RU2587633C2 - Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды - Google Patents
Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды Download PDFInfo
- Publication number
- RU2587633C2 RU2587633C2 RU2013156635/10A RU2013156635A RU2587633C2 RU 2587633 C2 RU2587633 C2 RU 2587633C2 RU 2013156635/10 A RU2013156635/10 A RU 2013156635/10A RU 2013156635 A RU2013156635 A RU 2013156635A RU 2587633 C2 RU2587633 C2 RU 2587633C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligodeoxynucleotide
- virus
- antigenic component
- cpg
- oligodeoxynucleotides
- Prior art date
Links
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 title claims abstract description 83
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 39
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 11
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 8
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 claims description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 2
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 claims description 2
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 claims description 2
- 241000202942 Mycoplasma synoviae Species 0.000 claims description 2
- 241001135620 Ornithobacterium rhinotracheale Species 0.000 claims description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 claims description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 2
- 241001223089 Tremovirus A Species 0.000 claims description 2
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 claims description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 claims description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000606767 Avibacterium paragallinarum Species 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 8
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 2
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 23
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 9
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 6
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 6
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 6
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 229940044655 toll-like receptor 9 agonist Drugs 0.000 description 5
- 102100039385 Histone deacetylase 11 Human genes 0.000 description 4
- 108700038332 Histone deacetylase 11 Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 3
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- -1 aminohexyl Chemical group 0.000 description 2
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVKLKDEXOWFSL-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-bromo-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1Br QFVKLKDEXOWFSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- GXGJIOMUZAGVEH-UHFFFAOYSA-N Chamazulene Chemical group CCC1=CC=C(C)C2=CC=C(C)C2=C1 GXGJIOMUZAGVEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N beta-D-ribose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 240000001735 chia Species 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- CPQCSJYYDADLCZ-UHFFFAOYSA-N n-methylhydroxylamine Chemical compound CNO CPQCSJYYDADLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/311—Phosphotriesters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуностимулирующих олигодезоксинуклеотидов общей формулы 5′[G]х{[Т]pTTCGTC [Т]q}n[G]z 3′, где х = 3-10, z = 0-10, n = 2-100, p = 1-15, и может быть использовано в ветеринарии. Полученные иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды или включающие их векторы и лекарственные средства могут быть использованы в вакцинации против инфекционных заболеваний у домашней птицы. Настоящее изобретение позволяет стимулировать активацию факторов транскрипции NF-kB и IRF3, а также повысить экспрессию вовлеченных в воспалительный процесс цитокинов. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим олигодезоксинуклеотидам (ODN), векторам и вакцинам, включающим такие олигодезоксинуклеотиды, к их применению в качестве лекарственного средства, к их применению для предупреждения инфекционного заболевания или борьбы с ним, к способам детектирования таких олигодезоксинуклеотидов и клеткам, используемым в данных способах.
На протяжении последних двух десятилетий в иммунологии выяснялось, что иммунная система позвоночных обладает механизмами для обнаружения микробной инфекции и запуска быстрой активации иммунной системы через посредство опосредуемого рецепторами распознавания уникальных характеристик патогенов, так называемых связанных с патогенами молекулярных структур (PAMP), взаимодействующих с когнатными, распознающими патогены рецепторами хозяина (PRR) (Iwasaki A, Medzhitov R. 2001; Science 327, 291-295. Medzhitov R., 2009. Immunity 30, 766-775).
В настоящее время очевидно, что некоторые формы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) патогенов входят в число таких PAMP. В 1995 были представлены данные, что неметилированные CpG-мотивы в бактериальной ДНК запускают активацию B-клеток мыши (Krieg et al. 1995). Это исследование впервые сформировало связь между специфическим распознаванием бактериальной, иммуностимулирующей, содержащей неметилированные CpG ДНК и уже признанной супрессией CpG, а также широко распространенным метилированием CpG в ДНК млекопитающих. Было установлено, что самый эффективный, стимулирующий B-клетки, содержащий неметилированные CpG олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) имеет элемент последовательности GACGTT.
Следующая значительная статья в данной области была опубликована лабораторией Shizuo Akira в Осаке/Японии (Hemmi et al. 2000). С использованием клонирования гена и способа нацеленного выключения гена у мышей смогли определенно установить, что клеточную реакцию у мышей на CpG-ODN опосредует Toll-подобный рецептор 9 (TLR9). Впоследствии было установлено, что CpG-ODN являются агонистами в отношении передачи сигнала от TLR9 преимущественно через посредство пути ядерного фактора NF каппа-B (Medzhitov 2001). В последнее десятилетие было опубликовано немало исследований по темам основных исследований и по основным возможным иммунотерапевтическим применениям (обзоры которых приведены, например, в Krieg 2002, 2003, 2006; Klinman 2004, Vollmer 2005, Wilson et al. 2006, Kindrachuk et al. 2008, Dorn and Kippenberger 2008, Vollmer and Krieg 2009, Wilson et al. 2009). Ряд обзорных статей фокусируется на антиинфекционных применениях CpG-ODN (Krieg 2007), применении агонистов TLR9 при лечении рака (Krieg 2007, Weiner 2009), активации TLR9 для лечения астмы и аллергии (Kline 2007, Kline and Krieg 2008, Fonseca and Kline 2009) и в качестве адъювантов для вакцин (Klinman et al. 2004, Klinman 2006, Daubenberger 2007, Wagner 2009, Mutwiri et al. 2009, Klinman et al. 2009).
CpG-ODN также описывались и обсуждались как иммуностимулирующие агенты и адъюванты для вакцин в применениях в ветеринарии, в частности, для жвачных животных, свиней, овец, собак, кур и рыб (Babiuk et al. 2003, Carrington and Secombes 2006, Griebel et al. 2005, Mutwiri et al. 2003, Singh and O'Hagan 2003, Werling and Jungi 2003).
В области применений в ветеринарии для кур описано использование содержащих CpG олигодезоксинуклеотидов, например, в вакцинах для защиты кур от пневмоэнцефалита (Linghua 2007). Недавно было обнаружено, что у кур TLR21 действует как функциональный гомолог TLR9 млекопитающих при распознавании содержащих CpG олигодезоксинуклеотидов (Brownlie et al., 2009).
Конструирование специфических CpG-ODN в качестве иммуномодуляторов до сих пор было довольно произвольным. Это особенно справедливо в отношении CpG-ODN не млекопитающих. Причина этого является многофакторной; прежде всего не известно о корреляции между иммуномодулирующими CpG-мотивами для TLR у человека и для TLR у не человека, не говоря уже о не являющихся млекопитающими видах. Во-вторых, нет в распоряжении клеточных систем с достаточно низким уровнем фона/шума, чтобы селективно исследовать эффекты очень низких концентраций CpG-ODN. Кроме того, нет в распоряжении способов с высокой пропускной способностью, и даже если бы они были, нет четкой корреляции между in vivo и in vitro эффективностями CpG-ODN в качестве иммуномодуляторов у не являющихся млекопитающими видов.
