RU2576842C2 - Способ получения миобластов, использование биоптата десны, препарат миобластов для лечения патологий мышечной ткани и способ его получения - Google Patents
Способ получения миобластов, использование биоптата десны, препарат миобластов для лечения патологий мышечной ткани и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2576842C2 RU2576842C2 RU2014107682/15A RU2014107682A RU2576842C2 RU 2576842 C2 RU2576842 C2 RU 2576842C2 RU 2014107682/15 A RU2014107682/15 A RU 2014107682/15A RU 2014107682 A RU2014107682 A RU 2014107682A RU 2576842 C2 RU2576842 C2 RU 2576842C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- myoblasts
- cells
- culture
- biopsy
- producing
- Prior art date
Links
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 title description 3
- 230000003387 muscular Effects 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 7
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 2
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 238000011130 autologous cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 1
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000005996 muscular dysfunction Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000003365 myofibril Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения миобластов из слизистой оболочки полости рта человека. Для этого проводят биопсию слизистой оболочки полости рта человека и обработку биоптата, предусматривающую отмывку, измельчение, ферментативное расщепление ткани десны протеолитическими ферментами. Далее культивируют выделенные из дезагрегированной ткани фибробластоподобные клетки на подходящей среде для получения культуры миобластов. Проводят иммунофенотипическое тестирование культуры миобластов на иммунофенотип и исключение вирусной и бактериальной контаминации. Использование данного способа позволяет получить культуру миобластов из легкодоступного источника - слизистой оболочки полости рта человека. 1 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 ил.
Description
Изобретение относится к области биофармакологии, биотехнологии и регенеративной медицины и описывает новый источник и метод выделения миобластов человека.
Миобласты млекопитающих представляют собой уникальный тип клеток, способных в естественных условиях к делению, направленной миграции с последующим слиянием с образованием мышечных трубок (синцития) и быстрой потерей антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса. Такое сочетание свойств делает миобласты практически идеальным объектом для исследований с целью применения этих клеток в области клеточной терапии и генной инженерии при лечении мышечных заболеваний. Исследования показали, что трансплантация миобластов позволяет увеличить максимальную сократительную способность мышечных тканей у пациентов с миопатией Дюшенна (мышечная дистрофия Дюшенна). Разрабатываются способы лечения тяжелой сердечной недостаточности, заключающиеся в лечении данного серьезного заболевания с помощью «листов» аутологичных миобластов, выделенных из скелетных мышц пациента [1].
В результате наблюдается увеличение продолжительности жизни пациентов, улучшение ее качества, оттягивание момента прикованности к инвалидному креслу при наиболее серьезных формах заболеваний.
Известно, что основным источником сателлитных клеток и миобластов являются скелетые мышцы человека и животных [2]. Описано также, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) костного мозга и жировой ткани при добавлении определенных факторов могут дифференцироваться в миогенном направлении [3, 4], что нашло применение в заместительной клеточной терапии (при кардиомиопластике, лечении инконтиненции, миопатий и др. мышечных заболеваний).
Одним из примеров применения миобластов для лечения мышечных заболеваний является болезнь Дюшенна - наследственного заболевания, характеризующегося прогрессирующей мышечной дистрофией и являющегося вторым по распространенности смертельным наследственным заболеванием.
Так, в патенте ЕР 1407788 описан метод лечения болезни Дюшенна с применением специализированного клеточного процессора для получения миобластов, который предполагает использование клеток для переноса нормального набора генов в дефектные клетки с целью репарации генома больного. Изобретение включает стадии забора биоптата мышечной ткани, выделения миобластов, их культивирования в условиях in vitro для получения необходимой терапевтической дозы и инъекционное введение в поврежденную мышечную ткань.
В заявке WO 1996018303 описывается способ терапии наследственных, дегенеративных заболеваний различной степени тяжести у млекопитающих с использованием нативных, генетически или фенотипически трансформированных миогенных клеток, включающих миобласты, миотрубки, молодые мышечные волокна и модифицированные клеточные линии, включающий стадии культивирования миогенных клеток; последовательное введение реципиенту терапевтически эффективной дозы иммуносупрессоров и указанных миогенных клеток, благодаря чему достигается терапевтический эффект.
