RU2579997C2 - Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes - Google Patents
Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2579997C2 RU2579997C2 RU2014130726/10A RU2014130726A RU2579997C2 RU 2579997 C2 RU2579997 C2 RU 2579997C2 RU 2014130726/10 A RU2014130726/10 A RU 2014130726/10A RU 2014130726 A RU2014130726 A RU 2014130726A RU 2579997 C2 RU2579997 C2 RU 2579997C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- insulin
- multipotent progenitor
- pancreas
- progenitor cells
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 title abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims abstract description 4
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 13
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 13
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 11
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 claims description 9
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 claims description 8
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 claims description 8
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 6
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 abstract description 3
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 abstract description 2
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 abstract description 2
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 abstract 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 12
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 11
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- UOFGSWVZMUXXIY-UHFFFAOYSA-N 1,5-Diphenyl-3-thiocarbazone Chemical compound C=1C=CC=CC=1N=NC(=S)NNC1=CC=CC=C1 UOFGSWVZMUXXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 7
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 6
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 3
- -1 TER119 Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 2
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 2
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002571 pancreatic alpha cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGZUCVGMNQGGNA-UHFFFAOYSA-N 7-[5-(2-acetamidoethyl)-2-hydroxyphenyl]-3,5,6,8-tetrahydroxy-9,10-dioxoanthracene-1,2-dicarboxylic acid 7-[5-(2-amino-2-carboxyethyl)-2-hydroxyphenyl]-3,5,6,8-tetrahydroxy-9,10-dioxoanthracene-1,2-dicarboxylic acid 3,5,6,8-tetrahydroxy-7-[2-hydroxy-5-(2-hydroxyethyl)phenyl]-9,10-dioxoanthracene-1,2-dicarboxylic acid 3,6,8-trihydroxy-1-methyl-9,10-dioxoanthracene-2-carboxylic acid Chemical compound Cc1c(C(O)=O)c(O)cc2C(=O)c3cc(O)cc(O)c3C(=O)c12.OCCc1ccc(O)c(c1)-c1c(O)c(O)c2C(=O)c3cc(O)c(C(O)=O)c(C(O)=O)c3C(=O)c2c1O.CC(=O)NCCc1ccc(O)c(c1)-c1c(O)c(O)c2C(=O)c3cc(O)c(C(O)=O)c(C(O)=O)c3C(=O)c2c1O.NC(Cc1ccc(O)c(c1)-c1c(O)c(O)c2C(=O)c3cc(O)c(C(O)=O)c(C(O)=O)c3C(=O)c2c1O)C(O)=O NGZUCVGMNQGGNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010012655 Diabetic complications Diseases 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 1
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 1
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011509 clonal analysis Methods 0.000 description 1
- 101150113125 cpa-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000009101 diabetic angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002249 diabetic peripheral angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002907 exocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000006362 insulin response pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007474 nonparametric Mann- Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 208000024691 pancreas disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям и регенеративной медицине, и касается способа получения и индукции дифференцировки культуры мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы в инсулин-продуцирующие β-клетки при сахарном диабете. Изобретение может быть использовано для решения практических задач регенеративной медицины: поиска потенциальных лекарственных средств, способных избирательно стимулировать дифференцировку панкреатических мультипотентных прогениторных клеток в продуцирующие инсулин β-клетки при сахарном диабете, что может стать альтернативой инсулинзамещающей терапии, трансплантации поджелудочной железы либо отдельных типов ее клеток.The invention relates to biotechnology, specifically to cell technology and regenerative medicine, and relates to a method for producing and inducing differentiation of a culture of multipotent progenitor pancreatic cells into insulin-producing β-cells in diabetes mellitus. The invention can be used to solve the practical problems of regenerative medicine: the search for potential drugs that can selectively stimulate the differentiation of pancreatic multipotent progenitor cells into insulin-producing β-cells in diabetes mellitus, which can be an alternative to insulin replacement therapy, pancreatic transplantation or certain types of its cells.
Сахарный диабет объединяет заболевания разной этиологии, но ключевое звено патогенеза одинаковое: разрушение β-клеток, ухудшение усвоения глюкозы различными тканями. Недостаточная утилизация глюкозы приводит к нарушению не только углеводного, но и жирового, и белкового обмена. Накопление продуктов гликозилирования в сочетании с другими метаболическими сдвигами лежит в основе поздних осложнений сахарного диабета - диабетической ангиопатии, ретинопатии, невропатии и нефропатии [1; 2; 3]. Наиболее агрессивным и прогностически тяжелым считается сахарный диабет I типа (инсулинозависимый сахарный диабет). Инсулинозависимый сахарный диабет - хроническое аутоиммунное заболевание, вызванное разрушением β-клеток островков поджелудочной железы [4]. Болезнь поражает детей, подростков и молодых людей, но может начинаться в любом возрасте. Спонтанная аутоиммунная реакция возникает у лиц генетически предрасположенных к аутоиммунным нарушениям. Однако в подавляющем большинстве (более 90% всех случаев) сахарный диабет типа I возникает в силу вмешательства в иммунную систему различных провоцирующих факторов, в том числе токсических агентов.Diabetes mellitus unites diseases of different etiologies, but the key link in pathogenesis is the same: destruction of β-cells, impaired absorption of glucose by various tissues. Insufficient utilization of glucose leads to a violation of not only carbohydrate, but also fat and protein metabolism. The accumulation of glycosylation products in combination with other metabolic changes underlies the late complications of diabetes mellitus - diabetic angiopathy, retinopathy, neuropathy and nephropathy [1; 2; 3]. The most aggressive and prognostically severe type I diabetes mellitus (insulin-dependent diabetes mellitus) is considered. Insulin-dependent diabetes mellitus is a chronic autoimmune disease caused by the destruction of β-cells of pancreatic islets [4]. The disease affects children, adolescents and young people, but can begin at any age. A spontaneous autoimmune reaction occurs in individuals genetically predisposed to autoimmune disorders. However, in the vast majority (more than 90% of all cases), type I diabetes mellitus occurs due to the intervention of various provoking factors in the immune system, including toxic agents.
