425745 Rattus norvegicus Ngfr gene Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000288561 Torulaspora delbrueckii Species 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- FEPMHVLSLDOMQC-UHFFFAOYSA-N virginiamycin-S1 Natural products CC1OC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2CC(=O)CCN2C(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC)NC(=O)C1NC(=O)C1=NC=CC=C1O FEPMHVLSLDOMQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019160 vitamin B3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011708 vitamin B3 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа синтеза целевого секретируемого белка человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Способ включает культивирование в подходящих условиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae и секрецию целевого белка, причем секреция направлена лидерным полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO1 и представляющим собой вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris. Представленное изобретение расширяет арсенал способов получения целевого белка в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и увеличивает возможности для эффективного синтеза таких белков. 2 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа синтеза целевого секретируемого белка человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Под секретируемыми белками будем понимать такие целевые растворимые белки, биосинтез которых в клетках дрожжей S. cerevisiae сопровождается их секрецией во внеклеточную среду.
Получение белков технического и медицинского назначения с использованием рекомбинантных эукариотических организмов является важным направлением биотехнологической промышленности. Значительное место в общем спектре продуктов занимают секретируемые белки, производство которых более экономично по сравнению с внутриклеточными, благодаря возможности применения упрощенной схемы их выделения и очистки. К числу микроорганизмов, используемых для этих целей, относят дрожжи S.cerevisiae.
Известно, что эффективность секреции белков в дрожжах зависит от выбора направляющих секрецию лидерных полипептидов (лидерных областей) [Romanos et al., 1992, Yeast, 8: 423-488; Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892; Murasugi, 2010, Recent Patents Biotechnology, 4: 153-166]. В наиболее общем виде лидерный полипептид состоит из сигнальной части (пре-области) и про-области, каждая из них удаляется из состава секретируемого белка по мере выполнения своей функции.
К основным функциям лидерных полипептидов относят:
- направление белков по секреторному пути клетки (функция пре- и про-области);
- участие в процессах сворачивания и созревания секретируемых белков (в основном функция про-области) [Takagi & Takahashi, 2003, Appl Microbiol Biotechnol 63:1-9; Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892];
- повышение растворимости, т.е. термодинамической стабильности секретируемых белков (функция про-области) [Kohara et al., 1994, Biosci Biotechnol Biochem, 58(4):779-81; Zhang et al., 2001, J Cell Biol. 153(6): 1187-98].
Способ с использованием лидерного пептида (пре-про области) α-фактора дрожжей S.cerevisiae, зарекомендовал себя как эффективный и универсальный способ синтеза целевых секретируемых белков [Romanos et al, 1992, Yeast 8, 423-488; Daly & Hearn, 2005, J. Mol. Recognit., 18: 119-138; Gellissen et al., 2005, FEMS Yeast Research 5: 1079-1096].
Другим известным секреторным лидером дрожжевого происхождения является пре-про-область гликопротеина HSP150 S. cerevisiae, положительное влияние которой на секрецию гетерологичных белков в клетках дрожжей установлено, например, для β-лактамазы [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269: 13887-92] и внеклеточного домена рецептора фактора роста нервов крысы [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].
Примером последовательности искусственного происхождения, эффективно выполняющей в клетках дрожжей функции лидерного полипептида, является фрагмент белка интерлейкина-1-бета [Lee et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890; WO98/54339A1].
Найден ряд модификаций про-областей лидерных полипептидов, которые обеспечивают улучшение процессинга целевых белков [Kjeldsen et al., 1996, Gene, 170: 107-112] и секреторной активности [Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286]. В частности, известен искусственно сконструированный про-пептид, обеспечивающий 4-кратное увеличение секреции инсулина человека по сравнению со стандартным вариантом про-области α-фактора дрожжей [Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286].
Однако ни один из известных лидерных полипептидов не может считаться универсальным инструментом для организации синтеза секретируемых белков в клетках дрожжей.
Например, в отношении продукции альбумина в клетках S.cerevisiae пре-про-область α-фактора опосредует не увеличение секреции, а 5-6-кратное увеличение деградации этого белка, тогда, как другие лидерные полипептиды подобных эффектов не обнаруживают [Sleep et al., 1990, Biotechnology, 8:42-46]. Дестабилизация целевого белка в присутствии α-факторного лидера отмечена и в экспериментах по экспрессии лизоцима шелковичного червя в клетках P.pastoris [Koganesawa et al., 2001, Protein Engeneering, 14(9):705-710].
