RU2586513C1 - RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS) - Google Patents
RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2586513C1 RU2586513C1 RU2015115515/10A RU2015115515A RU2586513C1 RU 2586513 C1 RU2586513 C1 RU 2586513C1 RU 2015115515/10 A RU2015115515/10 A RU 2015115515/10A RU 2015115515 A RU2015115515 A RU 2015115515A RU 2586513 C1 RU2586513 C1 RU 2586513C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- esc
- recombinant
- gene
- strain
- promoter
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 title claims abstract description 25
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 21
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 101100022254 Candida albicans MAL2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101100446038 Mus musculus Fabp5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101150083490 mal1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000737598 recombinant Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 241000926178 Tubulanus polymorphus Species 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 101150035672 DAK gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 16
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 7
- 101150023946 MOX gene Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 101150026818 trp3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 101100208128 Arabidopsis thaliana TSA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010015895 Glycerone kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 244000173297 Medicago polymorpha Species 0.000 description 1
- 241000336025 Ogataea parapolymorpha DL-1 Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150037542 Trpc3 gene Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000005323 carbonate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005547 intrafamily transmission Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000009800 post vaccination immunity Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В (Hepatitis В virus Surface Antigen, HBsAg), имеющего мутацию G145R.The invention relates to the field of biotechnology and genetic engineering, and can be used to create a yeast producer microbial surface antigen of hepatitis B virus (H epatitis B virus S urface A ntigen, HBsAg) , having a mutation G145R.
В последние годы было установлено, что имеет место распространение мутантных форм вируса гепатита В (ВГВ), которые не выявляются тестами иммунодетекции HBsAg и «ускользают» от защитного действия поствакцинального иммунитета. Такие мутантные формы ВГВ, отличительной чертой которых является экспрессия HBsAg с атипичными серологическими свойствами, были названы «ускользающими» («эскейп», «escape») мутантами.In recent years, it has been established that there is a proliferation of mutant forms of hepatitis B virus (HBV), which are not detected by HBsAg immunodetection tests and “escape” the protective effect of post-vaccination immunity. Such mutant forms of HBV, the hallmark of which is the expression of HBsAg with atypical serological properties, have been called “elusive” (“escape”) “mutants”.
Впервые существование таких мутантов ВГВ зарегистрировано в Италии. Позднее было показано (Carman W.F. et al., Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus, Lancet, 1990, v. 336, p. 325-329), что из 1590 лиц, вакцинированных против гепатита В, 32 (2%) оказались инфицированными ВГВ. У всех инфицированных определялось одновременное присутствие в крови и HBsAg, и антител к HBsAg. Вирус, выделенный из крови одного из инфицированных, оказался так называемым «ускользающим» мутантом ВГВ, отличающимся от вируса дикого типа по последовательности нуклеотидов в регионе S генома.For the first time, the existence of such HBV mutants was recorded in Italy. It was later shown (Carman WF et al., Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus, Lancet, 1990, v. 336, p. 325-329) that of 1590 individuals vaccinated against hepatitis B, 32 (2%) were infected with HBV. In all infected, the simultaneous presence in the blood of both HBsAg and antibodies to HBsAg was determined. The virus isolated from the blood of one of the infected turned out to be the so-called “elusive” HBV mutant, which differs from the wild-type virus in the sequence of nucleotides in region S of the genome.
Изменение нуклеотидной последовательности в регионе S генома ВГВ и последующие аминокислотные замены приводят к конформационным изменениям вирусных белков оболочки. Эти изменения способны вызвать пространственные затруднения во взаимодействии антигенных эпитопов с антителами, выработанными на антиген дикого типа, таким образом, позволяя мутантному вирусу преодолевать иммунную защиту и ускользать из-под вакцинного надзора. Особенно важны для ускользания вируса от протективного действия вакцин мутации детерминанты «а», которая локализована между 124-147 аминокислотными остатками (а.о.) в пределах главной гидрофильной петли (100-170 а.о.) (Weber В. Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact, J.Clin. Virol., 2005, v. 32, p. 102-112).A change in the nucleotide sequence in region S of the HBV genome and subsequent amino acid substitutions lead to conformational changes in the viral envelope proteins. These changes can cause spatial difficulties in the interaction of antigenic epitopes with antibodies generated for the wild-type antigen, thus allowing the mutant virus to overcome immune defense and escape from vaccine surveillance. The mutations of the determinant “a”, which is localized between 124-147 amino acid residues (a.o.) within the main hydrophilic loop (100-170 a.o.) (Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact, J. Clin. Virol., 2005, v. 32, p. 102-112).
Наиболее важной среди серологически значимых аминокислотных замен является замена глицина в положении 145 на аргинин (G145R), вызванная точечной мутацией в позиции 587 нуклеотидной последовательности кодирующей области гена HBsAg дикого типа. Этот мутант стабилен на протяжении долгого времени и может сохранять способность к репликации несколько лет. Он обладает способностью к горизонтальной передаче другим людям. Факты внутрисемейной передачи были отмечены у 3-х из 10-ти носителей мутанта G145R, несмотря на присутствие в высоких концентрациях антител к HBsAg в крови всех заразившихся (Oon C.J. et al., Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis В virus surface antigen mutant G145R, J. Infect., 2000, v. 41, p. 260-26400). Возникновение этой мутации связывают с прессом вследствие вакцинации или специфической иммунотерапии. Частота мутаций G145R может колебаться от 0,4 до 5%. При динамическом наблюдении и определении мутантных форм среди новорожденных исследователи Тайваня выявили увеличение числа детей, инфицированных мутантными штаммами ВГВ. Так, в 1984 г. оно составило 7,8%, в 1989 г. - 19,6%, в 1994 г. - 28,1% (Hsu Ну et al., Hepatology, 1999, v. 30(5), p. 1312-7).The most important among serologically significant amino acid substitutions is the replacement of glycine at position 145 with arginine (G145R), caused by a point mutation at position 587 of the nucleotide sequence of the coding region of the wild-type HBsAg gene. This mutant is stable over time and can maintain replication ability for several years. He has the ability to horizontally transmit to other people. Intra-family transmission facts were noted in 3 out of 10 carriers of the G145R mutant, despite the presence of high concentrations of antibodies to HBsAg in the blood of all infected (Oon CJ et al., Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis B virus surface antigen mutant G145R, J. Infect., 2000, v. 41, p. 260-26400). The occurrence of this mutation is associated with the press due to vaccination or specific immunotherapy. The mutation frequency of G145R can range from 0.4 to 5%. During dynamic observation and determination of mutant forms among newborns, Taiwan researchers revealed an increase in the number of children infected with mutant HBV strains. So, in 1984 it amounted to 7.8%, in 1989 - 19.6%, in 1994 - 28.1% (Hsu Well et al., Hepatology, 1999, v. 30 (5), p. 1312-7).
На территории РФ, где широко распространены генотип D и серотип «ау», также выявлена циркуляция мутантных штаммов ВГВ, экспрессирующих HBsAg разных серотипов («ау» и «ad») с заменами G145R. Распространенность серологически значимой мутации G145R в московской области среди хронических носителей ВГВ составила 0,12% (А.И. Баженов и др. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2011, №5, с. 49-53). Учитывая высокий процент носительства ВГВ в человеческой популяции, выявленное количество мутантов ВГВ представляется значительным.In the territory of the Russian Federation, where genotype D and serotype “ay” are widespread, circulation of mutant HBV strains expressing HBsAg of different serotypes (“ay” and “ad”) with G145R substitutions is also found. The prevalence of the serologically significant mutation G145R in the Moscow region among chronic carriers of HBV was 0.12% (A.I. Bazhenov et al. Epidemiology and Vaccine Prevention, 2011, No. 5, pp. 49-53). Given the high percentage of HBV carriage in the human population, the detected number of HBV mutants appears to be significant.
