RU2597661C1 - Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента - Google Patents
Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента Download PDFInfo
- Publication number
- RU2597661C1 RU2597661C1 RU2015127132/28A RU2015127132A RU2597661C1 RU 2597661 C1 RU2597661 C1 RU 2597661C1 RU 2015127132/28 A RU2015127132/28 A RU 2015127132/28A RU 2015127132 A RU2015127132 A RU 2015127132A RU 2597661 C1 RU2597661 C1 RU 2597661C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- content
- polyphenolic compounds
- sample
- chromatogram
- chromatographic
- Prior art date
Links
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000010828 elution Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 title claims abstract description 7
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 239000001648 tannin Substances 0.000 claims abstract description 30
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004590 computer program Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims abstract description 9
- UMEAURNTRYCPNR-UHFFFAOYSA-N azane;iron(2+) Chemical compound N.[Fe+2] UMEAURNTRYCPNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 19
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005220 pharmaceutical analysis Methods 0.000 abstract description 3
- -1 polyphenol compounds Chemical class 0.000 abstract 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 3
- 240000009023 Myrrhis odorata Species 0.000 description 3
- 235000007265 Myrrhis odorata Nutrition 0.000 description 3
- 235000012550 Pimpinella anisum Nutrition 0.000 description 3
- 240000009089 Quercus robur Species 0.000 description 3
- 241000219100 Rhamnaceae Species 0.000 description 3
- 244000274883 Urtica dioica Species 0.000 description 3
- 235000009108 Urtica dioica Nutrition 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Natural products CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- YTAQZPGBTPDBPW-UHFFFAOYSA-N flavonoid group Chemical group O1C(C(C(=O)C2=CC=CC=C12)=O)C1=CC=CC=C1 YTAQZPGBTPDBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012484 Agastache anethiodora Nutrition 0.000 description 1
- 244000180303 Agastache foeniculum Species 0.000 description 1
- 235000010685 Agastache foeniculum Nutrition 0.000 description 1
- 241001489705 Aquarius Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 240000000950 Hippophae rhamnoides Species 0.000 description 1
- 235000003145 Hippophae rhamnoides Nutrition 0.000 description 1
- 241000207923 Lamiaceae Species 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 239000008361 herbal raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001292 planar chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья, фитопрепаратов и биологически активных добавок по содержанию танина, галловой кислоты и кверцетина, и может быть использовано в фармацевтическом анализе, в химико-фармацевтической промышленности. Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента характеризуется тем, что навеску исследуемого препарата обрабатывают водой при кипячении на водяной бане с последующим ступенчатым хроматографированием в двух системах растворителей, обработкой 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов и высушиванием при температуре 80°С в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон; после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера, а полученные изображения обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», зоны полифенольных соединений идентифицируются по характерному значению величины Rf и рассчитывают количественное содержание полифенольных соединений в пробе. Техническим результатом является повышение точности, возможность проведения одновременного разделения, идентификации и количественного определения полифенольных соединений в лекарственных препаратах, растительном сырье, фитопрепаратах и биологически активных добавках к пище, а также возможность разделения сложных смесей и отделения полифенольных соединений от других биологически активных веществ. 5 ил., 3 табл.
Description
Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в фармацевтическом анализе, в химико-фармацевтической промышленности.
В настоящее время тонкослойная хроматография (ТСХ) в фармацевтическом анализе применяется для идентификации полифенольных соединений в субстанциях, лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах. ТСХ, обладая всеми преимуществами хроматографических методов, находит широкое применение ввиду своей экспрессности, доступности, достаточной чувствительности, селективности и простоте выполнения анализа. Тем более, что разработанные в последнее десятилетие новые неподвижные фазы, оборудование для нанесения проб, новые методы элюирования пластинок и количественного определения с использованием сканирующих денситометров способны обеспечить более высокое разрешение, лучшее детектирование и воспроизводимость результатов качественного и количественного хроматографического анализа различных групп биологически активных веществ, в т.ч. и полифенольных соединений (Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. М.: Мир, 1999, 405 с.). Многие из описанных способов позволяют определять только суммарное содержание дубильных веществ, без достоверной информации о присутствии отдельных компонентов.