Различные по протяженности фрагменты белка HSP1500 S. cerevisiae выполняют функцию эффективного секреторного лидера в дрожжах S.cerevisiae, при этом они обладают разными транспортными возможностями и разными возможностями по стимулированию корректного сворачивания секретируемого белка [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892; Simonen et al., 1996, Yeast, 12(5):457-66].
Также лишь один из вариантов лидеров на основе последовательности белка HSP150 обеспечивает секрецию высокоактивной бета-лактамазы в клетках S.cerevisiae, тогда как другие варианты лидеров вызывают накопление белка в клетках или секрецию неактивной формы белка [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892].
В этой связи расширение арсенала лидерных полипептидов, пригодных для решения задач, связанных с секрецией целевых белков в клетках дрожжей S.cerevisiae, является актуальной задачей.
В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения рассмотрим способ микробиологического синтеза целевого секретируемого белка в дрожжах S.cerevisiae с использованием лидерного полипептида, включающего 45 аминокислотных остатков субъединицы I белка HSP150 S.cerevisiae [WO93/18167].
Температуро-индуцируемый белок HSP150 клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae, имеет процессируемый лидерный полипептид размером 72 аминокислотных остатка, из которых первые 18 остатков формируют сигнальный пептид, а последующие 54 остатка, образующие субъединицу I белка, выполняют функцию про-области [WO93/18167, Russo et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3671-3675].
В дополнение к возможностям по использованию лидерных фрагментов белка HSP150 в клетках S. cerevisiae [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269(19): 13887-13892; Simonen et al., 1996, Yeast, 12(5):457-66] известно об эффективном использовании лидерной области белка HSP150 S.cerevisiae в качестве секреторного лидера в клетках дрожжей Pichia pastoris [Sievi et al., 2003, Biotechnol. Prog., 19: 1368-1371]. На модели секреции каталитического домена α2,3-сиалилтрансферазы крысы показано, что лидер HSP150 способен направлять корректное сворачивание и секрецию белка в клетках Р. pastoris. Эффективность этой лидерной области в дрожжах P. pastoris и в дрожжах S.cerevisiae сопоставима с эффективностью универсального α-факторного лидера [Sievi et al., 2003, Biotechnol. Prog, 19: 1368-1371].
С другой стороны известен белок PpPIR1 дрожжей Pichia pastoris, гомологичный белку HSP150 S. cerevisiae и также имеющий лидерный полипептид. Известно, что вариант лидерного полипептида белка PpPIR1 P.pastoris, имеющий размер 59 аминокислотных остатков и гомологичный лидерной области белка HSP150 S.cerevisiae, может служить секреторным лидером в клетках P.pastoris [Khasa et al., 2011, Yeast, 28(3):213-26].
Про-область лидерного полипептида белка HSP150 S. cerevisiae и про-область лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris гомологичны друг другу, однако содержат достаточно протяженные негомологичные участки и различаются по длине.
Задача заявляемого изобретения - расширение арсенала способов микробиологического синтеза целевых секретируемых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
Задача решена путем разработки способа микробиологического синтеза целевого секретируемого белка путем культивирования в подходящих условиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae, секреция целевого белка в клетках которых направлена лидерным полипептидом, в состав которого включен вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIRl Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO1.
Используемый в заявляемом изобретении вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris отличается:
- от известного варианта этой про-области [Khasa et al., 2011, Yeast, 28(3):213-26] тремя аминокислотными заменами, а именно, в положении 38 аминокислотный остаток Asp заменен на остаток Ser, в положении 39 аминокислотный остаток Lys заменен на остаток Met, а в положении 40 аминокислотный остаток Ilе заменен на остаток Glu,
- от фрагмента белка HSP150 S. cerevisiae, использованного в способе ближайшем аналоге, отличается размером (42 остатка в SEQ ID NO1 и не менее 45 остатков в ближайшем аналоге) и заменами не менее, чем в 50% аминокислотных позиций.
В заявляемом изобретении использован вариант полного лидерного полипептида белка PpPIR1, который отличается от опубликованного варианта [Khasa et al., 2011, Yeast, 28(3):213-26] указанными выше заменами в про-области и наличием дополнительного метионина на N- конце.