Таким образом, «ускользающие» мутанты ВГВ G145R, представляя собой реплицирующие инфекционные вирусные мутанты, избегающие нейтрализующий иммунитет при вакцинации, основанной на нормальном HBsAg, могут быть причиной заболевания вирусным гепатитом. Существование и распространение «ускользающих» мутантов создает серьезную проблему как для донорства, так и для эффективности современной стратегии вакцинации. В связи с этим существует необходимость в создании вакцин нового поколения, полезных для профилактики гепатита В, вызываемого мутантами ВГВ.Thus, the “elusive” HBV G145R mutants, which are replicating infectious viral mutants that avoid neutralizing immunity in vaccines based on normal HBsAg, can cause viral hepatitis. The existence and spread of “elusive” mutants poses a serious problem for both donation and the effectiveness of a modern vaccination strategy. In this regard, there is a need to create a new generation of vaccines useful for the prevention of hepatitis B caused by HBV mutants.
Затруднения, препятствующие созданию эффективных вакцин для профилактики гепатита В, вызываемого мутантным ВГВ G145R, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продукции рекомбинантного HBsAg, содержащего мутацию G145R, и обладающего высокими иммуногенными свойствами.Difficulties preventing the development of effective vaccines for the prevention of hepatitis B caused by mutant HBV G145R are associated with the development of optimal expression systems for the production of recombinant HBsAg containing the G145R mutation and possessing high immunogenic properties.
Известно получение полипептида HBsAg, имеющего аминокислотную последовательность с заменой в позиции 145 глицина на аргинин рекомбинантным путем (US 7038035, 02.05.2006). Из крови пациента (ребенок из Китая) был изолирован мутантный вирус гепатита В, несущий мутацию в последовательности HBsAg, которая была обусловлена заменой в нуклеотидной последовательности в позиции 587-589. Геном выделенного мутантного вируса относился к «adw» субтипу. Чтобы получить мутантный белок HBsAg был сконструирован экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность с AGA в позиции 587-589, соответствующую последовательности изолированного штамма вируса. Сконструированный вектор интродуцировали в подходящие клетки-хозяева, в частности клетки млекопитающих. Полученный путем культивирования рекомбинантных клеток млекопитающих мутантный HBsAg имеет кажущуюся молекулярную массу 23 kDa в отличие от 25 kDa HBsAg дикого типа и обладает более высокой иммуногенностью.It is known to obtain an HBsAg polypeptide having an amino acid sequence with substitution at position 145 of glycine for arginine by the recombinant route (US 7038035, 02/02/2006). A mutant hepatitis B virus was isolated from the blood of a patient (a child from China), carrying a mutation in the HBsAg sequence, which was caused by a substitution in the nucleotide sequence at positions 587-589. The genome of the isolated mutant virus belonged to the "adw" subtype. To obtain the mutant HBsAg protein, an expression vector was constructed containing the nucleotide sequence with AGA at position 587-589 corresponding to the sequence of an isolated virus strain. The constructed vector was introduced into suitable host cells, in particular mammalian cells. Mutant HBsAg obtained by culturing recombinant mammalian cells has an apparent molecular weight of 23 kDa as opposed to 25 kDa wild type HBsAg and has a higher immunogenicity.
Thomas Н.С. et al. в ряде патентов охарактеризовали вариант белка HBsAg с модифицированной детерминантой «а», в которой аминокислота глицин в позиции 145 заменена на аргинин (US 5639637, 1997), последовательность ДНК, кодирующую данный вариант белка (US 5854024, 1998), дрожжевой экспрессирующий вектор, включающий указанную последовательность (US 5,851823, 1998), набор для диагностики антител против варианта HBsAg (US 5989865, 1999), антитело против варианта HBsAg (US 6099840, 2000).Thomas N.S. et al. in a number of patents, a variant of the HBsAg protein with a modified determinant “a” was characterized, in which the amino acid glycine at position 145 was replaced by arginine (US 5639637, 1997), the DNA sequence encoding this protein variant (US 5854024, 1998), a yeast expression vector including the specified sequence (US 5.851823, 1998), a kit for the diagnosis of antibodies against the HBsAg variant (US 5989865, 1999), an antibody against the HBsAg variant (US 6099840, 2000).
Ближайшим аналогом является патент US 5639637, 1997, в котором описано получение варианта HBsAg, имеющего модифицированную детерминанту «а» с заменой глицина в положении 145 на аргинин, путем экспрессии кодирующего его гена в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Первоначально получали последовательность ДНК, кодирующую HBsAg серотипа «ау», которая содержала точечную мутацию, приводящую к замене кодона GGA, кодирующего глицин на кодон AGA, кодирующий аргинин, в позиции 145 полипептида HBsAg. Затем конструировали плазмиду pRIT13557, содержащую полученную последовательность, и этой плазмидой трансформировали дрожжевые клетки S. cerevisiae штамма DC5-cir0 (АТСС20820). После культивирования рекомбинантных дрожжевых клеток (Y1648) полученный вариант HBsAg выделяли, очищали и анализировали радиоиммунным и электронно-микроскопическим методами. Установлено, что антигенность полученного варианта отличается от таковой HBsAg дикого типа.The closest analogue is US Pat. No. 5,639,637,1997, which describes the preparation of an HBsAg variant having a modified determinant “a” replacing glycine at position 145 with arginine by expressing the gene encoding it in Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Initially, the DNA sequence encoding the HBsAg serotype “au” was obtained, which contained a point mutation, resulting in the replacement of the GGA codon encoding glycine with the AGA codon encoding arginine at position 145 of the HBsAg polypeptide. The plasmid pRIT13557 containing the obtained sequence was then constructed, and the yeast cells of S. cerevisiae strain DC5-cir 0 (ATCC20820) were transformed with this plasmid. After cultivation of recombinant yeast cells (Y1648), the resulting HBsAg variant was isolated, purified and analyzed by radio-immune and electron-microscopic methods. It was established that the antigenicity of the obtained variant differs from that of wild-type HBsAg.