Таким образом, несомненно, существует потребность в новых CpG-ODN, которые оказывают большой иммуномодулирующий эффект, и, следовательно, являются эффективными в низких дозах. И существует потребность в селективных и чувствительных системах отбора CpG-ODN для целей ветеринарии, которые демонстрируют корреляцию между in vitro и in vivo CpG-активностями.
Одной из задач настоящего изобретения является обеспечение таких новых CpG-ODN.
В связи с этим, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммуностимулирующему неметилированному олигодезоксинуклеотиду, имеющему общую формулу 5'[G]x{[T]pTTCGTC[T]q}n[G]z 3', где p=1-15, q=1-15, n=2-100, x=3-10 и z=0-10, или его фармацевтически приемлемой соли.
«Иммуностимулирующий неметилированный олигодезоксинуклеотид» относится к олигодезоксинуклеотиду, который содержит неметилированную динуклеотидную последовательность цитидин-фосфат-гуанозин, которая стимулирует инициацию каскадов передачи сигналов, приводящих к активации факторов транскрипции, таких как NF-κB или регулирующий интерфероны фактор 3 (IRF3). Именно эта активация, в свою очередь, приводит к экспрессии вовлеченных в воспалительный процесс цитокинов и к другим событиям активации клеток. Сайты связывания NF-κB и экспрессия генов, на которую влияет NF-κB, описаны, помимо прочего, Schindler and Baichwal (1994).
Термин «олигодезоксинуклеотид» означает короткий полимер из дезоксинуклеотидов; т.е. молекулу, включающую множество дезоксирибоз, связанных с фосфатной группой и сменяемым органическим основанием. Таким органическим основанием является замещенный пиримидин или замещенный пурин. Примерами являются цитозин и тимин относительно аденина и гуанина. Олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут включать модификации. Примерами таких модификаций являются, например, модификации в фосфодиэфирном межнуклеозидном мостике, находящемся на 3' и/или 5' конце нуклеозида. Такие модификации относятся, между прочим, к замене фосфодиэфира, например, фосфоротиоатом или фосфородитиоатом.
Другими модификациями являются, например, замены фосфодиэфирного мостика дефосфо-мостиком. Примерами дефосфо-мостиков являются метилгидроксиламинная, формацетальная и диметиленсульфоновая группы.
Тем не менее, другими модификациями являются модификации, которые имеют отношение к замене природного нуклеозидного основания неприродным нуклеозидным основанием, таким как 5-фторцитоцин, 7-дезаза-7-замещенный гуанин, 7-дезаза-8-замещенный гуанин, 2-тиоурацил, дигидроурацил, 5-бромцитозин, 6-замещенные цитозины, N4-замещенные цитозины.
Кроме того, другими модификациями являются модификации, которые имеют отношение к замене сахарной единицы; сахара в виде β-рибозы или сахарной единицы в виде β-D-2'-рибозы, модифицированной сахарной единицей, такой как, например, L-2'-дезоксирибоза или 2'-L-арабиноза.
Учебником, дающим дополнительное понимание олигонуклеотидов, является, например, "PCR Primer: A Laboratory Manual", Second Edition, 2003, Edited By Carl W. Dieffenbach, National Institute of Allergy and Infectious Diseases; Gabriela S. Dreksler, Uniformed Services University of the Health Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN 978-087969654-2.
Структура {[T]pTTCGTC[T]q}n, содержащая CpG-мотив, представляет собой активную иммуностимулирующую составляющую ODN согласно настоящему изобретению. Следовательно, настоящим изобретением обеспечиваются иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды, которые включают этот так называемый «остов».
Было обнаружено, что остов олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению, структура {[T]pTTCGTC[T]q}n, должен быть представлен по меньшей мере два, предпочтительно три раза. Следовательно, n должно быть равно по меньшей мере двум. Было также обнаружено, что активность олигодезоксинуклеотидов увеличивается при увеличении n. Этот эффект нивелируется, когда n увеличивается. По существу, число n остовной структуры должно быть, следовательно, равно по меньшей мере 2. Предпочтительно диапазон n составляет 3≤n≤100, просто из-за того факта, что чем длиннее синтетическая последовательность, тем труднее ее создать. На практике диапазон n предпочтительно составляет 2≤n≤18. Более предпочтительно, диапазон n составляет 3≤n≤18, даже более предпочтительно диапазон n составляет 4≤n≤18, даже еще более предпочтительно диапазон n составляет 5≤n≤18.
Идентификация CpG-ODN согласно настоящему изобретению была обеспечена, между прочим, в результате использования более селективной системы детектирования, чем системы, используемые в настоящее время для обнаружения активации NF-κB. Brownlie и др. (2009) описывают репортерную систему на основе люциферазы для NF-κB. Другие системы основаны, например, на измерении транскрипта IL-8, или секреции цитокинов, или детектировании секреции NO.
В отличие от этого, в настоящем изобретении была использована система детектирования на основе секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP). SEAP является репортерным ферментом в системах млекопитающих (Yang et al., 1997). Эта система, как оказалось, является неожиданно чувствительной и, кроме того, неожиданно обеспечивает близкую корреляцию между in vitro и in vivo активностями проверенных CpG-ODN. Система на основе SEAP использовалась вместе с пара-нитрофенилфосфатом (pNPP) в качестве субстрата.
Другим усовершенствованием по сравнению с существующими системами было введение и прочное сохранение в клетках плазмиды, несущей ген SEAP. До сих пор во всех системах детектирования использовалась транзиторная трансфекция клеток геном-репортером. Именно благодаря введению и прочному сохранению в клетках гена-репортера теперь впервые удалось построить кривую зависимости ответной реакции от дозы. Такая кривая важна, если должно быть осуществлено надежное сравнение между активностями различных CpG-ODN.
Следовательно, способы и линии клеток, подробно описанные в разделе «Примеры» настоящего изобретения, впервые создают возможность для проведения надежного одновременного сравнения между различными CpG-ODN. Дополнительные подробности используемой системы приведены в разделе «Примеры».
Поскольку способы и линии клеток настоящего изобретения теперь делают возможными такие надежные одновременные сравнения между различными CpG-ODN, смогли определить, что олигодезоксинуклеотид согласно настоящему изобретению, в котором p>1, обладает более высоким уровнем активности, чем когда p=1. Следовательно, в предпочтительной форме данного варианта осуществления p>1. Значение p, равное 2, 3, 4, 5 или 6, является более предпочтительным в этом порядке возрастания предпочтения. Еще более предпочтительными являются значения p>6, хотя увеличение активности нивелируется. Олигодезоксинуклеотиды, в которых р-значения превышают 15, будет все более и более трудно синтезировать. Поэтому предпочтительно значение p не должно превышать 15.
Смогли также определить, что олигодезоксинуклеотид согласно настоящему изобретению, в котором q>1, обладает более высоким уровнем активности, чем когда q=1. Следовательно, в предпочтительной форме данного варианта осуществления q>1. Значение q, равное 2, 3, 4, 5 или 6, является более предпочтительным в этом порядке возрастания предпочтения. Еще более предпочтительными являются значения q>6, хотя увеличение активности нивелируется. Олигодезоксинуклеотиды, в которых q-значения превышают 15, будет все более и более трудно синтезировать. Поэтому предпочтительно значение q не должно превышать 15.