Эффективность заявляемого способа подтверждена на примерах синтеза в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae сывороточного альбумина человека и интерферона альфа-2b человека
Способ в общем виде
Для амплификации фрагмента хромосомной ДНК дрожжей P. pastoris, кодирующей, лидерный полипептид белка PpPIR1. используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для того чтобы в процессе амплификации изменить последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК так, чтобы измененная последовательность содержала уникальный сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции NcoI и кодировала вариант модифицированного полипептида SEQ ID NO1, используют дополнительные праймеры. Амплифицированный фрагмент ДНК методами генной инженерии сливают с последовательностью ДНК, обладающей функцией промотора в дрожжах S. cerevisiae, и результирующий фрагмент ДНК, прецизионно слитый с последовательностью ДНК, кодирующей целевой секретируемый белок, клонируют в экспрессионном векторе. При этом экспрессионным вектором может быть эписомный или интегративный вектор, способный стабильно и селективно поддерживаться в клетках дрожжей S. cerevisiae.
Сконструированным вектором трансформируют клетки реципиентного штамма дрожжей S. cerevisiae. Для этого используют одну из рутинных процедур трансформации. Селекцию трансформантов осуществляют за счет комплементации рецессивной хромосомной мутации реципиентного штамма с помощью функционального аллеля гена, локализованного в составе векторной ДНК, или за счет использования в составе векторной ДНК гена, кодирующего один из доминантных признаков (например, определяющего устойчивость клеток к действию антибиотика).
Полученные трансформанты используют для биосинтеза секретируемого целевого белка. Для этого культивирование клеток полученных трансформантов осуществляют в среде следующего состава, в мас.%: пептон 1-3; дрожжевой экстракт 0,5-3; глюкоза 1-3, вода - остальное, рН среды - естественный в течение 16-48 часов при температуре 22-32°С на качалке 100-350 об/мин.
В этих условиях клетки дрожжей секретируют в среду культивирования целевой белок.
Способ позволяет синтезировать различные целевые секретируемые белки, включая сывороточный альбумин и интерферон альфа-2b человека, в количествах, превосходящих или по крайней мере не уступающих количествам белков, синтезируемых с использованием способов, известных из предыдущего уровня развития техники.
Заявляемое изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг 1. Влияние лидерных полипептидов на уровень секреции сыворточного альбумина человека в дрожжах S.cerevisiae. Секреция сывороточного альбумина человека направлена следующими лидерными полипептидами:
HSA5 - сигнальным пептидом «ART» (штамм HSA5-Sc),
HSA7 - лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с про-областью белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae (штамм HSA7-Sc),
HSA8 - полным лидерным полипептидом белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris, включающим последовательность SEQ ID NO1 (штамм HSA8-Sc),
HSA9 - лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с последовательностью SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris (штамм HSA9-Sc).
Штаммы S.cerevisiae HSA5-Sc и HSA7-Sc используют лидерные полипептиды, известные из предыдущего уровня техники, и рассмотрены в качестве контроля к штаммам HSA8-Sc и HSA9-Sc, секретирующим альбумин человека с использованием лидерных полипептидов, включающих последовательность SEQ ID NO1, являющейся вариантом про-области белка PpPIR1 P.pastoris. Приведены сравнительные данные иммуноферментного анализа (ИФА) образцов культуральной жидкости из двух экспериментов. Данные усреднены по 3-10 клонам случайных трансформантов. Указаны величины среднеквадратичного отклонения.
Фиг.2. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости, полученных в результате культивирования штаммов дрожжей: IFN-F-Sc (дорожка «α-factor»), IFN-H-Sc (дорожка «PpPIR1»). Штамм S.cerevisiae IFN-F-Sc использует лидерный полипептид, известный из предыдущего уровня техники, и рассмотрен в качестве контроля к штамму IFN-H-Sc, секретирующему интерферон альфа-2b человека с использованием лидерного полипептида, включающего последовательность SEQ ID NO1.
На дорожки нанесены образцы, содержащие по 5 мкл культуральной жидкости каждого штамма. Маркерами молекулярного веса (дорожка М, слева приведены значения молекулярного веса белковых маркеров (в кДа) служили белки набора PageRuler Prestained Protein Ladder (#SM0671, "Fermentas"). В качестве отрицательного контроля (не способного синтезировать интерферон альфа-2b человека) нанесен образец культуральнгой жидкости реципиентного штамма S.cerevisiae G1L.