В то же время в патенте ЕР 1048724 отмечается, что успешное применение миобластов требует использования клеточных линий, способных в условиях культивирования in vitro активно пролиферировать, дифференцироваться и при этом сохранять характеристики клеток ткани, из которой они были выделены. Недостаток данного способа заключается в том, что миобласты человека, выделенные из мышечной ткани путем ее дезагрегирования под действием ферментов, в отличие от миобластов грызунов (мышей и крыс), не способны к многократному делению в условиях культивирования, причем их пролиферативная способность снижается с возрастом и особенно сильно у больных с различного рода мышечными дисфункциями (например, болезнью Дюшенна), что значительно затрудняет их использование в терапевтических целях. Для решения указанной проблемы в патенте описан способ получения устойчивых линий мышечных клеток человека, включающий следующие стадии:
а) обработку первичной культуры мышечных клеток с помощью глюкокортикоидов;
б) перенос в обработанную по п. а) клеточную культуру по крайней мере одного нуклеотидного вектора неретровирусной природы, способного «иммортализовать» данные клетки;
в) проведение дальнейшего культивирования полученной клеточной культуры.
Все перечисленные выше изобретения предполагают стадию забора биоптата мышечной ткани, получения первичной клеточной культуры и последующего наращивания (культивирования in vitro) миогенных клеток, при этом в качестве источника таких клеток всегда указывается биопсийный материал, полученный хирургическим путем в виде фрагмента скелетной мышечной ткани. В то же время следует признать, что данный источник мышечной ткани и метод его забора имеет ряд недостатков и ограничений. Так, забор биопсийного материала мышечной ткани требует довольно серьезного хирургического вмешательства, характеризующегося высокой степенью травматизации, проведением обезболивающих процедур местного или общего характера, что приводит к временной потере трудоспособности и относительно длительному реабилитационному периоду.
Кроме того, клетки, полученные из мышечной ткани, в свою очередь, также имеют ряд недостатков, существенно ограничивающих их применение для проведения клеточной терапии, а именно имеют ограниченный срок жизни, не способны к длительному делению в условиях in vitro; при этом описанные свойства имеют тенденцию усугубляться с возрастом пациента и особенно выражены у больных с мышечными дистрофиями, что делает применение аутологичной клеточной терапии для таких пациентов крайне проблематичной.
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является значительное упрощение проведения клеточной терапии у пациентов с мышечными заболеваниями за счет использования миобластов, полученных из легкодоступного источника путем проведения малотравматичной процедуры.
Техническим решением настоящего изобретения является получение миогенных клеток (миобластов, предшественников миобластов) из нового, ранее не известного источника, неожиданно открытого авторами при культивировании фибробластподобных клеток, выделенных из слизистой оболочки полости рта (десны) человека.
Способ состоит из следующих основных стадий:
I. Биопсия десны.
II. Обработка биоптата для получения клеток-предшественников миобластов. Обработка биоптата предусматривает традиционные процедуры его отмывки, измельчения и ферментативного расщепления ткани десны протеолитическими ферментами, которые могут быть легко подобраны специалистом. Обычно для этого используют препараты коллагеназ.
III. Выделенные из дезагригированной ткани клетки-предшественники культивируют на подходящей среде с получением культуры миобластов.
IV. Культуру миобластов далее:
1) тестируют на иммунофенотип и исключение вирусной и бактериальной контаминации;
2) криоконсервируют и хранят в криобанке;
3) размораживают (по необходимости.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения клеточного препарата миобластов для лечения патологий мышечной ткани.
Полученные миобласты могут быть перенесены в любой физиологически/фармакологически приемлемый носитель/наполнитель, например 0,9% физиологический раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера, с аутологичной сывороткой (0,5-10%) или без. Количество клеток может быть выбрано в зависимости от нозологии и обычно составляет 1×106-5×108 клеток на 1 мл.
Способ и схема лечения зависит от состояния больного, тяжести патологии мышечной ткани и выбирается для достижения максимального терапевтического эффекта. Возможные способы введения: внутримышечное, внутрикоронарное, интрамиокардиальное.