Недостатки систем экспрессии HBsAg на основе S. cerevisiae связаны с проблемами достижения высокого выхода и низкой себестоимости целевого белка. Для увеличения уровня экспрессии, как правило, используют автономно реплицирующиеся мультикопийные векторы, требующие специальных селективных сред для предотвращения накопления бесплазмидных клеток в процессе культивирования штамма-продуцента. Это осложняет получение достаточного количества биомассы на единицу объема культуры. Другой проблемой использования автономно реплицирующегося экспрессионного вектора является существенная вариабельность его копийности в отдельных клетках культуры. В результате, в клетках с низкой копийностью вектора уровень экпрессии гена оказывается недостаточно высоким, а слишком высокая копийность может приводить к неспособности белка принять правильную конформацию из-за его гипер-продукции, и только часть клеток культуры содержит оптимальное количество копий экспрессионного вектора, способное обеспечить максимальный выход целевого белка. В качестве индуцируемого промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, как правило, используют промотор гена GAL1, требующий для индукции использование больших количеств хорошо очищенной галактозы, являющейся достаточно дорогим веществом.The disadvantages of S. cerevisiae-based HBsAg expression systems are associated with problems in achieving high yield and low cost of the target protein. Autonomously replicating multicopy vectors, which require special selective media to prevent the accumulation of non-plasmid cells during the cultivation of the producer strain, are usually used to increase the level of expression. This makes it difficult to obtain a sufficient amount of biomass per unit volume of culture. Another problem of using an autonomously replicating expression vector is the significant variability of its copy number in individual cells of the culture. As a result, in cells with a low copy number of the vector, the level of gene expression is not high enough, and too high copy number can lead to the inability of the protein to accept the correct conformation due to its hyper-production, and only part of the culture cells contains the optimal number of copies of the expression vector, which can provide maximum yield of the target protein. As an inducible promoter providing a high level of expression of the recombinant protein, the GAL1 gene promoter is usually used, which requires the use of large amounts of well-purified galactose, which is a rather expensive substance, for induction.
Задачей изобретения является создание эффективного микробиологического дрожжевого штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), антигенные свойства которого позволяли бы использовать его в качестве вакцины для защиты от мутантной формы "Escape" вируса гепатита В. Под эффективностью понимается возможность получения целевого продукта, обладающего необходимыми биологическими свойствами (правильная конформация, иммуногенность, чистота) и низкой себестоимостью.The objective of the invention is to provide an effective microbiological yeast strain producing a surface antigen of hepatitis B virus, having the G145R mutation (ESC-Ag), the antigenic properties of which would allow using it as a vaccine to protect against the mutant form of the Escape virus of hepatitis B. By efficiency is meant the ability to obtain the target product with the necessary biological properties (proper conformation, immunogenicity, purity) and low cost.
Задача решена тем, что, согласно изобретению, в первом варианте для получения рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена метанолоксидазы (МОХ Н. polymorpha) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма Н. polymorpha DL1-L (Sohn J.H. et al., J Bacteriol. 1996, 178:4420-4428). Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки клонов, полученных в результате этой процедуры, на способность синтезировать белок ESC-Ag, был выделен трансформант с наибольшей продуктивностью. Т.к. искусственный ген интегрирован в геном дрожжей, т.е. находится в составе одной из хромосом, это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора МОХ, позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка ESC-Ag при более простых способах получения культур высокой плотности. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ11/pEMmulti-7. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.The problem is solved in that, according to the invention, in the first embodiment, to obtain a recombinant producer strain of hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag), a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of a promoter gene methanol oxidase (MOX N. polymorpha) and a selective marker (gene LEU2 S. cerevisiae) are integrated into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L (Sohn JH et al., J Bacteriol. 1996, 178: 4420-4428). To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of testing the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize ESC-Ag protein, the transformant with the highest productivity was isolated. Because the artificial gene is integrated into the genome of yeast, i.e. It is part of one of the chromosomes, this ensures high mitotic stability of the strain, making it possible to optimize the conditions for its cultivation without taking into account the risk of accumulation of cells that have lost the ability to synthesize foreign protein. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MOX promoter allows to achieve higher levels of synthesis of the recombinant ESC-Ag protein with simpler methods for producing high density cultures. The strain was deposited May 20, 2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT11 / pEMmulti-7. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.
Согласно изобретению, во втором варианте рекомбинантный штамм-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), получали интеграцией в геном штамма DL1-L (Н. polymorpha) одной копии синтетической последовательности ДНК, кодирующей ESC-Ag, под контролем промотора гена МОХ. Для этого в качестве реципиента был использован штамм DLT2, полученный в результате инактивации в штамме DL1-L генов МОХ и TRP3 интеграцией селективного маркера, гена LEU2 S. cerevisiae, аналогично тому, как это было сделано ранее (Bogdanova A.I., Agaphonov М.О. et al., Yeast, 1995, Apr. 15; 11 (4): 343-53). Это давало возможность с высокой эффективностью отбирать трансформанты, в которых интеграция синтетической последовательности происходила по механизму гомологичной рекомбинации с последовательностями локуса гена МОХ, в результате чего происходила замена кодирующей области этого гена на последовательность, кодирующую ESC-Ag. Уровень экспрессии ESC-Ag, который достигается у полученного таким образом штамма, подходит для увеличения доли антигена во фракции растворимых клеточных белков. Поскольку такой штамм содержит только одну копию рекомбинантного гена, интегрированную в строго определенный локус генома, реплика этого гена может быть получена при помощи полимеразной цепной реакции для контроля отсутствия в нем мутаций, которые могли образоваться в процессе его введения в геном дрожжей или при культивировании штамма-продуцента. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ12/pEMmono-4. Штамм является новым, и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in a second embodiment, a recombinant strain producing the hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag) was obtained by integrating into the genome of strain DL1-L (H. polymorpha) one copy of the synthetic DNA sequence encoding ESC-Ag under control of the promoter of the MOX gene. For this, the DLT2 strain was used as a recipient, obtained by inactivation of the MOX and TRP3 genes in the DL1-L strain by integration of the selectable marker, the S. cerevisiae LEU2 gene, similarly to what was done earlier (Bogdanova AI, Agaphonov M.O. et al., Yeast, 1995, Apr. 15; 11 (4): 343-53). This made it possible to select transformants with high efficiency in which the synthetic sequence was integrated by the mechanism of homologous recombination with the MOX gene locus sequences, as a result of which the coding region of this gene was replaced by a sequence encoding ESC-Ag. The level of expression of ESC-Ag, which is achieved in the thus obtained strain, is suitable for increasing the proportion of antigen in the fraction of soluble cellular proteins. Since such a strain contains only one copy of the recombinant gene integrated into a strictly defined locus of the genome, a replica of this gene can be obtained using a polymerase chain reaction to control the absence of mutations in it that could have formed during its introduction into the yeast genome or during cultivation of the strain producer. The strain was deposited on 05/20/2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT12 / pEMmono-4. The strain is new, and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.
Согласно изобретению, в третьем варианте для получения рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена мальтазы (MALI Н. polymorpha) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма Н. polymorpha DL1-L. Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки полученных в результате этой процедуры клонов на способность синтезировать белок поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора MALI, депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером KBT14/pEMmalt-8. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in a third embodiment, to obtain a recombinant producer strain of hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag), a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of the maltase gene promoter (MALI N. polymorpha) and a selective marker (LEU2 gene of S. cerevisiae) are integrated into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L. To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of testing the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize the hepatitis B virus surface antigen protein having the G145R mutation, a transformant that best meets the required properties was isolated. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MALI promoter was deposited on May 20, 2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT14 / pEMmalt-8. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.