Известен способ идентификации и количественного определения танина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в лекарственном растительном сырье и лекарственных препаратах кровохлебки лекарственной (И.В. Попов, И.Н. Андреева, М.В. Гаврилин. Определение танина в сырье и препаратах кровохлебки лекарственной методом ВЭЖХ. - Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - №7. - Т. 37. - С. 24-26), заключающийся в том, что точную навеску измельченных корневищ и корней кровохлебки помешают в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40% этилового спирта, взвешивают с погрешностью ±0,01 г; присоединяют к обратному холодильнику и кипятят в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают, доводят до первоначальной массы 40% этиловым спиртом и фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтра (раствор А). 2 мкл раствора А вводят в хроматограф «Милихром-5» с УФ-детектором при длине волны 280 им на колонке из нержавеющей стали длиной 80 мм с внутренним диаметром 2,0 мм, заполненной адсорбентом «Диасорб-С16», или аналогичной с диаметром частиц 5 мкм. Анализ проводят методом изократического элюирования при комнатной температуре в системе растворителей ацетонитрил-вода-ледяная уксусная кислота (4:6:0,1). Недостатком данного способа является использование дорогостоящего оборудования, материалов и реактивов.
Описан способ идентификации и количественного денситометрического определения галловой кислоты методом ТСХ в траве лофанта анисового (В.В. Чумакова, Т.Д. Мезенова, О.И. Попова. Определение галловой кислоты в траве лофанта анисового методом планарной хроматографии. - Химия растительного сырья. - 2011. - №4. - С. 269-271), включающий получение извлечения с использованием 70% этилового спирта с последующим хроматографированием на пластинках марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1) при подъеме фронта растворителя на 12 см; высушивание пластин на воздухе до исчезновения запаха растворителя, обработку 1% водным раствором железоаммониевых квасцов, сканирование пластинки с помощью планшетного сканера с разрешением 100 dpi; обработку хроматограмм компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Недостатком данного способа - аналога является невозможность одновременного определения танина, галловой кислоты и кверцетина в растительных объектах и многокомпонентных лекарственных формах без предварительного разделения на отдельные компоненты.
1. Известны способы разделения и идентификации дубильных веществ методом ТСХ в извлечениях из растительного сырья, основанные на получении извлечения с использованием воды (А.А. Мальцева, А.С. Чистякова, А.А. Сорокина и др. Количественное определение дубильных веществ в траве горца почечуйного. - Вестник ВГУ. Сер.: Химия. Биология. Фармация. - 2013. - №2. - С. 203-205) или 60% этилового спирта (Е.Н. Гринько. Требования Российской и Европейской фармакопей к методикам определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье. - Фармация. - 2010. - №5. - С. 49-53) с последующим хроматографированием в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2 или муравьиная кислота безводная - этилацетат - толуол (10:30:60) (Гринько Е.Н. Исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества / Автореф. дисс. канд. фарм. н. - Москва, 2011. - 25 с); высушивание пластин на воздухе до исчезновения запаха растворителя, обработку 1% спиртовым раствором железоаммониевых квасцов и идентификацию зон дубильных веществ (галловая кислота и танин) и кверцетина по величинам Rf в сравнении с достоверными стандартными образцами. Данные способы - прототипы не лишены недостатков, так как не позволяют проводить количественное определение полифенольных соединений в исследуемых объектах.
В научной фармацевтической, медицинской и патентной литературе способов, позволяющих идентифицировать и количественно определить одновременно не только высокомолекулярные (танин) и низкомолекулярные (галловая кислота) дубильных веществ, но и представителя флавоноидной группы полифенольных соединений - кверцетина методом ТСХ с применением ступенчатого элюирования, не обнаружено.
