RU2585494C2 - Recombinant protein rec-mp, containing sequence of myelopeptides for treating secondary immunodeficiency conditions - Google Patents
Recombinant protein rec-mp, containing sequence of myelopeptides for treating secondary immunodeficiency conditions Download PDFInfo
- Publication number
- RU2585494C2 RU2585494C2 RU2014137558/10A RU2014137558A RU2585494C2 RU 2585494 C2 RU2585494 C2 RU 2585494C2 RU 2014137558/10 A RU2014137558/10 A RU 2014137558/10A RU 2014137558 A RU2014137558 A RU 2014137558A RU 2585494 C2 RU2585494 C2 RU 2585494C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rec
- recombinant protein
- myelopeptides
- cells
- treatment
- Prior art date
Links
- 108010083475 myelopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- GJQDTIRGBUXHLF-PKNHJBQWSA-N (2s,3r)-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical class C([C@@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GJQDTIRGBUXHLF-PKNHJBQWSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 206010054979 Secondary immunodeficiency Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 24
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 24
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 abstract description 6
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 abstract description 6
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 abstract description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 6
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 abstract description 5
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002082 fibula Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940046781 other immunosuppressants in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
- A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению рекомбинантного белка, содержащего в своем составе последовательности миелопептидов (rec-МР) с целью использования для лечения вторичных иммунодефицитов.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the production of a recombinant protein containing myelopeptide sequences (rec-MR) for use in the treatment of secondary immunodeficiencies.
Одной из важных медицинских проблем нашего времени является распространение вторичных иммунодефицитных состояний (ВИДС), обусловленных воздействием неблагоприятных факторов внешней среды. Вторичные ИДС могут провоцировать: травмы физической, химической и биологической природы, плохая экология, эндокринопатии (сахарный диабет, гипотиреоз и др.), оперативное вмешательство (наркоз + стресс + травма), лекарства (глюкокортикоиды, антибиотики, цитостатики и другие иммунодепрессанты), дефекты питания, стресс-синдром и т.д. Для лечения вторичных ИДС в настоящее время используется более 30 различных препаратов [Стандарты диагностики и лечения «Иммунология и аллергология», 2001]. Однако, с каждым годом расширяющийся спектр различных поражений иммунной системы быстро изменяющимися неблагоприятными факторами внешней среды требует разработки новых лекарственных средств для ее восстановления.One of the important medical problems of our time is the spread of secondary immunodeficiency states (VIDS), caused by exposure to adverse environmental factors. Secondary IDS can provoke: injuries of a physical, chemical and biological nature, poor ecology, endocrinopathies (diabetes mellitus, hypothyroidism, etc.), surgery (anesthesia + stress + trauma), drugs (glucocorticoids, antibiotics, cytostatics and other immunosuppressants), defects nutrition, stress syndrome, etc. For the treatment of secondary IDS, more than 30 different drugs are currently used [Diagnostic and treatment standards "Immunology and Allergology", 2001]. However, every year the expanding spectrum of various lesions of the immune system by rapidly changing adverse environmental factors requires the development of new drugs to restore it.
В основе методов медикаментозного лечения вторичных иммунодефицитов лежит представление о том, что изменения абсолютного или относительного количества клеток, участвующих в иммунных реакциях, или их функциональной активности, могут быть восстановлены с помощью соответствующих иммунотропных лекарственных средств. Одним из источников для разработки лекарственных препаратов, восстанавливающих нормальное функционирование иммунной системы, являются иммунологически активные пептиды, выделенные из лимфоидных тканей или их синтетические аналоги.The methods of drug treatment of secondary immunodeficiencies are based on the idea that changes in the absolute or relative number of cells involved in immune reactions, or their functional activity, can be restored using appropriate immunotropic drugs. One of the sources for the development of drugs that restore the normal functioning of the immune system are immunologically active peptides isolated from lymphoid tissues or their synthetic analogues.
На основании миелопептидов, продуцируемых клетками костного мозга, был разработан препарат миелопид [Petrov RV. Immunomodulating activity of myelopeptides: clinical trials, Ann N Y Acad Sci. 1993 Jun 23;685:351-61. Review], представляющий комплекс биорегуляторных медиаторов. Это группа низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 500-3000 дальтон. Данные миелопептиды получают экстракцией предварительно культивируемых in vitro клеток костного мозга свиньи или теленка. Очевидно, что получение коротких пептидов из тканей и клеток животных является очень затратным и плохо воспроизводимым. Современные требования к составу и чистоте лекарственных препаратов ограничивают такой способ производства.Based on the myelopeptides produced by bone marrow cells, myelopid was developed [Petrov RV. Immunomodulating activity of myelopeptides: clinical trials, Ann N Y Acad Sci. 1993 Jun 23; 685: 351-61. Review], representing a complex of bioregulatory mediators. This is a group of low molecular weight peptides with a molecular weight of 500-3000 daltons. These myelopeptides are obtained by extraction of pre-cultured in vitro pig or calf bone marrow cells. Obviously, obtaining short peptides from animal tissues and cells is very costly and poorly reproducible. Current requirements for the composition and purity of drugs limit this method of production.