Заявляемое изобретение проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris, включающий SEP ID NO1
Этап 1. Амплификация геномного фрагмента ДНК
Фрагмент ДНК, кодирующий лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris получают в результате 2-х этапной ПЦР-амплификации фрагментов хромосомной ДНК штамма GS115 (Invitrogen, USA). Матрицей для амплификации служит хромосомная ДНК штамма GS115 P.pastoris, которую выделяют по методу Сидорука [Сидорук с соавт., 2009]. На 1-ом этапе осуществляют ПЦР-амплификацию фрагмента-1 с использованием пары праймеров N520 (5′-attaaatgatcaaccatgatgtacaggaactt) и N541 (5′-tgtgctccaaggttcggaa), а также фрагмента-2 - с использованием праймеров N540 (5′-ttccgaaccttggagcaca) и N521 (′-ttactcgagtctagatctcttttccatggaggcatctaaggacttaa). На 2-ом этапе осуществляют ПЦР-амплификацию фрагмента-3 с использованием праймеров N520/N521 и смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы.
Путем обработки эндонуклеазами рестрикции BclI и XhoI на концах амплифицированного фрагмента-3 ДНК открывают липкие концы соответствующих сайтов рестрикции и тем самым получают пригодный для последующего клонирования фрагмент ДНК, кодирующий лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris.
В результате 2-этапной амплификации в последовательности ДНК, кодирующей лидерный полипептид изменяют расположение уникального сайта узнавания рестриктазы NcoI.
Этап 2. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris, включающий SEQ ID NO1
Плазмиду pUC18x-GAL1-hsp150pp получают в результате одновременного лигирования трех фрагментов ДНК: 1) HindIII/XhoI фрагмента, заключающего векторную часть лабораторной плазмиды pUC18x; 2) HindIII/BamHI фрагмента, заключающего последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae; 3) BclI/XhoI фрагмента ДНК, полученного на этапе 1 и кодирующего лидерный полипептид, белка PpPIR1 P.pastoris.
Результирующая плазмида pUC18x-GAL1-hspl50pp содержит в составе HindIII/NcoI фрагмента ДНК нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris.
Пример 2. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae для секреции сывороточного альбумина человека
Этап 1. Конструирование вектора pgkU::HSA8
С этой целью получают три фрагмента ДНК: 1) HindIII/SalI фрагмент ДНК, заключающий векторную часть интегративного вектора р91-3 [RU2420 567]; 2) Hindlll/Ncol фрагмент ДНК плазмиды pUC18x-GAL1-hsp150pp, заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris; 3) NcoI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий структурный ген HSA сывороточного альбумина человека, получаемый в результате открытия концевых сайтов рестрикции NcoI и XhoI во фрагменте ДНК, который амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров N522 (5'-tatccatggaaaagagagacgctcacaagtcagaa) и N169 (5'-gagcggataacaatttcacacagg) и ДНК вектора р69-63 (RU2009140367) в качестве матрицы.
Вектор pgkU::HSA8 получают в результате одновременного направленного лигирования этих трех фрагментов ДНК.
Вектор pgkU::HSA8 предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена сывороточного альбумина человека, секреция которого направляется модифицированным вариантом лидерного полипептида белка PpPIR1 P.pastoris.
Этап 2. Конструирование вектора pgU::HSA7
С этой целью HindIII/NcoI фрагмент ДНК вектора pgkU::HSA8, заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris, замещают на HindIII/NcoI фрагмент ДНК, заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей искусственный сигнальный пептид «ART» (HindIII/PstI фрагмент ДНК вектора р69-35, RU2009140367), который в свою очередь слит с последовательностью ДНК, кодирующей про-область белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae (PstI/NcoI фрагмент ДНК вектора р91-16, RU2420567).
В результате получают вектор pgkU::HSA7, который предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена сывороточного альбумина человека, секреция которого направлена лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с про-областью белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae.
Этап 3. Конструирование вектора pgkU::HSA9
С этой целью PstI/NcoI фрагмент ДНК вектора pgkU::HSA7, заключающий нуклеотидную последовательность, кодирующую про-область белка HSP150 дрожжей S.cerevisiae, замещают на PstI/NcoI фрагмент ДНК, кодирующий про-область белка PpPIR1 P.pastoris. PstI/NcoI фрагмент ДНК, кодирующий про-область белка PpPIR1 P.pastoris, получают в результате ПЦР-амплификации соответствующего фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GAL1-hsp150pp с использованием праймеров
N542 (5′-tgcctgcagctttgggtgcctacgttccttccgaaccttggagcaca) и
N521 (5′-ttactcgagtctagatctcttttccatggaggcatctaaggacttaa) и последующего открытия липких концов амплифицированного фрагмента путем обработки эндонуклеазами рестрикции PstI и NcoI.