Общепринятые методы терапии аутоиммунного сахарного диабета - иммунодепрессия и инсулинотерапия, не излечивают больных и лишь тормозят развитие поздних осложнений. При введении экзогенного инсулина снижается риск развития различных диабетических осложнений. Тем не менее, экзогенным инсулином не возможно поддерживать уровень глюкозы в крови в пределах узкого физиологического диапазона подобно тому, как регулирует уровень глюкозы эндогенный инсулин, секретируемый β-клетками поджелудочной железы. С теоретической точки зрения наиболее эффективным способом восстановления клеток эндогенной и экзогенной секреции поджелудочной железы при аутоиммунном сахарном диабете и других его формах является трансплантация островков поджелудочной железы, изолированных β-клеток и других клеток, способных восстанавливать глюкозозависимую продукцию инсулина [5]. Однако хроническая нехватка донорских органов и необходимость сопутствующей иммунносупрессивной терапии ограничивают широкое применение таких трансплантаций.The generally accepted methods for the treatment of autoimmune diabetes mellitus - immunosuppression and insulin therapy, do not cure patients and only inhibit the development of late complications. With the introduction of exogenous insulin, the risk of developing various diabetic complications is reduced. However, with exogenous insulin it is not possible to maintain blood glucose levels within a narrow physiological range, similar to how glucose regulates endogenous insulin secreted by pancreatic β-cells. From a theoretical point of view, the most effective way to restore cells of endogenous and exogenous pancreatic secretion in autoimmune diabetes mellitus and its other forms is transplantation of pancreatic islets, isolated β-cells and other cells capable of restoring glucose-dependent insulin production [5]. However, chronic organ donation and the need for concomitant immunosuppressive therapy limit the widespread use of such transplants.
Альтернативой трансплантации поджелудочной железы и островков Лангерганса предлагается генерация инсулин-секретирующих клеток in vitro с последующей их трансплантацией больным диабетом I типа. Изучается вопрос о возможной генерации инсулин-секретирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток (СК) [6], мезенхимальных СК костномозгового происхождения [7, 8] и поджелудочной железы [9]. В качестве кандидатов для клеточной терапии диабета рассматриваются взрослые панкреатические α-клетки [10] и предшественники ацинарных клеток [11]. Однако, несмотря на получение в результате трансдифференцировки стволовых/клеток-предшественников мононуклеаров с морфологией и фенотипом подобным β-клеткам, авторы признаются, что инсулиновый ответ на глюкозу у них значительно менее интенсивный, чем у родных β-клеток. Известно, что клеточно-популяционная организация поджелудочной железы представлена мультипотентными прогениторными клетками и олигопотентными предшественниками эндокринных клеток [12]. Вместе с тем вопрос о регенераторном потенциале этих клеток при диабете до конца не изучен.An alternative to transplantation of the pancreas and islets of Langerhans is the in vitro generation of insulin-secreting cells, followed by their transplantation in patients with type I diabetes. The question of the possible generation of insulin-secreting cells from embryonic stem cells (SC) [6], mesenchymal SC of bone marrow origin [7, 8] and pancreas [9] is being studied. Adult pancreatic α-cells [10] and acinar cell precursors [11] are considered as candidates for the cellular therapy of diabetes. However, despite receiving mononuclear cells with a morphology and phenotype similar to β-cells as a result of transdifferentiation of stem / progenitor cells, the authors admit that their insulin response to glucose is significantly less intense than that of native β-cells. It is known that the cell-population organization of the pancreas is represented by multipotent progenitor cells and oligopotent precursors of endocrine cells [12]. At the same time, the question of the regenerative potential of these cells in diabetes has not been fully studied.
Таким образом, наиболее эффективным подходом, позволяющим восстановить популяцию эндогенно и экзогенно секретируемых клеток поджелудочной железы, может выступить фармакологическая стимуляция дифференцировки эндогенных СК и прогениторных β-клеток в инсулин-продуцирующие клетки.Thus, the most effective approach to restore the population of endogenously and exogenously secreted pancreatic cells can be pharmacological stimulation of the differentiation of endogenous SC and progenitor β-cells into insulin-producing cells.
Адекватных аналогов предлагаемый способ не имеет.The proposed method does not have adequate analogues.
Задачей данного изобретения является оценка способности мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы дифференцироваться в инсулин-продуцирующие β-клетки, что может оптимизировать поиск лекарственных средств, способных избирательно стимулировать их дифференцировку в секретирующие инсулин β-клетки I типа и ускорять процессы регенерации при сахарном диабете.The objective of this invention is to assess the ability of multipotent progenitor cells of the pancreas to differentiate into insulin-producing β-cells, which can optimize the search for drugs that can selectively stimulate their differentiation into insulin-secreting β-cells of type I and accelerate the regeneration processes in diabetes mellitus.
Поставленная задача решается тем, что выделяют взвесь неадгезирующих мононуклеаров клеток из ткани поджелудочной железы при сахарном диабете, в полученной взвеси оценивают количество мультипотентных прогениторных клеток, олигопотентных прогениторных клеток и инсулин-продуцирующих β-клеток, затем в течение 30 дней в присутствии ростовых факторов, 4 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл фактора роста гепатоцитов, наращивают клеточную массу мультипотентных прогениторных клеток, по окончании цикла культивирования глюкагон-подобным пептидом GLP-1, в концентрации 6,7 мкл/мл, индуцируют дифференцировку полученных in vitro мультипотентных прогениторных клеток в β-клетки, у полученных β-клеток оценивают интенсивность секреции инсулина и реакцию на глюкозу.The problem is solved in that a suspension of non-adherent mononuclear cells is isolated from pancreatic tissue in diabetes mellitus, the amount of multipotent progenitor cells, oligopotent progenitor cells and insulin-producing β-cells is estimated in the resulting suspension, then for 30 days in the presence of growth factors, 4 ng / ml epidermal growth factor, 10 ng / ml hepatocyte growth factor, increase the cell mass of multipotent progenitor cells, at the end of the glucagon-like cultivation cycle with a GLP-1 peptide, at a concentration of 6.7 μl / ml, differentiation of the obtained in vitro multipotent progenitor cells into β-cells is induced, and the intensity of insulin secretion and the response to glucose are estimated from the obtained β-cells.