В патенте РФ 2507212 предлагается способ получения рекомбинантных пептидов с использованием штаммов-продуцентов E. coli. Недостатком предложенного метода является экспрессия каждого пептида отдельно. Во-первых, короткие пептиды можно экспрессировать только в составе слитного белка общей массой не менее 10 кД. При среднем весе целевого пептида менее 1 кД это резко понижает выход продукта и увеличивает его стоимость. Во-вторых, как уже отмечалось, препараты содержат несколько пептидов. Следовательно, необходимо получение нескольких отдельных штаммов-продуцентов, производящих нужное число пептидов. Это еще значительно удорожает производство. В итоге, в случае реализации предложенного изобретения, цена продукта будет значительно выше смеси пептидов, получаемых традиционным методом из тканей животных.In patent RF 2507212 a method for producing recombinant peptides using producer strains of E. coli is proposed. The disadvantage of the proposed method is the expression of each peptide separately. First, short peptides can only be expressed as part of a fusion protein with a total mass of at least 10 kD. With an average weight of the target peptide of less than 1 kD, this sharply reduces the yield of the product and increases its cost. Secondly, as already noted, the preparations contain several peptides. Therefore, it is necessary to obtain several separate producer strains producing the desired number of peptides. This still significantly increases the cost of production. As a result, in the case of the implementation of the proposed invention, the price of the product will be significantly higher than the mixture of peptides obtained by the traditional method from animal tissues.
Прототипом заявленного изобретения является патентный документ РФ 2198178. Данный документ раскрывает четыре миелопептида, входящих в состав заявленного REC-MP, однако показана их индивидуальная биологическая активность. Показано, что эти пептиды отдельно не обладают одинаковыми характеристиками (описание стр. 2), что определят их пригодность для какого-либо конкретного применения. Так миелопептид (МР-3) защищает от бактериальной инфекции, стимулируя макрофагальный фагоцитоз, в то время как МР-4 индуцирует терминальную дифференцировку в лейкозных клетках. Кроме того, повышение сывороточного интерферона, индуцированного с помощью разных MP, также отличалось. Так при однократной инъекции 0,1 мкг МР-4 в сыворотке через 48 часов уровень интерферона достигал 80 ед/мл, в то время как однократная инъекция 0,01 мкг МР-5 приводила к очень сильному повышению позднего (48 ч) сывороточного интерферона - 320 ед/мл. При этом МР-3 и МР-6 слабо индуцировали поздний интерферон при различных концентрациях. Таким образом, различная активность MP в отношении продукции интерферона будет проявляться различной эффективностью в отношении лечения вторичных иммунодефицитов.The prototype of the claimed invention is the patent document of the Russian Federation 2198178. This document discloses the four myelopeptides that are part of the claimed REC-MP, but their individual biological activity is shown. It was shown that these peptides separately do not have the same characteristics (description of page 2), which will determine their suitability for any particular application. So myelopeptide (MP-3) protects against bacterial infection by stimulating macrophage phagocytosis, while MP-4 induces terminal differentiation in leukemia cells. In addition, the increase in serum interferon induced by different MPs was also different. So, with a single injection of 0.1 μg MP-4 in serum after 48 hours, the level of interferon reached 80 units / ml, while a single injection of 0.01 μg MP-5 led to a very strong increase in late (48 h) serum interferon - 320 units / ml. Moreover, MP-3 and MP-6 weakly induced late interferon at various concentrations. Thus, the different activity of MP in relation to the production of interferon will manifest different efficacy in the treatment of secondary immunodeficiencies.
Поэтому задачей изобретения является получение рекомбинантного слитого полипептида с более высокой иммунологической активностью для лечения ВИДС.Therefore, the object of the invention is to obtain a recombinant fusion polypeptide with higher immunological activity for the treatment of IDA.
Согласно данному изобретению сконструирован рекомбинантный белок rec-МР путем чередованием коротких активных миелопептидов, перемежающихся сайтами узнавания специфических протеаз, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В состав рекомбинантного белка входят четыре миелопептида: FLGFPT, LVVYPW, LVCYPQ и FRPRMTP. В качестве сайтов распознавания протеазами использовались последовательности для гидролиза тромбином и урокиназой.According to the present invention, a recombinant rec-MP protein is constructed by alternating short active myelopeptides alternating with specific protease recognition sites having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The recombinant protein contains four myelopeptides: FLGFPT, LVVYPW, LVCYPQ and FRPRMTP. As protease recognition sites, sequences for hydrolysis by thrombin and urokinase were used.