Согласно изобретению, в 4-м варианте для получения рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), в геном штамма DL1-L Н. polymorpha последовательно интегрируют две экспрессионные кассеты, содержащие по одной копии нужного гена. Первая кассета содержит фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена МОХ (ген метанолоксидазы). Интеграция этой кассеты проходила по механизму гомологичной интеграции в локус гена МОХ. Вторая экспрессионная кассета содержит аналогичный ген ESC-Ag, но под контролем промотора гена DAK (ген кодирует дигидроксиацетон киназу) дрожжей Н. polymorpha. Интеграция этой кассеты проходила по механизму гомологичной интеграции в локус гена LEU2. В результате трансформации получают рекомбинантный штамм, содержащий одну копию целевого гена ESC-Ag под контролем промотора DAK и одну копию под контролем промотора МОХ. При этом искусственные гены интегрированы непосредственно в геном штамма-продуцента, т.е. находятся в составе хромосом дрожжей Н. polymorpha. Это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Кроме того, наличие в каждом из локусов интеграции только одной копии рекомбинантного гена с уникальной промоторной и терминаторной областью позволяет контролировать отсутствие мутаций этого гена в процессе его введения в геном и при культивировании штамма. Контроль за отсутствием мутаций осуществляют путем анализа нуклеотидной последовательности продуктов полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных специфическим последовательностям, фланкирующим кодирующую область рекомбинантного гена в каждом из локусов интеграции. Использование экспрессионных кассет с двумя разными промоторами (МОХ и DAK), максимальная активность которых достигается при разных условиях культивирования, обеспечивает большую равномерность синтеза продукта в процессе культивирования штамма. При этом не превышается уровень синтеза белка, который может привести к возможному нарушению эффективности укладки и, как следствие, снижению продуктивности штамма. В результате отбора клонов, способных синтезировать белок ESC-Ag, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-14/pEMmono2. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in the 4th embodiment, in order to obtain a recombinant producer strain of hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag), two expression cassettes, one copy of the desired gene, are sequentially integrated into the genome of the DL1-L strain H. polymorpha . The first cassette contains a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of the promoter of the MOX gene (methanol oxidase gene). The integration of this cassette took place according to the mechanism of homologous integration into the locus of the MOX gene. The second expression cassette contains a similar ESC-Ag gene, but under the control of the DAK gene promoter (the gene encodes the dihydroxyacetone kinase) of H. polymorpha yeast. The integration of this cassette took place according to the mechanism of homologous integration into the LEU2 gene locus. The transformation produces a recombinant strain containing one copy of the target ESC-Ag gene under the control of the DAK promoter and one copy under the control of the MOX promoter. Moreover, the artificial genes are integrated directly into the genome of the producer strain, i.e. are part of the chromosomes of the yeast H. polymorpha. This ensures high mitotic stability of the strain, making it possible to optimize the conditions for its cultivation without taking into account the risk of accumulation of cells that have lost the ability to synthesize a foreign protein. In addition, the presence in each of the integration loci of only one copy of a recombinant gene with a unique promoter and terminator region allows us to control the absence of mutations of this gene during its introduction into the genome and during cultivation of the strain. The absence of mutations is monitored by analyzing the nucleotide sequence of the products of the polymerase chain reaction using primers complementary to specific sequences flanking the coding region of the recombinant gene at each of the integration loci. The use of expression cassettes with two different promoters (MOX and DAK), the maximum activity of which is achieved under different cultivation conditions, provides a more uniform synthesis of the product during the cultivation of the strain. At the same time, the level of protein synthesis is not exceeded, which can lead to a possible violation of the laying efficiency and, as a result, a decrease in the strain productivity. As a result of the selection of clones capable of synthesizing the ESC-Ag protein, a transformant that best meets the required properties was isolated. The strain was deposited 05/20/2014 in the collection of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT-14 / pEMmono2. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.
Полученные рекомбинантные штаммы-продуценты КБТ-11/pEMmulti-7, КБТ-12/pEMmono-4, KBT-14/pEMmalt-8 и КБТ-14/pEMmono2 могут быть использованы для получения с высоким выходом белка ESC-Ag в виде вирусоподобных частиц, обладающего антигенными свойствами, необходимыми для его использования в качестве основного компонента вакцины для защиты от мутантного варианта Escape вируса гепатита В человека. Образование вирусоподобных частиц подтверждали с использованием метода электронной микроскопии и гель-фильтрационной хроматографии.The resulting recombinant producer strains KBT-11 / pEMmulti-7, KBT-12 / pEMmono-4, KBT-14 / pEMmalt-8 and KBT-14 / pEMmono2 can be used to obtain high-yield ESC-Ag protein in the form of virus-like particles possessing the antigenic properties necessary for its use as the main component of the vaccine for protection against the mutant variant of Escape human hepatitis B virus. The formation of virus-like particles was confirmed using electron microscopy and gel filtration chromatography.
Технический результат предложенного изобретения заключается в повышении иммуногенности и серологического соответствия природному мутанту полученного рекомбинантного белка Esc-Ag.The technical result of the proposed invention is to increase the immunogenicity and serological compliance of the natural mutant of the obtained recombinant protein Esc-Ag.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.The invention can be illustrated by the following examples.
В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и Hansenula polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue Н. et al., Gene, 1990, 96:23-28 и Bogdanova A.I. et al., Yeast, 1995, 11(4):343-53 соответственно). Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали полимеразу Pwo (Roche). Синтез олигонуклеотидов, получение фрагмента ДНК, содержащего последовательность, кодирующую ESC-Ag (SEQ ID NO: 1), а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО "Евроген" г. Москва.In the given examples, all genetic engineering operations were performed according to standard procedures and instructions of companies producing enzymes and sets for manipulating DNA in vitro. The transformation of Escherichia coli and Hansenula polymorpha cells was carried out according to the previously described methods (Inoue H. et al., Gene, 1990, 96: 23-28 and Bogdanova AI et al., Yeast, 1995, 11 (4): 343-53, respectively) . For polymerase chain reaction (PCR), Pwo polymerase (Roche) was used. The synthesis of oligonucleotides, the preparation of a DNA fragment containing the sequence encoding ESC-Ag (SEQ ID NO: 1), as well as the determination of the nucleotide sequence, were carried out by ZAO Evrogen, Moscow.
Пример 1. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ.Example 1. Obtaining a strain of N. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter.
Получали плазмиду pIR4-7 (Рисунок 1; SEQ ID NO: 2), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag. Этот ген включал промоторную область гена МОХ Н. polymorpha (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4338-4862) и синтетическую последовательность (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4863-5554), содержащую открытую рамку считывания ESC-Ag (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4874-5551), последовательность которой совпадала с последовательностью открытой рамки считывания гена HBsAg "ayw2" дикого типа за исключением позиции 433, в которой вместо остатка гуанина находился остаток аденина (SEQ ID NO: 2, нуклеотидная позиция 5306). Помимо этого гена, плазмида pIR4-7 состояла из: (а) фрагмента плазмиды рАМ619 (Agaphonov and Alexandrov, FEMS Yeast Res., 2014, 14(7): 1048-54), включающего бактериальный селективный маркер устойчивости к ампициллину и дрожжевой селективный маркер - модифицированный ген LEU2 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 895-4337), (б) фрагмента плазмиды AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15 (7): 541-51), несущего терминатор транскрипции и автономно-реплицирующуюся последовательность Н. polymorpha, (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 7-894) и (в) линкерной последовательности (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 1-6).The plasmid pIR4-7 (Figure 1; SEQ ID NO: 2) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide. This gene included the promoter region of the M. polymorpha MOX gene (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4338-4862) and a synthetic sequence (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4863-5554) containing an open reading frame of ESC-Ag (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4874-5551), the sequence of which coincided with the open reading frame of the wild-type HBsAg "ayw2" gene with the exception of position 433, in which instead of the guanine residue was the adenine residue (SEQ ID NO: 2, nucleotide position 5306) . In addition to this gene, plasmid pIR4-7 consisted of: (a) a fragment of plasmid pAM619 (Agaphonov and Alexandrov, FEMS Yeast Res., 2014, 14 (7): 1048-54), including a bacterial selective marker of ampicillin resistance and a yeast selective marker - a modified LEU2 gene of S. cerevisiae (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 895-4337), (b) a fragment of plasmid AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15 (7): 541-51) carrying a transcription terminator and an autonomously replicating sequence of H. polymorpha, (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 7-894) and (c) a linker sequence (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 1-6).
Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pIR4-7. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отобрали самые крупные и снова посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отобрали для анализа продукции белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-11/pEMmulti-7.Strain DL1-L was transformed with plasmid pIR4-7. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were seeded onto a solid leucine-free medium with a draining stroke to obtain individual colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. For one such subclone, several independent transformants were selected for analysis of ESC-Ag protein production. One of these transformants was designated KBT-11 / pEMmulti-7.
Пример 2. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего одну копию рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ.Example 2. Obtaining a strain of H. polymorpha containing one copy of a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter.
Получали плазмиду рАМ618 (Рисунок 2А; SEQ ID NO: 3), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 4188-5715). После терминирующего кодона этого гена находился фрагмент локуса гена МОХ, включающий его терминаторную область и часть гена TRP3 (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 1-1358). Помимо этих последовательностей плазмида рАМ618 содержала векторную последовательность для ее поддержания в клетках Е. coli, состоящую из фрагмента PciI-StuI плазмиды pUK21 (Vieira J. Et al., Gene. 1991, 100:189-94) (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 3818-4187) и фрагмента Ecl136II-PciI плазмиды pBlueScriptKS+ (Stratagen, USA) (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 1359-3817).The plasmid pAM618 (Figure 2A; SEQ ID NO: 3) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide under the control of the MOX promoter (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 4188-5715). After the termination codon of this gene, there was a fragment of the MOX gene locus, including its termination region and part of the TRP3 gene (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 1-1358). In addition to these sequences, the pAM618 plasmid contained a vector sequence for its maintenance in E. coli cells, consisting of a PciI-StuI fragment of the pUK21 plasmid (Vieira J. Et al., Gene. 1991, 100: 189-94) (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 3818-4187) and an Ecl136II-PciI fragment of the plasmid pBlueScriptKS + (Stratagen, USA) (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 1359-3817).
Штамм DLT2 трансформировали смесью фрагментов плазмиды рАМ618, гидролизованной рестриктазами Ec1136II и XhoI. Трансформантов отбирали на среде, содержащей лейцин и не содержащей триптофан. В локусе МОХ штамма DLT2 интегрирован селективный маркер, ген LEU2 S. cerevisiae, обеспечивающий штамму способность расти на среде без лейцина. При интеграции рекомбинантного гена в локус МОХ путем двойного кроссинговера, ген LEU2 должен замещаться (Рисунок 2Б). Поэтому полученные трансформанты проверяли на способность расти на среде, не содержащей лейцин. Неспособность трансформантов расти на среде без лейцина свидетельствовала об интеграции рекомбинантного гена в локус МОХ путем двойного кроссинговера. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-12/pEMmono-4.The DLT2 strain was transformed with a mixture of fragments of plasmid pAM618 hydrolyzed with restriction enzymes Ec1136II and XhoI. Transformants were selected on medium containing leucine and not containing tryptophan. A selective marker, the S. cerevisiae LEU2 gene, is integrated into the MOX locus of strain DLT2, which provides the strain with the ability to grow on a medium without leucine. When a recombinant gene is integrated into the MOX locus by double crossing over, the LEU2 gene must be replaced (Figure 2B). Therefore, the obtained transformants were tested for their ability to grow on a medium not containing leucine. The inability of transformants to grow on a medium without leucine testified to the integration of the recombinant gene into the MOX locus by double crossing over. One of these transformants was designated KBT-12 / pEMmono-4.
Пример 3. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора MAL1.Example 3. Obtaining a strain of N. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the MAL1 promoter.
Получали плазмиду pMAL-ESCl (Рисунок 3; SEQ ID NO: 4), которая отличалась от плазмиды pIR4-7 тем, что фрагмент, несущий промотор МОХ (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4390-4862) был заменен на фрагмент, несущий промотор гена MAL1 Н. polymorpha DL1 (SEQ ID NO: 4, нуклеотидные позиции 1-1326).The plasmid pMAL-ESCl (Figure 3; SEQ ID NO: 4) was obtained, which differed from the plasmid pIR4-7 in that the fragment bearing the MOX promoter (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4390-4862) was replaced by a fragment carrying MAL1 gene promoter H. polymorpha DL1 (SEQ ID NO: 4, nucleotide positions 1-1326).
Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pMAL-ESC1. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов рассевали истощающим штрихом на твердую среду без лейцина, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отбирали самые крупные и снова сеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отбирали для анализа продукции белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-14/pEMmalt-8.Strain DL1-L was transformed with plasmid pMAL-ESC1. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were scattered with an exhausting touch on a solid medium without leucine to obtain separate colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. One such subclone of several independent transformants was selected for analysis of ESC-Ag protein production. One of these transformants was designated KBT-14 / pEMmalt-8.
Пример 4. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего одну копию рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ и одну копию под контролем промотора DAK.Example 4. Obtaining a strain of H. polymorpha containing one copy of a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter and one copy under the control of the DAK promoter.
Получали плазмиду pDAK-ESC1 (Рисунок 4; SEQ ID NO: 5), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag, под контролем промотора DAK Н. polymorpha DL-1 (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 4404-5727) и последовательность вектора AMIpLD1 (Agaphonov et al., Yeas,. 1999, 15 (7): 541-51) (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 43-4403), включая дрожжевой селективный маркер ген LEU2 Н. polymorpha с делецией в промоторной области, а также линкерную последовательность (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 1-42).The plasmid pDAK-ESC1 (Figure 4; SEQ ID NO: 5) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide under the control of the DAK promoter polymorpha DL-1 (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 4404-5727) and the sequence of the vector AMIpLD1 (Agaphonov et al., Yeas, 1999, 15 (7): 541-51) (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 43-4403), including the yeast selective marker H. polymorpha deletion LEU2 gene with a deletion in the promoter region, as well as the linker sequence (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 1-42).
Штамм КБТ-12/pEMmono-4 (см. Пример 2) трансформировали плазмидой pDAK-ESC1, гидролизованной рестриктазой BstEII. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. У быстро растущих трансформантов проверяли продукцию белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-14/pEMmono-2.Strain KBT-12 / pEMmono-4 (see Example 2) was transformed with the plasmid pDAK-ESC1 hydrolyzed by BstEII restrictase. Transformants were selected on leucine-free medium. In fast-growing transformants, ESC-Ag protein production was tested. One of these transformants was designated KBT-14 / pEMmono-2.
Пример 5. Культивирование штаммов Н. polymorpha КБТ 11/pEMmulti-7, КБТ 12/pEMmono-4 и КБТ-14/pEMmono2.Example 5. Cultivation of strains of H. polymorpha KBT 11 / pEMmulti-7, KBT 12 / pEMmono-4 and KBT-14 / pEMmono2.