Задача изобретения: заключается в разработке способа разделения и количественного определения полифенольных соединений (на примере танина, галловой кислоты и кверцетина) методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента, разделения сложных смесей и отделения полифенольных соединений от других биологически активных веществ (в том числе дубильной и флавоноидной групп) и стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, биологически активных добавок по содержанию полифенольных соединений методом ТСХ. В задачи изобретения также входило обоснование необходимости ступенчатого хроматографирования при определении данных полифенольных соединений методом ТСХ.
Технический результат - повышение точности, а также возможность одновременного определения подлинности и количественного определения полифенольных соединений (танина, галловой кислоты и кверцетина), разделения сложных смесей и отделения полифенольных соединений от других биологически активных веществ достигается тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» с алюминиевой подложкой ПТСХ-П-А. Элюент 1 (высота пробега 9 см) - диэтиловый эфир-уксусная кислота-гексан-этилацетат (20:20:20:40). Элюент 2 (высота пробега 7 см) - этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (67:7,5:7,5:18). Хроматограмму равномерно обрабатывают 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°C в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. Оптимальный объем пробы - 0,5 мкл спиртового раствора с содержанием галловой кислоты 5 мг/мл; 0,5 мкл спиртового раствора с содержанием танина 10 мг/мл и 1-2 мкл спиртового раствора с содержанием кверцетина 1 мг/мл, причем время насыщения камер парами элюентов - 40 мин, время элюирования - 35-40 мин в системе 1 и 20-30 мин в системе 2; время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t=80±2°C - 3-5 минут. Сразу же после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». В результате получают треки в координатах Rf - интенсивность (фиг. 2), а содержание галловой кислоты (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазонах концентраций 0,3-1,5 и 1,5-4,0 мкг/мкл рассчитывают по формулам соответственно:
Содержание танина (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазонах концентраций 0,5-4,5 и 5,0-7,0 мкг/мкл рассчитывают по формулам соответственно:
Содержание кверцетина (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 1,0-6,0 мкг/мкл рассчитывают по формуле:
где S - значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videodensitometer». Изобретение проиллюстрировано графиками, чертежами, схемами, таблицами, где в таблице 1 представлены хроматографические параметры полифенольных соединений в различных элюирующих системах. Пределы обнаружения пятен исследуемых биологически активных веществ с помощью выбранного реагента приведены в таблице 2. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов полифенольных соединений в диапазоне концентраций от 1,0 до 4,0 мкг/мкл (1-1 мкг; 2-1,5 мкг; 3-2 мкг; 4-2,5 мкг; 5-3 мкг; 6-3,5 мкг; 7-4 мкг) дана на фиг. 1. Фиг. 2 демонстрирует вид денситограммы смеси стандартных растворов исследуемых полифенольных соединений. Влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность полифенольных соединений в тонком слое изображено на фиг. 3. Градуировочные графики для определения содержания танина в области концентраций (0,5-4,5 и 5,0-7,0 мкг/мкл) представлены на фиг. 4а. Градуировочный график для определения содержания кверцетина в области концентраций (1,0-6,0 мкг/мкл) изображен на фиг. 4б. Градуировочные графики для определения содержания галловой кислоты в области концентраций (0,3-1,5 и 1,5-4,0 мкг/мкл) приведены на фиг. 4в. Фиг. 5 демонстрирует вид хроматограммы водных извлечений из сырья (а - 20 мкл отвара плодов облепихи крушиновидной высушенных; б - 10 мкл настоя листьев крапивы двудомной; в - 10 мкл отвара коры дуба обыкновенного). В таблице 3 приведены результаты идентификации и количественного определения полифенольных соединений в лекарственном растительном сырье (в пересчете на абсолютно сухое сырье).
Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента реализуется следующим образом.