Рекомбинантный белок rec-МР получен путем экспрессии в клетках E.coli, разработаны методики очистки и рефолдинга данного продукта. Для получения рекомбинантного белка была создана генетическая конструкция на основе плазмиды рЕТ30а, которая содержит ген, кодирующий данный рекомбинантный белок. Последовательность гена представлена SEQ ID NO: 2. Первичная структура и гомогенность подтверждена методами масс-спектрометрии и ВЭЖХ. Рекомбинантный белок rec-МР после введения в организм способен гидролизоваться с высвобождением входящих в него миелопептидов.Recombinant rec-MP protein was obtained by expression in E. coli cells; methods for purification and refolding of this product were developed. To obtain a recombinant protein, a genetic construct was created based on the pET30a plasmid, which contains the gene encoding this recombinant protein. The gene sequence is represented by SEQ ID NO: 2. The primary structure and homogeneity are confirmed by mass spectrometry and HPLC. The recombinant protein rec-MR after introduction into the body is able to hydrolyze with the release of its myelopeptides.
Техническим результатом, достигаемым при реализации данного изобретения, является повышение эффективности профилактики и лечения вторичных ИДС при применении REC-MP, содержащего комплекс миелопептидов и представленного последовательностью SEQ ID NO: 1, путем более выраженной стимуляции антителообразования, увеличения количества В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD25 (рецептор для интерлейкина 2) и CD69 (маркер активации лимфоцитов).The technical result achieved by the implementation of this invention is to increase the effectiveness of the prevention and treatment of secondary IDS when using REC-MP containing a myelopeptide complex and represented by the sequence SEQ ID NO: 1, by more pronounced stimulation of antibody formation, an increase in the number of B-lymphocytes expressing on their surfaces of CD25 (receptor for interleukin 2) and CD69 (lymphocyte activation marker).
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Фиг. 1. Хроматографический профиль прохождения рекомбинантного белка rec-МР через SP-Sepharose. Мажорный пик соответствует выходу рекомбинантного белка.FIG. 1. The chromatographic profile of the passage of the recombinant rec-MP protein through SP-Sepharose. The major peak corresponds to the yield of the recombinant protein.
Фиг. 2. Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка rec-МР с аналитической колонки Kromasil 300-5С18.FIG. 2. Chromatographic profile of elution of recombinant rec-MP protein from a Kromasil 300-5C18 analytical column.
Фиг. 3. Влияние рекомбинантного белка rec-МР на содержание в лимфатических узлах экспериментальных животных клеток, несущих рецепторы CD25 и CD69.FIG. 3. The effect of recombinant protein rec-MP on the content in the lymph nodes of experimental animal cells carrying receptors CD25 and CD69.
Фиг. 4 Анализ клеток лимфатических узлов животных, иммунизированных рекомбинантным белком rec-МР.FIG. 4 Analysis of lymph node cells of animals immunized with recombinant rec-MP protein.
ИЗОБРЕТЕНИЕ ИЛЛЮСТРИРУЮТ ПРИМЕРЫ.The invention is illustrated by examples.
Пример 1. Получение штамма-продуцента рекомбинантного белка REC-MP.Example 1. Obtaining a producer strain of the recombinant protein REC-MP.
Для получения рекомбинантного белка была создана генетическая конструкция на основе плазмиды рЕТ30а, которая содержит ген, кодирующий данный рекомбинантный белок. Последовательность гена представлена SEQ ID NO: 2.To obtain a recombinant protein, a genetic construct was created based on the pET30a plasmid, which contains the gene encoding this recombinant protein. The gene sequence is represented by SEQ ID NO: 2.
Плазмидой трансфецировали клетки E.coli штамма BL21(DE3). Трансформированные клетки рассевали на чашку Петри с LB-агаром, содержащим 25 мг/мл канамицина, и инкубировали 16 часов при 37°С. 24 единичные колонии инкубировали 10 часов в 1 мл LB, содержащим 25 мг/мл канамицина. По 50 мкл культур клеток вносили в 0,5 мл LB, содержащим 25 мг/мл канамицина, инкубировали 2 часа и индуцировали экспрессию белка rec-МР, добавлением IPTG до 1 мкМ. Матричные культуры хранили на -80С до окончания анализа клонов. Наличие белка rec-МР анализировали электрофорезом в ПААГ. Один клон, продуцирующий наибольшее количество белка rec-МР, использовали в качестве штамма-продуцента рекомбинантного белка rec-МР.Plasmid transfected cells of E. coli strain BL21 (DE3). Transformed cells were scattered on a Petri dish with LB agar containing 25 mg / ml kanamycin and incubated for 16 hours at 37 ° C. 24 single colonies were incubated for 10 hours in 1 ml LB containing 25 mg / ml kanamycin. 50 μl of cell cultures were introduced into 0.5 ml LB containing 25 mg / ml kanamycin, incubated for 2 hours and expression of rec-MP protein was induced by adding IPTG to 1 μM. Matrix cultures were stored at -80 ° C until the end of clone analysis. The presence of rec-MR protein was analyzed by SDS page electrophoresis. One clone producing the highest amount of rec-MP protein was used as the producer strain of the recombinant rec-MP protein.