Было обнаружено, что увеличение числа G' на 5'-конце структуры 5'[G]x{[T]pTTCGTC[T]q}n[G]z 3' приводит к увеличению активности CpG-ODN. Значение x должно быть равно по меньшей мере 3, но увеличение численности G вплоть до 20 G приводит к увеличению активности CpG-ODN. Поэтому предпочтительно x равно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 в этом порядке возрастания предпочтения.
Было также обнаружено, что увеличение числа G' на 3'-конце структуры 5'[G]x{[T]pTTCGTC[T]q}n[G]z 3' приводит к (небольшому) уменьшению активности CpG-ODN. Значение z должно быть равно 10 или меньше 10, но уменьшение числа G вплоть до 0 G приводит к увеличению активности CpG-ODN. Следовательно, более предпочтительно, когда z равно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0, в этом порядке возрастания предпочтения.
Как указано выше, возможны некоторые виды модификаций в фосфодиэфирном межнуклеозидном мостике, находящемся на 3' и/или 5' конце нуклеозида. Но по существу, в зависимости от пути синтеза, обычными распространенными типами связей между двумя нуклеотидами являются фосфодиэфирные (PDE) связи и фосфоротиоатные (PTO) связи. Для увеличения стабильности и иммуностимулирующего эффекта CpG-ODN структурные элементы синтетических олигодезоксинуклеотидов обеспечены фосфоротиоатами, так что они образуют PTO связи. Однако неожиданно было обнаружено, что когда только нуклеотиды 5'[G]x и 3'[G]z связаны PTO связями, и другие нуклеотиды связаны PDE связями, эффективность олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению дополнительно увеличивается. (В таких случаях связь 5'[G]x с {[T]pTTCGTC[T]q} является PTO связью, в то время как связь {[T]pTTCGTC[T]q} с [G]z 3' является PDE связью.)
Следовательно, другая предпочтительная форма данного варианта осуществления относится к олигодезоксинуклеотидам согласно настоящему изобретению, в которых нуклеотиды 5'[G]x и 3'[G]z имеют фосфоротиоатную связь, и другие нуклеотиды имеют фосфодиэфирную связь.
Не является необходимым, чтобы остов олигодезоксинуклеотидов согласно настоящему изобретению, структура 5'{[T]pTTCGTC[T]q}n 3', был идентичным для каждого n. Это означает, что остов олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению может быть, между прочим, похожим на: {TTTCGTCT}{TTTCGTCTT}{TTTTCGTCT}. Такая последовательность из трех различных последовательных остовов будет обозначаться как гетерополимер. Последовательность из трех идентичных копий будет называться гомополимером. Предпочтительно олигодезоксинуклеотид согласно настоящему изобретению включает гомополимер 5'{[T]pTTCGTC[T]q}n 3'.
Содержащие CpG олигодезоксинуклеотиды согласно настоящему изобретению активны в пикомолярных (субнаномолярных) количествах; их EC50 меньше 1 нМ. Полумаксимальной эффективной концентрацией (EC50) олигодезоксинуклеотида является количество олигодезоксинуклеотида, которое необходимо для индукции количества репортерного фермента SEAP (который создает окрашенный продукт с абсорбционной способностью при 405 нм) в репортерных клетках (HEK293-pNifty2-TLR21 кур или HD11-pNifTy2Hyg), которое дает полумаксимальную скорость ферментативной реакции. Если EC50 олигодезоксинуклеотида меньше 1 нМ в этих клетках, он считается активным в пикомолярных (субнаномолярных) количествах.
Вполне возможно соединить олигодезоксинуклеотид согласно настоящему изобретению с носителем или гаптеном, через реакционноспособную химическую группу. Такое соединение увеличивает иммуностимулирующий эффект комбинированных молекул. Простыми примерами таких компонентов являются, например, дигоксигенин, аминогексил-, техасский красный и биотин. Предпочтительные носители или гаптены представляют собой 3'- и 5'-меченый техасский красный и 5'-меченый дигоксигенин. Соединение олигодезоксинуклеотидов с гаптенами/носителями хорошо известно в данной области техники.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору, включающему иммуностимулирующий неметилированный олигодезоксинуклеотид согласно настоящему изобретению. Таким вектором может быть молекула нуклеиновой кислоты, такая как плазмида, вирус, бактериофаг или любой другой вектор, используемый в молекулярной биологии. Просто в качестве примера: вектором, включающим иммуностимулирующий неметилированный олигодезоксинуклеотид, может быть, например, молекула ДНК, такая как плазмида, которая может увеличиваться в числе в бактериях, в которую был клонирован иммуностимулирующий неметилированный олигодезоксинуклеотид согласно настоящему изобретению. Предпочтительно такая плазмида имеет активное начало репликации, приводящее к присутствию большой численности плазмиды в хозяине. Выращивание таких бактерий в большом масштабе с последующим выделением плазмид обеспечивает альтернативу для синтетического получения иммуностимулирующего неметилированного олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению.
Одной из задач настоящего изобретения является обеспечение новых CpG-ODN, которые могут использоваться в качестве успешных иммуностимулирующих компонентов в вакцинах, которые предупреждают инфекционное заболевание или борются с ним, вместе с антигенным компонентом или генетической информацией, кодирующей антигенный компонент, и фармацевтически приемлемым носителем.
В общем, термин «антигенный компонент» относится к составу материала, который включает по меньшей мере один эпитоп, который может индуцировать, стимулировать или усиливать иммунный ответ после введения человеку или животному.
Антигенный компонент может быть любым видом антигенного компонента, но предпочтительно происходит из микроорганизма или вируса, который в его форме дикого типа является патогенным для людей или животных.
Антигенным компонентом может быть цельный патоген, предпочтительно в инактивированной или аттенуированной форме, экстракт из патогена или иммуногенный белок патогена. Если антигенным компонентом является иммуногенный белок патогена, то иммуногенный белок предпочтительно является экпрессированным в in vitro культивируемых клетках и выделенным из них.
Следовательно, другой вариант осуществления относится к вакцине для предупреждения инфекционного заболевания или борьбы с ним, характеризующейся тем, что указанная вакцина включает иммуностимулирующее количество олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению и/или вектор согласно настоящему изобретению, иммуногенное количество антигенного компонента или генетической информации, кодирующей антигенный компонент, и фармацевтически приемлемый носитель.
Конечно, иммуностимулирующее количество олигодезоксинуклеотида и иммуногенное количество антигенного компонента сильно взаимосвязаны. Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что присутствие олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению может уменьшить количество антигенного компонента, которое необходимо для предупреждения инфекционного заболевания или борьбы с ним. Количество антигенного компонента, которое необходимо для предупреждения инфекционного заболевания или борьбы с ним, называют иммуногенным количеством антигенного компонента. Иммуностимулирующим количеством олигодезоксинуклеотида является количество, которое способно к уменьшению иммуногенного количества антигенного компонента, т.е. количества антигенного компонента, которое необходимо для предупреждения инфекционного заболевания или борьбы с ним. То есть, по существу, формулировки «иммуностимулирующее количество олигодезоксинуклеотида» и «иммуногенное количество» должны рассматриваться в зависимости друг от друга.