Навеску исследуемого препарата растворяют в воде или навеску измельченного лекарственного растительного сырья экстрагируют водой при кипячении на водяной бане с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» с алюминиевой подложкой ПТСХ-П-А в системе растворителей 1 (высота пробега 9 см) - диэтиловый эфир-уксусная кислота-гексан-этилацетат (20:20:20:40) с последующим высушиванием на воздухе в течение 5-7 мин, а затем повторно хроматографируют в системе растворителей 2 (высота пробега 7 см) - этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (67:7,5:7,5:18); хроматограмму равномерно обрабатывают 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°C в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. Оптимальный объем пробы - 0,5 мкл спиртового раствора с содержанием галловой кислоты 5 мг/мл; 0,5 мкл спиртового раствора с содержанием танина 10 мг/мл и 1-2 мкл спиртового раствора с содержанием кверцетина 1 мг/мл, причем время насыщения камер парами элюентов - 40 мин, время элюирования - 35-40 мин в системе 1 и 20-30 мин в системе 2.
В способе проведено обоснование применения ступенчатого элюирования для разделения и определения полифенольных соединений в тонком слое сорбента. Для выбора оптимальных условий хроматографического определения полифенольных веществ было изучено влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность в тонком слое (фиг. 3). В эксперименте изучено более двадцати типов элюирующих систем с различными значениями полярности, предлагаемые в литературе, а также вновь апробированные элюенты (табл. 1). Для каждой элюирующей системы рассчитаны полярность (Р′) и величина (
). Для достижения оптимальных величин Rf, а также четкого разделения исследуемых веществ на хроматограммах необходимо использовать элюенты со значениями полярности в интервале 4,0-6,0 ед. Однако данные фиг. 3 также показывают, что за одно хроматографирование возможно отделить галловую кислоту, тогда как танин и кверцетин в данном диапазоне полярностей имеют сходные значения величин относительной подвижности в тонком слое. В то же время при достижении величины полярности элюента 8,0-9,5 ед. наблюдается удовлетворительное разделение зон танина и кверцетина на хроматограммах. Следовательно, для количественной обработки хроматограмм методом компьютерного сканирования необходимо использовать ступенчатое элюирование, где первый элюент - система №10 (Р=3,54 ед.) с высотой пробега 8-9 см, а второй элюент - система №9 (Р=9,68 ед.) с высотой пробега 7 см (табл. 1).
Сразу же после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». В результате получают треки в координатах Rf - интенсивность (фиг. 2).
Установлены линейные зависимости между содержанием изучаемых полифенольных соединений и площадью хроматографической зоны (фиг. 4а, б и в) в диапазоне изучаемых концентраций. Полученные результаты свидетельствуют о том, что для танина и галловой кислоты наблюдаются нелинейные зависимости площади хроматографической зоны от концентрации стандартного раствора с точками перегиба при 4,5 и 1,5 мкг/мкл соответственно (фиг. 4а и в). Наличие точки перегиба объясняется снижением коэффициента инструментальной чувствительности определения («а» в уравнении у=ах+b) с увеличением концентрации раствора. Анализ полученных данных позволил установить линейные зависимости между содержанием танина и галловой кислоты и интенсивностью окраски хроматографической зоны в диапазонах изучаемых концентраций (0,5-4,5 и 5,0-7,0 мкг/мкл) и (0,3-1,5 и 1,5-4,0 мкг/мкл) соответственно.
Ошибка в определении содержания танина будет уменьшаться с увеличением «а» в уравнении у=ах+в, следовательно, применение градуировочного графика для определения содержания танина, где а=6,0083 (фиг. 4а) приводит к более точным результатам по сравнению с результатами, полученными по графику в диапазоне концентраций 0,5-4,5 мкг/мкл, где а=4,4805.
Ошибка в определении содержания галловой кислоты будет меньше с применением градуировочного графика в области концентраций 0,3-1,5 мкг/мкл, где а=16,601 (фиг. 4в) по сравнению с результатами, полученными по графику в диапазоне концентраций 1,5-4,0 мкг/мкл, где а=4,8778. Наличие в регрессионных уравнениях коэффициентов b, отличных от нуля, говорит о постоянной систематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фона пластины на оценку яркости окрашенной хроматографической зоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».