Пример 2. Получение и хроматографическая очистка рекомбинантного белка REC-MP.Example 2. Obtaining and chromatographic purification of recombinant protein REC-MP.
Клетки штамма-продуцента пересевали в культуральную колбу с 200 мл LB, содержащим 25 мг/мл канамицина. Культура выращивалась на шейкере при 280 об/мин при температуре 37С до достижения оптической плотности значения OD585=0,8E. Индукция экспрессии белка проводилась добавлением IPTG до концентрации 1 мM. Культура дополнительно культивировалась 4 часа, далее клетки осаждались центрифугированием при 5000g. Осадок клеток лизировали в 8М мочевине и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе. Лизат клеток центрифугировали при 20000g 2 часа. Супернатант фильтровали через колонку с Q-Sepharose. Фракцию, не связавшуюся с данным сорбентом, хроматографировали на SP-Sepharose в градиенте NaCl (стартовый буфер: 20 mM TrisHCl рН6.8, 20 mM NaCl, итоговый буфер 20 mM TrisHCl рН6.8, 400 mM NaCl). Хроматографический профиль представлен на Фиг. 1. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и диализовали в 0,9% NaCl. Чистоту продукта анализировали методом ВЭЖХ (Фиг. 2). Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка rec-МР:
Пример 3. Влияние рекомбинантного белка на количество клеток, продуцирующих антитела, в лимфатических узлах иммунизированных животных.Example 3. The effect of recombinant protein on the number of cells producing antibodies in the lymph nodes of immunized animals.
15 мышей-самок, гибридов первого поколения (CBAЧC57BL), весом 20-22 г иммунизировали 5% взвесью эритроцитов барана в физиологическом растворе, подкожно по 0,1 мл в подушечки задних конечностей. Через 14 дней после первой иммунизации была проведена повторная иммунизация той же дозой и тем же способом. На 4-е сутки после второй иммунизации мышей разделили на 3 группы по 5 особей в группе. Первой группе (контрольной) вводили подкожно в подушечки задних лап по 0,1 мл физиологического раствора; второй группе вводили по 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 1,5 мкг коммерческого препарата миелопид и третьей группе - по 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 1,5 мкг рекомбинантного белка. Через сутки все мыши были забиты и у них были удалены подколенные лимфоузлы. Лимфоузлы гомогенизировали и в полученной клеточной суспензии определяли методом Ерне количество клеток, продуцирующих антитело класса IgG к эритроцитам барана. Коэффициент стимуляции (К) антителообразования рассчитывали как отношение количества зон гемолиза в опытных чашках к количеству зон гемолиза в контрольных. Достоверность разницы между экспериментальными группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты представлены в Таблице 1. Из полученных данных видно, что коэффициент стимуляции - миелопид/контроль составляет (36,4/25,2)=1,44, а коэффициент стимуляции - рекомбинантный белок/контроль составил (92,4/25,2)=3,67.15 female mice, first-generation hybrids (CBACCHC57BL), weighing 20-22 g, were immunized with 5% suspension of sheep erythrocytes in physiological saline, 0.1 ml subcutaneously in the hind limb pads. 14 days after the first immunization was re-immunized with the same dose and in the same way. On the 4th day after the second immunization, mice were divided into 3 groups of 5 animals per group. The first group (control) was injected subcutaneously in the pads of the hind legs in 0.1 ml of physiological saline; the second group was administered 0.1 ml of physiological saline containing 1.5 μg of the commercial preparation myelopid and the third group - 0.1 ml of physiological saline containing 1.5 μg of recombinant protein. After 24 hours, all the mice were blocked and their popliteal lymph nodes were removed. Lymph nodes were homogenized and the number of cells producing an IgG antibody against sheep erythrocytes was determined in the obtained cell suspension by the method of Erne. The stimulation coefficient (K) of antibody formation was calculated as the ratio of the number of hemolysis zones in the test cups to the number of hemolysis zones in the control. The significance of the difference between the experimental groups was evaluated by student t-test. The results obtained are presented in Table 1. From the obtained data it is seen that the stimulation coefficient - myelopid / control is (36.4 / 25.2) = 1.44, and the stimulation coefficient - recombinant protein / control was (92.4 / 25, 2) = 3.67.