Ферментацию штаммов-продуцентов дрожжей Н. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе культивирования в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бакто-пептона и 4% глицерина. Процесс вели до истощения источника углерода в питательной среде и прекращения роста биомассы. На втором этапе культивирование проводили с подпиткой культуры путем непрерывной подачи 30%-ного раствора дрожжевого экстракта. Одновременно с подпиткой добавляли индуктор до концентрации 0.5-0.8% и поддерживали на этом уровне в течение 48-72 ч. Продолжительность всего процесса составляла около 96 ч.The fermentation of strains producing yeast H. polymorpha was carried out in two stages. At the first stage of cultivation in the fed-batch mode at a temperature of 30 ° C, biomass was increased in a culture medium containing 4% yeast extract, 2% bacto-peptone and 4% glycerol. The process was conducted until the carbon source in the nutrient medium was depleted and the biomass stopped growing. In the second stage, the cultivation was carried out with feeding the culture by continuous supply of a 30% solution of yeast extract. Simultaneously with the replenishment, the inductor was added to a concentration of 0.5-0.8% and maintained at this level for 48-72 hours. The duration of the whole process was about 96 hours.
Пример 6. Культивирование штамма Н. polymorpha КБТ-14/pEMmalt-8, содержащего рекомбинантный ген ESC-Ag под контролем промотора MAL1.Example 6. Cultivation of H. polymorpha strain KBT-14 / pEMmalt-8 containing the recombinant ESC-Ag gene under the control of the MAL1 promoter.
Ферментацию штамма-продуцента KBT-14/pEMmalt-8 проводили в тех же условиях, что и штаммы с промоторами МОХ и DAK (Пример 5). За исключением того, что на втором этапе культивирования в качестве индуктора использовали 40% (вес.//об.) раствор сахарозы, который добавляли порциями по 0.5% (вес сахарозы / объем культуральной жидкости) через каждые два часа в течение 48-72 ч.The fermentation of the producer strain KBT-14 / pEMmalt-8 was carried out under the same conditions as the strains with MOX and DAK promoters (Example 5). Except that in the second stage of cultivation, a 40% (weight./vol.) Sucrose solution was used as an inductor, which was added in 0.5% portions (sucrose weight / volume of culture liquid) every two hours for 48-72 hours .
Пример 7. Выделение и очистка рекомбинантного белка ESC-Ag из клеток H. polymorpha.Example 7. Isolation and purification of recombinant ESC-Ag protein from H. polymorpha cells.
После ферментации белок ESC-Ag (аминокислотная последовательность - SEQ ID NO: 6) выделяли согласно опубликованной методике (Lunsdorf Н. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10: 48) с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до исходного объема в карбонатно-солевом буферном растворе для экстракции (50 mM NaHCO3, 150 mM NaCl, рН 8.0) и снова осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С. Полученную таким образом отмытую биомассу ресуспендировали в буферном растворе для экстракции с добавлением 1.7 mM EDTA и 2 mM PMSF до концентрации 400 г влажных клеток на литр суспензии. Далее клетки разрушали в проточном дезинтеграторе Dyno-Mill типа KDL при температуре 5-10°С, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Для удаления клеточного дебриса полученный гомогонизат центрифугировали при 4000g в течение 60 мин при 4°С.After fermentation, the ESC-Ag protein (amino acid sequence — SEQ ID NO: 6) was isolated according to a published procedure (Lunsdorf, H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10: 48) with slight changes. Cells from the culture fluid were besieged by centrifugation at 4000 g for 30 min at 4 ° C. The precipitated biomass was resuspended to the initial volume in carbonate-salt extraction buffer (50 mM NaHCO 3 , 150 mM NaCl, pH 8.0) and again precipitated by centrifugation at 4000 g for 30 min at 4 ° C. The washed biomass thus obtained was resuspended in extraction buffer with 1.7 mM EDTA and 2 mM PMSF added to a concentration of 400 g wet cells per liter of suspension. Next, the cells were destroyed in a Dyno-Mill flow disintegrator of the KDL type at a temperature of 5-10 ° C using glass balls with a diameter of 0.5-0.7 mm. To remove cell debris, the resulting homogonizate was centrifuged at 4000 g for 60 min at 4 ° C.
Полученный осветленный гомогенизат подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на системе Sartocon через мембрану с порогом отсечения 300 kDa (Sartorius, Германия), одновременно концентрировали и переводили в фосфатно-солевой буферный раствор (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 6.8). При этом отделяется большая часть примесных низкомолекулярных белков.The resulting clarified homogenizate was subjected to tangential flow ultrafiltration on a Sartocon system through a membrane with a cutoff threshold of 300 kDa (Sartorius, Germany), was simultaneously concentrated and transferred to phosphate-buffered saline (10 mM NaH 2 PO 4 , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, pH 6.8). In this case, most of the impurity low molecular weight proteins are separated.
Дальнейшую очистку проводили методом адсорбционной хроматографии на колонке с макропористым стеклом (МПС) с использованием технологии Streamline (хроматография в восходящем потоке). Концентрированный раствор ESC-Ag, полученный после ультрафильтрации, наносили на колонку при скорости 1 мл/мин, промывали 3-4 объемами фосфатно-солевого буферного раствора (рН 6.8) и элюировали карбонатным буфером (50 mM NaHCO3, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 9.5).Further purification was carried out by adsorption chromatography on a column with macroporous glass (MPS) using Streamline technology (upstream chromatography). The concentrated ESC-Ag solution obtained after ultrafiltration was applied to the column at a speed of 1 ml / min, washed with 3-4 volumes of phosphate-buffered saline (pH 6.8) and eluted with carbonate buffer (50 mM NaHCO 3 , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, pH 9.5).
Объединенные фракции, содержащие ESC антиген (определяли по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембране 300 KDa и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте плотности сахарозы (20-50% вес./вес.). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan) в фосфатном буферном растворе (10 mM NaH2PO4, 0.03% Tween-20, рН 7.2).The pooled fractions containing the ESC antigen (determined by immunoblot and SDS-PAGE) were concentrated by tangential flow ultrafiltration on a 300 KDa membrane and separated by zonal ultracentrifugation (Beckman Coulter, USA) in a sucrose density gradient (20-50% w / w) .). The fractions containing the target protein were combined and then purified by gel filtration on a Toyopearl HW-65 sorbent (ToyoSoda Corp., Japan) in phosphate buffered saline (10 mM NaH 2 PO 4 , 0.03% Tween-20, pH 7.2).
Чистоту полученного таким образом рекомбинантного белка ESC-Ag определяли методом SDS-PAGE электрофореза. Если чистота белка была недостаточна (менее 95%) производили дополнительную очистку при помощи анионообменной хроматографии на сорбенте Toyopearl DEAE-650M.The purity of the thus obtained recombinant ESC-Ag protein was determined by SDS-PAGE electrophoresis. If the protein purity was insufficient (less than 95%), additional purification was performed using anion exchange chromatography on a Toyopearl DEAE-650M sorbent.
В результате этих операций удается выделить около 30% антигена, присутствующего в осветленном клеточном лизате. Выход очищенного ESC-Ag составлял не менее 50 мг/л культуральной жидкости.As a result of these operations, it is possible to isolate about 30% of the antigen present in the clarified cell lysate. The yield of purified ESC-Ag was at least 50 mg / L of culture fluid.