В результате получают вектор pgkU::HSA9 для экспрессии гена сывороточного альбумина человека в клетках S.cerevisiae под контролем промотора GALL Секреция этого белка направлена лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с последовательностью SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 P.pastoris.
Этап 4. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc и HSA9-Sc
С этой целью осуществляют трансформацию реципиентного штамма S. cerevisiae G1L, маркированного четырьмя ауксотрофными мутациями (RU2420567), вектором р69-35 (RU2009140367) или pgkU::HSA7 или pgkU::HSA8 или pgkU::HSA9, соответственно.
Трансформацию реципиентого штамма дрожжей G1L проводят по методу Ито с соавт.(Ito Н., Fukuda Y., Murata К., Kimura А. 1983. J Bacteriol., 153: 163-168). Для отбора трансформантов используют синтетическую среду с добавлением аминокислот или оснований, соответствующих ауксотрофным мутациям конструируемого штамма, до конечной концентрации 30 мкг/л. Состав синтетической среды, мас.%: КН2РО4 - 0,1, MgSO4 - 0,05, NaCl - 0,01, CaCl2 - 0,01, (NH4)2SO4 - 0,35, глюкоза - 2, тиамин (витамина В1) - 0,02, рибофлавин (витамина В2) - 0,02, никотиновая кислота (витамина РР) - 0,02, п-аминобензойная кислота - 0,02, пантотенат кальция - 0,02, биотин - 0,0002, пиридоксин (витамина В6) - 0,02, инозит - 1, фолиевая кислота - 0,02, вода - остальное.
Непосредственно перед трансформацией ДНК каждого вектора обрабатывают рестриктазой XhoI, тем самым удаляя из состава интегрируемого вектора бактериальную часть и направляя интеграцию вектора в локус PGK1 хромосомы дрожжей.
В результате трансформации получают по 2 независимых клона штаммов дрожжей S.cerevisiae HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc и HSA9-Sc, соответственно. Секреция сывороточного альбумина человека в клетках полученных штаммов дрожжей направлена сигнальным пептидом «ART» (HSA5-Sc), лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с про-областью бежа HSP150 дрожжей S.cerevisiae (HSA7-Sc), лидерным полипептидом на основе сигнального пептида «ART», слитого с последовательностью SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris (HSA9-Sc) или полным лидерным полипептидом белка PpPIR1 дрожжей P.pastoris, содержащим последовательность SEQ ID NO1 про-области (HSA8-Sc).
Штаммы S.cerevisiae HSA5-Sc и HSA7-Sc рассматрены в качестве контроля к штаммам HSA8-Sc и HSA9-Sc, секретирующим альбумин человека с использованием лидерных полипептидов, включающих последовательность SEQ ID NO1 про-области белка PpPIR1 P.pastoris.
Пример 3. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae для секреции интерферона альфа-2b человека
Этап 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC18x-IFN
С этой целью осуществляют лигирование двух фрагментов ДНК: 1) BamHI/XhoI фрагмента, заключающего векторную часть лабораторного вектора pUC18x; 2) BamHI/XhoI фрагмента ДНК, который получают в результате ПЦР-амплификации фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GAL1ppI-IFN2b (RU2427645) с использованием праймеров N499 (5'-ataggatccteteatctecctcaaacccac) и N169 (5-gagcggataacaatttcacacagg) и последующего открытия его липких концов с использованием рестриктаз BamHI и XhoI.
Плазмида pUC18x-IFN заключает нуклеотидную последовательность структурного гена интерферона альфа-2b человека в составе BamHI/XhoI фрагмента ДНК. Этап 2. Конструирование вектора pPDX2H-sIFN
С этой целью осуществляют одновременное лигирование трех фрагментов ДНК: 1) HindIII/XhoI фрагмента ДНК, заключающего векторную часть рекомбинантной плазмиды pPDX2-IFN2b (RU2427645); 2) HindIII/BgIII фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GALl-hsp150pp, заключающего нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид белка PpPIR1 P.pastoris; 3) BamHI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-IFN, заключающего нуклеотидную последовательность структурного гена интерферона альфа-2b человека.