Таким образом, введение экспериментальным животным рекомбинантного белка rec-МР приводит к значительно более выраженной стимуляции антителообразования (К=3,3), т.е. обеспечивая синергетический эффект действия входящих в него миелопептидов, чем после введения миелопептида (К=1,45), что подтверждает повышение эффективности применения rec-МР для профилактики и лечения вторичных ИД путем активации гуморального иммунного ответа.Thus, the introduction of the recombinant rec-MP protein into experimental animals leads to a significantly more pronounced stimulation of antibody formation (K = 3.3), i.e. providing a synergistic effect of the effects of its myelopeptides than after the introduction of the myelopeptide (K = 1.45), which confirms the increased effectiveness of rec-MR for the prevention and treatment of secondary IDs by activating a humoral immune response.
Пример 4. Влияния рекомбинантного белка rec-МР на содержание в лимфатических узлах экспериментальных животных клеток, несущих рецепторы к интерлейкину 2.Example 4. The effect of recombinant protein rec-MP on the content in the lymph nodes of experimental animal cells carrying receptors for
15 мышей - гибридов первого поколения (CBA×C57BL) иммунизировали 10% взвесью ЭБ в физиологическом растворе подкожно по 0,05 мл в подушечки задних лап. Через 14 дней после первой иммунизации была проведена повторная иммунизация той же дозой и тем же способом. На 3 сутки после второй иммунизации одной группе мышей (5 особей) вводили 0,15 мкг rec-МР в 0,1 мл физиологического раствора в подушечки задних лап. Другим 5 иммунизированным мышам вводили rec-МР в дозе 1,5 мкг, Контрольным животным в подушечки задних лап вводили 0,1 мл физиологического раствора. На 4 сутки после иммунизации животных забивали, брали у них подколенные лимфатические узлы, гомогенизировали их, получали клеточные суспензии, которую окрашивали меченными флуросцеиновыми красителями антителами фирмы BD Bioscience (Anti-Mouse CD4 FITC, кат. 11-0042-82 и Anti-Mouse CD25 АРС кат. 17-0251-82) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре Gallios (Beckman Coulter). Обработку результатов проводили с помощью программы FlowJo v.7.6. Анализировали клетки лимфоцитарного гейта, построенного по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Полученные результаты представлены на фиг.4.Fifteen mice of the first generation hybrids (CBA × C57BL) were immunized with a 10% suspension of EB in physiological saline subcutaneous solution of 0.05 ml in the pads of the hind legs. 14 days after the first immunization was re-immunized with the same dose and in the same way. On the 3rd day after the second immunization, one group of mice (5 animals) was injected with 0.15 μg of rec-MR in 0.1 ml of saline in the pads of the hind legs. The other 5 immunized mice were injected with rec-MR in a dose of 1.5 μg, Control animals were injected with 0.1 ml of physiological saline into the pads of the hind legs. On the 4th day after immunization, animals were killed, popliteal lymph nodes were taken, homogenized, cell suspensions were obtained, which were stained with fluorescein-labeled dyes with BD Bioscience antibodies (Anti-Mouse CD4 FITC, cat. 11-0042-82 and Anti-Mouse CD25 APC cat. 17-0251-82) according to the manufacturer's instructions. Stained cells were analyzed on a Gallios flow cytometer (Beckman Coulter). The results were processed using the FlowJo v.7.6 program. The cells of the lymphocytic gate, constructed according to the parameters of direct and lateral light scattering, were analyzed. The results are presented in figure 4.
На фиг. 4 отображено, что введение rec-МР в продуктивную фазу гуморального иммунного ответа приводит к увеличению клеток, несущих на своей поверхности рецепторы к Интерлейкину 2 (CD 25). Данный эффект имеет доза-зависимый характер (контроль - 1,47%, rec-МР в дозе 0,15 мкг - 4,09% и rec-МР в дозе 1,5 мкг - 7,33%). Данные клетки не относятся к субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD4.In FIG. Figure 4 shows that the introduction of rec-MR into the productive phase of the humoral immune response leads to an increase in cells carrying receptors for Interleukin 2 (CD 25). This effect has a dose-dependent nature (control - 1.47%, rec-MR at a dose of 0.15 μg - 4.09% and rec-MR at a dose of 1.5 μg - 7.33%). These cells do not belong to a subpopulation of T-lymphocytes expressing the CD4 marker.
Пример 5. Влияния рекомбинантного белка rec-МР на содержание в лимфатических узлах экспериментальных животных клеток, несущих маркер активации лимфоцитов (CD69).Example 5. The effect of recombinant protein rec-MP on the content in the lymph nodes of experimental animal cells carrying a marker of activation of lymphocytes (CD69).