Пример 8. Анализ рекомбинантного ESC-Ag.Example 8. Analysis of recombinant ESC-Ag.
1) Чистота рекомбинантного ESC-Ag определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания с Coomassie Brilliant Blue R-250 и/или серебром. Анализ интенсивности полос отсканированных гелей проводится посредством компьютерной программы NIH Image (Рисунок 5).1) The purity of recombinant ESC-Ag is determined by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions (SDS-PAGE) by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 and / or silver. The analysis of the intensity of the bands of scanned gels is carried out using the NIH Image computer program (Figure 5).
2) Образование вирусоподобных частиц (ВПЧ) рекомбинантного белка ESC-Ag подтверждали методом гель-фильтрационной хроматографии на полимерной колонке TSK G5000PW диаметром 7.5 мм и длиной 60 см, соединенной с предколонкой PrePW диаметром 7.5 мм и длиной 7.5 см (Tosoh Bioscience, Japan). Разделение проводили в фосфатном буферном растворе (10 mM KH2PO4, (рН 7.2), 0.03% Tween-20) при скорости потока 0.6 мл/мин. Мониторинг процесса осуществляли по поглощению на 280 нм. Размер пор сорбента 1000Å позволяет отделить правильно собранные ВПЧ от мономеров и агрегатов Esc-антигена. Время элюции очищенного препарата ESC-Ag соответствует времени элюции вирусоподобных частиц 23-26 мин (Рисунок 6).2) The formation of virus-like particles (HPV) of the recombinant ESC-Ag protein was confirmed by gel filtration chromatography on a TSK G5000PW polymer column with a diameter of 7.5 mm and a length of 60 cm connected to a PrePW column with a diameter of 7.5 mm and a length of 7.5 cm (Tosoh Bioscience, Japan). Separation was carried out in a phosphate buffer solution (10 mM KH 2 PO 4 , (pH 7.2), 0.03% Tween-20) at a flow rate of 0.6 ml / min. The process was monitored by absorbance at 280 nm. The sorbent pore size of 1000Å allows you to separate correctly collected HPV from monomers and aggregates of Esc antigen. The elution time of the purified ESC-Ag preparation corresponds to the elution time of virus-like particles of 23-26 min (Figure 6).
Электронно-микроскопический анализ полученного антигена показал наличие в образце частиц размером 15-25 нм. округлой и овальной формы. Ободок частиц имел низкую электронную плотность и относительно более темный центр при окраске 1% раствором молибдата аммония и уранилацетата (Рисунок 7). Эти данные подтверждают то, что полученный Esc-антиген собирается в вирусоподобные частицы.Electron microscopic analysis of the obtained antigen showed the presence of particles with a size of 15-25 nm. round and oval. The rim of the particles had a low electron density and a relatively darker center when stained with a 1% solution of ammonium molybdate and uranyl acetate (Figure 7). These data confirm that the resulting Esc antigen is assembled into virus-like particles.
3) Иммуноспецифичность рекомбинантного ESC антигена определяют методом иммуноблотинга. Первичные антитела для этой цели получали иммунизацией кроликов рекомбинантным HBsAg (ЗАО НПК «Комбиотех»), восстановленным в присутствии 2% SDS и 5% β-меркаптоэтанола. Из полученных высокоиммунных сывороток специфические поликлональные антитела выделяли на афинной колонке с коньюгированным рекомбинантным HBsAg (Крымский М.А. et al., Биофармацевтический Журнал, 2010, 2(5): 8-15) Этими антителами окрашивали иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам кроликов, коньюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген ESC-Ag представлен в виде полосы мономера белка размером 22-25 кДа и слабых полос димера и тримера (Рисунок 5).3) The immunospecificity of the recombinant ESC antigen is determined by immunoblotting. Primary antibodies for this purpose were obtained by immunizing rabbits with recombinant HBsAg (ZAO NPK Kombioteh), reconstituted in the presence of 2% SDS and 5% β-mercaptoethanol. From the obtained high-immune sera, specific polyclonal antibodies were isolated on an affinity column with conjugated recombinant HBsAg (Krymsky MA et al., Biopharmaceutical Journal, 2010, 2 (5): 8-15) Immunoblot was stained with these antibodies, followed by visualization with specific antibodies to rabbit immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase according to the method of improved ECL chemiluminescence (Amersham, UK). The recombinant ESC-Ag antigen is presented as a 22–25 kDa protein monomer band and weak dimer and trimer bands (Figure 5).
4) Серологический портрет рекомбинантных Esc антигенов проводили по методике, разработанной в лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, с применением репрезентативной панели конъюгатов моноклональных антител к HBsAg. Поликлональные кроличьи (КАТ) и моноклональные мышиные (11F3, Н10, НВ4, 10D10, 5Н7, 4F5, Н2) антитела к HBsAg, а также их конъюгаты с пероксидазой хрена были получены в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Также использовали коммерческие моноклональные конъюгаты NF5, NE2 («Сорбент», Россия) и Х7 («Фармакс», Россия). Реактивность антигенных образцов с 11-ю пероксидазными конъюгатами антител исследовали методом ИФА. Оптимальные концентрации для каждого конъюгата подбирались в предварительных опытах с помощью внутреннего производственного стандарта, оттитрованного по отраслевому стандартному образцу. Относительную реактивность образцов оценивали по сравнению с соответствующей реактивностью внутреннего производственного стандарта (ВПС) HBsAg. За относительную реактивность каждого образца (обр) с исследованными конъюгатами принимали отношение Собр/Свпс×103. Реактивность образца с данным конъюгатом считали дефектной, если отношение Собр/Свпс для этого конъюгата не превышало 100. Полученные результаты представлены в таблице 1.4) A serological portrait of recombinant Esc antigens was carried out according to the method developed in the laboratory of mediators and immunity effectors of the State Research Institute of Electric Medicine named after N.F. Gamalei RAMS, using a representative panel of conjugates of monoclonal antibodies to HBsAg. Polyclonal rabbit (CAT) and monoclonal mouse (11F3, H10, HB4, 10D10, 5H7, 4F5, H2) antibodies to HBsAg, as well as their conjugates with horseradish peroxidase, were obtained at the State Research Institute of Electric Medicine named after N.F. Gamalei RAMS. Commercial monoclonal conjugates NF5, NE2 (Sorbent, Russia) and X7 (Pharmax, Russia) were also used. The reactivity of antigenic samples with 11 peroxidase antibody conjugates was studied by ELISA. The optimal concentration for each conjugate was selected in preliminary experiments using an internal production standard, titrated according to the industry standard sample. The relative reactivity of the samples was evaluated compared to the corresponding reactivity of the HBsAg internal production standard (IPN). For the relative reactivity of each sample (arr) with the studied conjugates, the Sobr / Svps × 10 3 ratio was taken. The reactivity of the sample with this conjugate was considered defective if the Sobr / HPS ratio for this conjugate did not exceed 100. The results obtained are presented in table 1.