Краткое описание рисунков:
Рис.1. Формирование многочисленных многоядерных миотуб (прижизненная съемка, оптическая микроскопия).
Рис.2. Иммуноцитохимическое выявление myo D1 (A), sk-миозин (Б) и sk-актин (С) в культуре миобластов, выделенных из слизистой оболочки полости рта человека (десны): а - окрашивание при помощи специфических моноклональных антител в комбинации с антивидовыми антителами, меченными красителем Alexa488; б - окрашивание клеточных ядер реактивом DAPI; в - совмещение изображений результата флуоресцентного мечения и ядер клеток. Светлый отрезок на фотографиях соответствует 20 мкм.
Подробное описание технического решения.
Забор биоптата (бипсия)
Биоптат десны объемом 2-3 мм3 получали от здоровых доноров под местным обезболиванием 2% раствором лидокаина. Возраст доноров 25-55 лет. Биоптат слизистой оболочки полости рта незамедлительно помещали в промаркированный стерильный контейнер со средой для транспортировки (DMEM/F12).
Доставку биоматериала в лабораторию производили в стерильном полимерном контейнере, содержащем транспортную среду, при температуре +4-8°С в транспортных герметично закрывающихся изотермических контейнерах в течение не более 24 часов.
Обработка биоптата десны
После доставки биоматериала в лабораторию его стерильно переносили в культуральную чашку Петри, промывали раствором Хенкса с антибиотиком (гентамицин), после чего трижды промывали раствором Версена. Биоптат измельчали с помощью стерильного скальпеля, добавляли дезагрегирующий 0,1% (366 units/мг) раствор коллагеназы I или II типа (Sigma) и инкубировали 1-1,5 часа при температуре 37°С.
Выделение предшественников миобластов и культивирование
После инкубирования тканевую взвесь интенсивно пипетировали и центрифугировали в течение 10 минут при 300 g, супернатант удаляли, а осадок разводили культуральной средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% сыворотки пуповинной крови человека (СПК) и 10% аутологичной сыворотки (АС), либо DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% СПК и 10% сыворотки эмбрионов коров (СЭК) фирмы НПП "ПанЭко" (Россия) или FBS Defined (HyClone, США), либо DMEM/F12 1:1 с добавлением 20% СЭК фирмы НПП "ПанЭко" (Россия) или FBS Defined (HyClone, США) и 40 мкг/мл гентамицина, ресуспендировали и переносили в культуральный флакон с плотностью 3-5×104 клеток/см2. Клетки культивировали при +37°С в атмосфере 5% СО2. Замену культуральной среды осуществляли каждые 3-4 дня, культуры пассировали при достижении ими 50% конфлюэнтности. Визуальный контроль роста и морфологии культуры проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для исследований использовали клеточные культуры 1-10 пассажей.
После образования субконфлюэнтного монослоя клетки отмывали раствором Версена, затем снимали с поверхности культуральной посуды раствором Версена с 0,25% трипсина, ресуспендировали в культуральной среде и эксплантировали в культуральную посуду большего объема для последующего культивирования.
Иммунофенотипический анализ фибробластоподобных клеток десны. Полученные клеточные культуры высевали на покровные стекла и через 2 суток проводили иммунофлуоресцентный анализ. Экспрессию белков, характерных для фибробластоподобных клеток, - коллагена I, III типов, эластина и виментина - определяли, используя первичные моноклональные и вторичные антитела, меченные Alexa488 (Life Technologies, США). Клетки визуализировали посредством микроскопа Axioplan 200 с камерой Axiocam HRm, используя программное обеспечение AxioVision (Carl Zeiss, Германия).
Для цитофлуориметрического анализа суспензию клеток фиксировали 1% раствором параформальдегида на фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и применяли флуоресцентные антитела к CD34PE, CD45FITC, CD73PE, CD90APC, CD324FITC, цитокератинам 14, 15, 16, 19 (BDPharmingen, США), CD105 Alexa488 (Life Technologies, США), согласно рекомендациям производителей.