В результате получают репликативный вектор pPDX2H-sIFN, который предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена рекомбинантного интерферона альфа-2b человека, секреция которого направлена лидерным полипептидом белка PpPIR1 P.pastoris.
Этап 3. Конструируирование вектора pPDX2F-sIFN
С этой целью HindIII/NcoI фрагмент ДНК плазмиды pPDX2H-sIFN заменяют на HindIII/NcoI фрагмент ДНК плазмиды pUC18x-GAL1ppI-IFN2b [RU2427645], заключающий нуклеотидную последовательность промотора GAL1 дрожжей S.cerevisiae, слитую с последовательностью ДНК, кодирующей лидерный полипептид α-фактора дрожжей S.cerevisiae (пре-про-область α-фактора дрожжей S.cerevisiae).
В результате получают репликативный вектор pPDX2F-sIFN, который предназначен для экспрессии в клетках дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора GAL1 гена рекомбинантного интерферона альфа-2b человека, секреция которого направлена лидерным полипептидом α-фактора дрожжей S.cerevisiae.
Этап 4. Конструирование штаммов дрожжей S.cerevisiae IFN-H-Sc и IFN-F-Sc
С этой целью осуществляют трансформацию реципиентного штамма S. cerevisiae G1L, маркированного четырьмя ауксотрофными мутациями (RU2420567), вектором pPDX2H-sIFN или pPDX2F-sIFN, соответственно.
Трансформацию реципиентого штамма дрожжей G1L и селекцию трансформантов осуществляют как в примере 2 за исключением того, что используют кольцевые формы векторных ДНК, не подвергая их расщеплению.
В результате трансформации получают по 2 независимых клона штаммов дрожжей S.cerevisiae IFN-H-Sc и S.cerevisiae IFN-F-Sc, соответственно. Секреция рекомбинантного интерферона альфа-2b человека в штамме S.cerevisiae IFN-H-Sc направлена лидерным полипептидом белка PpPIR1 P.pastoris (IFN-H-Sc), а в штамме S.cerevisiae IFN-F-Sc, который является контролем, лидерным полипептидом α-фактора дрожжей S.cerevisiae (IFN-F-Sc).
Пример 4. Культивирование дрожжей S.cerevisiae и анализ уровня секреции целевых белков
Для выращивания штаммов дрожжей S.cerevisiae IFN-H-Sc, IFN-F-Sc, HSA5-Sc, HSA7-Sc, HSA8-Sc и HSA9-Sc используют комплексную среду YPD следующего состава, мас.%: пептон -2, дрожжевой экстракт -1, глюкоза -2, вода - остальное. Дрожжи культивируют при температуре +28°С на качалке (250 об/мин) в течение 42 часов при плотности засева 5×105 мл-1.
Сравнительный анализ уровня секреции интерферона альфа-2b человека в клетках штаммов IFN-H-Sc и IFN-F-Sc осуществляют путем электрофорез белков культуральной жидкости в 15% ПААГ в денатурирующих редуцирующих условиях с использованием системы Mini-PROTEAN Tetra Cell (#165-8000, "BioRad") по инструкции, прилагаемой к системе. Приготовление буферов, подготовку образцов культуральной жидкости, нанесение на гель и электрофорез проводят согласно инструкции, прилагаемой к системе. Используют маркеры молекулярного веса PageRuler Prestained Protein Ladder (#SM0671, "Fermentas"). Окрашивание геля нитратом серебра проводят при помощи набора PageSilver Silver Staining Kit "Fermentas" (#K0681, "Fermentas") согласно инструкции, прилагаемой к киту.
Сравнительный анализ уровня секреции сывороточного альбумина человека осуществляют, используя метод и протокол ИФА Albumin Human Bioassay ELISA Kit (A 1274-85, "US Biological"). В качестве отрицательного контроля (не способного синтезировать сывороточный альбумин) используют реципиентный штамм дрожжей S.cerevisiae G1L.
Результаты сравнительного анализа (фиг.1) демонстрируют, что эффективность синтеза в дрожжах Saccharomyces cerevisiae секретируемого сывороточного альбумина человека с использованием лидерных полипептидов, включающих вариант про-области, SEQ ID NO1, превышает (штамм HSA8-Sc) или, по крайней мере, не уступает (штамм HSA9-SC) эффективности синтеза этого белка с использованием лидерных полипептидов, известных из предыдущего уровня техники (штаммы HSA5-Sc и HSA7-Sc).