Способ отличается возможностью проведения идентификации, разделения и количественной интерпретации данных ТСХ галловой кислоты, танина и кверцетина на персональном компьютере методом ступенчатого хроматографирования в тонком слое сорбента и стандартизировать лекарственные препараты, лекарственное растительное сырье, фитопрепараты и биологически активные добавки по содержанию полифенольных соединений; отличается также достаточной чувствительностью (3-10·10-7 г), экономичностью, доступностью и экспрессностью.
Способ иллюстрируется следующими конкретными примерами.
Пример 1. Разработанный способ идентификации и количественного определения полифенольных соединений был апробирован на лекарственном растительном сырье листьев крапивы двудомной.
Получение извлечения: Около 2,5 г (точная навеска) измельченного сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл воды очищенной (с учетом коэффициента водопоглощения сырья). Колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым настаивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Извлечение фильтруют через несколько слоев марли, отжимая частицы сырья в мерную колбу вместимостью 25 мл. При необходимости доводят объем до метки водой очищенной. Полученную суммарную вытяжку в количестве 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа на пластинах размером 5×10 см. Элюент 1 (высота пробега 9 см) - диэтиловый эфир-уксусная кислота-гексан-этилацетат (20:20:20:40). Отмечали линию фронта, пластинку высушивали на воздухе 5-7 мин и помещали в элюент 2 (высота пробега 7 см) - этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (67:7,5:7,5:18). Хроматограмму равномерно обрабатывают 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°C в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны полифенольных соединений характерной окраски, среди которых идентифицирована кислота галловая, кверцетин и танин по характерному значению величин Rf в сравнении с достоверными стандартными образцами. Сразу же после проявления хроматограмм пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения полифенольных соединений в извлечении из листьев крапивы двудомной, а также метрологическая характеристика представлены в табл. 3.
Пример 2. Разработанный способ идентификации и количественного определения полифенольных соединений был апробирован на лекарственном растительном сырье плодов облепихи крушиновидной.
Получение извлечения: Около 5,0 г (точная навеска) высушенного измельченного сырья помешают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной. Колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым настаивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Извлечение фильтруют через несколько слоев марли, отжимая частицы сырья, в мерную колбу вместимостью 50 мл. При необходимости доводят объем до метки водой очищенной. Полученную суммарную вытяжку в количестве 20 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа на пластинах размером 5×10 см. Элюент 1 (высота пробега 9 см) - диэтиловый эфир-уксусная кислота-гексан-этилацетат (20:20:20:40). Отмечали линию фронта, пластинку высушивали на воздухе 5-7 мин и помещали в элюент 2 (высота пробега 7 см) - этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (67:7,5:7,5:18). Хроматограмму равномерно обрабатывают 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°C в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны полифенольных соединений характерной окраски, среди которых идентифицирована кислота галловая по характерному значению величины Rf в сравнении с достоверным стандартным образцом. Сразу же после проявления хроматограмм пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения полифенольных соединений в извлечении из плодов облепихи крушиновидной, а также метрологическая характеристика представлены в табл. 3.
Пример 3. Разработанный способ идентификации и количественного определения полифенольных соединений был апробирован на лекарственном растительном сырье коры дуба обыкновенного.
Получение извлечения: Около 5,0 г (точная навеска) высушенного измельченного сырья помешают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 70 мл воды очищенной (с учетом коэффициента водопоглощения сырья). Колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым настаивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Извлечение фильтруют через несколько слоев марли, отжимая частицы сырья, в мерную колбу вместимостью 50 мл. При необходимости доводят объем до метки водой очищенной. Полученную суммарную вытяжку в количестве 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа на пластинах размером 5×10 см. Элюент 1 (высота пробега 9 см) - диэтиловый эфир-уксусная кислота-гексан-этилацетат (20:20:20:40). Отмечали линию фронта, пластинку высушивали на воздухе 5-7 мин и помещали в элюент 2 (высота пробега 7 см) - этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (67:7,5:7,5:18). Хроматограмму равномерно обрабатывают 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°C в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон. На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны полифенольных соединений характерной окраски, среди которых идентифицированы кислота галловая и танин по характерному значению величин Rf в сравнении с достоверными стандартными образцами. Сразу же после проявления хроматограмм пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения полифенольных соединений в извлечении из коры дуба обыкновенного, а также метрологическая характеристика представлены в табл. 3.