Само собой разумеется, что, если вакцина включает генетическую информацию, кодирующую антигенный компонент, количество антигенного компонента, экспрессируемого этой генетической информацией, должно быть достаточным для предупреждения инфекционного заболевания или борьбы с ним, т.е. оно должно быть иммуногенным количеством.
Тот факт, что неметилированные олигодезоксинуклеотиды согласно настоящему изобретению являются иммуностимулирующими, означает, что они увеличивают иммунологическую эффективность антигенных компонентов в вакцинах. По этой причине, вакцины согласно настоящему изобретению будут во многих случаях включать меньше антигенного компонента или генетической информации, кодирующей антигенный компонент, чем в случае, если бы олигодезоксинуклеотиды согласно настоящему изобретению не присутствовали. В некоторых случаях, антигенный компонент как таковой, без добавления иммуностимулирующих олинонуклеотидов, может обладать такими низкими иммуногенными свойствами, что, во всяком случае, должны вводиться большие количества, хотя и без достижения желаемого уровня иммуногенности. В таких случаях, антигенный компонент может вводиться в обычной высокой концентрации, однако теперь вместе с олигодезоксинуклеотидом согласно настоящему изобретению, чтобы подобным образом достичь желаемого уровня иммуногенности.
Таким образом, количество антигенного компонента или генетической информации, кодирующей антигенный компонент, вводимого с олигонуклеотидом согласно настоящему изобретению, будет, как позывает опыт, равно или меньше количества, вводимого в отсутствие олигонуклеотида. Квалифицированному специалисту, участвующему в производстве конкретных вакцин, будет известно это количество для данной конкретной вакцины. Также в разделе «Примеры» дается, например, вполне достаточное указание в отношении количества антигенных компонентов, используемых, например, в трех различных вакцинах на основе инактивированных вирусов: вакцине против вируса пневмоэнцефалита птиц, вакцине против вируса инфекционного бронхита и вакцине против ринотрахеита индеек.
Количество олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению, которое необходимо вводить вместе с антигенным компонентом или генетической информацией, кодирующей антигенный компонент, зависит как от выбранного олигодезоксинуклеотида, так и от антигенного компонента. Очень подходящее количество олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению будет обычно варьировать от 1 до 100 наномолей. Очень хорошие in vivo результаты были получены, например, при использовании 1-10 мкг олигодезоксинуклеотидов согласно настоящему изобретению со средней длиной, составляющей 30 дезоксинуклеотидов, которые, как было обнаружено, являются активными в vitro исследованиях в наномолярном диапазоне. Если олигодезоксинуклеотид выбран из группы олигодезоксинуклеотидов, которые активны в пикомолярном диапазоне, специалисту в данной области будет понятно, что до проверки наномолярных количеств стоит проверить количества, которые меньше, возможно гораздо меньше, 1 наномоля, т.е. пикомолярные количества.
Вакцины согласно настоящему изобретению включают фармацевтически приемлемый носитель. Природа этого носителя зависит, между прочим, от пути введения. Если введение осуществляют пероральным или интраназальным путем, носитель может быть настолько простым, как стерильная вода, физиологический солевой раствор или буфер. Если предпочтительным путем является инъекция, носитель должен быть предпочтительно изотоническим и удовлетворять особым требованиям в отношении pH, что делает его подходящим для инъекции. Однако такие носители широко известны в данной области техники.
Вакцины согласно настоящему изобретению могут, помимо антигенного компонента или генетической информации, кодирующей антигенный компонент, и олигодезоксинуклеотида согласно настоящему изобретению, включать адъювант. Как правило, адъюванты представляют собой вещества, которые усиливают иммунный ответ хозяина неспецифическим образом. В данной области техники известно множество адъювантов, которые являются подходящими, такие как полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин E, неионные блоксополимеры и полианионы, такие как декстран сульфата, карбопол и пиран, гидроксид алюминия. Также часто используемыми являются фосфат алюминия, сапонины, растительные масла, такие как токоферол и минеральные масла. Очень эффективными адъювантами являются эмульсии типа «масло-в-воде» и особенно эмульсии типа «вода-в-масле», далее также называемые адъювантами типа «масло-в-воде» и адъювантами типа «вода-в-масле». Такие эмульсии хорошо известны в данной области техники. Таким образом, предпочтительно вакцина включает адъювант типа «вода-в-масле».
Предпочтительно антигенный компонент представляет собой вирус или микроорганизм, который в его форме дикого типа является патогенным для домашней птицы, или происходит из него.
Более предпочтительно, когда указанный вирус или микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вируса инфекционного бронхита, вируса пневмоэнцефалита птиц, вируса инфекционного бурсита (болезни Гамборо), агента, вызывающего анемию у кур, реовируса птиц, Mycoplasma gallisepticum, вируса ринотрахеита индеек, Haemophilus paragallinarum (Coryza), поксвируса кур, вируса энцефаломиелита птиц, вируса синдрома снижения несучести, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса герпеса индеек, Eimeria spp., Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella multocida, Mycoplasma synoviae, Salmonella spp. и Escherichia coli.
Кроме того, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммуностимулирующему неметилированному олигодезоксинуклеотиду согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Кроме того, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммуностимулирующему неметилированному олигодезоксинуклеотиду согласно настоящему изобретению для применения для предупреждения инфекционного заболевания у домашней птицы или борьбы с ним.
До сих пор во всех системах детектирования использовалась транзиторная трансфекция клеток геном-репортером. Такие транзиторные системы не создают возможность для надежного одновременного сравнения эффективности CpG-ODN. Как указано выше, основным усовершенствованием по сравнению с существующими системами было введение и прочное сохранение в клетках плазмиды, содержащей ген-репортер. Прочное означает, что плазмида остается находиться в клетке после нескольких циклов деления клетки.
Часто прочного сохранения плазмиды достигают посредством выращивания клеток под давлением одного или более селективных агентов, таких как антибиотики, ген устойчивости к которым присутствует на плазмиде. Утрата плазмиды будет в таком случае приводить к гибели клетки, которая утратила плазмиду. Остающиеся жизнеспособные клетки будут все еще содержать плазмиду. Другим способом прочного сохранения будет трансфекция линеаризованной плазмидой. Такие плазмиды обычно интегрируются в геном клетки и поэтому прочно сохраняются. Таким образом, еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке, включающей TLR21-рецептор и плазмиду, кодирующую ген-репортер для NF-κB, которая прочно сохраняется в клетке. Такие клетки очень подходят для применения при отборе содержащих CpG молекул, более конкретно, отбора содержащих CpG молекул согласно настоящему изобретению. В разделе «Примеры» дается вполне достаточное описание в отношении того, как получить такую клетку, включающую плазмиду, кодирующую ген-репортер, которая может прочно сохраняться в клетке.
Как также отмечено выше, системы детектирования, основанные на секретируемой щелочной фосфатазе (SEAP), как установлено, очень подходят ради используемой системы детектирования. Таким образом, предпочтительно геном-репортером является ген, кодирующий секретируемую щелочную фосфатазу.