10 мышей - гибридов первого поколения (CBA×C57BL) иммунизировали 10% взвесью ЭБ в физиологическом растворе подкожно по 0,05 мл в подушечки задних лап и в основание хвоста. Через 14 дней после первой иммунизации была проведена повторная иммунизация той же дозой и тем же способом. На следующие сутки после второй иммунизации мышам вводили РБ в дозе 1 мкг или физиологический раствор в подушечки лап и основание хвоста. На 3 сутки после второй иммунизации животных забивали, брали у них подколенные и паховые лимфатические узлы, гомогенизировали их, получали клеточные суспензии, которую окрашивали Lymphocyte Activation Antibody Cocktail, with Isotype Control (PE-CY™7 CD25, PE CD69, & APC CD 19) (BD Biosciences), согласно инструкции фирмы-изготовителя. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре Gallios (Beckman Coulter). Обработку результатов проводили с помощью программы FlowJo v.7.6. Анализировали клетки лимфоцитарного гейта, построенного по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Полученные результаты представлены на фиг. 3.10 mice of the first generation hybrids (CBA × C57BL) were immunized with a 10% suspension of EB in physiological saline 0.05 ml subcutaneously in the pads of the hind legs and at the base of the tail. 14 days after the first immunization was re-immunized with the same dose and in the same way. On the next day after the second immunization, mice were injected with RB at a dose of 1 μg or saline into the paw pads and the base of the tail. On the 3rd day after the second immunization, animals were killed, popliteal and inguinal lymph nodes were taken, homogenized, cell suspensions were obtained, which were stained with Lymphocyte Activation Antibody Cocktail, with Isotype Control (PE-
Из представленных результатов на фиг. 3 следует, что в лимфатических узлах мышей, дренирующих место введения антигена (ЭБ), под влиянием rec-МР в 2,5 увеличивается относительное количество клеток cd25+cd19+, т.е. В-лимфоцитов, несущих рецептор к IL2, и, приблизительно, в 2 раза клеток cd69+cd19+, т.е. клеток, несущих маркер активации В-лимфоцитов. Следует также отметить, что наряду с увеличением В лимфоцитов, несущих маркер cd25, также увеличилось в 1,6 количество других лимфоцитов, несущих рецептор к IL2, что указывает на возможное участие различных типов клеток иммунной системы в реализации антителостимулирующей активности заявленного rec-МР.From the presented results in FIG. 3 it follows that in the lymph nodes of mice draining the site of introduction of antigen (EB), under the influence of rec-MR, the relative number of cd25 + cd19 + cells increases by 2.5, i.e. B-lymphocytes carrying the receptor for IL2, and approximately 2 times the cd69 + cd19 + cells, i.e. cells carrying a marker of activation of b-lymphocytes. It should also be noted that along with an increase in B lymphocytes carrying the cd25 marker, the number of other lymphocytes carrying the IL2 receptor also increased by 1.6, which indicates the possible participation of various types of immune system cells in the implementation of the antibody-stimulating activity of the claimed rec-MR.
Таким образом, REC-MP, содержащий комплекс миелопептидов и представленный последовательностью SEQ ID NO: 1, увеличивает количество В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD25 (рецептор для интерлейкина 2) и CD69 (маркер активации лимфоцитов).Thus, REC-MP, containing a myelopeptide complex and represented by the sequence SEQ ID NO: 1, increases the number of B-lymphocytes expressing CD25 (receptor for interleukin 2) and CD69 (lymphocyte activation marker) on their surface.
Пример 6. Изучение способности рекомбинантного белка восстанавливать гуморальный иммунный ответ при вторичном иммунодефицитном состоянии.Example 6. The study of the ability of a recombinant protein to restore the humoral immune response in a secondary immunodeficiency state.
10 мышам-самкам, гибридам первого поколения (CBA4C57BL), весом 18-20 г вводили внутрибрюшинно циклофосфамид в дозе 200 мг/кг в физиологическом растворе. 5 мышам вводили физиологический раствор. На следующие сутки всех 15 животных иммунизировали 5% взвесью эритроцитов барана в физиологическом растворе подкожно по 0,1 мл в подушечки задних конечностей. На 2-е и 3-и сутки после иммунизации 5 животным из группы, которая получала циклофосфамид, внутримышечно вводили по 1,5 мкг рекомбинантного белка в 0,1 мл физиологического раствора. На 4 сутки после иммунизации эритроцитами барана все мыши были забиты и у них были удалены подколенные лимфоузлы. Лимфоузлы гомогенизировали и в полученной клеточной суспензии определяли методом Ерне количество клеток, продуцирующих антитело класса IgM к эритроцитам барана. Достоверность разницы между экспериментальными группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты представлены в Таблице 2.Ten female mice, first-generation hybrids (CBA4C57BL) weighing 18-20 g were injected intraperitoneally with cyclophosphamide at a dose of 200 mg / kg in physiological saline. 5 mice were injected with saline. On the next day, all 15 animals were immunized with a 5% suspension of sheep erythrocytes in physiological saline, 0.1 ml subcutaneously in the hind limb pads. On the 2nd and 3rd day after immunization, 5 animals from the group that received cyclophosphamide were intramuscularly injected with 1.5 μg of recombinant protein in 0.1 ml of physiological saline. On the 4th day after immunization with sheep erythrocytes, all mice were clogged and popliteal lymph nodes were removed. Lymph nodes were homogenized and the number of cells producing an IgM antibody against sheep erythrocytes was determined in the resulting cell suspension by the method of Erne. The significance of the difference between the experimental groups was evaluated by student t-test. The results obtained are presented in Table 2.