Источники информации
1. Чумакова В.В. Фармакогностическое изучение лофанта анисового (Agastache Foeniculum (Pursh.) О. Kuntze) сем. яснотковые (Lamiaceae) / Автореф. дисс. канд. фарм. н. - Пятигорск, 2013. - 24 с.
2. О.Б. Рудаков, И.А. Востров, С.В. Федоров и др. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. Воронеж: «Водолей», 2004, 528 с.
Claims (1)
- Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента характеризуется тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде или навеску измельченного лекарственного растительного сырья экстрагируют водой при кипячении на водяной бане с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» с алюминиевой подложкой ПТСХ-П-А в системе растворителей 1 (высота пробега 9 см) - диэтиловый эфир - уксусная кислота - гексан - этилацетат (20:20:20:40) с последующим высушиванием на воздухе в течение 5-7 мин, а затем повторно хроматографируют в системе растворителей 2 (высота пробега 7 см) - этилацетат - муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (67:7,5:7,5:18); хроматограмму равномерно обрабатывают 1% спиртовым раствором железо-аммонийных квасцов из пульверизатора и высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°C в течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон; оптимальный объем пробы - 0,5 мкл спиртового раствора с содержанием галловой кислоты 5 мг/мл; 0,5 мкл спиртового раствора с содержанием танина 10 мг/мл и 1-2 мкл спиртового раствора с содержанием кверцетина 1 мг/мл, причем время насыщения камер парами элюентов - 40 мин, время элюирования - 35-40 мин в системе 1 и 20-30 мин в системе 2; после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера, а полученные изображения обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», зоны полифенольных соединений идентифицируются по характерному значению величины Rf в сравнении с достоверными стандартными образцами, а количественное содержание галловой кислоты (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазонах концентраций 0,3-1,5 и 1,5-4,0 мкг/мкл рассчитывают по формулам соответственно:
содержание танина (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазонах концентраций 0,5-4,5 и 5,0-7,0 мкг/мкл рассчитывают по формулам соответственно:
содержание кверцетина (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, в диапазоне концентраций 1,0-6,0 мкг/мкл рассчитывают по формуле:
где S - значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videodensitometer».
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015127132/28A RU2597661C1 (ru) | 2015-07-06 | 2015-07-06 | Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015127132/28A RU2597661C1 (ru) | 2015-07-06 | 2015-07-06 | Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2597661C1 true RU2597661C1 (ru) | 2016-09-20 |
Family
ID=56937871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015127132/28A RU2597661C1 (ru) | 2015-07-06 | 2015-07-06 | Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2597661C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114280201A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-05 | 山东省千佛山医院 | 一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法 |
| CN119000965A (zh) * | 2024-10-24 | 2024-11-22 | 浙江景岳堂药业有限公司 | 一种荷包草配方颗粒的质量检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102507834A (zh) * | 2011-09-27 | 2012-06-20 | 山东阿如拉药物研究开发有限公司 | 一种八味沉香制剂的质量控制方法 |
| CN102353745B (zh) * | 2011-08-26 | 2014-08-20 | 贵州师范大学 | 一种刺梨的炮制方法及多指标检测方法 |
-
2015