Данные сравнительного анализа (фиг.2) свидетельствуют, что эффективность синтеза секретируемого интерферона альфа-2b человека с использованием лидерного полипептида белка PpPIR1 P.pastoris, включающего вариант про-области с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO1 (штамм IFN-H-Sc), не уступает эффективности синтеза этого белка с помощью «универсального» лидерного полипептида α-фактора дрожжей, используемого в качестве контроля (штамм IFN-F-Sc). Кроме того, видно (фиг.2), что целевой продукт, синтезированный заявляемым способом с использованием штамма IFN-H-Sc отличается более высоким качеством, чем целевой продукт, синтезированный контрольным штаммом IFN-H-Sc, так как содержит значительно меньшее количество фоновых белков.
Таким образом, вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO1, с использованием которой разработан заявляемый способ, пополняет арсенал известных фрагментов лидерных пептидов для микробиологического синтеза секретируемых целевых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и увеличивает возможности для эффективного синтеза этих белков.
Заявляемый способ позволяет использовать для секреции целевых белков в клетках дрожжей S.cerevisiae вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO1, в сочетании с различными пре-областями.
Источники научно-технической информации
Сидорук К.В., Левитин Е.И., Пиксасова О.В. (2009). Универсальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов, основанный на предварительной обработке биомассы раствором ацетата аммония. «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии: Вторые чтения, посвященные памяти В.И.Корогодина и В.А.Шевченко». (Дубна, ОИЯИ, 12-13 января, 2009). Материалы тезисов и докладов. Стр.100.
Daly, R. and Hearn, M.T.W. (2005) Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: A useful experimental tool in protein engineering and production. JMol Recognit, 18:119-138. Gellissen G., Kunze G., Gaillardin C, Cregg J.M., Berardi E., Veenhuis M., van der Klei I. (2005). New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica - a comparison. FEMS Yeast Res. 2005, 5(11):1079-96.
Ito H., Fukuda Y, Murata K, Kimura A.(1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J.Bacteriol. 153:163-168.
Khasa Y.P., Conrad S., Sengul M., Plautz S., Meagher M.M., Inan M. (2011). Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast, 28(3): 213-226.
Kjeldsen T. Yeast secretory expression of insulin precursors. Appl Microbiol Biotechnol. 54 (2000) 277-286.
Kjeldsen T, Brandt J, Andersen AS, Egel-Mitani M, Hach M, Pettersson AF, Vad К. A removable spacer peptide in an alpha-factor-leader/insulin precursor fusion protein improves processing and concomitant yield of the insulin precursor in Saccharomyces cerevisiae. Gene 170 (1996) 107-112.
Koganesawa N, Aizawa T, Masaki K, Matsuura A, Nimori T, Bando H, Kawano K, Nitta K. (2001). Construction of an expression system of insect lysozyme lacking thermal stability: the effect of selection of signal sequence on level of expression in the Pichia pastoris expression system. Protein Eng, 14(9): 705-710.
Kohara A, Yamamoto Y, Kikuchi M. (1994) Processing and secretion of human growth hormone with an artificial signal sequence. Biosci Biotechnol Biochem., 58(4):779-781
Lee J., Choi S.-I., Jang J.S., Jang K., Moon J.W., Bae C.S., Yang D.S., Seong B.L. (1999) Novel secretion system of recombinant Saccharomyces cerevisiae using an N-terminus residue of human IL-1β as secretion enhancer. Biotechnol Prog, 15: 884-890.
Murasugi A. (2010) Secretory Expression of Human Protein in the Yeast Pichia pastoris by Controlled Fermentor Culture. Recent Patents on Biotechnology, 4: 153-166.
Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.J. (1992). Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast, 8: 423-488.
Russo P., Kalkkinen N., Sareneva H., Paakkola J., Makarow M. A heat shock gene from Saccharomyces cerevisiae encoding a secretory glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992)3671-3675.