Индукция миогенной дифференцировки. Для индукции миогенной дифференцировки клетки рассевали с высокой плотностью 5×105/см2, культивировали в среде DMEM/F12, 20% FBS (HyClone, США) до 90-100% конфлюэнтного монослоя, затем среду заменяли на DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, США) с добавлением 2% лошадиной сыворотки (BioInd, Израиль) и инкубировали при 37°С и 5% СО2 до появления миотуб-подобных структур.
В клеточной культуре миогенные клетки проходят следующие этапы: адгезия клеток к субстрату, активация и пролиферация клеток-предшественников миобластов; образование миобластов с последующим их слиянием в многоядерные миотубы; образование миофибрилл, характеризующихся сократительной активностью (рис. 1)
Тестирование, криоконсервация и хранение миобластов.
Перед замораживанием клетки высевали из расчета получения субконфлюэнтного монослоя.
Стерильный криозащитный раствор (среда для замораживания), состоящий из 10% ДМСО, DMEM/F12 и 40% FBS, готовили на ледяной бане с целью поддержания температуры +4°С.
Клеточную культуру трехкратно отмывали раствором Версена и трипсинизировали при 37°С, 5% СО2 в течение 10 минут. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 200 g, 10 мин. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в растворе Хэнкса, после чего производили подсчет клеток к камере Горяева.
Часть клеток отбирали для проведения:
1) иммунофенотипического анализа (с целью подтверждения миогенной природы клеток), для этого клеточную суспензию высевали на покровные стекла и культивировали в среде DMEM/F12 с 10-20% содержанием FBS (без пассирования) в течение 21 суток, затем фиксировали в 4% р-ре ПФА (SIGMA Product No. 158127) и проводили иммунофлюоресцентный анализ при помощи первичных мышиных моноклональных антител: DAKO Actin (Sarcomeric) Product No. M087401-2, DAKO MyoD1 Product No. M351201-2, Invitrogen Myosin (skeletal muscle) Product No. 18-0105; и вторичных антител кролика, меченных флуорохромом Alexa488 - Molecular Probes Alexa Fluor 488 Rabbit Anti-Mouse IgG Product No. A-11059. Клеточные ядра дополнительно были окрашены реактивом DAPI - SIGMA Product No. 32670-F (рис. 2).
Оценка эффективности миогенной дифференцировки. Для оценки эффективности индукции миогенной дифференцировки клетки, посеянные на предметные стекла, фиксировали 4% параформальдегидом. Затем культуры инкубировали с первичными мышиными антителами, специфичными к человеческому скелетному миозину (AbD Serotec, Великобритания), актину (Thermo Scientific, США) и ядерному фосфопротеину MyoD1, индуцирующему миогенез (DAKO, США) с последующим окрашиванием вторичными антителами кролика, меченными флуоресцеином (FITC) (Life Technologies, США). Проводили съемку изображений при помощи микроскопа Axioplan 2, камеры Axiocam HRc и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Далее используя программу ImageJ (National Institutes of Health, США), выделяли и измеряли процент специфически окрашенной площади на снимках по отношению ко всему полю. Для каждого случая было проанализировано по 25 независимых полей зрения и даны усредненные значения для всех пациентов (рис. 2).
2) тестирования на биобезопасность (для исключения вирусной и бактериальной контаминации):
- ПЦР (HIV-1 и -2, HBV, HCV, CMV, HSV 1, 2 и 6, EBV, Toxoplasma gondii, Mycoplasma hominis);
- бактериологическое исследование на стерильность (исключение бактериальной и грибковой микрофлоры).
Остальные клетки повторно центрифугировали, клеточный осадок ресуспендировали в среде для замораживания в концентрации 2×106 клеток в 1 мл, после чего клеточную суспензию переносили в криопробирки. Криопробирки маркировали: номер образца, дата, вид биоматериала, количество клеток, количество пассажей.
Клеточный материал подвергали программному замораживанию до -80°С со скоростью 1°С/мин и затем переносили на хранение в криохранилище с жидким азотом. После этого криопробирки помещали в карантинное криохранилище до момента получения результатов тестирования на биобезопасность.