Из представленных данных видно, что введение экспериментальным животным с вторичными иммунодефицитами заявленного рекомбинантнного белка rec-МР приводит к восстановлению гуморального иммунного ответа.From the presented data it is seen that the introduction of experimental recombinant protein rec-MP to experimental animals with secondary immunodeficiencies leads to the restoration of the humoral immune response.
Таким образом, создание REC-MP, содержащего комплекс миелопептидов и представленного последовательностью SEQ ID NO 1, позволяет не только сохранить функциональную активность входящих в его миелопептидов, но повысить эффективность лечения вторичных иммунодефицитов. Поскольку после введения в организм REC-MP способен гидролизоваться по сайтам узнавания специфических протеаз с высвобождением входящих в него коротких миелопептидов, обеспечивая синергетический эффект при иммунизации (как отмечено в вышеуказанных примерах).Thus, the creation of REC-MP containing a complex of myelopeptides and represented by the sequence
Перечень последовательностейSequence listing
<110> ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России<110> FSBI "SSC Institute of Immunology" FMBA of Russia
<120> Рекомбинантный белок rec-MP, содержащий в своем составе последовательности миелопептидов для лечения вторичных иммунодефицитных состояний.<120> Recombinant rec-MP protein containing myelopeptide sequences for the treatment of secondary immunodeficiency conditions.
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 6<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 6
<210> SEQ ID NO 1<210>
<211> 73<211> 73
<212> AA (amino acid)<212> AA (amino acids)
<213> artificial<213> artificial
<400> SEQUENCE 1: <400> SEQUENCE 1 :
MFLGFPTGRGLVVYPWGRGLVCYPQGRGFRPRIMTPGRGFLGFPTTGRLVVYPWTGRLVCYPQTGRFRPRIMTMFLGFPTGRGLVVYPWGRGLVCYPQGRGFRPRIMTPGRGFLGFPTTGRLVVYPWTGRLVCYPQTGRFRPRIMT
<210> SEQ ID NO 2<210>
<211> 228<211> 228
<212> DNA<212> DNA
<213> artificial<213> artificial
<400> SEQUENCE 2:<400> SEQUENCE 2:
ATGTTCTTAGGCTTTCCAACTGGCCGTGGTCTGGTGGTGTATCCATGGGGTCGTGGTCTGGTGTGCTATCCGCAAGGTCGTGGCTTCCGTCCACGCATCATGACTCCAGGCCGCGGCTTTCTGGGCTTCCCGACCACTGGTCGTCTCGTTGTGTACCCGTGGACCGGCCGCCTGGTTTGTTACCCACAGACGGGTCGCTTTCGCCCGCGTATTATGACGCCGTAATGAATGTTCTTAGGCTTTCCAACTGGCCGTGGTCTGGTGGTGTATCCATGGGGTCGTGGTCTGGTGTGCTATCCGCAAGGTCGTGGCTTCCGTCCACGCATCATGACTCCAGGCCGCGGCTTTCTGGGCTTCCCGACCACTGGTCGTCTCGTTGTGTACCCGTGGACCGGCCGCCTGGTTTGTTACCCACAGACGGGTCGCTTTCGCCCGCGTATTATGACGCCGTAATGA
<210> SEQ ID NO 3<210>
<211> 6<211> 6
<212> AA (amino acid)<212> AA (amino acids)
<213> artificial<213> artificial
<400> SEQUENCE 3:<400> SEQUENCE 3:
FLGFPTFLGFPT
<210> SEQ ID NO 4<210>
<211> 6<211> 6
<212> AA (amino acid)<212> AA (amino acids)
<213> artificial<213> artificial
<400> SEQUENCE 4:<400> SEQUENCE 4:
LVVYPWLVVYPW
<210> SEQ ID NO 5<210>
<211> 6<211> 6
<212> AA (amino acid)<212> AA (amino acids)
<213> artificial<213> artificial
<400> SEQUENCE 5:<400> SEQUENCE 5:
LVCYPQLVCYPQ
<210> SEQ ID NO 6<210> SEQ ID NO 6
<211> 7<211> 7
<212> AA (amino acid)<212> AA (amino acids)
<213> artificial<213> artificial
<400> SEQUENCE 6:<400> SEQUENCE 6:
FRPRMTPFRPRMTP
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014137558/10A RU2585494C2 (en) | 2014-09-17 | 2014-09-17 | Recombinant protein rec-mp, containing sequence of myelopeptides for treating secondary immunodeficiency conditions |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014137558/10A RU2585494C2 (en) | 2014-09-17 | 2014-09-17 | Recombinant protein rec-mp, containing sequence of myelopeptides for treating secondary immunodeficiency conditions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014137558A RU2014137558A (en) | 2016-04-10 |
| RU2585494C2 true RU2585494C2 (en) | 2016-05-27 |
Family
ID=55647499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014137558/10A RU2585494C2 (en) | 2014-09-17 | 2014-09-17 | Recombinant protein rec-mp, containing sequence of myelopeptides for treating secondary immunodeficiency conditions |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2585494C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2630302C1 (en) * | 2016-11-02 | 2017-09-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России | Method for purification of recombinant protein containing myelopeptides sequences |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2120475C1 (en) * | 1990-05-17 | 1998-10-20 | Макс-Планк-Гезельшафт Цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.ф. | Method of synthesis of polypeptide, hybrid dna (variants), fusion protein (variants) |