Sievi E., Halnninen A.-L., Salo H., Kumar V., Makarow M. Validation of the HSP150 Polypeptide Carrier and HSP150 Promoter in Expression of Rat r2,3-Sialyltransferase in Yeasts. Biotechnol. Prog. 2003,19, 1368-1371
Simonen M., Jamsa E., Makarow M. The role of the carrier protein and disulfide formatioinn the folding of p-lactamase fusion proteins in the endoplasmic reticulum of yeast. The Journal of Biological Chemisitry 269 (1994) 13887-13892 Simonen M, Vihinen H, Jänsä E, Arumäe U, Kalkkinen N, Makarow M. The hsp150 delta-carrier confers secretion competence to the rat nerve growth factor receptor ectodomain in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 12 (1996) 457-466.
Sleep D., Belfield G.P., Goodey A.R. (1990) The secretion of human serum albumin from the yeast Saccharomyces cerevisiae using five different leader sequences. Biotechnology, 8: 42-46
Takagi H, Takahashi M. (2003). A new approach for alteration of protease functions: pro-sequence engineering. Appl Microbiol Biotechnol, 63(1):1-9.
Zhang X, Kiechle F. (2001). Hoechst 33342-induced apoptosis is associated with decreased immunoreactive topoisomerase I and topoisomerase I-DNA complex formation. Ann Clin Lab Sci., 31(2):187-198.
Claims (1)
- Способ микробиологического синтеза целевого секретируемого белка путем культивирования в подходящих условиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae, секреция целевого белка в клетках которых направлена лидерным полипептидом, отличающийся тем, что в состав лидерного полипептида включен вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID NO 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012139788/10A RU2502805C1 (ru) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012139788/10A RU2502805C1 (ru) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2502805C1 true RU2502805C1 (ru) | 2013-12-27 |
Family
ID=49817713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012139788/10A RU2502805C1 (ru) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2502805C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993018167A1 (en) * | 1992-03-11 | 1993-09-16 | Marja Makarow | A method for production of proteins in yeast |
| US7741075B2 (en) * | 2008-06-06 | 2010-06-22 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Pichia pastoris PIR1 secretion signal peptide for recombinant protein expression and Pichia pastoris PIR1 and PIR2 anchor domain peptides for recombinant surface display |
| RU2427645C1 (ru) * | 2010-06-10 | 2011-08-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЗРЕЛОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ ЗРЕЛОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ) |
-
2012
- 2012-09-18 RU RU2012139788/10A patent/RU2502805C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993018167A1 (en) * | 1992-03-11 | 1993-09-16 | Marja Makarow | A method for production of proteins in yeast |
| US7741075B2 (en) * | 2008-06-06 | 2010-06-22 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Pichia pastoris PIR1 secretion signal peptide for recombinant protein expression and Pichia pastoris PIR1 and PIR2 anchor domain peptides for recombinant surface display |
| RU2427645C1 (ru) * | 2010-06-10 | 2011-08-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЗРЕЛОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ ЗРЕЛОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6833812B2 (ja) | プロモーター変異体 | |
| US12264319B2 (en) | Yeast promotors for protein expression | |
| JP5290997B2 (ja) | ピキアにおけるメタノール誘導性プロモーターからのメタノール非依存的誘導の方法 | |
| CN102239183B (zh) | 大量分泌的蛋白的筛选和它们作为融合配偶体在重组蛋白制备中应用 | |
| EP3594351B1 (en) | Yeast promoters from pichia pastoris | |
| US9012367B2 (en) | Rapid screening method of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom | |
| KR100490190B1 (ko) | 개량된 단백질 발현균주 | |
| WO2012124567A1 (ja) | Vps遺伝子が破壊されている酵母を用いる異種タンパク質の製造方法 | |
| US20250207143A1 (en) | Recombinant yeast cell | |
| RU2502805C1 (ru) | СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae | |
| US20210388037A1 (en) | Leader sequence for yeast | |
| Felber et al. | Strains and molecular tools for recombinant protein production in Pichia pastoris | |
| JPWO2008032659A1 (ja) | 効率向上型分泌シグナルペプチド及びそれらを利用したタンパク質生産方法 | |
| Piboonpocanun | Recombinant Production of Food Allergens in Yeast Pichia pastoris | |
| KR102613936B1 (ko) | 자가분해능이 저하된 켁신 효소 및 이의 생산 방법 | |
| JP2001509392A (ja) | 組換え酵母細胞による分泌タンパク質の産生増加 | |
| CN1954083B (zh) | 用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴 | |
| JPWO2017122638A1 (ja) | 形質転換体、およびトランスフェリンの製造方法 | |
| HK1251256B (zh) | 启动子变体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |