RU2576812C2 - Ингибитор тирозиназы, полученный с использованием сухого порошка из дождевых червей, и способ его получения - Google Patents
Ингибитор тирозиназы, полученный с использованием сухого порошка из дождевых червей, и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2576812C2 RU2576812C2 RU2014107467/15A RU2014107467A RU2576812C2 RU 2576812 C2 RU2576812 C2 RU 2576812C2 RU 2014107467/15 A RU2014107467/15 A RU 2014107467/15A RU 2014107467 A RU2014107467 A RU 2014107467A RU 2576812 C2 RU2576812 C2 RU 2576812C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- earthworms
- minutes
- tyrosinase
- water
- tyrosinase inhibitor
- Prior art date
Links
- 101710147108 Tyrosinase inhibitor Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 239000000843 powder Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 22
- 241000361919 Metaphire sieboldi Species 0.000 title description 25
- 241001233061 earthworms Species 0.000 claims abstract description 118
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 21
- 229910001510 metal chloride Inorganic materials 0.000 claims description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 59
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 54
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 41
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 25
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 21
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 239000000306 component Substances 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 10
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 241001495098 Lumbricus rubellus Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 5
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 5
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyglutaric acid Chemical compound OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- -1 thiol compounds Chemical class 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropionic acid Chemical compound OCCC(O)=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AHMIDUVKSGCHAU-LURJTMIESA-N L-dopaquinone Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC(=O)C(=O)C=C1 AHMIDUVKSGCHAU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N isomaltol Natural products CC(=O)C=1OC=CC=1O HPIGCVXMBGOWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 2
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQHYXNSQOIDNTL-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyglutaric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CC(O)=O ZQHYXNSQOIDNTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001262938 Allolobophora Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000357261 Dendrobaena octaedra Species 0.000 description 1
- 241000679539 Drawida Species 0.000 description 1
- 241000243686 Eisenia fetida Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014970 Ephelides Diseases 0.000 description 1
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 150000000996 L-ascorbic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 241001478739 Ledebouria socialis Species 0.000 description 1
- 241001290772 Limnodrilus Species 0.000 description 1
- 241000243662 Lumbricus terrestris Species 0.000 description 1
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 1
- 241000361908 Metaphire hilgendorfi Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241000237636 Pheretima Species 0.000 description 1
- 241000881741 Pontodrilus Species 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 206010042496 Sunburn Diseases 0.000 description 1
- 241000243653 Tubifex Species 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000003048 aphrodisiac agent Substances 0.000 description 1
- 230000002509 aphrodisiac effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 229940030606 diuretics Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960004337 hydroquinone Drugs 0.000 description 1
- 238000010335 hydrothermal treatment Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 230000004215 skin function Effects 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/62—Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
- A61K8/0216—Solid or semisolid forms
- A61K8/022—Powders; Compacted Powders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
- A61K8/987—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of species other than mammals or birds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Birds (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения ингибитора тирозиназы. Способ получения ингибитора тирозиназы включает этапы создания контакта живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты, разбавления полученной смеси водой для доведения рН до 2-5 и последующего выдерживания полученной разведенной смеси в течение 3-180 минут, или создания контакта живых дождевых червей с водным раствором гидроксикарбоновой кислоты, имеющим рН 2-5, и последующего выдерживания полученной смеси в течение 3-180 минут; с последующим промыванием живых дождевых червей водой, измельчением промытых дождевых червей и последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта. Косметическое средство, содержащее ингибитор тирозиназы. Вышеописанный способ позволяет получить высокобезопасный ингибитор тирозиназы, обладающий повышенной ингибирующей тирозиназу активностью. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 10 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к ингибитору тирозиназы, полученному с использованием сухого порошка из дождевых червей, и к способу получения ингибитора тирозиназы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к безопасному и высокоэффективному ингибитору тирозиназы, полученному с использованием сухого порошка из дождевых червей, и к способу получения ингибитора тирозиназы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В то время как средства против старения кожи становятся все более востребованными в связи с продолжающимся в последнее время старением общества, интерес к красоте собственной кожи значительно возрастает и у молодых людей. В связи с этим возрастает важность косметических средств, особенно средств для отбеливания кожи.
Внутренние факторы, такие как старение, и внешние факторы, такие как ультрафиолет и активный кислород, вызывают истощение различных функций кожи, которые изначально поддерживались, что приводит к возникновению различных проблем. Примером кожных проблем является пигментация кожи, обусловленная пятнами, веснушками, солнечными ожогами и тому подобным. Считают, что основной причиной пигментации является образование предшественника меланина в результате ферментативной реакции тирозина, присутствующего в коже, с последующим образованием меланина вследствие окисления.
Вещества, подавляющие выработку меланина, можно условно разделить на два вида. Одним из них является тот, который непосредственно подавляет саму активность фермента тирозиназы, влияющего на выработку меланина, а другим является тот, который не подавляет непосредственно активность тирозиназы, но подавляет образование меланина в пигментных клетках. Существуют также вещества, проявляющие обе активности. Примеры общеизвестных компонентов, которые обладают подавляющей выработку меланина активностью и эффективны для предотвращения или уменьшения пигментации, включают аскорбиновую кислоту, глутатион и гидрохинон, а также различные другие натуральные компоненты растительного происхождения, предложенные до настоящего времени (например, патентные документы 1 и 2).
С другой стороны, экстракты из дождевых червей и сухие порошки из дождевых червей использовали с древних времен, главным образом, в восточных странах в качестве профилактических средств и лекарственных средств против различных заболеваний, и примеры известных на сегодняшний день вариантов их применения включают использование в качестве средств для уменьшения камней в мочевом пузыре и средств, способствующих выведению камней из мочевого пузыря, лекарственных средств против желтухи, средств, стимулирующих родовую деятельность, тонизирующих средств, средств, способствующих росту волос, афродизиаков, жаропонижающих средств, противосудорожных лекарственных средств, средств, стимулирующих кровообращение, лекарственных средств против гемиплегии, непрямых анальгетиков, диуретиков, лекарственных средств против бронхиальной астмы и лекарственных средств против гипертензии.
В патентном документе 3 раскрыто, что экстракты из дождевых червей, полученные путем гидротермальной обработки с последующей экстракцией органическим растворителем или путем гидролитической экстракции, обладают способностью подавлять активность тирозиназы.
ДОКУМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ПРИ ЭКСПЕРТИЗЕ ЗАЯВКИ
[Патентные документы]
[Патентный документ 1] Публикация японской нерассмотренной патентной заявки №2011-032173
[Патентный документ 2] Публикация японской нерассмотренной патентной заявки №2011-037764
[Патентный документ 3] Публикация японской нерассмотренной патентной заявки №S63-238009
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Однако среди веществ, которые подавляют выработку меланина, аскорбиновые кислоты являются проблематичными с точки зрения их стабильности. Они нестабильны в водных системах и могут вызывать изменения цвета или изменения запаха. Проблемы с тиоловыми соединениями, такими как глутатион, заключаются в том, например, что они имеют неприятный запах и легко окисляются. Кроме того, гидрохинон небезопасен для кожи.
Помимо этого, среди экстрактов из дождевых червей, описанных в вышеуказанном патентном документе 3, те, которые получены путем нагревания и измельчения дождевых червей с последующей экстракцией органическим растворителем, имеют проблему, связанную с остаточным органическим растворителем, а те, которые получены путем гидролитической экстракции (обработки ферментом), не являются предпочтительными с точки зрения смешивания с косметическими средствами или с наружными препаратами для кожи, которые наносят на кожу в течение длительного периода времени, поскольку, в конечном счете, экстракты получают путем обработки раствором цетилпиридиния хлорида или этанола. Кроме того, ингибирующая тирозиназу активность экстрактов дождевых червей, полученных способом, описанным в патентном документе 3, по-прежнему является неудовлетворительной.
Таким образом, целью настоящего изобретения является предложение способа получения ингибитора тирозиназы, позволяющего получать высокобезопасный ингибитор тирозиназы, обладающий превосходной ингибирующей тирозиназу активностью, и косметических средств, полученных с использованием ингибитора тирозиназы, полученного указанным способом.
В результате интенсивных исследований для решения вышеупомянутой проблемы авторы настоящего изобретения установили, что компонент из дождевых червей, полученный путем специальной обработки живых дождевых червей с последующим измельчением полученного продукта, обладает превосходной ингибирующей тирозиназу активностью, и тем самым осуществили настоящее изобретение.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
Таким образом, способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению включает этапы создания контакта живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты, разбавления полученной смеси водой для доведения рН до 2-5 и последующего выдерживания полученной разведенной смеси в течение 3-180 минут, или создания контакта живых дождевых червей с водным раствором гидроксикарбоновой кислоты, имеющим рН 2-5, и последующего выдерживания полученной смеси в течение 3-180 минут; с последующим промыванием живых дождевых червей водой, измельчением промытых дождевых червей, и последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта.
Способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению предпочтительно включает этап создания контакта живых дождевых червей с хлорид(ами) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция, где этот этап выполняют до создания контакта живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты или водным раствором гидроксикарбоновой кислоты.
Кроме того, способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению предпочтительно включает этап выдерживания живых дождевых червей в освещенном месте в течение 10-50 часов и последующего отделения грязи, приставшей к поверхности их тела, где этот этап выполняют до создания контакта живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты или водным раствором гидроксикарбоновой кислоты.
В способе получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению лиофилизацию предпочтительно проводят путем замораживания измельченного продукта при температуре от -18°C до -35°C в течение 20-240 часов с последующей лиофилизацией полученного продукта в вакууме.
Кроме того, способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению предпочтительно включает этап растворения лиофилизированного измельченного продукта в воде или водном растворе этанола с последующим удалением или отделением нерастворимой фракции.
Косметические средства по настоящему изобретению получают с использованием ингибитора тирозиназы, полученного любым из вышеуказанных способов получения ингибитора тирозиназы.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения ингибитора тирозиназы без применения органического растворителя или тому подобного, позволяющему получать высокобезопасный ингибитор тирозиназы, обладающий превосходной ингибирующей тирозиназу активностью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примеров 1 и 2.
Фиг.2 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примера 6.
Фиг.3 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примера 7.
Фиг.4 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примера 8.
Фиг.5 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примера 9.
Фиг.6 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примера 10.
Фиг.7 представляет собой графическую диаграмму, демонстрирующую результаты примера 10.
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению включает этапы создания контакта живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты, разбавления полученной смеси водой для доведения рН до 2-5 и последующего выдерживания полученной разведенной смеси в течение 3-180 минут, или создания контакта живых дождевых червей с водным раствором гидроксикарбоновой кислоты, имеющим рН 2-5, и последующего выдерживания полученной смеси в течение 3-180 минут; с последующим промыванием живых дождевых червей водой, измельчением промытых дождевых червей, и последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта.
Кроме того, способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению предпочтительно включает этапы создания контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; а затем
создания контакта живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты, разбавления полученной смеси водой для доведения рН до 2-5 и последующего выдерживания полученной разведенной смеси в течение 3-180 минут, или создания контакта живых дождевых червей с водным раствором гидроксикарбоновой кислоты, имеющим рН 2-5, и последующего выдерживания полученной смеси в течение 3-180 минут; с последующим промыванием живых дождевых червей водой, измельчением промытых дождевых червей, и последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта.
Способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению представляет собой способ, позволяющий получать высокобезопасный ингибитор тирозиназы, обладающий превосходной ингибирующей тирозиназу активностью, с использованием живых дождевых червей.
В способе получения по настоящему изобретению перед обработкой, заключающейся в помещении живых дождевых червей в дискомфортные условия, то есть перед созданием контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) металла или гидроксикарбоновой кислотой(ами), живых дождевых червей предпочтительно переносят в плоский контейнер, такой как контейнер для хлеба, и оставляют в освещенном месте на 10-50 часов, с последующим удалением грязи с поверхности их тел. Срок, в течение которого дождевых червей оставляют в освещенном месте, составляет, более предпочтительно, от 12 до 24 часов. Что касается количества дождевых червей, выдерживаемых в течение данного периода времени, то дождевых червей предпочтительно укладывают так, чтобы толщина слоя составляла примерно от 30 до 60 мм, предпочтительно примерно от 40 до 50 мм. В этот плоский контейнер не допускают попадания чужеродных веществ, таких как песок и грязь, и внутри контейнера предпочтительно поддерживают освещенность в ночное время за счет искусственного освещения или тому подобного, поскольку дождевые черви ведут ночной образ жизни и становятся активными в темное время суток, что может приводить к физическому истощению. В результате этой процедуры живые дождевые черви проявляют свой инстинкт самосохранения и выделяют продукты пищеварения, остающиеся в пищеварительном тракте, которыми полностью покрываются их тела для предотвращения испарения влаги и поддержания тем самым их среды обитания. Таким образом, путем периодического удаления этой покрывающей их грязи, то есть, экскрементов, соответствующим способом, можно в конечном итоге удалить продукты пищеварения из пищеварительного тракта и грязь, приставшую к поверхности тела.
Грязь, приставшую к поверхности тела дождевых червей, можно удалять, например, покрывая живых дождевых червей нетканым материалом, впитывающим грязь. За счет сочетания такого выдерживания дождевых червей в освещенном месте с последующим удалением грязи, приставшей к поверхности их тела, и создания контакта дождевых червей с хлоридом(ами) металла и/или гидроксикарбоновой кислотой(ами), можно ожидать дальнейшей экскреции и удаления токсических веществ из организма дождевых червей.
Хлорид(ы) металла, используемые в другом способе получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению, представляет/представляют собой хлорид(ы) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция. То есть хлорид(ы) металла представляет/представляют собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, состоящей из хлорида калия, хлорида натрия, хлорида магния и хлорида кальция. Кроме того, хлорид(ы) металла могут представлять собой смесь двух или более из них, или могут представлять собой смесь одного или более из них и одного или более безвредных компонентов, которые можно добавлять к пище. Примеры такой смеси включают диетические соли, каменные соли и осадочные морские соли. Вышеописанный(е) хлорид(ы) металла можно использовать путем посыпания его/их порошком живых дождевых червей, и в результате этого создается контакт дождевых червей с хлоридом(ами) металла.
В другом способе получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы был создан контакт живых дождевых червей с гидроксикарбоновой кислотой(ами) после создания контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) металла. Альтернативно, способ получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению можно осуществлять путем создания контакта живых дождевых червей с гидроксикарбоновой кислотой(ами) без создания контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) металла.
Контакт с гидроксикарбоновой кислотой(ами) можно также создавать путем посыпания порошком гидроксикарбоновой кислоты(кислот) живых дождевых червей. Альтернативно, живых дождевых червей можно погружать в водной раствор гидроксикарбоновой кислоты, имеющий рН 2-5. В случаях, когда контакт с гидроксикарбоновой кислотой(ами) создают после контакта с хлоридом(ами) металла, контакт с гидроксикарбоновой кислотой(ами) создают сразу после контакта с вышеописанным хлоридом(ами) металла.
Кроме того, перед созданием контакта живых дождевых червей с гидроксикарбоновой кислотой(ами) дождевых червей предпочтительно промывают водой. Удаление хлорида(ов) металла путем промывания водой с последующим созданием контакта живых дождевых червей с гидроксикарбоновой кислотой(ами) позволяет получать сухой порошок из дождевых червей, обладающий высокой ферментативной активностью. В случаях, когда дождевых червей промывают водой перед контактом с гидроксикарбоновой кислотой(ами), дождевых червей промывают водой предпочтительно в течение 30 минут, более предпочтительно в течение 20 минут после контакта с хлоридом(ами) металла. Способ промывания водой не имеет ограничений, и можно использовать любой известный способ.
В случаях, когда живые дождевые черви находятся в контакте с порошком гидроксикарбоновой кислоты(кислот) в течение длительного времени, их жизненные функции утрачиваются и продукты пищеварения из пищеварительного тракта не экскретируются. Вследствие этого, гидроксикарбоновую кислоту(ы) следует разводить водой как можно скорее, предпочтительно в течение 30 секунд, более предпочтительно в течение 20 секунд, чтобы довести рН до 2-5.
Поскольку гидроксикарбоновая (ые) кислота(ы) создает(ют) дискомфортную среду обитания для дождевых червей, живые дождевые черви пытаются улучшить среду обитания путем экскреции из организма жидкостей и экскрементов, следуя инстинкту самосохранения. Кроме того, поскольку гидроксикарбоновые кислоты обладают бактерицидными свойствами, предполагается, что они не только играют роль в стимуляции экскреции продуктов пищеварения и тому подобного из пищеварительного тракта, как описано выше, но также уничтожают бактерий на поверхности дождевых червей.
Кристаллическая гидроксикарбоновая кислота, используемая в способе по настоящему изобретению, не имеет ограничений по числу в ней гидрокси-групп и карбоксильных групп при условии, что гидроксикарбоновая кислота находится в виде кристаллического тела в условиях ее использования. То есть кристаллическая гидроксикарбоновая кислота может быть любой из моногидроксимонокарбоновой кислоты, моногидроксиполикарбоновой кислоты, полигидроксимонокарбоновой кислоты и полигидроксиполикарбоновой кислоты.
Примеры гидроксикарбоновой кислоты(кислот), используемой(мых) по настоящему изобретению, включают гликолевую кислоту, молочную кислоту, уксусную кислоту, β-гидроксипропионовую кислоту, α-гидрокси-н-масляную кислоту, β-гидрокси-н-масляную кислоту, α-гидрокси-н-валериановую кислоту, β-гидрокси-н-валериановую кислоту, яблочную кислоту, α-метиляблочную кислоту, α-гидроксиглутаровую кислоту, β-гидроксиглутаровую кислоту, лимонную кислоту, малоновую кислоту и янтарную кислоту. Среди них, молочная кислота, уксусная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, малоновая кислота и янтарная кислота являются предпочтительными в связи с тем, их можно использовать в пищу и можно легко получать. Один вид гидроксикарбоновой кислоты можно использовать самостоятельно, или можно использовать смесь из двух или более ее видов.
Вода составляет 65% всех компонентов тканей живых дождевых червей. Хотя защитные функции живых дождевых червей активны в течение определенного периода времени, гибель живых дождевых червей позволяет ферментам действовать, так что срок, на который живых дождевых червей помещают в дискомфортные условия, необходимо тщательно контролировать. Продолжительность этого срока варьирует в зависимости от условий и, как правило, находится в диапазоне 3-180 минут.
В настоящем изобретении живых дождевых червей, обработанных гидроксикарбоновой кислотой(ами), промывают водой и затем измельчают, получая измельченный продукт в виде жидкости или пасты. Промывание предпочтительно проводить чистой водой. Способ промывания не имеет ограничений и можно использовать любой известный способ промывания водой. Кроме того, общее количество времени, затраченное на этапы до измельчения, то есть, общее количество времени, затраченное на этапы от посыпания хлоридом(ами) металла живых дождевых червей до завершения вымывания гидроксикарбоновой кислоты(кислот) водой, предпочтительно составляет не более 240 минут.
Способ вышеописанного измельчения не имеет ограничений и, например, измельчение проводят при помощи гомогенизатора, блендера, смесителя-гомогенизатора, аппарата для измельчения, френч-пресса или тому подобного, как правило, при температуре от 1 до 25°C. С точки зрения подавления деградации составляющих компонентов дождевых червей, измельчение предпочтительно проводят при низкой температуре, предпочтительно при температуре от 2 до 15°C.
Измельченный продукт, полученный путем измельчения дождевых червей, помещают в лоток из нержавеющей стали и подвергают лиофилизации. Хотя ферменты, содержащиеся в организме живых дождевых червей, не действуют на живые клетки, они немедленно начинают действовать на мертвые клетки. Таким образом, в описанном выше способе существует риск образования септических газов. Для предотвращения образования септических газов измельченный продукт предпочтительно сразу же замораживают быстрым охлаждением до температуры от -18°C до -35°C, чтобы подавить действие ферментов, а затем подвергают лиофилизации.
Таким образом, измельчение дождевых червей без потери фармакологической активности требует быстрого замораживания, однако, с другой стороны, слишком быстрое замораживание не является предпочтительным, поскольку, в случаях, когда дождевые черви заморожены слишком быстро, примеси, присутствующие вместе с белками, которые являются основными компонентами пасты из дождевых червей, могут образовывать незамерзшие участки и не могут быть отделены. Вследствие этого, замораживание предпочтительно проводят при низкой температуре от -18°C до -35°C в течение 20-240 часов, более предпочтительно 50-170 часов.
Для лиофилизации важно выбирать условия, при которых примеси можно удалять без остатка вместе с водой. Таким образом, лиофилизацию предпочтительно проводят под контролем при давлении не более 50 Па и температуре от -60°C до +90°C, при этом температура повышается ступенчато в течение 10-60 часов.
Примеры способа лиофилизации включают способ, в котором измельченный продукт замораживают, как описано выше, при температуре от -18°C до -35°C в течение 20-240 часов, а затем температура повышается в несколько этапов в диапазоне от -60°C до +90°C и давление снижается в несколько этапов в диапазоне от 25 до 40 Па, при этом продукт лиофилизируется в вакууме в течение 10-60 часов, в результате получается стерильный бледно-желтый сухой порошок из дождевых червей.
Способ получения ингибитора тирозин-азы по настоящему изобретению предпочтительно дополнительно включает этап растворения лиофилизированного измельченного продукта в воде или водном растворе этанола с последующим удалением или отделением нерастворимой фракции. Удаление или отделение нерастворимой фракции можно проводить осаждением, оставляя раствор стоять таким же образом, как описано выше, или центрифугированием, фильтрованием или тому подобным. Растворение лиофилизированного измельченного продукта в воде или водном растворе этанола предпочтительно проводят при перемешивании или встряхивании. Количество времени, необходимое для растворения продукта в воде, предпочтительно составляет от 1 до 120 минут, более предпочтительно от 5 до 80 минут. Концентрация этанола в водном растворе этанола не имеет ограничений, и предпочтительно составляет от 10 до 70% (об./об.), более предпочтительно от 30 до 60%.
Форма ингибитора тирозиназы, полученного способом по настоящему изобретению, не имеет ограничений. То есть супернатант, полученный после растворения в воде или водном растворе этанола, как описано выше, можно использовать как есть, в состоянии водного раствора, или можно использовать после испарения воды для получения концентрата, или можно использовать после высушивания в форме порошка. Порошок, полученный путем высушивания супернатанта, можно использовать после растворения его в воде. Альтернативно, порошок, полученный лиофилизацией пасты из дождевых червей, можно использовать как есть, без растворения в воде или водном растворе этанола.
Дождевые черви, используемые в качестве сырья в способе по настоящему изобретению, не имеют ограничений, и примеры дождевых червей включают Lumbricus rubellus, Lumbricus terrestris, Eisenia foetida, Allolobophora caliginosa, Dendrobaena octaedra, Allolobophora japonica Michaelsen, Drawida hattamimizu Hatai, Pheretima divergens Michaelsen, Pheretima communissima, Pheretima agrestis, Pheretima sieboldi Horst, Pheretima hilgendorfi, Pontodrilus matsushimensis Iizuka, Tubifex hattai Nomura и Limnodrilus gotoi Hatai = L. Socialis Stephenson.
Косметические средства по настоящему изобретению содержат ингибитор тирозиназы, полученный способом получения ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению. В результате действия ингибитора тирозиназы выработка меланина может быть подавлена, и можно ожидать эффекта улучшения внешнего вида кожи и эффекта предотвращения пигментации.
Виды косметических средств по настоящему изобретению не имеют ограничений. В зависимости от активности и эффектов активных компонентов ингибитора тирозиназы, ингибитор тирозиназы можно применять в любом косметическом средстве, в котором может проявляться его активность/эффект. Путем смешивания активного компонента(ов) по настоящему изобретению с основами для различных косметических средств, активный компонент(ы) можно применять в таких формах, как различные основные продукты по уходу за кожей, включая кремы, молочко для кожи, лосьоны для кожи, косметические маски и очищающие средства для лица; различные средства для макияжа, включая тональные кремы, помады, румяна и пудры; различные косметические средства по уходу за волосами, включая средства для мытья волос, средства для укрепления волос, шампуни и кондиционеры для волос; мыла; средства для маникюра; одеколоны; лосьоны; эмульсии; мази; золи; гели; порошки; спреи и твердые средства.
Содержание ингибитора тирозиназы по настоящему изобретению в каждом косметическом средстве не имеет ограничений, поскольку его можно изменять в зависимости от, например, вида косметического средства и способа применения косметического средства, В принципе, ингибитор тирозиназы может содержаться в эффективном количестве и, как правило, содержание ингибитора тирозиназы в композиции косметического средства составляет от 0,0001 до 100% по массе, предпочтительно от 0,01 до 10% по массе в пересчете на сухой вес.
Кроме того, ингибитор тирозиназы можно смешивать с добавками, обычно используемыми в косметических средствах, и/или другими активными компонентами. Примеры добавок и активных компонентов включают воду, этанол, масляные компоненты, увлажнители, загустители, антисептики, эмульгаторы, фармакологически активные компоненты, порошки, поглотители ультрафиолетового излучения, ароматизирующие вещества и стабилизаторы эмульсии.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение далее описано более подробно с помощью примеров.
Настоящее изобретение никоим образом не ограничивается приведенными ниже примерами.
[Получение сухого порошка из дождевых червей]
(Пример 1)
После выдерживания 30 кг живых червей Lumbricus rubellus в освещенном месте в течение 24 часов удаляли грязь, приставшую к поверхности их тел, с последующим распределением дождевых червей слоем толщиной примерно 5 см в плоскодонной кювете и посыпанием их 250 г лимонной кислоты. Через 15 секунд полученную смесь разбавляли, добавляя 30 литров чистой воды.
После посыпания порошком лимонной кислоты дождевые черви немедленно выпускали из тела желтую жидкость. После разбавления водой дождевых червей выдерживали в таком состоянии в течение 20 минут.
Затем живых дождевых червей вынимали из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой, после чего измельчали в гомогенизаторе при 10°C, получая пасту из дождевых червей. Затем эту пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления содержащегося в ней газа и переносили на лоток из нержавеющей стали, после чего сразу же быстро охлаждали до -35°C, при этой температуре пасту из дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для медленного замораживания.
Замороженную пасту из дождевых червей выдерживали при -35°C и давлении 0 Па в течение 2 часов, а затем температуру повышали до 25°C с последующим высушиванием пасты при 40 Па в течение 10 часов; при 40°C и давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°C и давлении 35 Па в течение 12 часов и, наконец, при температуре 80°C и давлении 25 Па в течение 6 часов, тем самым проводя вакуумную лиофилизацию. Путем такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок из дождевых червей с содержанием влаги 8% по массе.
(Пример 2)
После выдерживания 30 кг живых червей Lumbricus rubellus в освещенном месте в течение 24 часов удаляли грязь, приставшую к поверхности их тел, с последующим распределением дождевых червей слоем толщиной примерно 5 см в плоскодонной кювете и равномерным посыпанием их 250 г хлорида натрия. Через 20 минут дождевых червей промывали водой.
Затем таким же образом дождевых червей посыпали 250 г лимонной кислоты и через 15 секунд полученную смесь разбавляли добавлением 30 литров чистой воды. В это время значение рН сразу после добавления воды составляло 2,25, а после полного растворения значение рН составляло 2,74.
После посыпания порошком лимонной кислоты дождевые черви немедленно выпускали из тела желтую жидкость. После разбавления водой дождевых червей выдерживали в таком состоянии в течение 20 минут.
Затем живых дождевых червей вынимали из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой, после чего измельчали в гомогенизаторе при 10°C, получая пасту из дождевых червей. Затем эту пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления, содержащегося в ней газа и переносили на лоток из нержавеющей стали, после чего сразу же быстро охлаждали до -35°C, при этой температуре пасту из дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для медленного замораживания.
Замороженную пасту из дождевых червей выдерживали при -35°C и давлении 0 Па в течение 2 часов, а затем температуру повышали до 25°C с последующим высушиванием пасты при 40 Па в течение 10 часов; при 40°C и давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°C и давлении 35 Па в течение 12 часов и наконец, при температуре 80°C и давлении 25 Па в течение 6 часов, тем самым проводя вакуумную лиофилизацию. Путем такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок из дождевых червей с содержанием влаги 8% по массе.
К 1 г каждого сухого порошка из дождевых червей, полученному как описано выше, добавляли 20 мл очищенной ионным обменом воды, и полученную смесь перемешивали в течение 1 часа. Затем проводили центрифугирование (10000×g, комнатная температура, 15 минут) для отделения супернатанта, получая образец для измерений.
[Реагенты для измерений]
Для измерения ингибирующей тирозиназу активности использовали следующие реагенты.
Фосфатный буфер (фосфорная кислота + фосфат натрия, 0,05 М, рН 6,8)
Тирозиназа (из грибов, 50 Ед/мл в фосфатном буфере)
L-DOPA (2,5 мМ в фосфатном буфере)
[Метод измерения]
К 500 мкл фосфатного буфера добавляли 200 мкл тирозиназы и полученную смесь перемешивали. Затем туда добавляли 100 мкл вышеуказанного образца для измерения или очищенной ионным обменом воды (контроль), и полученную смесь инкубировали при 25°C в течение 3 минут. Затем 250 мкл L-DOPA добавляли к смеси, и полученную смесь перемешивали, после чего измеряли оптическую плотность при 490 нм. После начала измерения показатель оптической плотности наносили на график каждые 30 секунд на протяжении 10 минут измерения. Вычерчивали приблизительную линию от момента начала измерения до минуты 10 измерения, и рассчитывали наклон этой линии. Отношение наклона данной приблизительной линии к наклону, полученному в результате реакции с очищенной ионным обменом водой (контроль), представляли в виде графика, принимая последний наклон за 100. График приведен на фиг.1.
Как видно на фиг.1, ингибиторы тирозиназы по настоящему изобретению сильно ингибировали функцию тирозиназы. Тирозиназа обладает способностью превращать L-тирозин в L-DOPA и затем в L-допахинон. Поскольку затем пигмент меланин синтезируется из L-допахинона в процессе нескольких этапов реакций, ингибирование активности тирозиназы приводит к ингибированию синтеза меланина. Таким образом, ингибитор тирозиназы по настоящему изобретению подходит для применения в косметических средствах, особенно отбеливающих кожу косметических средствах.
(Справочный пример 1)
Способом, описанным в японской патентной публикации №2090412, получали лиофилизированный порошок из дождевых червей.
То есть после выдерживания 30 кг живых червей Lumbricus rubellus в освещенном месте в течение 24 часов, удаляли грязь, приставшую к поверхности их тел, с последующим распределением дождевых червей слоем толщиной примерно 5 см в плоскодонной кювете и добавлением туда 30 литров воды. Вслед за этим полученную смесь выдерживали в таком состоянии в течение 20 минут. Затем живых дождевых червей вынимали из воды и промывали водой, после чего измельчали в гомогенизаторе при 10°C, получая пасту из дождевых червей. Затем эту пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления содержащегося в ней газа и переносили на лоток из нержавеющей стали, после чего сразу же быстро охлаждали до -35°C, при этой температуре пасту из дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для медленного замораживания.
Замороженную пасту из дождевых червей выдерживали при -35°C и давлении 0 Па в течение 2 часов, а затем температуру повышали до 25°C с последующим высушиванием пасты при 40 Па в течение 10 часов; при 40°C и давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°C и давлении 35 Па в течение 12 часов и наконец, при температуре 80°C и давлении 25 Па в течение 6 часов, тем самым проводя вакуумную лиофилизацию. Путем такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок из дождевых червей с содержанием влаги 8% по массе.
Лиофилизированный порошок растворяли в 50% водном растворе этанола так, что соотношение этанол:лиофилизированный порошок составляло 20:1 (об./масс.), и полученный раствор встряхивали при комнатной температуре (25°C) со скоростью 1500 об/мин в течение 1 часа. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут для отделения супернатанта, и полученный супернатант концентрировали при пониженном давлении и температуре 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок A-I.
(Справочный пример 2)
Лиофилизированный порошок B-I получали таким же образом, как и в справочном примере 1, описанном выше, за исключением того, что очищенную ионным обменом воду использовали вместо 50% водного раствора этанола.
(Справочный пример 3)
Лиофилизированный порошок C-I получали таким же образом, как и в справочном примере 1, описанном выше, за исключением того, что очищенную ионным обменом воду использовали вместо 50% водного раствора этанола и не проводили завершающего концентрирования при пониженном давлении.
(Пример 3)
После промывания 30 кг живых червей Lumbricus rubellus водой для удаления приставшей к поверхности их кожи грязи дождевых червей распределяли слоем толщиной примерно 5 см в плоскодонной кювете и равномерно посыпали их 250 г лимонной кислоты. Через 15 секунд полученную смесь разбавляли, добавляя 30 литров чистой воды.
Затем дождевых червей, погруженных в разбавленную лимонную кислоту, выдерживали при 20°C в течение 60 минут. Вслед за этим живых дождевых червей вынимали из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой, после чего измельчали в гомогенизаторе при 10°C, получая пасту из дождевых червей. Затем эту пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления, содержащегося в ней газа и переносили на лоток из нержавеющей стали, после чего сразу же быстро охлаждали до -35°C, при этой температуре пасту из дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для медленного замораживания.
Замороженную таким образом пасту из дождевых червей выдерживали при -30°C и пониженном давлении 5 Па в течение 10 часов, а затем высушивали при повышенной температуре 20°C и давлении 10 Па в течение 10 часов и затем при 40°C в течение 10 часов. И, наконец, пасту из дождевых червей выдерживали при температуре 80°C и давлении 5 Па в течение 5 часов для завершения вакуумной лиофилизации. Путем такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок из дождевых червей с содержанием влаги 8% по массе.
Лиофилизированный порошок растворяли в 50% водном растворе этанола так, что соотношение этанол : Лиофилизированный порошок составляло 20:1 (об./масс.), и полученный раствор встряхивали при комнатной температуре (25°C) со скоростью 1500 об/мин в течение 1 часа. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут для отделения супернатанта, и полученный супернатант концентрировали при пониженном давлении и температуре 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая Лиофилизированный порошок А-II.
(Пример 4)
Лиофилизированный порошок В-II получали таким же образом, как и в примере 3, описанном выше, за исключением того, что очищенную ионным обменом воду использовали вместо 50% водного раствора этанола.
(Пример 5)
Лиофилизированный порошок С-II получали таким же образом, как и в примере 3, описанном выше, за исключением того, что очищенную ионным обменом воду использовали вместо 50% водного раствора этанола и не проводили завершающего концентрирования при пониженном давлении.
(Пример 6)
Таким же образом, как и в примере 2, описанном выше, получали бледно-желтый лиофилизированный порошок.
Лиофилизированный порошок растворяли в 50% водном растворе этанола так, что соотношение этанол : Лиофилизированный порошок составляло 20:1 (об./масс.), и полученный раствор встряхивали при комнатной температуре (25°C) со скоростью 1500 об/мин в течение 1 часа. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут для отделения супернатанта, и полученный супернатант концентрировали при пониженном давлении и температуре 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая Лиофилизированный порошок А-III.
(Пример 7)
Лиофилизированный порошок B-III получали таким же образом, как и в примере 6, описанном выше, за исключением того, что очищенную ионным обменом воду использовали вместо 50% водного раствора этанола.
(Пример 8)
Лиофилизированный порошок С-III получали таким же образом, как и в примере 6, описанном выше, за исключением того, что очищенную ионным обменом воду использовали вместо 50% водного раствора этанола и не проводили завершающего концентрирования при пониженном давлении.
К 0,1 г каждого из лиофилизированных порошков A-I, А-II, А-III, B-I, B-II, B-III, C-I, C-II и C-III добавляли фосфатный буфер так, что порошок содержался в нем в концентрации 0,05 г/мл. Полученный раствор встряхивали (1500 об/мин, 25°C, 1 час) и затем центрифугировали (10000×g, 4°C, 15 минут), собирая супернатант в качестве образца для измерения.
Готовили растворы тирозиназы (Sigma-Aldrich Co., из грибов) и L-DOPA (NACALAI TESQE, INC.) в фосфатном буфере так, что была достигнута заранее определенная концентрация (2,5 мМ). Смесь 0,5 мл фосфатного буфера, 0,2 мл тирозиназы (250 Ед/мл) и 0,1 мл образца для измерения инкубировали с использование спектрофотометра при 37°C в течение 3 минут.
Измерение начинали через 2 минуты и 48 секунд после начала инкубации, и 0,25 мл L-DOPA (2,5 мМ) добавляли к смеси в минуту 3 с последующей инкубацией полученной смеси при 37°C в течение 10 минут, при этом измеряя оптическую плотность при 490 нм (каждые 10 секунд).
На основании результатов измерения рассчитывали степень ингибирования (%) активности тирозиназы с помощью уравнений, приведенных ниже (приведенные ниже уравнения демонстрируют случай со значением, измеренным в минуту 5).
At: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, содержащего тирозиназу и L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Ас: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, содержащего тирозиназу, но не содержащего L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
At0: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, не содержащего тирозиназу, но содержащего L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Ас0: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, не содержащего ни тирозиназу, ни L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Степень активности (%)=([At]-[At0])/([Ас]-[Ас0])×100
Степень ингибирования активности тирозиназы (%) = 100-степень активности.
Полученные результаты приведены ниже в таблицах 1-3 и на фиг.2-4. В каждой таблице «0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8» соответствует контролю, полученному с использованием фосфатного буфера вместо образца для измерения.
| Таблица 1 | |||
| Степень ингибирования активности тирозиназы (%) | |||
| Затраченное время | 2 минуты и 30 секунд | 5 минут | 10 минут |
| 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| A-I | 25,16 | 17,98 | 10,74 |
| A-II | 22,44 | 17,67 | 12,10 |
| A-III | 57,85 | 44,64 | 27,88 |
| Таблица 2 | |||
| Степень ингибирования активности тирозиназы (%) | |||
| Затраченное время | 2 минуты и 30 секунд | 5 минут | 10 минут |
| 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| B-I | 19,74 | 8,78 | 0,00 |
| B-II | 16,28 | 7,84 | 0,00 |
| B-III | 45,56 | 30,09 | 10,82 |
| Таблица 3 | |||
| Степень ингибирования активности тирозиназы (%) | |||
| Затраченное время | 2 минуты и 30 секунд | 5 минут | 10 минут |
| 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| C-I | 25,00 | 12,95 | 0,00 |
| C-II | 25,74 | 13,61 | 0,00 |
| C-III | 53,25 | 37,43 | 16,92 |
Как видно из таблиц 1-3, приведенных выше, и фиг.2-4, ингибиторы тирозиназы, состоящие из лиофилизированного порошка из дождевых червей, полученного способом по настоящему изобретению, проявляли ингибирующую активность в отношении тирозиназы. Ингибиторы, полученные способами, включающими этап создания контакта живых дождевых червей с солью металла и гидроксикарбоновой кислотой до их измельчения, обладали особенно высокими ингибирующими тирозиназу активностями.
(Сравнительный пример 1)
Способом, описанным в публикации японской нерассмотренной патентной заявки № S63-238009, живых дождевых червей (90,0 г) нагревали в горячей воде примерно при 80°C в течение 20 минут и промывали водопроводной водой. После слива воды дождевых червей обрабатывали при помощи миксера, получая пасту из дождевых червей.
Пасту растворяли в 50% водном растворе этанола так, что соотношение этанол : паста составляло 10:1 (об./масс.), и полученную смесь выдерживали при низкой температуре 5-10°C при перемешивании в течение 2 недель. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут. Супернатант отделяли и затем концентрировали при пониженном давлении при 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок D-I.
(Пример 9)
Таким же образом, как и в примере 2, описанном выше, получали бледно-желтый лиофилизированный порошок.
Лиофилизированный порошок растворяли в 50% водном растворе этанола так, что соотношение этанол : лиофилизированный порошок составляло 10:1 (об./масс.), и полученную смесь выдерживали при низкой температуре 5-10°C при перемешивании в течение 2 недель. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут. Супернатант отделяли и затем концентрировали при пониженном давлении при 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок D-II.
(Справочный пример 4)
Таким же образом, как и в справочном примере 1, получали лиофилизированный порошок из дождевых червей способом, описанным в японской патентной публикации №2090412.
Лиофилизированный порошок растворяли в 50% водном растворе этанола так, что соотношение этанол : лиофилизированный порошок составляло 10:1 (об./масс.), и полученную смесь выдерживали при низкой температуре 5-10°C при перемешивании в течение 2 недель. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут. Супернатант отделяли и затем концентрировали при пониженном давлении при 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок D-III.
К 0,1 г каждого из лиофилизированных порошков D-I, D-II и D-III добавляли фосфатный буфер так, что порошок содержался в нем в концентрации 0,05 г/мл. Полученный раствор встряхивали (1500 об/мин, 25°C, 1 час) и затем центрифугировали (10000×g, 4°C, 15 минут), собирая Супернатант в качестве образца для измерения.
Готовили растворы тирозиназы (Sigma-Aldrich Co., из грибов) и L-DOPA (NACALAI TESQE, INC.) в фосфатном буфере так, что была достигнута заранее определенная концентрация (2,5 мМ). Смесь 0,5 мл фосфатного буфера, 0,2 мл тирозиназы (250 Ед/мл) и 0,1 мл образца для измерения инкубировали с использованием спектрофотометра при 37°C в течение 3 минут.
Измерение начинали через 2 минуты и 48 секунд после начала инкубации, и 0,25 мл L-DOPA (2,5 мМ) добавляли к смеси в минуту 3 с последующей инкубацией полученной смеси при 37°C в течение 10 минут, при этом измеряя оптическую плотность при 490 нм (каждые 10 секунд).
На основании результатов измерения рассчитывали степень ингибирования (%) активности тирозиназы с помощью уравнений, приведенных ниже (приведенные ниже уравнения демонстрируют случай со значением, измеренным в минуту 5).
At: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, содержащего тирозиназу и L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Ас: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, содержащего тирозиназу, но не содержащего L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
At0: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, не содержащего тирозиназу, но содержащего L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Ас0: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, не содержащего ни тирозиназу, ни L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Степень активности (%)=([At]-[At0])/([Ac]-[Ac0])×100
Степень ингибирования активности тирозиназы (%) = 100 степень активности.
Результаты приведены ниже в таблице 4 и на фиг.5. В каждой таблице «0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8» соответствует контролю, полученному с использованием фосфатного буфера вместо образца для измерения.
| Таблица 4 | |||
| Степень ингибирования активности тирозиназы (%) | |||
| Затраченное время | 2 минуты и 30 секунд | 5 минут | 10 минут |
| 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| D-I | 29,73 | 18,00 | 2,46 |
| D-II | 43,37 | 31,76 | 18,24 |
| D-III | 21,21 | 16,67 | 10,59 |
Как видно из таблицы 4, приведенной выше, и фиг.5, ингибиторы тирозиназы, состоящие из лиофилизированного порошка из дождевых червей, полученного способом по настоящему изобретению, особенно способом, включающим этап создания контакта живых дождевых червей с солью металла и гидроксикарбоновой кислотой (D-II) до их измельчения, обладали более высокими ингибирующими тирозиназу активностями, чем ингибитор тирозиназы, полученный способом, описанным в публикации японской нерассмотренной патентной заявки № S63-238009 (D-I).
(Сравнительный пример 2)
Способом, описанным в публикации японской нерассмотренной патентной заявки № S63-238009, живых дождевых червей (90,0 г) нагревали в горячей воде примерно при 80°C в течение 20 минут и промывали водопроводной водой. После слива воды дождевых червей обрабатывали при помощи миксера, получая пасту из дождевых червей.
Пасту растворяли в очищенной ионным обменом воде так, чтобы соотношение очищенная ионным обменом вода : паста составляло 10:1 (об./масс.), с последующим добавлением в смесь хлороформа в количестве 50% по отношению к добавленной очищенной ионным обменом воде. Полученную смесь встряхивали и затем выдерживали при низкой температуре 5-10°C в течение 24 часов. Затем водный слой удаляли, и в смесь добавляли 50% водный раствор этанола в количестве 90% по отношению к количеству водного слоя. Полученную смесь перемешивали и выдерживали при низкой температуре 5-10°C в течение 24 часов. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут. Слой осадка отделяли и лиофилизировали, получая лиофилизированный порошок E-I. С другой стороны, супернатант концентрировали при пониженном давлении при 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок F-I.
(Пример 10)
Используя 90,0 г живых дождевых червей, получали бледно-желтый лиофилизированный порошок таким же образом, как и в примере 2, описанном выше.
Лиофилизированный порошок растворяли в очищенной ионным обменом воде так, чтобы соотношение очищенная ионным обменом вода : лиофилизированный порошок составляло 10:1 (об./масс.), с последующим добавлением в смесь хлороформа в количестве 50% по отношению к добавленной очищенной ионным обменом воде. Полученную смесь встряхивали и затем выдерживали при низкой температуре 5-10°C в течение 24 часов. Затем водный слой удаляли, и в смесь добавляли 50% водный раствор этанола в количестве 90% по отношению к количеству водного слоя. Полученную смесь перемешивали и выдерживали при низкой температуре 5-10°C в течение 24 часов. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут. Слой осадка отделяли и лиофилизировали, получая лиофилизированный порошок Е-II. С другой стороны, супернатант концентрировали при пониженном давлении при 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок F-II.
(Справочный пример 5)
Таким же образом, как и в справочном примере 1, получали лиофилизированный порошок из дождевых червей способом, описанным в японской патентной публикации №2090412.
Лиофилизированный порошок растворяли в очищенной ионным обменом воде так, чтобы соотношение очищенная ионным обменом вода : лиофилизированный порошок составляло 10:1 (об./масс.), с последующим добавлением в смесь хлороформа в количестве 50% по отношению к добавленной очищенной ионным обменом воде. Полученную смесь встряхивали и затем выдерживали при низкой температуре 5-10°C в течение 24 часов. Затем водный слой удаляли, и в смесь добавляли 50% водный раствор этанола в количестве 90% по отношению к количеству водного слоя. Полученную смесь перемешивали и выдерживали при низкой температуре 5-10°C в течение 24 часов. Затем проводили центрифугирование при температуре 4°C при 10000×g в течение 15 минут. Слой осадка отделяли и лиофилизировали, получая лиофилизированный порошок Е-III. С другой стороны, супернатант концентрировали при пониженном давлении при 75°C в течение 15 минут с последующей лиофилизацией полученного концентрата, получая лиофилизированный порошок F-III.
