RU2599418C1 - Method for preparing cell material from human placenta - Google Patents
Method for preparing cell material from human placenta Download PDFInfo
- Publication number
- RU2599418C1 RU2599418C1 RU2015142374/10A RU2015142374A RU2599418C1 RU 2599418 C1 RU2599418 C1 RU 2599418C1 RU 2015142374/10 A RU2015142374/10 A RU 2015142374/10A RU 2015142374 A RU2015142374 A RU 2015142374A RU 2599418 C1 RU2599418 C1 RU 2599418C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- solution
- transferred
- growth medium
- tube
- Prior art date
Links
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 8
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 7
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 208000034423 Delivery Diseases 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 claims description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000155 melt Substances 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 7
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 4
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 2
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001951 Fetal Death Diseases 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018359 Systemic autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 230000006538 anaerobic glycolysis Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 231100000479 fetal death Toxicity 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может использовано для получения клеточного материала из неонатальных органов человека (плаценты) после родов на 38-40 неделе гестации, используемого в широком спектре медицинских клеточных технологий с возможностью длительного хранения перед применением.The invention relates to medicine and can be used to obtain cellular material from neonatal organs (placenta) after childbirth at 38-40 weeks of gestation, used in a wide range of medical cell technologies with the possibility of long-term storage before use.
Известен способ получения клеточной культуры [RU 2455357, C1, C12N 15/08, A61K 35/50, 10.07.2012], основанный на том, что выделенные из плаценты человека после родов на 38-40 неделе гестации и культивированные мезенхимальные стволовые клетки переводят в суспензию и помещают в среду для транспортировки, содержащую физиологический раствор, причем используют среду для транспортировки, включающую также лекарственное средство в виде раствора, выбранного из следующего ряда: лекарственное средство на основе янтарной кислоты, или лекарственное средство, стимулирующее анаэробный гликолиз, или лекарственное средство, оказывающее протективное действие, при следующем их соотношении, об. %: лекарственное средство - 20-80, физиологический раствор - остальное до 100, при этом готовый продукт содержит от 0,1 до 5 млн клеток в 1 мл среды для транспортировки.A known method of obtaining cell culture [RU 2455357, C1, C12N 15/08, A61K 35/50, 10.07.2012], based on the fact that isolated from human placenta after delivery at 38-40 weeks of gestation and cultured mesenchymal stem cells are transferred to suspension and placed in a transport medium containing physiological saline, and use the medium for transport, which also includes a drug in the form of a solution selected from the following series: a drug based on succinic acid, or a drug that stimulates e anaerobic glycolysis, or a drug that has a protective effect, in the following ratio, vol. %: drug - 20-80, physiological saline - the rest is up to 100, while the finished product contains from 0.1 to 5 million cells in 1 ml of medium for transportation.
Недостатком способа является относительно узкая область применения, что не позволяет получать клеточный материал с высокими потребительскими свойствами, в частности, способ не обеспечивает получение клеточного материала с большими сроками хранения, обеспечивающими возможность его оперативного использования.The disadvantage of this method is the relatively narrow scope that does not allow to obtain cellular material with high consumer properties, in particular, the method does not provide cellular material with long shelf life, providing the possibility of its operational use.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ [RU 2347579, C1, A61K 35/50, A61K 35/44, C12N 15/08, A61P 25/00, 27.02.2009], основанный на том, что выделяют из пуповины новорожденного после нормальных родов культуру стволовых клеток, осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 100 ед./мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°C в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспензированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°C, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора.The closest in technical essence to the proposed one is the method [RU 2347579, C1, A61K 35/50, A61K 35/44, C12N 15/08, A61P 25/00, 02/27/2009], based on the fact that the newborn is isolated from the umbilical cord after of normal birth, stem cell culture, a culture of allogeneic mesenchymal stem cells is isolated for parenteral administration to a patient with neurological pathology, when allogenic mesenchymal stem cells are isolated, the umbilical cord is released from blood residues and washed in Versen's solution with the addition of antibiotics of 100 units / ml nitsillin, 100 units / ml streptomycin, 100 units / ml amphotericin for 1 h at room temperature on a shaker, veins cannulated on both sides and washed first with Hanks solution and then with a 0.1%
Недостатком способа является относительно узкая область применения, что не позволяет получать клеточный материал с высокими потребительскими свойствами, в частности, способ не обеспечивает получение клеточного материала с большими сроками хранения, обеспечивающими возможность его оперативного использования.The disadvantage of this method is the relatively narrow scope that does not allow to obtain cellular material with high consumer properties, in particular, the method does not provide cellular material with long shelf life, providing the possibility of its operational use.
Задачей, которая решается в изобретении, является получение клеточного материала с высокими потребительскими свойствами, в частности, с большими сроками хранения без существенной потери лечебных свойств, обеспечивающими возможность оперативного использования клеточного материала.The problem that is solved in the invention is to obtain cellular material with high consumer properties, in particular, with long shelf life without significant loss of medicinal properties, providing the ability to quickly use cellular material.
Технический результат, который реализуется при использовании предложенного способа, заключается в получении клеточного материала с высокими потребительскими свойствами, в частности, с большими сроками хранения, обеспечивающими возможность его оперативного использования.The technical result, which is realized by using the proposed method, is to obtain cellular material with high consumer properties, in particular, with long shelf life, providing the possibility of its operational use.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, согласно способу, основанному на том, что выделяют из плаценты новорожденного после нормальных родов культуру аллогенных мезенхимальных стволовых клеток, согласно изобретению амнион плаценты вместе с неглубоким захватом хориона нарезают на небольшие кусочки, промывают их от крови путем их помещения в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл раствора Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика и последующего энергичного встряхивания, промытые кусочки ткани измельчают и инкубируют 1-2 ч при 37°C в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 10 см из расчета 1 кусочек ткани на 1 чашку Петри с 10 мл раствора фермента, полученную суспензию из каждой чашки Петри переносят в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл и осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 300 g, полученные осадки суспензии из каждой чашки Петри ресуспендируют в 15 мл ростовой среды DMEM: F12; 10% фетальная телячья сыворотка; р-р гентамицин/стрептомицин/глутамина 0,25 мг ципрофлоксацина, содержимое каждой пробирки переносят в отдельный культуральный флакон площадью 75 см2 , культивируют со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности и переводят в суспензию с использованием раствора 0,25%-ного трипсина с версеном (1:1) и рассевают в культуральные флаконы площадью 75 см2 в соотношении 1:3, клетки отделяют от внутренних стенок пробирки смесью растворов версена и трипсина в отношении 1:1 и переносят в центрифужную пробирку объемом 15-50 мл и центрифугируют 5 мин, 300 g, после чего осадок ресуспендируют для криозаморозки в среде: 90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида, подсчитывают количество клеток в полученной суспензии и разбавляют ее средой для криозаморозки до конечной концентрации 1 млн клеток/мл, разливают в криопробирки требуемых объемов и осуществляют замораживание в течение первых суток в низкотемпературном холодильнике при -80°C с последующим переносом в сосуд Дьюара с жидким азотом при -196°C, а при подготовке к применению клетки восстанавливают при температуре 37-40°C на водяной бане до таяния льда, содержимое криопробирки переносят в культуральный флакон 75 см2 с фильтром, содержащий 10 мл полной ростовой среды, культивируют одни сутки 24 ч в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% CO2, 80% влажности с последующей разовой заменой ростовой среды на 10 мл свежей и последующих периодической сменой ростовой среды через каждые трое суток до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности.The problem is solved, and the required technical result is achieved by the fact that, according to the method, based on the fact that the culture of allogeneic mesenchymal stem cells is isolated from the placenta of the newborn after normal birth, according to the invention, the placental amnion together with a shallow chorion capture are cut into small pieces, washed from blood by placing them in a separate 50 ml isopropylene tube filled with 40 ml of Hanks solution with the addition of an antibiotic and antimycotic and subsequent vigorous shaking, washed tissue pieces are crushed and incubated for 1-2 hours at 37 ° C in 0.1% type I collagenase solution in Petri dishes with a diameter of 10 cm at the rate of 1 piece of tissue per 1 Petri dish with 10 ml of enzyme solution, the suspension obtained from each Petri dish, transfer to a separate 50 ml isopropylene tube and precipitate by centrifugation for 5 min at 300 g, the resulting precipitate suspension from each Petri dish is resuspended in 15 ml of DMEM growth medium: F12; 10% fetal calf serum; gentamicin / streptomycin / glutamine solution 0.25 mg of ciprofloxacin, the contents of each tube are transferred to a separate culture vial with an area of 75 cm 2 , cultured with a change in growth medium every 3 days until the obtained primary cell culture reaches 80% confluency and transferred into suspension using a solution of 0.25% trypsin with versene (1: 1) and scattered in culture vials with an area of 75 cm 2 in a 1: 3 ratio, the cells are separated from the inner walls of the tube with a mixture of versene and trypsin solutions in a ratio of 1: 1 and transferred centrifuge 15–50 ml test tube and centrifuged for 5 min, 300 g, after which the pellet is resuspended for cryogenic freezing in medium: 90% fetal calf serum, 10% dimethyl sulfoxide, the number of cells in the resulting suspension is counted and diluted with cryogenic freezing medium to a final concentration of 1 million cells / ml are poured into cryovials of the required volumes and frozen for the first day in a low-temperature refrigerator at -80 ° C, followed by transfer to a Dewar vessel with liquid nitrogen at -196 ° C, and in preparation for use etki reduced at a temperature of 37-40 ° C in a water bath until the ice melts, the contents transferred into cryovials culture flask of 75 cm 2 with a filter containing 10 ml of complete growth medium, cultured for 24 h in a CO 2 incubator night at 37 ° C, 5% CO 2 , 80% humidity, followed by a one-time replacement of the growth medium with 10 ml of fresh and subsequent periodic change of the growth medium every three days until the primary cell culture reaches 80% confluency.
В качестве графических материалов представлены:As graphic materials are presented:
на фиг. 1 - сравнительная оценка зависимости жизнеспособности различных пассажей фибробластов кожи (верхняя кривая), МСК из плаценты (средняя кривая) и костного мозга (нижняя кривая) человека после криоконсервации в течение 60 сут в жидком азоте (-196°C);in FIG. 1 - a comparative assessment of the dependence of the viability of various passages of skin fibroblasts (upper curve), MSCs from the placenta (middle curve) and bone marrow (lower curve) of a person after cryopreservation for 60 days in liquid nitrogen (-196 ° C);
на фиг. 2 - результаты определения жизнеспособности различных пассажей МСК из плаценты человека после криоконсервации в течение 60 сут. в жидком азоте (-196°C).in FIG. 2 - the results of determining the viability of the various passages of MSCs from human placenta after cryopreservation for 60 days. in liquid nitrogen (-196 ° C).
на фиг. 3 - образец паспорта для клеточного материала из плаценты человека.in FIG. 3 - sample passport for cellular material from human placenta.
Предложенный способ получения клеточного материала из плаценты человека реализуется следующим образом.The proposed method for producing cellular material from human placenta is implemented as follows.
Предложенный способ получения клеточного материала из плаценты человека предполагает, что имеются показания, гарантирующие безопасность их последующего применения, в частности, нормальное течение беременности и родов, отсутствие инфекционных заболеваний у донора. Технология не может быть использована из-за нарушений требований к безопасности, в частности, при наличии в крови донора вирусов: гепатита В и/или С, иммунодефицита человека (ВИЧ), сифилиса, наличии у донора онкологических заболеваний в анамнезе, при наличии у донора системных аутоиммунных заболеваний в анамнезе, генетических заболеваний, психических расстройств психосоматического характера, при наличии у плода выраженных уродств и мальформаций, при мертворождении или внутриутробной гибели плода.The proposed method for obtaining cellular material from human placenta suggests that there are indications that guarantee the safety of their subsequent use, in particular, the normal course of pregnancy and childbirth, and the absence of infectious diseases in the donor. The technology cannot be used due to violations of safety requirements, in particular, in the presence of viruses in the blood of the donor: hepatitis B and / or C, human immunodeficiency (HIV), syphilis, a history of cancer of the donor, if the donor a history of systemic autoimmune diseases, genetic diseases, mental disorders of a psychosomatic nature, if the fetus has pronounced deformities and malformations, with stillbirth or fetal death.
Способ может быть реализован при наличии соответствующих оборудования (центрифуга, СО2-инкубатор, ламинарный шкаф, инвертированный микроскоп, автоматическая пипетка, микропипетка, замораживатель, сосуд Дьюара, низкотемпературный холодильник, бытовой холодильник, камера Горяева, водяная баня, термос, сумка холодильник), реактивов (антибиотики, антимикотики, питательная среда ДМЕМ/F12, фетальная телячья сыворотка, Версен, 0,25%-ный раствор трипсина, ДМСО, раствор Хенкса, физиологический раствор, коллагеназа 1-го типа, трипановый синий) и расходных материалов (одноразовая культуральная пластиковая посуда (флаконы, пробирки, серологические пипетки, чашки Петри, наконечники для микропипеток, криопробирки); покровные стекла, набор медицинских инструментов (пинцет, хирургические ножницы, глазные ножницы, скальпель, шпатель, карцанг), вакутейнеры, хладагенты).The method can be implemented with the appropriate equipment (centrifuge, CO 2 incubator, laminar cabinet, inverted microscope, automatic pipette, micropipette, freezer, Dewar vessel, low temperature refrigerator, household refrigerator, Goryaev’s camera, water bath, thermos, refrigerator bag), reagents (antibiotics, antimycotics, DMEM / F12 growth medium, fetal calf serum, Versen, 0.25% trypsin solution, DMSO, Hanks solution, physiological solution,
При соблюдении указанных выше условий способ реализуется следующим образом.Subject to the above conditions, the method is implemented as follows.
1. Получение плаценты1. Getting the placenta
Забор плаценты должен осуществляться сразу после родов.The placenta should be taken immediately after birth.
Плацента помещается в стерильный герметичный контейнер, который помещается на лед в сумку-холодильник (температура +2°…+8°C).The placenta is placed in a sterile airtight container, which is placed on ice in a cooler bag (temperature + 2 ° ... + 8 ° C).
Транспортировка плаценты может осуществляться до трех суток при условии соблюдения герметичности, стерильности и температурного режима.Transportation of the placenta can take up to three days, subject to tightness, sterility and temperature.
К транспортируемой плаценте прилагается следующий пакет документов: анамнез донора (матери) плаценты, результаты диагностики крови донора (матери) плаценты на вирусы (в соответствии с приказным списком).The following package of documents is attached to the transported placenta: anamnesis of the donor (mother) of the placenta, the results of the diagnosis of blood of the donor (mother) of the placenta for viruses (in accordance with the order list).
2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека и их культивирование2. Isolation of mesenchymal stem cells from human placenta and their cultivation
Все манипуляции по выделению и культивированию мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.All manipulations on the isolation and cultivation of mesenchymal stem cells from human placenta are carried out sterile in the conditions of a specially equipped culture box.
Амнион плаценты, вместе с неглубоким захватом хориона, нарезается на небольшие кусочки, достаточные для помещения в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл.The amnion of the placenta, together with a shallow capture of the chorion, is cut into small pieces, sufficient for placement in a 50 ml isopropylene tube.
Кусочки ткани энергично промываются от крови. Для этого каждый кусочек помещается в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл раствора Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика (Gibco, США) и энергично встряхивается.Pieces of tissue are washed vigorously from the blood. For this, each piece is placed in a separate 50 ml isopropylene tube filled with 40 ml of Hanks solution with the addition of an antibiotic and antimycotic (Gibco, USA) and shaken vigorously.
Промытые кусочки ткани измельчаются и инкубируются 1-2 ч при 37°C в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 10 см из расчета 1 кусочек ткани: 1 чашка Петри: 10 мл раствора фермента.The washed tissue pieces are crushed and incubated for 1-2 hours at 37 ° C in 0.1% type I collagenase solution in Petri dishes with a diameter of 10 cm at the rate of 1 tissue piece: 1 Petri dish: 10 ml of the enzyme solution.
Полученная суспензия из каждой чашки Петри переносится в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл и осаждается центрифугированием (5 мин, 300 g).The resulting suspension from each Petri dish is transferred to a separate 50 ml isopropylene tube and precipitated by centrifugation (5 min, 300 g).
Полученные осадки ресуспендируются каждый в 15 мл ростовой среды: DMEM:F12; 10% фетальная телячья сыворотка; р-р гентамицин/стрептомицин/глутамина (все - Gibco, США); 0,25 мг ципрофлоксацина.The resulting precipitates are resuspended each in 15 ml of growth medium: DMEM: F12; 10% fetal calf serum; gentamicin / streptomycin / glutamine solution (all - Gibco, USA); 0.25 mg ciprofloxacin.
Содержимое каждой пробирки переносится в отдельный культуральный флакон площадью 75 см2 и культивируется со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-уой конфлюэнтности.The contents of each tube are transferred to a separate culture vial with an area of 75 cm 2 and cultivated with a change in growth medium every 3 days until the obtained primary cell culture reaches 80% confluency.
При достижении монослоем 80%-уой конфлюэнтности, клетки переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-yjго трипсина с версеном (1:1) и рассеваются в культуральные флаконы площадью 75 см2 в соотношении 1:3.When the monolayer reaches 80% confluence, the cells are transferred into suspension using a solution of 0.25% trypsin with versene (1: 1) and scattered in culture vials with an area of 75 cm 2 in a 1: 3 ratio.
3. Подготовка и длительное хранение (криоконсервация) мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека3. Preparation and long-term storage (cryopreservation) of mesenchymal stem cells isolated from human placenta
Замораживание клеток проводят на уровне не старше V пассажа для создания запаса клеток, которые можно впоследствии восстановить, или для сохранения невостребованных клеток. Все манипуляции по криоконсервации клеточных линий, предназначенных для длительного хранения, проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.Cell freezing is carried out at a level not older than passage V to create a supply of cells that can subsequently be restored, or to preserve unclaimed cells. All manipulations on cryopreservation of cell lines intended for long-term storage are carried out sterile in the conditions of a specially equipped culture box.
Подготовка клеток к замораживаниюPreparing cells for freezing
Клетки отделяют от пластика смесью растворов версена и трипсина в отношении 1:1 и переносят в центрифужную пробирку (15-50 мл в зависимости от полученного обьема клеточной суспензии) и центрифугируют (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендируют в среде для криозаморозки (90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида (DMSO).The cells are separated from the plastic with a mixture of versene and trypsin solutions in a ratio of 1: 1 and transferred to a centrifuge tube (15-50 ml depending on the volume of cell suspension obtained) and centrifuged (5 min, 300 g). The pellet was resuspended in cryogenic freezing medium (90% fetal calf serum, 10% dimethyl sulfoxide (DMSO).
Подсчитывают количество клеток в полученной суспензии и разбавляют ее средой для криозаморозки до конечной концентрации 1 млн клеток/мл. Полученную клеточную суспензию разливают в криопробирки требуемых объемов и сразу начинают процесс замораживания.Count the number of cells in the resulting suspension and dilute it with cryogenic freezing medium to a final concentration of 1 million cells / ml. The resulting cell suspension is poured into cryovials of the required volumes and the freezing process immediately begins.
Режим криозамораживанияCryo-freezing mode
Для замораживания криопробирки с клетками переносят в контейнер для замораживания пробирок Mr. Frosty™ (Thermo Scientific, США) и помещают его в низкотемпературный холодильник (-80°C).To freeze, cryovials with cells are transferred to a container for freezing Mr. tubes Frosty ™ (Thermo Scientific, USA) and place it in a low-temperature refrigerator (-80 ° C).
Через сутки ампулы с клетками переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом (-196°C).After a day, the ampoules with the cells are transferred to a Dewar vessel with liquid nitrogen (-196 ° C).
Размораживание криоконсервированного клеточного материала.Thawing cryopreserved cellular material.
Клетки восстанавливают при температуре 37-40° на водяной бане до таяния льда. Замороженные клетки достаточно хрупкие, плохо переносят пипетирование, взбалтывание и потому требуют особенно аккуратного обращения.Cells are restored at a temperature of 37-40 ° in a water bath until the ice melts. Frozen cells are quite fragile, poorly tolerate pipetting, shaking, and therefore require especially careful handling.
Все манипуляции, связанные с размораживанием клеток, следует проводить максимально быстро и не допускать передержки клеток в размороженном криоконсерванте.All manipulations associated with thawing cells should be carried out as quickly as possible and prevent overexposure of cells in a thawed cryopreservative.
Содержимое криопробирки переносится в культуральный флакон 75 см2 с фильтром, содержащий 10 мл полной ростовой среды.The contents of the cryovial are transferred to a 75 cm 2 culture vial with a filter containing 10 ml of complete growth medium.
Клетки культивируются 24 ч в CO2-инкубаторе (37°C, 5% CO2, 80% влажности), затем старая среда, содержащая криоконсервант, удаляется и заменяется на 10 мл свежей полной ростовой среды.Cells are cultured 24 hours in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 , 80% humidity), then the old medium containing the cryopreservative is removed and replaced with 10 ml of fresh complete growth medium.
Полученные клетки культивируются со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности.The resulting cells are cultured with a change in growth medium every 3 days until the obtained primary cell culture reaches 80% confluency.
При достижении монослоем 80%-ной конфлюэнтности клетки переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-ного трипсина с версеном (1: 1) и рассеваются в культуральные флаконы площадью 75 см2 в соотношении 1:3.When the monolayer reaches 80% confluency, the cells are transferred into suspension using a solution of 0.25% trypsin with versene (1: 1) and scattered in culture vials with an area of 75 cm 2 in a 1: 3 ratio.
Исключение инфекционных агентов в мезенхимальных стволовых клетках, выделенных из плаценты чловека, выполняется в клинико-диагностической лаборатории однократно. Стандартное обследование проводится после пассирования in vitro образца клеточной линии в количестве не менее 500 тыс. клеток.The exclusion of infectious agents in mesenchymal stem cells isolated from the human placenta is performed in the clinical diagnostic laboratory once. A standard examination is carried out after passaging in vitro a sample of a cell line in an amount of at least 500 thousand cells.
Приготовление мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека, для транспортировки и медицинского примененияPreparation of mesenchymal stem cells isolated from human placenta for transportation and medical use
Отобранные образцы клеточных культур, не старше V пассажа, переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-ного трипсина с версеном (1:1). Для этого ростовая среда удаляется, а монослой дважды промывается физиологическим раствором, а затем инкубируется в растворе 0,25%-ного трипсина с версеном (1:1) при 37°C из расчета 3 мл раствора на культуральный флакон площадью 75 см2.The selected cell culture samples, not older than passage V, are transferred to the suspension using a solution of 0.25% trypsin with versene (1: 1). For this, the growth medium is removed, and the monolayer is washed twice with physiological saline, and then incubated in a solution of 0.25% trypsin with versene (1: 1) at 37 ° C at the rate of 3 ml of solution on a culture vial with an area of 75 cm 2 .
Полученная суспензия переносится в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, после чего осуществляется подсчет количества в ней клеток при помощи камеры Горяева.The resulting suspension is transferred into a 50 ml isopropylene tube, after which the number of cells in it is counted using a Goryaev chamber.
Далее суспензия промывается физиологическим раствором. Для этого клетки осаждаются центрифугированием (5 мин, 300g), а осадок ресуспендируется в физиологическом растворе. Манипуляция повторяется дважды.Next, the suspension is washed with saline. For this, cells are precipitated by centrifugation (5 min, 300 g), and the pellet is resuspended in physiological saline. Manipulation is repeated twice.
Полученный осадок клеток в количестве, предусмотренном лечебным стандартом конкретной патологии, ресуспендируется в стерильной среде транспортировки, состоящей из физиологического раствора и разрешенного к применению лекарственного средства, обеспечивающего лучшую выживаемость клеток и улучшение лечебных характеристик технологии.The obtained cell pellet in the amount prescribed by the medical standard of a particular pathology is resuspended in a sterile transport medium consisting of physiological saline and a drug approved for use, which provides better cell survival and improved healing characteristics of the technology.
Процент жизнеспособных клеток в препарате определяется с помощью окраски трипановым синим и подсчетом в камере Горяева. Для медицинского применения необходим уровень не ниже 80% жизнеспособных клеток в суспезии.The percentage of viable cells in the preparation is determined by trypan blue staining and counting in a Goryaev chamber. For medical use, a level of at least 80% of viable cells in suspension is required.
Полученная суспензия переносится стерильно в вакуумную пробирку для забора крови (вакутейнер, Gibco, США).The resulting suspension is sterilized in a vacuum tube for blood collection (Wakutainer, Gibco, USA).
Вакутейнер с готовым клеточным материалом помещается в термос со льдом и транспортируется к месту назначения. Транспортировка и хранение клеточного материала осуществляется стерильно при температурном режиме +2…+8°C. Срок годности клеточного материала для медицинского применения указан в сопровождающем его паспорте клеточного материала.A vacutainer with ready-made cellular material is placed in an ice thermos and transported to its destination. Transportation and storage of cellular material is sterile at a temperature of + 2 ... + 8 ° C. The expiration date of the cellular material for medical use is indicated in the accompanying passport of the cellular material.
Используют готовое лекарственное средство в виде раствора для инъекций или для инфузий.Use the finished drug in the form of a solution for injection or for infusion.
Жизнеспособность различных пассажей культур мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека после криоконсервации была подтверждена в процессе выполнения исследований, результаты которых отражены на фиг. 1 и фиг. 2. В результате были выбраны оптимальные номера пассажей для криозаморозки, с наибольшей жизнеспособностью после размораживания, а следовательно, и с наилучшими лечебными свойствами в случае их дальнейшего клинического применения.The viability of the various passages of mesenchymal stem cell cultures from human placenta after cryopreservation was confirmed in the course of studies, the results of which are shown in FIG. 1 and FIG. 2. As a result, the optimal passage numbers for cryogenic freezing were selected, with the highest viability after thawing, and, consequently, with the best therapeutic properties in case of their further clinical use.
Для исследований использовалась стандартная криоконсервационная среда: FBS («Gibco», США) с 10% ДМСО («ПанЭко», РФ). МСК из плаценты человека получали по описанной выше методике и пассировали в 75 см2 пластиковых флаконах («Greiner», США). После выделения (0 пассаж) и после каждого пассажа (с I-го по VI-й) по 1 млн жизнеспособных клеток в 1 мл криоконсервационной среды помещали в 1.8 мл криопробирки («Greiner», США), замораживали в замораживателе MrFroster («Greiner», США) и хранили в сосудах Дьюара с жидким азотом (-196°C) в течение 60 сут. Затем образцы размораживали на водяной бане (37°C) и рассевали в 75 см2 пластиковых флаконах («Greiner», США). Через 12 ч клетки снимали с пластика смесью трипсина и версена и проводили пятикратный подсчет жизнеспособности клеток в камере Горяева с трипановым синим.For research, a standard cryopreservation medium was used: FBS (Gibco, USA) with 10% DMSO (PanEco, RF). MSCs from human placenta were obtained according to the method described above and passaged in 75 cm 2 plastic bottles (Greiner, USA). After isolation (passage 0) and after each passage (from I to VI), 1 million viable cells in 1 ml of cryopreservation medium were placed in 1.8 ml of cryovials (Greiner, USA), frozen in MrFroster freezer (Greiner ”, USA) and stored in Dewar vessels with liquid nitrogen (-196 ° C) for 60 days. Then the samples were thawed in a water bath (37 ° C) and dispersed in 75 cm 2 plastic bottles (Greiner, USA). After 12 hours, the cells were removed from the plastic with a mixture of trypsin and versene and five-fold counting of cell viability was performed in the Goryaev chamber with trypan blue.
Выбор срока хранения образцов клеточных культур в условиях криоконсервации (60 сут) связан с тем, что при клиническом использовании клеточного материала стандартная процедура повторяется с интервалом, как правило, в 2 мес, т.е. именно через этот срок приходится размораживать клетки для их повторного приготовления. Поэтому проверка жизнеспособности клеток через 60 суток криоконсервации имела не только теоретическое, но и очевидное практическое значение.The choice of the shelf life of samples of cell cultures under cryopreservation (60 days) is due to the fact that in the clinical use of cell material, the standard procedure is repeated with an interval of, as a rule, 2 months, i.e. it is after this period that cells have to be thawed for re-preparation. Therefore, verification of cell viability after 60 days of cryopreservation was not only theoretical, but also of obvious practical importance.
Непосредственно после выделения (0 пассаж) клетки обычно не закладывают на долговременное хранение, поскольку, во-первых, вследствие их немногочисленности, во-вторых, в силу недостаточной гомогенности клеточной культуры. Поздние пассажи, старше IV, также стараются не консервировать. Однако в данной работе была поставлена цель установить основной тренд зависимости жизнеспособности от номера пассажа, поэтому и нулевой пассаж, и V-VI пассажи были включены в эксперимент по криоконсервации.Immediately after isolation (passage 0), cells are usually not stored for long-term storage, because, firstly, due to their scarcity, and secondly, due to insufficient homogeneity of the cell culture. Later passages, older than IV, also try not to preserve. However, in this work, the goal was to establish the main trend of the dependence of viability on the passage number, therefore, both the zero passage and the V-VI passages were included in the cryopreservation experiment.
Результаты исследований представлены на фиг. 1.The research results are presented in FIG. one.
Зависимость жизнеспособности после размораживания от номера пассажа для МСК из плаценты человека имеет постепенно (с учетом статистических погрешностей - монотонно) убывающий характер. Падение жизнеспособности после размораживания в зависимости от пассажа довольно четко выражено для исследованной клеточной культуры: примерно с 94% до 79%. При этом снижение жизнеспособности достоверно для всех пар пассажей, за исключением разницы между IV и V пассажами (фиг. 2). Была проведена оценка зависимости жизнеспособности различных пассажей МСК из плаценты человека по сравнению с фибробластами кожи и МСК костного мозга человека после криоконсервации в течение 60 суток в жидком азоте (196°C) (фиг. 1), где показано, что жизнеспособность у МСК плаценты человека после криоконсервации немного ниже, чем у фибробластов кожи человека, но значительно выше, чем у МСК, выделенных из костного мозга человека.The dependence of viability after thawing on the passage number for MSCs from the human placenta is gradually (taking into account statistical errors - monotonously) decreasing in nature. The decrease in viability after thawing, depending on the passage, is quite pronounced for the studied cell culture: from about 94% to 79%. Moreover, the decrease in viability is significant for all pairs of passages, with the exception of the difference between the IV and V passages (Fig. 2). The dependence of the viability of various passages of MSCs from human placenta was compared with fibroblasts of the skin and MSCs of human bone marrow after cryopreservation for 60 days in liquid nitrogen (196 ° C) (Fig. 1), where it was shown that the viability of MSCs in human placenta after cryopreservation, it is slightly lower than that of human skin fibroblasts, but significantly higher than that of MSCs isolated from human bone marrow.
Таким образом, в проведенные исследования подтверждают, что предложенный способ получения клеточного материала позволяет обеспечить большой срок его хранения без существенной потери лечебных свойств, что обеспечивает возможность оперативного использования клеточного материала. При этом результаты исследований позволяют учитывать номер пассажа клеточной культуры при ее размораживании для подготовки клеточного материала в случае его клинического применения.Thus, in the conducted studies confirm that the proposed method for producing cellular material allows for a long shelf life without significant loss of therapeutic properties, which allows the rapid use of cellular material. Moreover, the research results allow to take into account the passage number of the cell culture when it is thawed to prepare the cell material in case of its clinical use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015142374/10A RU2599418C1 (en) | 2015-10-06 | 2015-10-06 | Method for preparing cell material from human placenta |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015142374/10A RU2599418C1 (en) | 2015-10-06 | 2015-10-06 | Method for preparing cell material from human placenta |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2599418C1 true RU2599418C1 (en) | 2016-10-10 |
Family
ID=57127637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015142374/10A RU2599418C1 (en) | 2015-10-06 | 2015-10-06 | Method for preparing cell material from human placenta |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2599418C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2748057C2 (en) * | 2016-01-14 | 2021-05-19 | Депуи Синтез Продактс, Инк. | Composition and methods of cryopreservation of hutc cells |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2252252C1 (en) * | 2004-04-09 | 2005-05-20 | Тепляшин Александр Сергеевич | Method for isolation of mesenchymal stem cells |
| UA14548U (en) * | 2005-12-02 | 2006-05-15 | Inst Of Cell Therapy Ltd Liabi | Method for obtaining preparation from smooth chorion |
| RU2455357C1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские технологии" | Cell product for auto- and allografting prepared of human umbilical cord, and method for preparing thereof |
-
2015
- 2015-10-06 RU RU2015142374/10A patent/RU2599418C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2252252C1 (en) * | 2004-04-09 | 2005-05-20 | Тепляшин Александр Сергеевич | Method for isolation of mesenchymal stem cells |
| UA14548U (en) * | 2005-12-02 | 2006-05-15 | Inst Of Cell Therapy Ltd Liabi | Method for obtaining preparation from smooth chorion |
| RU2455357C1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские технологии" | Cell product for auto- and allografting prepared of human umbilical cord, and method for preparing thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| PENG HUANG ET AL. Differentiation of human umbilical cord Wharton`s jelly-derived mesenchymal stem cells into germ-like cells in vitro.// Journal of Cellular Biochemistry, V.109, 2010, p.748. * |
| БУРУНОВА В.В., Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ. Диссертация, Москва, 2011, с.64-66, 85 * |
| БУРУНОВА В.В., Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ. Диссертация, Москва, 2011, с.64-66, 85, 144-150. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2748057C2 (en) * | 2016-01-14 | 2021-05-19 | Депуи Синтез Продактс, Инк. | Composition and methods of cryopreservation of hutc cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100779812B1 (en) | Preservation of non-embryonic cells from non-hematopoietic tissue | |
| Liebenthron et al. | Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option | |
| CN101974484B (en) | Method for preparing human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| ES2522890T3 (en) | Method to collect placental stem cells | |
| Cho et al. | A new possibility in fertility preservation: The artificial ovary | |
| US20180000870A1 (en) | Methods of forming amniotic fluid-derived preparations | |
| Filatov et al. | Female fertility preservation strategies: cryopreservation and ovarian tissue in vitro culture, current state of the art and future perspectives | |
| Hsieh et al. | Cryopreservation of human spermatozoa within human or mouse empty zona pellucidae | |
| Huang et al. | Novel micro-straw for freezing small quantities of human spermatozoa | |
| Taguchi et al. | The efficacy of autologous cord-blood transfusions in neonatal surgical patients | |
| RU2599418C1 (en) | Method for preparing cell material from human placenta | |
| Dhot et al. | Cord blood stem cell banking and transplantation | |
| RU2519637C1 (en) | Method for fertility recovery in patients with oncological diseases | |
| RU2631642C1 (en) | Method for treating nonscarring alopecia | |
| RU2648162C2 (en) | Method for producing growth additive based on thrombocyte lysate from platelet of donors to medium for build-up of cellular weight of stem, progenitor, differentiated and tumor cells | |
| Sivakumaran et al. | Umbilical cord blood banking and its therapeutic uses | |
| JP6412696B2 (en) | Serum preparation method and instrument | |
| WO2016109828A1 (en) | Injectable amniotic membrane tissue graft | |
| JP2023109846A (en) | Cell preservation method | |
| US20160287749A1 (en) | Reconstituted amniotic membrane-amniotic fluid combination tissue graft | |
| RU2303631C1 (en) | Method for production of mesenchymal stem cells and biotransplant using the same | |
| Armato | Primary tissue culture of normal adult human and rat adrenocortical cells from zonae fasciculata and reticularis | |
| Pelé et al. | Guinea pig lung cells: Method of isolation and partial purification, identification, ultrastructure, and cell count | |
| RU2695364C1 (en) | Method of treating non-scarring alopecia | |
| Haidar | Platelet-rich plasma therapy in the management and treatment of male infertility—an update of state-of-art |