| RU2198178C2 (en) * | 1997-01-07 | 2003-02-10 | Праймамедик Лтд. | Peptide-immunoregulator (versions), medicinal agent comprising peptide-immunoregulator |
| US20110287517A1 (en) * | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Allergan, Inc. | Degradable Clostridial Toxins |
| RU2503684C2 (en) * | 2006-03-29 | 2014-01-10 | Сергей В. ЛИТВИНОВ | Immunomodulating oligopeptides |
-
2014
- 2014-09-17 RU RU2014137558/10A patent/RU2585494C2/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2120475C1 (en) * | 1990-05-17 | 1998-10-20 | Макс-Планк-Гезельшафт Цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.ф. | Method of synthesis of polypeptide, hybrid dna (variants), fusion protein (variants) |
| RU2198178C2 (en) * | 1997-01-07 | 2003-02-10 | Праймамедик Лтд. | Peptide-immunoregulator (versions), medicinal agent comprising peptide-immunoregulator |
| RU2503684C2 (en) * | 2006-03-29 | 2014-01-10 | Сергей В. ЛИТВИНОВ | Immunomodulating oligopeptides |
| US20110287517A1 (en) * | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Allergan, Inc. | Degradable Clostridial Toxins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014137558A (en) | 2016-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Obal Jr et al. | Interleukin 1 alpha and an interleukin 1 beta fragment are somnogenic | |
| KR20150022800A (en) | Composition for preventing or treating cachexia | |
| NZ203042A (en) | Increasing milk production in cows by administering synthetic bovine growth hormone | |
| CN101434650A (en) | Bursa pentapeptide, deriving peptide thereof and use thereof | |
| TW201825122A (en) | Combination cancer immunotherapy with arginine depleting agent | |
| CA2186423C (en) | Protein which induces interferon-gamma production by immunocompetent cell | |
| Lange et al. | Isolation and characterization of complement component C3 from Atlantic cod (Gadus morhua L.) and Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) | |
| JP2022551463A (en) | Fusion protein containing human interleukin 10 and Fc fragment and medical use thereof | |
| ES2663862T3 (en) | Modulation of antigen immunogenicity by eliminating epitopes recognized by NKT lymphocytes | |
| CN111454371B (en) | PDL1-pHLIP, preparation method and application thereof in treatment of autoimmune disease | |
| EP0524834A2 (en) | Immunosuppressive drugs containing a cysteine protease | |
| JP5036546B2 (en) | Thymus-specific protein | |
| RU2585494C2 (en) | Recombinant protein rec-mp, containing sequence of myelopeptides for treating secondary immunodeficiency conditions | |
| Shen et al. | Expression of recombinant AccMRJP1 protein from royal jelly of Chinese honeybee in Pichia pastoris and its proliferation activity in an insect cell line | |
| CA2054289A1 (en) | Smooth muscle mitogen | |
| Feng et al. | Isolation and potential immunological characterization of TPSGLVY, a novel bursal septpeptide isolated from the bursa of Fabricius | |
| RU2601126C2 (en) | Method of producing biologically active peptides | |
| TW200838558A (en) | New immunomodulating oligopeptides | |
| KR20010043088A (en) | NOVEL POLYPEPTIDE, cDNA ENCODING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF | |
| KR20010033640A (en) | NOVEL POLYPEPTIDES, cDNAS ENCODING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF | |
| CN102015757A (en) | Modified Cpn10 and PRR signalling | |
| KR20010072289A (en) | NOVEL POLYPEPTIDE, cDNA ENCODING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF | |
| CN105232576A (en) | DC-based therapeutic glioma vaccine and preparation method thereof | |
| CN114349857B (en) | Treg cell preparation method and application in aspect of autoimmune diseases | |
| KR20120130916A (en) | The polypeptide derived from sebastes schlegelii and Immune Booster Composition for fish Comprising thereof |