По существу, любая клетка или линия клеток, содержащая и экспрессирующая TLR21, которая дает возможность вводить и предпочтительно прочно сохранять плазмиду, несущую ген-репортер для NF-κB, предпочтительно ген SEAP, описанный выше, подходит для проверки TLR21-специфических CpG-ODN. Предпочтительным примером такой линии клеток, подходящей для проверки TLR21-специфических CpG-ODN, является линия клеток кур HD11. Следовательно, предпочтительно линией клеток для использования в системе детектирования является линия клеток HD11, включающая стабильную плазмиду, кодирующую ген-репортер.
Линии клеток кур, такие как линия клеток HD11, демонстрируют полный набор TLR кур. В определенных условиях это может порождать некоторую фоновую активность. По этой причине, более предпочтительными линиями клеток являются линии клеток не домашней птицы, такие как линии клеток млекопитающих. Примером такой линии клеток млекопитающих является клетка HEK293, в которую был клонирован TLR21. Такая линия клеток является более специфически селективной в отношении TLR21-активирующих сигналов. По этой причине, более предпочтительно, когда линией клеток для использования в системе детектирования является линия клеток млекопитающих HEK293, которая включает прочно сохраняемый ген-репортер и в которую был клонирован TLR21.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу детектирования иммуностимулирующих олигодезоксинуклеотидов согласно настоящему изобретению, который включает стадии a) приведения олигодезоксинуклеотида в контакт с клеткой согласно настоящему изобретению, b) определения уровня продукта гена-репортера.
В предпочтительной форме данного способа продуктом гена-репортера является SEAP.
Более предпочтительная форма данного варианта осуществления относится к способу детектирования иммуностимулирующих олигодезоксинуклеотидов согласно настоящему изобретению, в котором клеткой является клетка линии клеток кур HD11, или линии клеток HEK293, в которую был клонирован TLR21 кур.
Примеры
Пример 1
Клонирование гена и гетерологичная экспрессия TLR21 кур
Недавние успехи в поиске TLR у кур говорят о том, что TLR21 является функциональным гомологом TLR9 млекопитающих у видов птиц (Keestra 2008, Brownlie et al. 2009).
Основные положения клонирования гена TLR21
На основе последовательности NM_001030558 в базе данных Genbank была синтезирована пара праймеров для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена TLR21 кур:
Ga-TLR21-for1 (прямой праймер): GAAGCTTACCATGATGGAGACAGCGGAGAAGGC
Ga-TLR21-rev1 (обратный праймер): GGCGGCCGCTACATCTGTTTGTCTCCTTCCCTG
Праймеры были разработаны так, чтобы они обеспечивали рестрикционые сайты для клонирования (с подчеркиванием) и последовательность Козака (курсивный шрифт), фланкирующие инициирующий кодон и стоп-кодон (жирный шрифт). Используя эти праймеры и тотальную РНК кур в качестве матрицы, выполняли ОП-ПЦР. Продукт ПЦР ожидаемого размера (~3000 п.о.) клонировали в pCR2.1-Topo, и секвенировали 5 независимых плазмидных клонов (P1, P2, P12, P13, P14).
Последовательность ДНК TLR21 кур, которая использовалась:
Трансфекция HEK293-pNifTy2-Zeo (клональной клеточной линии) плазмидой pcDNA3.1(+)-Neo-chiTLR21
Клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293 были созданы в 70-годах ХХ столетия в результате вирусной трансформации (Graham et al., 1977) и в настоящее время имеются в распоряжении научного сообщества благодаря депозитариям линий клеток, таким как ATCC.
pNifty2 является плазмидой, которая позволяет детектировать активацию транскрипционного фактора NFκВ, которая является признаком многих иммуностимулирующих действий, активаций Toll-подобных рецепторов среди них. Геном-репортером в pNifTy2, транскрипция/трансляция которого зависит от активации NFκВ, является секретируемая щелочная фосфатаза (SEAP). Детали описаны в спецификации от компании, продающей эту плазмиду: Invivogen. События трансформации/трансфекции с использованием pNifty2 отбирают как в бактериях, так и в клетках млекопитающих посредством добавления зеоцина в среды для роста.
Клетки HEK293 трансфицировали pNifTy2 с использованием стандартных способов (липофекции), отбирали стабильную линию клеток, функциональность осевой линии NFκВ/SEAP устанавливали посредством стимуляции с помощью фактора α некроза опухолей человека (Sigma). Секретируемую SEAP в супернатанте культуры стимулированных клеток определяли с помощью колориметрического исследования в титрационном микропланшете, в котором используется хромогенный субстрат пара-нитрофенилфосфат (pNPP, 5 мМ) в щелочном буфере (50 мМ NaHCO3, pH 9,6, 2 мМ MgCl2). Развитие цвета (λ=405 нм) считывали на микропланшет-ридере. Это считывание данных также использовали для отбора клональных линий (методом предельного разведения) с высокими отношениями сигнала к шуму. Один из отобранных клонов (дублированный клон 11) затем использовали для дальнейших исследований с TLR21 кур.
pcDNA3.1(+)-neo представляет собой стандартный вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, купленный у Invitrogen. Субклонирование гена TLR21 кур в этот вектор осуществляли через фланкирующие рестрикционные сайты для Hind III (инициирующий кодон) и Not I (стоп-кодон), которые были введены с помощью ПЦР. (См. фиг.1).
Данную плазмиду затем трансфицировали (с помощью липофекции) в клональную линию HEK293-pNifty2-zeo, и рекомбинантные клетки отбирали посредством добавления и зеоцина, и G418 в среду для роста. Функциональность результирующей поликлональной рекомбинантной клеточной линии оценивали посредством стимуляции культуры с помощью ODN-X4 и ODN-HEK1-PTO и детектирования SEAP. Лучшие клональные линии затем идентифицировали методом предельного разведения с последующей стимуляцией и детектированием SEAP.
SEAP является репортерным ферментом в системах млекопитающих (Yang et al., 1997). SEAP является секретируемой формой щелочной фосфатазы эмбриона человека. Ее основными преимуществами являются высокая стабильность и очень высокая специфическая активность, которые обеспечивают чувствительность и надежность детектирования. Для обнаружения SEAP описано несколько субстратов, но был выбран экономичный и устойчивый pNPP, поскольку продукт его реакции пара-нитрофенолят детектируется с высокой чувствительностью (ε405=18500 M-1 см-1). В своих схемах проверки авторы настоящего изобретения выполняли кинетические исследования, поскольку они обеспечивают более широкий динамический диапазон квантификации.
Клетки HEK293-pNifTy2-Zeo трансфицировали pcDNA3.1(+)-Neo-chiTLR21 (линеаризованной с помощью Pvu I), и поликлональную клеточную линию отбирали посредством пополнения среды 350 мкг/мл зеоцина и 600 мкг/мл G418. Проверку на функциональность проводили путем стимуляции клеток с помощью ODN-X4 (PDE) и ODN-HEK1 (PTO). Секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP) продуцировали отобранные клетки, но не родительская клеточная линия HEK293-pNifTy2-Zeo. Выполняли клонирование одной клетки, и отдельные клоны анализировали в отношении их способности реагировать на ODN-X4 (PDE) (GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG) и ODN-HEKl (PTO) (TCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT).