- 2015-07-06 RU RU2015127132/28A patent/RU2597661C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102353745B (zh) * | 2011-08-26 | 2014-08-20 | 贵州师范大学 | 一种刺梨的炮制方法及多指标检测方法 |
| CN102507834A (zh) * | 2011-09-27 | 2012-06-20 | 山东阿如拉药物研究开发有限公司 | 一种八味沉香制剂的质量控制方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| В.В. Чумакова и др., Определение галловой кислоты в траве лофанта анисового методом планарной хроматографии, Химия растительного сырья, N4, стр. 269-271, 2011 * |
| В.В. Чумакова и др., Определение галловой кислоты в траве лофанта анисового методом планарной хроматографии, Химия растительного сырья, N4, стр. 269-271, 2011. * |
| П. Т. Суханов и др., Экстракция танина, галловой кислоты и пирогаллола из водных сред водорастворимыми полимерами и их определение в концентратах методом тонкослойной хроматографии, Аналитика и контроль, Т. 19. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114280201A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-05 | 山东省千佛山医院 | 一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法 |
| CN119000965A (zh) * | 2024-10-24 | 2024-11-22 | 浙江景岳堂药业有限公司 | 一种荷包草配方颗粒的质量检测方法 |
| CN119000965B (zh) * | 2024-10-24 | 2025-02-28 | 浙江景岳堂药业有限公司 | 一种荷包草配方颗粒的质量检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Agatonovic-Kustrin et al. | High-performance thin-layer chromatography linked with (bio) assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants | |
| CN113533614B (zh) | 小承气汤物质基准的建立方法 | |
| CN109596751A (zh) | 一种清热养阴活血祛瘀的脉络宁口服液成分检测方法 | |
| Misra et al. | Study of extraction and HPTLC-UV method for estimation of caffeine in marketed tea (Camellia sinensis) granules | |
| Ravishankara et al. | HPTLC method for the estimation of alkaloids of Cinchona officinalis stem bark and its marketed formulations | |
| CN113156010B (zh) | 一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法 | |
| CN106370738B (zh) | 一种美洲大蠊药材的指纹图谱质量测定方法 | |
| CN102707007A (zh) | 一种五味甘露药浴制剂的质量检测方法 | |
| RU2597661C1 (ru) | Способ определения полифенольных соединений методом ступенчатого элюирования в тонком слое сорбента | |
| CN104502485B (zh) | 由穿山龙和刺五加为药材的中药复方制剂中6个化学成分的定量分析方法 | |
| CN110441445A (zh) | 一种鸡冠花hplc特征指纹图谱的构建方法及黄酮类成分含量测定 | |
| CN108426963A (zh) | 一种醋香附hplc指纹图谱的构建方法 | |
| CN108414666B (zh) | 一种姜药材挥发油提取物中姜辣素含量的测定方法 | |
| Preet et al. | HPTLC analysis of Solanum xanthocarpum Schrad. And Wendl., a siddha medicinal herb | |
| CN102707006B (zh) | 穿破石配方颗粒的质量检测方法 | |
| CN102590431A (zh) | 一种治疗咳嗽的中药药物组合物质量标准检测方法 | |
| CN105616946A (zh) | 一种治疗咳嗽的制剂及其制备和质量控制方法 | |
| Acar et al. | Development and validation of a high-performance liquid chromatography–diode-array detection method for the determination of eight phenolic constituents in extracts of different wine species | |
| Ding et al. | Quality control of medicinal herbs Fructus gardeniae, Common Andrographis Herb and their preparations for their active constituents by high-performance liquid chromatography–photodiode array detection–electrospray mass spectrometry | |
| CN104569186B (zh) | 多酚物质的hplc分离检测、大花红景天质量检测方法 | |
| CN105301138B (zh) | 一种藏茵陈的检测方法及其hplc指纹图谱 | |
| CN101482543B (zh) | 一种谷维素的高效液相色谱分析方法 | |
| RU2530620C1 (ru) | Способ определения жирорастворимых витаминов а, d2, е и в-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии | |
| RU2839147C1 (ru) | Способ определения флавоноидов в траве горца перечного и траве горца птичьего | |
| Mutiah et al. | The development and validation of hplc and hptlc-densitometry methods for the determination of 1, 4-naphthoquinone content in eleutherine bulbosa extract |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180707 |