К 0,1 г каждого из лиофилизированных порошков E-I, Е-II, Е-III, F-I, F-II и F-III добавляли фосфатный буфер так, что порошок содержался в нем в концентрации 0,05 г/мл. Полученный раствор встряхивали (1500 об/мин, 25°C, 1 час) и затем центрифугировали (10000×g, 4°C, 15 минут), собирая супернатант в качестве образца для измерения.
Готовили растворы тирозиназы (Sigma-Aldrich Co., из грибов) и L-DOPA (NACALAI TESQE, INC.) в фосфатном буфере так, что была достигнута заранее определенная концентрация (2,5 мМ). Смесь 0,5 мл фосфатного буфера, 0,2 мл тирозиназы (250 Ед/мл) и 0,1 мл образца для измерения инкубировали с использованием спектрофотометра при 37°C в течение 3 минут.
Измерение начинали через 2 минуты и 48 секунд после начала инкубации, и 0,25 мл L-DOPA (2,5 мМ) добавляли к смеси в минуту 3 с последующей инкубацией полученной смеси при 37°C в течение 10 минут, при этом измеряя оптическую плотность при 490 нм (каждые 10 секунд).
На основании результатов измерения рассчитывали степень ингибирования (%) активности тирозиназы с помощью уравнений, приведенных ниже (приведенные ниже уравнения демонстрируют случай со значением, измеренным в минуту 5).
At: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, содержащего тирозиназу и L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Ас: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, содержащего тирозиназу, но не содержащего L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
At0: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, не содержащего тирозиназу, но содержащего L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Ас0: Увеличение оптической плотности раствора для измерения, не содержащего ни тирозиназу, ни L-DOPA, на протяжении периода времени от 30 секунд после начала измерения до 5 минут и 30 секунд после начала измерения.
Степень активности (%)=([At]-[At0])/([Ас]-[Ас0])×100
Степень ингибирования активности тирозиназы (%) = 100 - степень активности.
Результаты приведены ниже в таблицах 5 и 6 и на фиг.6 и 7. В каждой таблице «0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8» соответствует контролю, полученному с использованием фосфатного буфера вместо образца для измерения.
| Таблица 5 | |||
| Степень ингибирования активности тирозиназы (%) | |||
| Затраченное время | 2 минуты и 30 секунд | 5 минут | 10 минут |
| 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| E-I | 6,18 | 1,62 | 0,00 |
| E-II | 16,99 | 12,69 | 7,64 |
| E-III | 25,48 | 14,80 | 2,45 |
| Таблица 6 | |||
| Степень ингибирования активности тирозиназы (%) | |||
| Затраченное время | 2 минуты и 30 секунд | 5 минут | 10 минут |
| 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,8 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| F-I | 25,34 | 12,31 | 0,00 |
| F-II | 36,74 | 22,99 | 7,29 |
| F-III | 15,91 | 8,54 | 0,00 |
Как видно из таблиц 5 и 6, приведенных выше, и фиг.6 и 7, ингибиторы тирозиназы, состоящие из лиофилизированного порошка из дождевых червей, полученного способом по настоящему изобретению, особенно способом, включающим этап создания контакта живых дождевых червей с солью металла и гидроксикарбоновой кислотой (E-II, F-II) до их измельчения, обладали более высокими ингибирующими тирозиназу активностями, чем ингибиторы тирозиназы, полученные способом, описанным в публикации японской нерассмотренной патентной заявки № S63-238009 (E-I, F-I).
Claims (5)
1. Способ получения ингибитора тирозиназы, включающий этапы:
создания контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; с последующим
созданием контакта этих живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты, разбавлением полученной смеси водой для доведения pH до 2-5 и последующим выдерживанием полученной разведенной смеси в течение 3-180 минут, или созданием контакта этих живых дождевых червей с водным раствором гидроксикарбоновой кислоты, имеющим pH 2-5, и последующим выдерживанием полученной смеси в течение 3-180 минут; с последующим
промыванием живых дождевых червей водой, измельчением промытых дождевых червей, и последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта.
создания контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; с последующим
созданием контакта этих живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислоты, разбавлением полученной смеси водой для доведения pH до 2-5 и последующим выдерживанием полученной разведенной смеси в течение 3-180 минут, или созданием контакта этих живых дождевых червей с водным раствором гидроксикарбоновой кислоты, имеющим pH 2-5, и последующим выдерживанием полученной смеси в течение 3-180 минут; с последующим
промыванием живых дождевых червей водой, измельчением промытых дождевых червей, и последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта.
2. Способ получения ингибитора тирозиназы по п. 1, включающий этап выдерживания живых дождевых червей в освещенном месте в течение 10-50 часов, отделения грязи, приставшей к поверхности их тела, с последующим созданием контакта живых дождевых червей с указанным хлоридом(ами) металла(ов), где данный этап выполняют до создания контакта живых дождевых червей с указанным хлоридом(ами).
3. Способ получения ингибитора тирозиназы по п. 1, в котором указанную лиофилизацию проводят путем замораживания измельченного продукта при температуре от -18°C до -35°C в течение 20-240 часов с последующей лиофилизацией полученного продукта в вакууме.
4. Способ получения ингибитора тирозиназы по п. 1, включающий этап растворения указанного лиофилизированного измельченного продукта в воде в течение от 1 до 120 минут с последующим удалением или отделением нерастворимой фракции.
5. Косметическое средство, содержащее ингибитор тирозиназы, полученный способом по любому из пп. 1-4.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011-167720 | 2011-07-29 | ||
| JP2011167720 | 2011-07-29 | ||
| PCT/JP2012/068718 WO2013018587A1 (ja) | 2011-07-29 | 2012-07-24 | ミミズ乾燥粉末を用いたチロシナーゼ阻害剤およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014107467A RU2014107467A (ru) | 2015-09-10 |
| RU2576812C2 true RU2576812C2 (ru) | 2016-03-10 |
Family
ID=47629114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014107467/15A RU2576812C2 (ru) | 2011-07-29 | 2012-07-24 | Ингибитор тирозиназы, полученный с использованием сухого порошка из дождевых червей, и способ его получения |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9060958B2 (ru) |
| EP (1) | EP2737893B1 (ru) |
| JP (1) | JP5243662B1 (ru) |
| KR (1) | KR101325004B1 (ru) |
| CN (1) | CN103702661B (ru) |
| AU (1) | AU2012291228B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014001613B1 (ru) |
| CA (1) | CA2842891C (ru) |
| IL (1) | IL230617B (ru) |
| PH (1) | PH12014500177A1 (ru) |
| RU (1) | RU2576812C2 (ru) |
| TW (1) | TWI542367B (ru) |
| WO (1) | WO2013018587A1 (ru) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6321521B2 (ja) * | 2014-11-04 | 2018-05-09 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | タウ蛋白産生促進剤、タウ蛋白の欠乏に起因する疾患の治療薬・予防薬および治療用・予防用食品組成物 |