Новым в предлагаемом способе является получение культуры мультипотентных прогениторных клеток диабетической поджелудочной железы, иммунофенотипическая и морфологическая оценка их способности дифференцироваться в β-клетки в присутствии специфических ростовых факторов, иммуноферментная оценка продукции и секреции инсулина у β-клеток, полученных в результате дифференцировки диабетических мультипотентных прогениторных клеток, в ответ на глюкозную нагрузку.New in the proposed method is to obtain a culture of multipotent progenitor cells of the diabetic pancreas, immunophenotypic and morphological assessment of their ability to differentiate into β-cells in the presence of specific growth factors, enzyme-linked immunosorbent assay for the production and secretion of insulin in β-cells obtained by differentiation of diabetic multipotent progenitor cells , in response to glucose load.
Разрушение инсулин-продуцирующих β-клеток имеет аутоиммунную природу и обусловлено врожденным отсутствием или потерей толерантности к аутоантигенам β-клеток. Причины аутоиммунного разрушения β-клеток до сих пор не выяснены. Однако совершенно ясно, что после запуска этого процесса активируется как клеточное, так и гуморальное звено иммунитета. К тому времени, когда обнаруживается гипергликемия, около 80-95% β-клеток погибает, возникает абсолютный дефицит инсулина. Оставшиеся и жизнеспособные β-клетки не способны обеспечивать требуемым для усвоения тканями глюкозы количеством инсулина. В результате этого развиваются тяжелые метаболические нарушения. В ряде случаев в качестве трансплантантов используют не островки, а предварительно культивированные микрофрагменты ткани поджелудочной железы. Алло- и ксетрансплантация микрофрагментов ткани поджелудочной железы у больных сахарном диабетом типа I мало эффективна.The destruction of insulin-producing β-cells has an autoimmune nature and is due to the congenital absence or loss of tolerance to β-cell autoantigens. The causes of autoimmune destruction of β-cells have not yet been elucidated. However, it is clear that after the start of this process, both the cellular and the humoral immunity link are activated. By the time hyperglycemia is detected, about 80-95% of β-cells are dying, there is an absolute deficiency of insulin. The remaining and viable β-cells are not able to provide the required amount of insulin for the absorption of glucose by the tissues. As a result of this, severe metabolic disturbances develop. In some cases, not islets are used as transplants, but pre-cultured microfragments of pancreatic tissue. Allo- and xetograft of microfragments of pancreatic tissue in patients with type I diabetes mellitus is not very effective.
В отличие от кроветворной ткани, печени, покровного эпителия и других быстро обновляющихся клеточных систем, поджелудочная железа - медленно обновляющаяся ткань. Генетическое отслеживание отдельных клонов клеток на разных стадиях панкреатогенеза позволило охарактеризовать мультипотентные прогениторные клетки, способные дифференцироваться в направлении клеток ацинусов, протоков и островков. Генетически мультипотентные прогениторные клетки представляли собой Pdx1+/Ptfla+/c-Myc+/Cpa1+-клетки [13]. Оценка экспрессии мембранных маркеров здоровых панкреатических клеток позволяет получать мультипотентные прогениторные клетки (экспрессия на поверхности рецептора к фактору роста гепатоцитов (c-Met), отсутствие антигенов гемопоэтических стволовых клеток и клеток эндотелия (Flk-1, c-Kit, CD45, TER119)) [12], олигопотентные предшественники с фенотипом CD133+/CD49flow и экспрессирующие на поверхности Ngn3 [14], монопотентные предшественники β-клеток (некоторые авторы называют их транзиторными клетками) [1]. Рассматривается вопрос о возможности формирования здоровыми мультипотентными прогениторными клетками и олигопотентными предшественниками в культуре КОЕ и эндокринных, и экзокринных клеток. В силу высокого пролиферативного потенциала и возможности дифференцироваться в направлении секреторных клеток в условиях оптимальной жизнедеятельности, наиболее интересными для использования в качестве мишени для фармакологического воздействия при патологии поджелудочной железы являются панкреатические мультипотентные прогениторные клетки. Между тем, вопрос об их использовании при сахарном диабете остается открытым.Unlike hematopoietic tissue, liver, integument epithelium and other rapidly renewing cellular systems, the pancreas is a slowly renewing tissue. Genetic tracking of individual cell clones at different stages of pancreatogenesis made it possible to characterize multipotent progenitor cells capable of differentiating in the direction of acinus, duct, and islet cells. Genetically multipotent progenitor cells were Pdx1 + / Ptfla + / c-Myc + / Cpa1 + cells [13]. Assessment of expression of membrane markers of healthy pancreatic cells allows to obtain multipotent progenitor cells (expression on the surface of the hepatocyte growth factor receptor (c-Met), the absence of hematopoietic stem and endothelial antigens (Flk-1, c-Kit, CD45, TER119)) [ 12], oligopotent precursors with the CD133 + / CD49f low phenotype and expressing Ngn3 on the surface [14], monopotent precursors of β-cells (some authors call them transient cells) [1]. The question of the possibility of forming healthy multipotent progenitor cells and oligopotent precursors in the culture of CFU and endocrine and exocrine cells is considered. Due to the high proliferative potential and the ability to differentiate in the direction of secretory cells under optimal life conditions, pancreatic multipotent progenitor cells are the most interesting for use as a target for pharmacological effects in pancreatic pathology. Meanwhile, the question of their use in diabetes remains open.
В этой связи, необходимость изучения потенциала к самоподдержанию и дифференцировки мультипотентных прогениторных клеток при сахарном диабете возрастает многократно, так как потенциальные возможности регионарных прогениторных клеток взрослого организма могут определять стратегию лечения.In this regard, the need to study the potential for self-maintenance and differentiation of multipotent progenitor cells in diabetes mellitus increases many times, since the potential capabilities of regional adult progenitor cells can determine the treatment strategy.
Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста.Distinctive features showed in the inventive combination of new properties that are not explicitly derived from the prior art in this field and are not obvious to a specialist.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.An identical set of features was not found in the analyzed patent and medical literature.
Способ может быть использован для изучения регенераторного потенциала мультипотентных прогениторных клеток поджелудочной железы с целью поиска потенциальных лекарственных средств для регенеративной медицины, в частности для лечения хронических заболеваний поджелудочной железы, связанных с поражением секретирующих инсулин β-клетки, механизм действия которых связан с индукцией дифференцировки панкреатических мультипотентных прогениторных клеток. Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».The method can be used to study the regenerative potential of multipotent progenitor cells of the pancreas in order to search for potential drugs for regenerative medicine, in particular for the treatment of chronic pancreatic diseases associated with damage to insulin-secreting β-cells, the mechanism of action of which is associated with the induction of differentiation of pancreatic multipotent progenitor cells. Based on the foregoing, the claimed invention meets the criteria for patentability of the invention of "Novelty", "Inventive step" and "Industrial applicability".
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на 5-недельных мышах линии С57В 1/6 в количестве 102 штук. Животные первой категории, инбредные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (сертификат имеется). Использование животных в экспериментах обосновано и согласовано с Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.The proposed method was studied in experiments on 5-week-old mice of the C57B 1/6 line in the amount of 102 pieces. Animals of the first category, inbred mice, were obtained from the nursery of the experimental biomedical modeling department of the Federal State Budgetary Institution Scientific Research Institute of Pharmacology named after E.D. Goldberg »SB RAMS (certificate available). The use of animals in experiments is justified and agreed with the Commission for the control of the maintenance and use of laboratory animals of the Federal State Budget Scientific Research Institute of Pharmacology SB RAMS.
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему рисунков 1, 2.The invention will be clear from the following description and the attached drawings 1, 2.
На рис. 1 изображены дот-плоты, представляющие данные анализа количественной и качественной экспрессии CD45, TER119, c-Kit, Flk-1, CD133, CD491flow, полученные с помощью флуоресцентной цитометрии, на неадгезирующих мононуклеарах поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 на 21-й день после последнего введения стрептозотоцина: 1 - интактные животные; 2 - животные с сахарным диабетом; A1, A2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119 на двухмерных гистограммах; Б1, Б2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119/c-Kit/Flk-1 на двухмерных гистограммах; B1, B2 - подтверждение фенотипа и качественный анализ экспрессии CD45/TER119/CD133/CD49f на двухмерных гистограммах.In fig. Figure 1 shows dot-rafts representing the data of quantitative and qualitative expression analysis of CD45, TER119, c-Kit, Flk-1, CD133, CD491f low , obtained by fluorescence cytometry, on non-adherent pancreatic mononuclear cells of 1/57 C57B mice on 21- day after the last injection of streptozotocin: 1 - intact animals; 2 - animals with diabetes; A1, A2 — phenotype confirmation and qualitative analysis of the expression of CD45 / TER119 on two-dimensional histograms; B1, B2 — phenotype confirmation and qualitative analysis of the expression of CD45 / TER119 / c-Kit / Flk-1 on two-dimensional histograms; B1, B2 - phenotype confirmation and qualitative analysis of the expression of CD45 / TER119 / CD133 / CD49f on two-dimensional histograms.
На рис. 2 изображена морфология клеточных ассоциаций, полученных в результате культивирования неадгезирующих мононуклеаров поджелудочной железы мышей линии С57В 1/6 на 21-й день после введения стрептозотоцина: А - интактные животные; Б - животные с сахарным диабетом. Увеличение ×100.In fig. 2 depicts the morphology of cell associations obtained by culturing non-adherent pancreatic mononuclear cells of 1/6 C57B mice on the 21st day after the administration of streptozotocin: A - intact animals; B - animals with diabetes. Magnification × 100.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Диабет моделировали стрептозотоцином («Sigma», USA). Препарат вводили после 4-часовой голодовки животных внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг в 250 мкл фосфатного буфера 1 раз в сутки в течение 5-ти дней. Контролировался диабет по уровню глюкозы в крови при помощи глюкометра SencoCard («77 Электроника Кфт», Венгрия) и по количеству инсулин-продуцирующих клеток в поджелудочной железе [15]. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 250 мкл фосфатного буфера. Противоопухолевый препарат стрептозотоцин разрушает секреторные клетки поджелудочной железы (в том числе β-клетки).Diabetes was modeled with streptozotocin (Sigma, USA). The drug was administered intraperitoneally after a 4-hour fasting of animals at a dose of 40 mg / kg in 250 μl of phosphate buffer 1 time per day for 5 days. Diabetes was controlled by blood glucose using a SencoCard glucometer (“77 Electronics Kft”, Hungary) and by the number of insulin-producing cells in the pancreas [15]. Animals of the control group were injected intraperitoneally with 250 μl of phosphate buffer. The antitumor drug streptozotocin destroys the secretory cells of the pancreas (including β-cells).
Уровень глюкозы в крови изучали за 24 ч до первого введения стрептозотоцина и на 21-й день после последнего введения стрептозотоцина. На 21-й день после последнего введения стрептозотоцина проводили эвтаназию мышей передозировкой СО2, выделяли поджелудочную железу, получали неприлипающие мононуклеары. Неприлипающие мононуклеары разделяли на 3 группы. У клеток 1 группы цитометрически изучали экспрессию CD45, TER119, CD117 (c-Kit), CD49f, Flk-1, CD133. Для анализа использовался прибор FACS Canto II с программным обеспечением FACS Diva («Becton Dickinson», США). У мононуклеаров 2 группы прижизненным окрашиванием дитизоном выявляли инсулин-продуцирующие клетки (Pancreatic Cell DTZ Detection Assay, США). У мононуклеаров 3 группы изучали потенциал к самоподдержанию при длительном культивировании. Для этого мононуклеары в количестве 1×106 вносили в культуральный флакон («ТРР Techno Plastic Products AG», Швейцария) и инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2, 100% влажность воздуха) в течение 30 дней в среду, содержащую 45% DMEM («Sigma», США), 45% DMEM/F-12 («Sigma», США), 10% инактивированной фетальной бычьей сывороткой («Sigma», США), 5 мг/л ITS+3 (смесь рекомбинантного человеческого инсулина, трансферина и селинита Na) («Sigma», США), 1×10-7 М дексаметозона («Sigma», США), 10 ммоль/л никотиновой кислоты («Sigma», США), 5 ммоль/л фосфатного буфера (HEPES) («Sigma», США) раствор антибиотиков 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («Sigma», США), 2 ммоль/л L-глутамина («Sigma», США), β-меркаптоэтанола 50 ммоль/л («Thermoscientific», США). Эпидермальный фактор роста 4 нг/мл («Sigma», США) и фактор роста гепатоцитов 10 нг/мл («Sigma», США) добавляли через 24 часа от начала культивирования. Каждые 3-4 дня проводили смену среды. По окончании цикла культивирования супернатанты от мононуклеаров собирали и исследовали уровень свободного инсулина. Инсулин измерялся методом иммуноферментного анализа («Monobind Inc», США).Blood glucose levels were studied 24 hours before the first administration of streptozotocin and on the 21st day after the last administration of streptozotocin. On the 21st day after the last injection of streptozotocin, mice were euthanized with an overdose of CO 2 , the pancreas was isolated, and non-adherent mononuclear cells were obtained. Non-adherent mononuclear cells were divided into 3 groups. In group 1 cells, the expression of CD45, TER119, CD117 (c-Kit), CD49f, Flk-1, CD133 was studied cytometrically. For analysis, we used a FACS Canto II instrument with FACS Diva software (Becton Dickinson, USA). In mononuclear cells of group 2, insulin-producing cells (Pancreatic Cell DTZ Detection Assay, USA) were revealed by intravital staining with dithizone. In mononuclear cells of 3 groups, the potential for self-maintenance was studied during prolonged cultivation. For this, 1 × 10 6 mononuclear cells were added to a culture bottle (TPP Techno Plastic Products AG, Switzerland) and incubated under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 , 100% air humidity) for 30 days on Wednesday containing 45% DMEM (Sigma, USA), 45% DMEM / F-12 (Sigma, USA), 10% inactivated fetal bovine serum (Sigma, USA), 5 mg / L ITS + 3 ( a mixture of recombinant human insulin, transferrin and Na selinite) (Sigma, USA), 1 × 10 -7 M dexamethosone (Sigma, USA), 10 mmol / L of nicotinic acid (Sigma, USA), 5 mmol / l phosphate buffer (HEPES) (Sigma, USA) antibiotic solution 100 e ./ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin ( «Sigma», USA), 2 mmol / L L-glutamine ( «Sigma», USA), β-mercaptoethanol, 50 mmol / l ( «Thermoscientific», USA). Epidermal growth factor 4 ng / ml (Sigma, USA) and
Полученные в результате культивирования мононуклеаров 3 группы клеток разделили на две подгруппы. У клеток 1 подгруппы оценивали экспрессию CD45, TER119, CD117 (c-kit), CD49f, Flk-1, CD133. У 0,5×106 клеток 2 подгруппы с использованием глюкагон-подобного пептида GLP-1 (7-37) («Sigma», США) (2 мг/кг) изучали дифференцировку в инсулин-продуцирующие клетки по методикам Bonner-Weir S. et al. (2000) и Suzuki A. et al. (2004), модифицированных для панкреатических мультипотентных прогениторных клеток. По окончании 30 дней у клеток 2 подгруппы прижизненным окрашиванием дитизоном выявляли инсулин-продуцирующие клетки и изучали секрецию инсулина. Оценивали базальный уровень секреции (при концентрации глюкозы в фосфатном буфере 3 ммоль/л) и секреторную активность в условиях повышения концентрации глюкозы до 20 ммоль/л у 1×106 мононуклеаров [16, 17].The resulting 3 groups of cells resulting from the cultivation of mononuclear cells were divided into two subgroups. In cells of the 1st subgroup, the expression of CD45, TER119, CD117 (c-kit), CD49f, Flk-1, CD133 was evaluated. In 0.5 × 10 6 cells of 2 subgroups using glucagon-like peptide GLP-1 (7-37) (Sigma, USA) (2 mg / kg), differentiation into insulin-producing cells was studied according to Bonner-Weir S methods . et al. (2000) and Suzuki A. et al. (2004), modified for pancreatic multipotent progenitor cells. At the end of 30 days, cells of the 2 subgroups by intravital staining with dithizone revealed insulin-producing cells and studied the secretion of insulin. The basal secretion level was estimated (at a glucose concentration in phosphate buffer of 3 mmol / L) and secretory activity under conditions of increasing glucose concentration to 20 mmol / L in 1 × 10 6 mononuclear cells [16, 17].
Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Манна-Уитни.Mathematical processing of the results was carried out using standard methods of variation statistics. Significance of differences was evaluated using parametric Student's t test or non-parametric Mann-Whitney U test.
ПримерExample
Проведенные эксперименты позволили показать, что курсовое введение стрептозотоцина вызывает изменения, свойственные для сахарного диабета I типа. Так, на 21-й день после последней инъекции препарата уровень глюкозы в крови у мышей С57В 1/6 поднимается до 18,0±1,7 ммоль/л (Р<0,001). Исходный уровень глюкозы составляет 7,5±0,8 ммоль/л. Окрашивание дитизоном демонстрирует разрушение панкреатических инсулин-продуцирующих клеток. По сравнению с животными интактного контроля их количество уменьшается в 5 раз (Р<0,01). Цитометрические исследования позволяют выявить во фракции неприлипающих мононуклеаров поджелудочной железы у интактных мышей и мышей при сахарном диабете клетки с фенотипом CD45-, TER119-, c-Kit-, Flk-1- (мультипотентные прогениторные клетки) и CD45-, TER119-, CD133+, CD49flow (олигопотентные предшественники β-клеток) (рис. 1). У больных мышей наблюдается значительное расширение популяции олигопотентных предшественников. При этом стрептозотоцин не влияет на мультипотентные прогениторные клетки (таблица 1).The experiments performed showed that the course administration of streptozotocin causes the changes characteristic of type I diabetes mellitus. So, on the 21st day after the last injection of the drug, the blood glucose level in 1/57 C57B mice rises to 18.0 ± 1.7 mmol / L (P <0.001). The initial glucose level is 7.5 ± 0.8 mmol / L. Dithizone staining demonstrates the destruction of pancreatic insulin-producing cells. Compared with animals of intact control, their number is reduced by 5 times (P <0.01). Cytometric studies reveal cells with the phenotype CD45 - , TER119 - , c-Kit - , Flk-1 - (multipotent progenitor cells) and CD45 - , TER119 - , CD133 + in the fraction of non-adherent pancreatic mononuclear cells in intact mice and diabetes mice , CD49f low (oligopotent β-cell precursors) (Fig. 1). Patient mice show a significant expansion in the population of oligopotent precursors. In this case, streptozotocin does not affect multipotent progenitor cells (table 1).
Как видно из представленных данных, на фоне гибели островковых β-клеток в поврежденной стрептозотоцином поджелудочной железе присутствуют мультипотентные прогениторные клетки и наблюдается расширение популяции олигопотентных предшественников β-клеток.As can be seen from the data presented, against the background of the death of islet β-cells in the pancreas damaged by streptozotocin, multipotent progenitor cells are present and an expansion of the population of oligopotent β-cell precursors is observed.
Клональный анализ показывает способность панкреатических неприлипающих мононуклеаров диабетических мышей образовывать клеточные агрегаты (колонии) при длительном культивировании - опытная группа (1 месяц) (рис. 2). Однако плотность колоний и клеточность в образцах опытной группы ниже (1 колония/240 клеток/см2), чем в культуре интактного контроля (7 колоний/602 клетки/см2) (Р<0,05). Мы проанализировали экспрессию антигенов стволовых и прогениторных β-клеток, полученных в результате культивирования. Оказалось, что содержание CD45-, TER119-, cKit-, Flk-1--клеток в культуре контрольной группы значительно больше, чем в свежевыделенной поджелудочной железе у мышей с сахарным диабетом (контрольная группа) (+29,24%, Р<0,05). При культивировании обогащение мультипотентными прогениторными клетками в образцах опытной группы происходит более интенсивно (+56,97%, Р<0,03), чем в образцах контрольной группы. В противоположность этому, популяция CD45-, TER119-, CD133+, CD49flow-клеток в культуре опытной группы сокращается (-65,6%; Р<0,02) (таблица 1). Прижизненное окрашивание дитизоном мононуклеаров, полученных в результате культивирования, не выявило инсулин-продуцирующих клеток в контрольных и опытных образцах. В супернатантах не определяется инсулин.Clonal analysis shows the ability of pancreatic non-adherent mononuclear cells of diabetic mice to form cell aggregates (colonies) during prolonged cultivation - the experimental group (1 month) (Fig. 2). However, the density of the colonies and the cellularity in the samples of the experimental group is lower (1 colony / 240 cells / cm 2 ) than in the culture of the intact control (7 colonies / 602 cells / cm 2 ) (P <0.05). We analyzed the expression of stem and progenitor β-cell antigens obtained by cultivation. It turned out that the content of CD45 - , TER119 - , cKit - , Flk-1 - cells in the culture of the control group was significantly higher than in the freshly isolated pancreas in mice with diabetes mellitus (control group) (+ 29.24%, P <0 , 05). During cultivation, enrichment with multipotent progenitor cells in the samples of the experimental group occurs more intensively (+ 56.97%, P <0.03) than in the samples of the control group. In contrast, the population of CD45 - , TER119 - , CD133 + , CD49f low- cells in the culture of the experimental group is reduced (-65.6%; P <0.02) (table 1). Intravital dithizone staining of mononuclear cells obtained by cultivation did not reveal insulin-producing cells in the control and experimental samples. Insulin is not detected in supernatants.
Итак, культивирование позволяет наращивать панкреатические мультипотентные прогениторные клетки от мышей с диабетом, что указывает на их способность к самоподдержанию. При этом в образцах сокращается количество более зрелых олигопотентных предшественников β-клеток, не выявлены инсулин и инсулин-продуцирующие клетки.So, cultivation allows you to build pancreatic multipotent progenitor cells from mice with diabetes, which indicates their ability to self-sustain. At the same time, the number of more mature oligopotent precursors of β-cells is reduced in the samples, insulin and insulin-producing cells have not been detected.
У полученных в результате культивирования мультипотентных прогениторных клеток изучали способность дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки (дитизон-положительные) в присутствии GLP-1 (7-37) in vitro. Полученные данные показывают, что по окончании цикла дифференцировки количество дитизон-положительных клеток в культуре опытной группы (предварительно обогащенной мультипотентными прогениторными клетками) более чем в 10 раз превышает (Р<0,001) их уровень в образцах интактного контроля (таблица 1). Биохимическое исследование позволило выявить инсулин в супернатантах от дитизон-положительных клеток контрольной и опытной группы под влиянием глюкозы в минимальной концентрации (3 ммоль/л). При повышении концентрации глюкозы до 20 ммоль/л увеличивается и уровень гормона в исследуемых жидкостях. Следует отметить, что базальный уровень инсулина и уровень инсулина при повышенной нагрузке в опытных образцах достоверно превосходит таковой в контрольной группе (таблица 2).The ability to differentiate into insulin-producing cells (dithizone-positive) in the presence of GLP-1 (7-37) in vitro was studied in cultured multipotent progenitor cells. The data obtained show that at the end of the differentiation cycle, the number of dithizone-positive cells in the culture of the experimental group (previously enriched with multipotent progenitor cells) is more than 10 times (P <0.001) their level in intact control samples (table 1). A biochemical study revealed insulin in supernatants from dithizone-positive cells of the control and experimental groups under the influence of glucose in a minimum concentration (3 mmol / L). With an increase in glucose concentration to 20 mmol / L, the hormone level in the studied fluids also increases. It should be noted that the basal level of insulin and insulin level at increased load in the experimental samples significantly exceeds that in the control group (table 2).
Таким образом, исследование демонстрирует, что мультипотентные предшественники β-клеток (CD45-, TER119-, c-Kit-, Flk-1-) поджелудочной железы мышей со стрептозотоцин-индуцированным диабетом могут дифференцироваться в направлении инсулин-продуцирующих клеток, способных секретировать гормон инсулин в ответ на глюкозную нагрузку.Thus, the study demonstrates that the multipotent precursors of β-cells (CD45 - , TER119 - , c-Kit - , Flk-1 - ) of the pancreas of mice with streptozotocin-induced diabetes can differentiate in the direction of insulin-producing cells capable of secreting the hormone insulin in response to glucose load.
Предлагаемый способ позволяет получить и определить способность к дифференцировке мультипотентных прогениторных клеток диабетической поджелудочной железы в секретирующие инсулин β-клетки, что поможет оценить выраженность поражения панкреатической железы и стратегию лечения сахарного диабета, основанную на избирательной стимуляции эндогенных мультипотентных прогениторных клеток больного.The proposed method allows to obtain and determine the ability to differentiate multipotent progenitor cells of a diabetic pancreas into insulin-secreting β-cells, which will help to assess the severity of pancreatic lesions and a diabetes treatment strategy based on the selective stimulation of endogenous multipotent progenitor cells of a patient.
ЛитератураLiterature
1. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 2 / Под ред. М.А. Пальцева. - М.: ОАО Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - 456 с.: ил. (Учеб. Лит. Для студ. Мед. вузов).1. Stem cell biology and cell technology. Volume 2 / Ed. M.A. Finger - M .: OJSC Publishing house "Medicine", publishing house "Shiko", 2009. - 456 p.: Ill. (Textbook. Lit. For the student. Medical. High schools).
2. Дедов И.И. Сахарный диабет - опаснейший вызов мировому сообществу // Вестник РАМН. - 2012. - Т. 1. - С. 7-13.2. Grandfather II Diabetes mellitus - the most dangerous challenge to the world community // Vestnik RAMS. - 2012. - T. 1. - S. 7-13.
3. Готье С.В. Сахарный диабет 1 типа, диабетическая невропатия: возможности трансплантологии. Вестник РАМН. - 2012. - Т. 1. - С. 54-60.3. Gauthier S.V. Type 1 diabetes mellitus, diabetic neuropathy: the possibilities of transplantology. Bulletin of RAMS. - 2012. - T. 1. - S. 54-60.
4. Atkinson М.А., Eisenbarth G.S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. // Lancet. - 2001. - V. 358. - P. 221-229.4. Atkinson M.A., Eisenbarth G.S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. // Lancet. - 2001. - V. 358. - P. 221-229.
5. Inverardi L., Kenyon N.S., Ricordi C. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user′s guide. // Stem Cells. - 2010. - Dev19. - P. 1449-1470.5. Inverardi L., Kenyon N.S., Ricordi C. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. // Stem Cells. - 2010 .-- Dev19. - P. 1449-1470.
6. Minami К., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. // Journal of Diabetes investigation. - 2013. - V. 4 (2). - P. 131-141.6. Minami K., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. // Journal of Diabetes investigation. - 2013 .-- V. 4 (2). - P. 131-141.
7. Dominguez-Bendala J., Lanzoni G., Inverardi L., Ricordi C. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells for Diabetes. // Stem cells Translation Medicine. - 2012. - V. 1. - P. 59-63.7. Dominguez-Bendala J., Lanzoni G., Inverardi L., Ricordi C. Concise Review: Mesenchymal Stem Cells for Diabetes. // Stem cells Translation Medicine. - 2012. - V. 1. - P. 59-63.
8. Zanini С., Bruno S., Mandili G., Baci D., Cerutti F., Cenacchi G., Izzi L., Camussi G., Forni M. Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Pancreatic Islets and Bone Marrow into Islet-Like Cell Phenotype. // PLoS One. - 2011. - V. 6(12). - e28175.8. Zanini S., Bruno S., Mandili G., Baci D., Cerutti F., Cenacchi G., Izzi L., Camussi G., Forni M. Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Pancreatic Islets and Bone Marrow into Islet-Like Cell Phenotype. // PLoS One. - 2011 .-- V. 6 (12). - e28175.
9. Gopurappilly R., Bhat V., Bhonde R. Pancreatic tissue resident mesenchymal stromal cell (MSC)-like cells as a source of in vitro islet neogenesis. // J Cell biochem. - 2013. - Apr 19. Doi: 10. 1002/jcb. 24572. [Epub ahead of print].9. Gopurappilly R., Bhat V., Bhonde R. Pancreatic tissue resident mesenchymal stromal cell (MSC) -like cells as a source of in vitro islet neogenesis. // J Cell biochem. - 2013. - Apr 19. Doi: 10. 1002 / jcb. 24572. [Epub ahead of print].
10. Chung C.H., Levine F. Adult Pancreatic Alpha-Cells: A New Soorce of Cells for Beta-Cells Regeneration. // Rev Diabet Stud. - 2010. - V. 7(2). - P. 124-131.10. Chung C. H., Levine F. Adult Pancreatic Alpha-Cells: A New Soorce of Cells for Beta-Cells Regeneration. // Rev Diabet Stud. - 2010 .-- V. 7 (2). - P. 124-131.
11. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki К., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007. - V. 292(1). - P. 158-165.11. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007 .-- V. 292 (1). - P. 158-165.
12. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. Prospective Isolation of Multipotent Pancreatic Progenitors Using Flow-Cytometric Cell Sorting. // Diabetes. - 2004. - V. 53, N8. - P. 2143-2152.12. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. Prospective Isolation of Multipotent Pancreatic Progenitors Using Flow-Cytometric Cell Sorting. // Diabetes. - 2004 .-- V. 53, N8. - P. 2143-2152.
13. Zhou Q., Law A.C., Rajagopal J. et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis // Dev. Cell. - 2007. - Vol. 13. - P. 103-114.13. Zhou Q., Law A.C., Rajagopal J. et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis // Dev. Cell. - 2007. - Vol. 13. - P. 103-114.
14. Sugiyama Т., Rodriguez R.T., McLean G.W., Kim S.K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FASC // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. - Vol. 104. - P. 175-180.14. Sugiyama T., Rodriguez R.T., McLean G.W., Kim S.K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FASC // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2007. - Vol. 104. - P. 175-180.
15. Akira S., Masahide Y., Hiroshi Y. et al., Identification of insulinproducing cells derived from embryonic stem cells by zinc-chelating dithizone. // Stem Cells. - 2002. - V. 20. - P. 284-292.15. Akira S., Masahide Y., Hiroshi Y. et al., Identification of insulin producing cells derived from embryonic stem cells by zinc-chelating dithizone. // Stem Cells. - 2002. - V. 20. - P. 284-292.
16. Minami К., Okuno M., Miyawaki K., Okumachi A., Ishizaki K., Oyama K., Kawaquchi M., Ishizuka N., Iwanaqa Т., Seino S. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005. - V. 102(42). - P. 15116-15121.16. Minami K., Okuno M., Miyawaki K., Okumachi A., Ishizaki K., Oyama K., Kawaquchi M., Ishizuka N., Iwanaqa T., Seino S. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005 .-- V. 102 (42). - P. 15116-15121.
17. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007. - V. 292(1). - P. 158-165.17. Okuno M., Minami K., Okumachi A., Miyawaki K., Yokoi N., Toyokuni S., Seino S. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. // Am J Physiol Endocrinol Metab. - 2007 .-- V. 292 (1). - P. 158-165.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014130726/10A RU2579997C2 (en) | 2014-07-24 | 2014-07-24 | Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014130726/10A RU2579997C2 (en) | 2014-07-24 | 2014-07-24 | Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014130726A RU2014130726A (en) | 2016-02-20 |
| RU2579997C2 true RU2579997C2 (en) | 2016-04-10 |
Family
ID=55313332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014130726/10A RU2579997C2 (en) | 2014-07-24 | 2014-07-24 | Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2579997C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2825665C2 (en) * | 2018-04-23 | 2024-08-28 | Оризуру Терапьютикс, Инк. | Growth inhibitor |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2636044C1 (en) * | 2016-05-26 | 2017-11-17 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольберга" | Means for stimulation of differentiation of pancreatic progenitors of beta-cells into insulin producing and secreting beta-cell in case of insulin-dependent diabetes mellitus |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202080B2 (en) * | 2001-03-29 | 2007-04-10 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway |
| EP1438418B1 (en) * | 2001-09-26 | 2010-11-24 | The General Hospital Corporation | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| WO2012025914A1 (en) * | 2010-08-22 | 2012-03-01 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic beta cells |
| RU2465323C2 (en) * | 2007-07-18 | 2012-10-27 | Лайфскен, Инк. | Differentiation of human embryonic stem cells |
-
2014
- 2014-07-24 RU RU2014130726/10A patent/RU2579997C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202080B2 (en) * | 2001-03-29 | 2007-04-10 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway |
| EP1438418B1 (en) * | 2001-09-26 | 2010-11-24 | The General Hospital Corporation | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| RU2465323C2 (en) * | 2007-07-18 | 2012-10-27 | Лайфскен, Инк. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| WO2012025914A1 (en) * | 2010-08-22 | 2012-03-01 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic beta cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СКУРИХИН Е. Г. и др., Дифференцировка стволовых и прогениторных бета-клеток поджелудочной железы в инсулинсекретирующие клетки у мышей при сахарном диабете, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013, Т.156, N 12, С.681-686. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2825665C2 (en) * | 2018-04-23 | 2024-08-28 | Оризуру Терапьютикс, Инк. | Growth inhibitor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014130726A (en) | 2016-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Current progress in stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus | |
| Du et al. | Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates | |
| Lee et al. | Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells | |
| Lechner et al. | Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus | |
| Petropavlovskaia et al. | Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells? | |
| Márquez-Aguirre et al. | Development of the endocrine pancreas and novel strategies for β-cell mass restoration and diabetes therapy | |
| CZ2004696A3 (en) | Endocrine pancreatic differentiation of adipose-derived stromal cells and its use | |
| WO2003054171A1 (en) | Method for differentiating islet precursor cells into beta cells | |
| Corritore et al. | β-cell replacement sources for type 1 diabetes: a focus on pancreatic ductal cells | |
| JP2023133612A (en) | Improved methods for pancreatic islet transplantation | |
| Yang et al. | Immunogenicity of insulin-producing cells derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| Dave et al. | Extrinsic factors promoting in vitro differentiation of insulin-secreting cells from human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells | |
| Cañibano-Hernández et al. | Hyaluronic acid promotes differentiation of mesenchymal stem cells from different sources toward pancreatic progenitors within three-dimensional alginate matrixes | |
| Nemati et al. | Efficiency of stem cell (SC) differentiation into insulin‐producing cells for treating diabetes: a systematic review | |
| Yagi Mendoza et al. | Regeneration of insulin-producing islets from dental pulp stem cells using a 3D culture system | |
| Peck et al. | Generation of islets of Langerhans from adult pancreatic stem cells | |
| Du et al. | Engineering islets from stem cells: the optimal solution for the treatment of diabetes? | |
| Skurikhin et al. | Differentiation of pancreatic stem and progenitor β-cells into insulin secreting cells in mice with diabetes mellitus | |
| RU2579997C2 (en) | Method of inducing targeted differentiation of multipotent progenitor cells of pancreas in insulin-producing beta cells during diabetes | |
| US20250002863A1 (en) | Method of generating functional islets from pluripotent stem cells | |
| Rohban et al. | Advanced therapy to cure diabetes: mission impossible is now possible? | |
| Buang et al. | In vitro generation of functional insulin-producing cells from lipoaspirated human adipose tissue-derived stem cells | |
| Lan et al. | Islet-like clusters derived from skeletal muscle-derived stem/progenitor cells for autologous transplantation to control type 1 diabetes in mice | |
| Palma et al. | Blood into β-cells: can adult stem cells be used as a therapy for type 1 diabetes? | |
| Carlotti et al. | β‐Cell Generation: Can Rodent Studies Be Translated to Humans? |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160725 |