Из 46 клональных линий клеток, устойчивых как к зеоцину, так и к G418, только 3, несомненно, реагировали на ODN стимулы, в то время как 3-4 дополнительные клеточные линии продемонстрировали более слабые сигналы. 85% отобранных клонов были, следовательно, нефункциональными.
Для всех дальнейших исследований использовали клональную клеточную линию 38, которая порождала, вне всяких сомнений, самый высокий сигнал считывания SEAP в ответ на стимуляцию с помощью ODN-X4 (PDE) и ODN-HEKl (PTO).
Фиг.2-5 дают общее представление о SEAP активности различных клональных клеточных линий, устойчивых как к зеоцину, так и к G418.
Пример 2
Исходя из X43-batch4: GGGGGGTTCGTCTTCGTCTTCGTCGGGGG, были осуществлены и проверены следующие модификации:
Как можно видеть на фиг.6, олигонуклеотид X43-II-T дает самую высокую степень индукции количества окрашенного продукта с абсорбционной способностью при 405 нм репортерного фермента SEAP в репортерных клетках (HEK293-pNifty2-TLR21 кур), что касается максимальной ответной реакции, по сравнению с другими проверенными олигонуклеотидами.
X43-II-T представляет собой формулу 5'[G]x{[T]pTTCGTC[T]q}n[G]z 3', где x=6, z=5, p=2, q=2 и n=3.
На основе фиг.6, были сделаны следующие расчеты EC50 для различных соединений:
Расчет EC50:
Заключение: как следует из фиг.6, представляющей ОП405нм/мин, и фиг.7, представляющей EC50 в наномолях, добавление двух 3'-фланкирующих тимидинов и двух 5'-фланкирующих тимидинов в X43 (→X43-II-T) приводит к неожиданному сильному увеличению эффективности, как в отношении максимальной ответной реакции, так и в отношении EC50. Было показано, что EC50 соединения 5'[G]6{[T]2TTCGTC[T]2}3[G]5 3 находится в пикомолярном диапазоне.
Пример 3
В данном примере значение n варьировало от n=3 в X43-II-trip до n=4 (X43-II-quad) и до n=5 (X43-II-pent)
На фиг.8 продемонстрирован эффект увеличения значения n. В таблице, представленной ниже, продемонстрирован эффект увеличения n на EC50. Очевидно, что увеличение n приводит к уменьшению EC50 и, соответственно, большему иммуностимулирующему эффекту.
Пример 4
В данном примере значение p и q изменяли с 2 (X43-II-trip) до 3 (X43-II-trip) и до 4 (X43-IV-trip).
На фиг.9 продемонстрирован эффект увеличения значения p и q. В таблице, представленной ниже, продемонстрирован эффект увеличения значения на EC50. Очевидно, что увеличение p и q приводит к уменьшению EC50 и, соответственно, большему иммуностимулирующему эффекту.
Пример 5
В данном примере значение x увеличивали с 6 до 7 (X43-II-5735), и z уменьшали с 5 до 2 (X43-II-5732).
На фиг.10 продемонстрирован эффект увеличения значения x и уменьшения значения z. В таблице, представленной ниже, продемонстрирован эффект увеличения значения на EC50. И увеличение x, и уменьшение z приводит к уменьшению EC50 и, соответственно, большему иммуностимулирующему эффекту.
Подписи к фигурам:
Фиг.1: карта плазмиды pcDNA3.1(+)-chiTLR21
Фиг.2-5: общее представление о SEAP активности различных клональных клеточных линий, устойчивых как к зеоцину, так и к G418.
Фиг.6: на данной фигуре представлена эффективность различных проверенных соединений в индукции количества окрашенного продукта с абсорбционной способностью при 405 нм репортерного фермента SEAP в репортерных клетках (HEK293-pNifty2-TLR21 кур).
Фиг.7: на данной фигуре представлены значения EC50 для различных проверенных соединений, в пикомолях.
Фиг.8-10: на данных фигурах представлена эффективность дополнительных проверенных модифицированных соединений в индукции количества окрашенного продукта с абсорбционной способностью при 405 нм репортерного фермента SEAP в репортерных клетках (HEK293-pNifty2-TLR21 кур).
Библиография
Babiuk L.A., Gomis S., Hecker R., 2003. Molecular approaches to disease control. Poult. Sci. 82, 870-875.
Brownlie, R., Zhu J., Allan B., Mutwiri G.K., Babiuk L.A., Potter A., Griebel P., 2009. Chickei TLR21 acts as a functional homologue to mammalian TLR9 in the recognition of CpG oligodeoxynucleotides. Mol. Immunol. 46, 3163-3170.
Carrington A.C., Secombes C.J., 2006. A review of CpGs and their relevance to aquaculture. Vet. Immunol. Immunopathol. 112, 87-101.
Daubenberger C.A., 2007. TLR9 agonists as adjuvants for prophylactic and therapeutic vaccines. Curr. Opin. Mol. Ther. 9, 45-52.
Dorn A., Kippenberger S., 2008. Clinical application of CpG-, non-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 10-20.
Fonseca D.E., Kline J.N., 2009. Use of CpG oligodeoxynucleotides in treatment of asthma and allergic disease. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 256-262.
Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., Nairn, R., 1977. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-74.
Griebel P.J., Brownlie R., Manuja A., Nichani A., Mookherjee N., Popowych Y., Mutwiri G., Hecker R., Babiuk L.A., 2005. Bovine toll-like receptor 9: a comparative analysis of molecular structure, function and expression. Vet. Immunol. Immunopathol. 108, 11-16.
Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S., 2000. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745.
Iwasaki A, Medzhitov R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. 2010. Science 327, 291-295.
Keestra A.M., 2008. Molecular dissection of the chicken Toll-like receptor repertoire. PhD thesis (Proefschrift), University of Utrecht, The Netherlands.
Kline J.N., 2007. Immunotherapy of asthma using CpG oligodeoxynucleotides. Immunol. Res. 39, 279-286.
Kline J.N., Krieg A.M., 2008. Toll-like receptor 9 activation with CpG oligodeoxynucleotides for asthma therapy. Drug News Perspect. 21, 434-439.
Klinman D.M., 2004. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nat. Rev. Immunol. 4, 249-258.
Klinman D.M, Currie D., Gursel I., Verthelyi D., 2004. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunol. Rev. 199, 201-216.
Klinman D.M., 2006. Adjuvant activity of CpG oligodeoxynucleotides. Int. Rev. Immunol. 25, 135-154.
Klinman D.M., Klaschik S., Sato T., Tross D., 2009. CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases. Adv. DrugDeliv. Rev. 61, 248-255.
Kindrachuk I, Potter I, Wilson H.L., Griebel P., Babiuk L.A., Napper S., 2008. Activation and regulation of toll-like receptor 9: CpGs and beyond. Mini Rev. Med. Chem. 8, 590-600.
Krieg A.M., Yi A,K., Matson S,, Waldschmidt T,J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M., 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374, 546-549.
Krieg A.M., 2002. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu. Rev. Immunol. 20, 709-760.
Krieg A.M., 2003. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts? Nat. Med. 9, 831-835.