Из таблицы видно, что рекомбинантные антигены HBsAg субтипов «ау» и «ad» - стандартные компоненты вакцины, производимой ЗАО НПК «Комбиотех», распознаются всей панелью конъюгатов. Это означает, что их серологические и конформационные характеристики полностью соответствуют HBsAg дикого типа. Серологическое портретирование антигенов с эскейп-мутацией G145R показало, что все три исследуемых рекомбинантных препарата, рассматриваемые в данном изобретении, (Таблица 1, строки 7,8,9) имеют многочисленные дефекты в реактивности с большинством конъюгатов (Табл 1, выделение серым фоном). Точно такую же картину дефектов (или серологический портрет) показывают нативные Esc-антигены, выделенные из человеческих сывороток, несущих природную мутацию G145R (Таблица 1, строки 5,6), В то же время рекомбинантные образцы AHBV203 (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) и HBs-878 («PROSPEC», Израиль), тоже содержащие мутацию G145R, не имели ни одного дефекта распознавания моноклональными конъюгатами, т.е. конформация этих рекомбинантных молекул полностью соответствовала HBsAg дикого типа, а не мутантного антигена.The table shows that the recombinant HBsAg antigens of the subtypes "au" and "ad" - the standard components of the vaccine manufactured by NPK Kombiotekh, are recognized by the entire panel of conjugates. This means that their serological and conformational characteristics are fully consistent with wild-type HBsAg. Serological portrayal of antigens with the G145R escape mutation showed that all three of the studied recombinant drugs considered in this invention (Table 1,
Таким образом, серологическое портретирование показывает полное конформационное соответствие рекомбинантных Esc антигенов, полученных из штаммов, описанных в данном изобретении, с нативными мутантами G145R, в отличие от Esc-Ag других производителей.Thus, serological portraiture shows the complete conformational correspondence of recombinant Esc antigens obtained from the strains described in this invention with native G145R mutants, in contrast to Esc-Ag from other manufacturers.
Культурально-морфологические особенности штаммов: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой. Хранение штаммов - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.Cultural and morphological features of the strains: round-shaped cells, small in size, form large round colonies with a pronounced convex middle on an agarized YPD medium. The strains are stored at -70 ° C in the form of a suspension of cells in a sterile 30-50% glycerol solution.
Генетические особенности: Штаммы не являются зоопатогенными или фитопатогенными.Genetic features: Strains are not zoopathogenic or phytopathogenic.
Способ, условия и состав сред для размножения штаммов: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.Method, conditions and composition of media for the propagation of strains: incubation by pumping at 30 ° C in a nutrient medium composition: 2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose.
Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.5-6.0 в питательной среде, содержащей до 4% глицерина.The conditions and composition of the medium for fermentation: pumping at 30 ° C and pH 5.5-6.0 in a nutrient medium containing up to 4% glycerol.
Выделенный белок ESC-Ag может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гепатита В.Isolated ESC-Ag protein can be used in test systems, as well as to create vaccines based on it for the prevention of diseases associated with hepatitis B.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015115515/10A RU2586513C1 (en) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015115515/10A RU2586513C1 (en) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2586513C1 true RU2586513C1 (en) | 2016-06-10 |
Family
ID=56115453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015115515/10A RU2586513C1 (en) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2586513C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639637A (en) * | 1990-03-29 | 1997-06-17 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | Hepatitis B vaccine |
| US6099840A (en) * | 1990-03-29 | 2000-08-08 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | Hepatitis B vaccine |
| RU2207374C1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-06-27 | Закрытое акционерное общество "Медицинские технологии - "МТХ" | Recombinant plasmid encoding hepatitis b virus surface antigen (hbsag), its preparing and yeast strain hansenula polymorpha as producer of hepatitis b virus surface antigen (hbsag) |
| US7038035B1 (en) * | 1998-06-19 | 2006-05-02 | Government Of Republic Of Singapore | Vaccine-induced hepatitis B viral strain and uses thereof |
-
2015
- 2015-04-24 RU RU2015115515/10A patent/RU2586513C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639637A (en) * | 1990-03-29 | 1997-06-17 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | Hepatitis B vaccine |
| US6099840A (en) * | 1990-03-29 | 2000-08-08 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | Hepatitis B vaccine |
| US7038035B1 (en) * | 1998-06-19 | 2006-05-02 | Government Of Republic Of Singapore | Vaccine-induced hepatitis B viral strain and uses thereof |
| RU2207374C1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-06-27 | Закрытое акционерное общество "Медицинские технологии - "МТХ" | Recombinant plasmid encoding hepatitis b virus surface antigen (hbsag), its preparing and yeast strain hansenula polymorpha as producer of hepatitis b virus surface antigen (hbsag) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9782471B2 (en) | EV71 virus-like particles and preparation method and application thereof | |
| CN1142271C (en) | Attenuated Japanese encephalitis virus adapted to African green monkey kidney cells and its vaccine | |
| JP2010516807A (en) | HBV vaccine and method for producing the same | |
| Yang et al. | Investigation of Kluyveromyces marxianus as a novel host for large‐scale production of porcine parvovirus virus‐like particles | |
| EP2907821B1 (en) | Method for producing a N-terminaly truncated L1 protein of human papillomavirus (HPV) | |
| US12251435B2 (en) | Engineered Hansenula fungi efficiently expressing CA10 virus-like particles and uses thereof | |
| CN113845576A (en) | Recombinant feline herpesvirus type 1 gB-gD protein and application thereof | |
| CN111925452B (en) | Mycoplasma hyopneumoniae genetic engineering subunit vaccine, and preparation method and application thereof | |
| NL2025015B1 (en) | Method for Efficiently Expressing PCV2 Cap and PCV3 Cap Fusion Protein | |
| CN102154325A (en) | Vaccine against human papillomavirus (HPV) as well as preparation method and application thereof | |
| US20100255021A1 (en) | Truncated l1 protein of human papillomavirus type 6 | |
| CN112011556B (en) | Porcine circovirus 2b and 2d type bivalent virus-like particle vaccine as well as preparation method and application thereof | |
| CN113461788A (en) | Cat coronavirus recombinant antigen, genetic engineering subunit vaccine thereof and application | |
| US9034340B2 (en) | Genes encoding major capsid protein L1 of human papilloma virus | |
| CN113896773B (en) | Recombinant FCV antigen and feline calicivirus genetic engineering subunit vaccine | |
| CN102586287A (en) | HPV16L1 polynucleotide sequence and expression vector, host cell and application thereof | |
| RU2603729C2 (en) | Recombinant vaccine for prophylaxis of hepatitis b (versions) | |
| CN112592409B (en) | Genetic engineering subunit vaccine of porcine reproductive and respiratory syndrome virus | |
| CN111729078B (en) | Chicken infectious anemia virus gene engineering vaccine | |
| RU2586513C1 (en) | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS) | |
| RU2445357C1 (en) | Pichia angusta recombinant yeast strain - producer of capsid protein l1 of human papillomavirus type 16 | |
| RU2586511C1 (en) | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN SEROTYPE "ayw" | |
| RU2546242C1 (en) | RECOMBINANT STRAIN OF YEAST Hansenula polymorpha - PRODUCER OF MAJOR CAPSID PROTEIN L1 OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS OF TYPE 18 | |
| RU2546240C1 (en) | RECOMBINANT STRAIN OF YEAST Hansenula polymorpha - PRODUCER OF MAJOR CAPSID PROTEIN L1 OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS OF TYPE 56 | |
| RU2676160C1 (en) | Recombinant yeast strain harsenula polymorpha - producer of the main capcid protein l1 of human papillomavirus type 11 |