| JP2017025019A (ja) * | 2015-07-21 | 2017-02-02 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | アミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬・予防薬および治療用・予防用食品組成物 |
| JP6409151B1 (ja) * | 2017-03-21 | 2018-10-17 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | 口腔用組成物の製造方法、及び、口腔用組成物 |
| JP6249581B1 (ja) * | 2017-06-12 | 2017-12-20 | ワキ製薬株式会社 | 糖質分解酵素阻害剤の製造方法 |
| TW201914575A (zh) * | 2017-09-19 | 2019-04-16 | 大江生醫股份有限公司 | 地龍蛋白用於製造調理皮膚醫藥組成物之用途 |
| CN108478488A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-09-04 | 冯敬洲 | 一种痘印修复液及其制备方法 |
| CN109270057B (zh) * | 2018-10-17 | 2021-07-20 | 无限极（中国）有限公司 | 一种检测美白化妆品功效的试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN114152688B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-07-04 | 华中农业大学 | 从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5024844A (en) * | 1987-08-18 | 1991-06-18 | Eimei Company, Ltd. | Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient |
| JP2009249362A (ja) * | 2008-04-09 | 2009-10-29 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | 無害化されたミミズ乾燥粉末の製造方法 |
| CA2747770A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Kouji Yokoyama | Melanin production inhibitor |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4568545A (en) * | 1982-10-02 | 1986-02-04 | Amano Seiyaku Kabushiki Kaisha | Thrombolytic agent |
| JPS63238009A (ja) * | 1987-03-25 | 1988-10-04 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | ミミズ抽出物含有化粧料 |
| JPH0290412A (ja) | 1988-09-28 | 1990-03-29 | Fujikura Ltd | 電気ケーブル |
| US5186944A (en) * | 1989-02-15 | 1993-02-16 | Eimei Company Ltd. | Therapeutic medicament for thrombosis |
| US5576026A (en) * | 1994-09-30 | 1996-11-19 | Charter; Edward A. | Lumbricus product and method of making same |
| CN1281743C (zh) | 2004-02-20 | 2006-10-25 | 北京百奥药业有限责任公司 | 蚓激酶干粉的制备方法 |
| JP5123470B2 (ja) * | 2005-08-05 | 2013-01-23 | 株式会社 皇漢薬品研究所 | 自動クロマトグラフ装置によるルムブロキナーゼ含有蛋白の製造方法と用途 |
| CN101095697A (zh) * | 2006-06-28 | 2008-01-02 | 李振国 | 水蛭和/或地龙分子量5800道尔顿以下的提取物 |
| US8137701B2 (en) * | 2008-03-21 | 2012-03-20 | Well Stone Co. | Method of producing a dry earthworm powder |
| ATE475425T1 (de) * | 2008-03-26 | 2010-08-15 | Well Stone Co | Verfahren zur herstellung eines trockenen regenwurmpulvers |
| US8337902B2 (en) * | 2008-09-25 | 2012-12-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Degradation of prion protein and reduced prion infectivity by earthworm homogenates |
| JP4975069B2 (ja) | 2009-07-29 | 2012-07-11 | 株式会社山田養蜂場本社 | チロシナーゼ阻害剤 |
| JP2011037764A (ja) | 2009-08-11 | 2011-02-24 | Shiseido Co Ltd | 皮膚外用剤、美白剤、抗酸化剤および抗老化剤 |
| JP4886017B2 (ja) * | 2009-10-13 | 2012-02-29 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | ミミズ乾燥粉末の製造方法 |
| JP4808822B1 (ja) | 2011-04-11 | 2011-11-02 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | ミミズ乾燥粉末の製造方法 |
-
2012
- 2012-07-24 PH PH1/2014/500177A patent/PH12014500177A1/en unknown
- 2012-07-24 BR BR112014001613-5A patent/BR112014001613B1/pt active IP Right Grant
- 2012-07-24 KR KR1020137005343A patent/KR101325004B1/ko active Active
- 2012-07-24 AU AU2012291228A patent/AU2012291228B2/en active Active
- 2012-07-24 WO PCT/JP2012/068718 patent/WO2013018587A1/ja not_active Ceased
- 2012-07-24 RU RU2014107467/15A patent/RU2576812C2/ru active
- 2012-07-24 JP JP2012535279A patent/JP5243662B1/ja active Active
- 2012-07-24 EP EP12819966.8A patent/EP2737893B1/en active Active
- 2012-07-24 CN CN201280036317.XA patent/CN103702661B/zh active Active
- 2012-07-24 US US14/235,191 patent/US9060958B2/en active Active
- 2012-07-24 CA CA2842891A patent/CA2842891C/en active Active
- 2012-07-27 TW TW101127254A patent/TWI542367B/zh active
-
2014
- 2014-01-23 IL IL230617A patent/IL230617B/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5024844A (en) * | 1987-08-18 | 1991-06-18 | Eimei Company, Ltd. | Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient |
| JP2009249362A (ja) * | 2008-04-09 | 2009-10-29 | Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｎｅ 有限会社 | 無害化されたミミズ乾燥粉末の製造方法 |
| CA2747770A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Kouji Yokoyama | Melanin production inhibitor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112014001613B1 (pt) | 2019-01-22 |
| IL230617B (en) | 2018-01-31 |
| EP2737893A4 (en) | 2015-04-29 |
| AU2012291228B2 (en) | 2016-07-28 |
| WO2013018587A1 (ja) | 2013-02-07 |
| JPWO2013018587A1 (ja) | 2015-03-05 |
| HK1196277A1 (en) | 2014-12-12 |
| JP5243662B1 (ja) | 2013-07-24 |
| CA2842891C (en) | 2016-05-24 |
| TW201311292A (zh) | 2013-03-16 |
| CN103702661A (zh) | 2014-04-02 |
| EP2737893B1 (en) | 2017-08-30 |
| KR20130058042A (ko) | 2013-06-03 |
| US9060958B2 (en) | 2015-06-23 |
| KR101325004B1 (ko) | 2013-11-04 |
| US20140154331A1 (en) | 2014-06-05 |
| IL230617A0 (en) | 2014-03-31 |
| TWI542367B (zh) | 2016-07-21 |
| CA2842891A1 (en) | 2013-02-07 |
| PH12014500177A1 (en) | 2014-03-24 |
| CN103702661B (zh) | 2015-10-07 |
| AU2012291228A1 (en) | 2014-03-13 |
| RU2014107467A (ru) | 2015-09-10 |
| EP2737893A1 (en) | 2014-06-04 |
| BR112014001613A2 (pt) | 2017-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2576812C2 (ru) | Ингибитор тирозиназы, полученный с использованием сухого порошка из дождевых червей, и способ его получения | |
| AU2003278775B2 (en) | Porifera-based therapeutic compositions for treating and preventing skin diseases | |
| KR20080101821A (ko) | 홍화 분획물를 포함하는 피부 외용제 조성물 | |
| TWI400070B (zh) | 蚯蚓乾燥粉末之製造方法 | |
| JP4808822B1 (ja) | ミミズ乾燥粉末の製造方法 | |
| KR101719124B1 (ko) | 천연광물 추출물을 포함하는 피부 미백 및 보습용 화장료 조성물 | |
| KR101618726B1 (ko) | 명태껍질로부터 엘라스틴을 포함하는 단백질추출물을 제조하는 방법 | |
| KR20130008211A (ko) | 동물의 방광으로부터 분리한 세포간 신호전달 촉진물질이 포함된 세포외기질의 구성분인 단백질를 약효제로 포함하는 세포재생 기능성 조성물과 그 제조방법 | |
| RU2708673C2 (ru) | Ускоритель продуцирования катехоламина и терапевтическое и профилактическое средство и терапевтическая и профилактическая пищевая композиция для заболеваний, обусловленных недостаточностью катехоламина | |
| AU2022200329B2 (en) | Amyloid beta fibril decomposing agent, and therapeutic or preventive agent and therapeutic or preventive food composition for diseases caused by amyloid beta fibril formation | |
| EP0424444B1 (fr) | Compositions cosmetiques a base de chromone-carboxylate | |
| KR100977113B1 (ko) | 지렁이 건조분말의 제조방법 | |
| KR101609217B1 (ko) | 해파리로부터 당단백질을 제조하는 방법 및 그 당단백질을 함유하는 화장료 조성물 | |
| HK1196277B (en) | Tyrosinase inhibitor produced using dried earthworm powder, and method for producing same | |
| WO2018173971A1 (ja) | 点鼻剤組成物の製造方法、及び、点鼻剤組成物 | |
| HK1246154B (en) | AMYLOID β FIBRIL DECOMPOSING AGENT, AND THERAPEUTIC OR PREVENTIVE AGENT FOR DISEASES CAUSED BY AMYLOID β FIBRIL FORMATION | |
| HK1246154A1 (en) | AMYLOID β FIBRIL DECOMPOSING AGENT, AND THERAPEUTIC OR PREVENTIVE AGENT FOR DISEASES CAUSED BY AMYLOID β FIBRIL FORMATION |