Krieg A.M., 2006. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nat. Rev. DrugDiscov. 5, 471-484.
Krieg A.M., 2007a. Anti-infective applications of toll-like receptor 9 agonists. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 289-294.
Krieg A.M., 2007b. Development of TLR9 agonists for cancer therapy. J. Clin. Invest. 117, 1184-1194.
Linghua Zhang et al., 2007. Vaccination with Newcatle disease vaccine and CpG oligodeoxynucleotides induces specific immunity and protection against Newcastle disease virus in SPF chicken. Vet. Immun. And Immunopath. 115, 216-222.
Medzhitov R., 2001. CpG DNA: security code for host defense. Nat. Immunol. 2, 15-16.
Medzhitov R., Approaching the asymptote: 20 years later. 2009. Immunity 30, 766-775)
Mutwiri G., van Drunen Littel-van den Hurk S., Babiuk L.A., 2009. Approaches to enhancing immune responses stimulated by CpG oligodeoxynucleotides. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 226-232.
Mutwiri G., Pontarollo R., Babiuk S., Griebel P., van Drunen Littel-van den Hurk S., Mena A., Tsang C, Alcon V., Nichani A., Ioannou X., Gomis S., Townsend H., Hecker R., Potter A., Babiuk L.A., 2003. Biological activity of immunostimulatory CpG DNA motifs in domestic animals. Vet. Immunol. Immunopathol. 91, 89-103.
Schindler, U., and Baichwal, V.R., 1994. Moll. Cell. Biol. 14: 5820-5831.
Singh M., O'Hagan D.T., 2003. Recent advances in veterinary vaccine adjuvants. Int. J. Parasitol. 33, 469-478.
Vollmer J., 2005. Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9. Expert Opin. Biol. Ther. 5, 673-682.
Vollmer J., Krieg A.M., 2009. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 195-204.
Wagner H., 2009. The immunogenicity of CpG-antigen conjugates. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 243-247.
Weiner G.J., 2009. CpG oligodeoxynucleotide-based therapy of lymphoid malignancies. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 263-267.
Werling D., Jungi T.W., 2003. TOLL-like receptors linking innate and adaptive immune response. Vet. Immunol. Immunopathol. 91, 1-12.
Wilson H.L., Dar A., Napper S.K., Marianela Lopez A., Babiuk L.A., Mutwiri G.K., 2006. Immune mechanisms and therapeutic potential of CpG oligodeoxynucleotides. Int. Rev. Immunol. 25, 183-213.
Wilson K.D., de Jong S.D., Tarn Y.K., 2009. Lipid-based delivery of CpG oligodeoxynucleotides enhances immunotherapeutic efficacy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 233-242.
Yang, T.T., Sinai, P., Kitts, P.A., Kain, S.R., 1997. Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechniques 23, 1110-1114.
Claims (14)
1. Иммуностимулирующий неметилированный олигодезоксинуклеотид, имеющий общую формулу 5′[G]х{[Т]pTTCGTC [Т]q}n[G]z 3′, где р = 1-15, q = 1-15, n = 2-100, х = 3-10 и z = 0-10, или его фармацевтически приемлемая соль,
который, необязательно, соединен с носителем или гаптеном.
который, необязательно, соединен с носителем или гаптеном.
2. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, где р = 2-15.
3. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, где р = 3-15.
4. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, где q = 2-15.
5. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, где q = 3-15.
6. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, где n = 3-18.
7. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, характеризующийся тем, что нуклеотиды 5′[G]х и 3′[G]z связаны с помощью фосфоротиоатной связи, а другие нуклеотиды связаны с помощью фосфодиэфирной связи.
8. Олигодезоксинуклеотид по п. 1, в котором {[Т]pTTCGTC[Т]q}n представляет собой гомополимер.
9. Олигодезоксинуклеотид по любому из пп. 1-8, который соединен с носителем или гаптеном.
10. Вектор, включающий олигодезоксинуклеотид по любому из пп. 1-8, где указанный вектор способен экспрессировать указанный олигодезоксинуклеотид.
11. Вакцина для предупреждения инфекционного заболевания у домашней птицы, характеризующаяся тем, что указанная вакцина включает иммуностимулирующее количество олигодезоксинуклеотида по любому из пп. 1-9 и/или иммуностимулирующее количество вектора по п. 10, иммуногенное количество убитого или аттенуированного антигенного компонента или нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный компонент, и фармацевтически приемлемый носитель, где
указанный антигенный компонент представляет собой вирус или микроорганизм, который в своей форме дикого типа является патогенным для домашней птицы или происходит из него.
указанный антигенный компонент представляет собой вирус или микроорганизм, который в своей форме дикого типа является патогенным для домашней птицы или происходит из него.
12. Вакцина по п. 11, характеризующаяся тем, что указанный вирус или микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вируса инфекционного бронхита, вируса пневмоэнцефалита птиц, вируса инфекционного бурсита (болезни Гамборо), агента, вызывающего анемию у кур, реовируса птиц, Mycoplasma gallisepticum, вируса ринотрахеита индеек, Haemophilus paragallinarum (Coryza), поксвируса кур, вируса энцефаломиелита птиц, вируса синдрома снижения несучести, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса герпеса индеек, Eimeria spp., Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella multocida, Mycoplasma synoviae, Salmonella spp. и E. coli.
13. Применение иммуностимулирующего неметилированного олигодезоксинуклеотида по любому из пп. 1-9 в комбинации с иммунологическим количеством убитого или аттенуированного антигенного компонента или нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный компонент, для предупреждения инфекционного заболевания у домашней птицы, где указанный антигенный компонент является вирусом или микроорганизмом, который в своей форме дикого типа является патогенным для домашней птицы или происходит из него.
14. Применение вектора по п. 10 в комбинации с иммунологическим количеством убитого или аттенуированного антигенного компонента или нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный компонент, для предупреждения инфекционного заболевания у домашней птицы.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161490380P | 2011-05-26 | 2011-05-26 | |
| US61/490,380 | 2011-05-26 | ||
| EP11167602.9 | 2011-05-26 | ||
| EP11167602 | 2011-05-26 | ||
| PCT/EP2012/059797 WO2012160183A1 (en) | 2011-05-26 | 2012-05-25 | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013156635A RU2013156635A (ru) | 2015-07-10 |
| RU2587633C2 true RU2587633C2 (ru) | 2016-06-20 |
Family
ID=47216635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013156635/10A RU2587633C2 (ru) | 2011-05-26 | 2012-05-25 | Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9359602B2 (ru) |
| EP (1) | EP2714907B1 (ru) |
| JP (1) | JP5872684B2 (ru) |
| CN (1) | CN103547674A (ru) |
| BR (1) | BR112013029968A2 (ru) |
| CA (1) | CA2834442A1 (ru) |
| MX (1) | MX346596B (ru) |
| RU (1) | RU2587633C2 (ru) |
| WO (1) | WO2012160183A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201308479B (ru) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012160183A1 (en) * | 2011-05-26 | 2012-11-29 | Intervet International B.V. | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides |
| AR091569A1 (es) | 2012-06-28 | 2015-02-11 | Intervet Int Bv | Receptores de tipo toll |
| AU2014280133B2 (en) | 2013-06-14 | 2016-12-15 | Intervet International B.V. | Pharmaceutical compositions comprising a GPG oligodeoxynucleotide and cyclic di-GMP |
| AR097029A1 (es) * | 2013-07-26 | 2016-02-17 | Intervet Int Bv | Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune |
| HUE063529T2 (hu) | 2014-10-03 | 2024-01-28 | Intervet Int Bv | Szélesspektrumú vakcina madár reovírus ellen |
| JP2018518511A (ja) * | 2015-06-26 | 2018-07-12 | バイエル・アニマル・ヘルス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｍｂｈ | 細胞質ｄｎａ監視分子の調節方法 |
| CN105567782B (zh) * | 2016-01-29 | 2020-08-04 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 鸡胚成纤维细胞在体外筛选CpG寡聚脱氧核苷酸活性分子中的应用 |
| US12239702B2 (en) | 2017-12-04 | 2025-03-04 | Intervet Inc. | Vaccination with replicon particles and oil adjuvant |
| JP7770769B2 (ja) * | 2017-12-15 | 2025-11-17 | エランコ アニマル ヘルス ゲー・エム・ベー・ハー | 免疫刺激性オリゴヌクレオチド |
| WO2019121888A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Intervet International B.V. | Improved diluent for cell-associated alphaherpesvirus vaccine |
| CN113194989B (zh) | 2018-12-20 | 2024-01-30 | 英特维特国际股份有限公司 | 初免-强化免疫接种方案 |
| BR112022010825A2 (pt) | 2019-12-20 | 2022-08-23 | Intervet Int Bv | Vacina de vetor hvt multivalente |
| MX2023007634A (es) | 2020-12-24 | 2023-07-14 | Intervet Int Bv | Vacuna de vector hvt multivalente. |
| US20250352642A1 (en) | 2022-05-05 | 2025-11-20 | Intervet Inc. | New multivalent hvt vector vaccine |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006079291A1 (fr) * | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Changchun Huapu Biotechnology Co., Ltd. | Désoxynucléotide synthétique artificiel monobrin, préparation pour vaccin issue dudit désoxynucléotide et applications |
| RU2413520C2 (ru) * | 2000-06-08 | 2011-03-10 | Интерселл Аг | Вакцинная композиция, содержащая иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002331643B2 (en) * | 2001-08-17 | 2007-10-11 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity |
| EP2196217A1 (en) * | 2001-09-14 | 2010-06-16 | Cytos Biotechnology AG | Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use |
| CN101693890B (zh) * | 2002-12-23 | 2012-09-05 | 戴纳伐克斯技术股份有限公司 | 免疫刺激序列寡核苷酸和使用方法 |
| WO2007020017A1 (en) * | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Bionostra, S.L. | Composition for bird immunization administered by aerosol |
| DE102006031483B4 (de) | 2006-07-07 | 2009-12-24 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Zellulärer Pyrogentest |
| KR20100063048A (ko) * | 2007-07-31 | 2010-06-10 | 더 존스 홉킨스 유니버시티 | 신생물성 또는 감염성 장애의 면역예방 또는 면역치료를 위한 폴리펩티드-핵산 접합체 |
| TWI351288B (en) * | 2008-07-04 | 2011-11-01 | Univ Nat Pingtung Sci & Tech | Cpg dna adjuvant in avian vaccines |
| EP2329845A4 (en) * | 2008-08-18 | 2013-08-14 | Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co Ltd | BIRD GRAPEVIRUS ANTIGEN AND BOOSTER IMMUNIZATION PROCEDURE FOR BIRD FLUID VACCINE IN COMBINATION WITH A MUCOSAL ADJUVAN WITH EFFICACY THROUGH ORAL ADMINISTRATION |
| MX337723B (es) * | 2008-12-09 | 2016-03-15 | Pfizer Vaccines Llc | Vacuna de peptido ch3 de ige. |
| WO2010125480A1 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Pneumococcal vaccine and uses thereof |
| WO2012160183A1 (en) * | 2011-05-26 | 2012-11-29 | Intervet International B.V. | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides |
-
2012
- 2012-05-25 WO PCT/EP2012/059797 patent/WO2012160183A1/en not_active Ceased
- 2012-05-25 BR BR112013029968A patent/BR112013029968A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-05-25 JP JP2014511897A patent/JP5872684B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-05-25 CA CA2834442A patent/CA2834442A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-25 CN CN201280024794.4A patent/CN103547674A/zh active Pending
- 2012-05-25 MX MX2013013800A patent/MX346596B/es active IP Right Grant
- 2012-05-25 RU RU2013156635/10A patent/RU2587633C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-05-25 US US14/119,514 patent/US9359602B2/en active Active
- 2012-05-25 EP EP12724122.2A patent/EP2714907B1/en active Active
-
2013
- 2013-11-11 ZA ZA2013/08479A patent/ZA201308479B/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2413520C2 (ru) * | 2000-06-08 | 2011-03-10 | Интерселл Аг | Вакцинная композиция, содержащая иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды |
| WO2006079291A1 (fr) * | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Changchun Huapu Biotechnology Co., Ltd. | Désoxynucléotide synthétique artificiel monobrin, préparation pour vaccin issue dudit désoxynucléotide et applications |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JACKWOOD D.J., Infectious Bursal Disease: Introduction, The Merck Veterinary Manual, 2007. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5872684B2 (ja) | 2016-03-01 |
| CA2834442A1 (en) | 2012-11-29 |
| BR112013029968A2 (pt) | 2017-01-31 |
| EP2714907B1 (en) | 2016-06-15 |
| ZA201308479B (en) | 2014-08-27 |
| EP2714907A1 (en) | 2014-04-09 |
| US9359602B2 (en) | 2016-06-07 |
| WO2012160183A1 (en) | 2012-11-29 |
| CN103547674A (zh) | 2014-01-29 |
| RU2013156635A (ru) | 2015-07-10 |
| MX346596B (es) | 2017-03-23 |
| JP2014516533A (ja) | 2014-07-17 |
| US20140199345A1 (en) | 2014-07-17 |
| MX2013013800A (es) | 2013-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2587633C2 (ru) | Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды | |
| RU2584588C2 (ru) | Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды | |
| US9364531B2 (en) | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides | |
| Thim et al. | Immunoprotective activity of a Salmonid Alphavirus Vaccine: comparison of the immune responses induced by inactivated whole virus antigen formulations based on CpG class B oligonucleotides and poly I: C alone or combined with an oil adjuvant | |
| US10112985B2 (en) | Toll-like receptors | |
| EP3024935A1 (en) | Acceleration of vector virus induced immune response in avians | |
| US20240287529A1 (en) | Cpg oligodeoxynucleotides as immunostimulants of fish | |
| TW201021827A (en) | Adjuvant and vaccine includes the same | |
| De Silva Senapathi | Comparative innate responses induced by Toll-like receptor (TLR) 7 and 21 ligands against infectious bronchitis virus infection | |
| Thim | Adjuvant combinations with the Toll-like receptor ligand CpG-Protective immune responses in Atlantic salmon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180526 |