Постоянное хранение образцов с единым идентификационным номером производили в криохранилище (при отрицательных результатах тестирования на биобезопасность). Срок хранения клеток не ограничен.
Размораживание миобластов
Криопробирку с миобластами размораживали, клеточную суспензию переносили в пробирку для центрифугирования, добавляли (по каплям) холодную культуральную среду DMEM/F12 (+4°С), после чего центрифугировали в течение 5 мин при 300 g, 4°С. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12. Процедуру отмывки от DMSO повторяли дважды.
Пример
У добровольца (после подписания информированного согласия) был взят биоптат слизистой оболочки полости рта из ретромолярного пространства диаметром 3 мм3. Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывали растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ/F12. Затем биоптат переносили в среду ДМЕМ/F12, содержащую 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводили при 37°С, инкубировали 1-1,5 часа при температуре 37°С. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в среде для культивирования - ДМЕМ/F12, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы Т 25 ("Nunc"). Флаконы помещали в СО2-инкубатор (37°С, 5% СО2) и культивировали в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизировали и переносили в новый большей площади (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяли на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживали не менее 8-14 часов при 37°С. В конце инкубации клетки снимали с культурального пластика посредством 0,25% раствора трипсин - ЭДТА, отмывали путем трехкратного центрифугирования и ресуспендирования в 0,9% физиологическом растворе натрия хлорида, после чего суспендировали в количестве 20×106 кл./мл в 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций. Полученный препарат миобластов должен храниться при температуре (+4°С)-(+8°С) и должен быть использован в течение 24 часов с момента приготовления.
Список литературы:
1. Miyagawa S, et al. Impaired myocardium regeneration with skeletal cell sheets-a preclinical trial for tissue-engineered regeneration therapy. Transplantion. 2010; 90: 364-72.
2. Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 1961 Feb; 9: 493-5.
3. Pittenger MF, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284(5411): 143-7.
4. Zuk P.A. et. al. Multilinege cells from human adipose tissue: implication for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7: 211-28.
Claims (2)
1. Способ получения миобластов путем культивирования фибробластоподобных клеток, выделенных из слизистой оболочки полости рта человека, включающий:
а) биопсию из слизистой оболочки полости рта человека;
б) обработку биоптата, предусматривающую отмывку, измельчение, ферментативное расщепление ткани десны протеолитическими ферментами;
в) культивирование выделенных из дезагрегированной ткани фибробластоподобных клеток на подходящей среде для получения культуры миобластов;
г) иммунофенотипическое тестирование культуры миобластов на иммунофенотип и исключение вирусной и бактериальной контаминации.
а) биопсию из слизистой оболочки полости рта человека;
б) обработку биоптата, предусматривающую отмывку, измельчение, ферментативное расщепление ткани десны протеолитическими ферментами;
в) культивирование выделенных из дезагрегированной ткани фибробластоподобных клеток на подходящей среде для получения культуры миобластов;
г) иммунофенотипическое тестирование культуры миобластов на иммунофенотип и исключение вирусной и бактериальной контаминации.
2. Способ получения миобластов по п.1, где после стадии г) проводят криоконсервирование миобластов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014107682/15A RU2576842C2 (ru) | 2014-02-28 | 2014-02-28 | Способ получения миобластов, использование биоптата десны, препарат миобластов для лечения патологий мышечной ткани и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014107682/15A RU2576842C2 (ru) | 2014-02-28 | 2014-02-28 | Способ получения миобластов, использование биоптата десны, препарат миобластов для лечения патологий мышечной ткани и способ его получения |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014107682A RU2014107682A (ru) | 2015-09-10 |
| RU2576842C2 true RU2576842C2 (ru) | 2016-03-10 |
Family
ID=54073171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014107682/15A RU2576842C2 (ru) | 2014-02-28 | 2014-02-28 | Способ получения миобластов, использование биоптата десны, препарат миобластов для лечения патологий мышечной ткани и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2576842C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729365C1 (ru) * | 2019-07-11 | 2020-08-06 | Эрнест Арамович Базикян | Тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области |
| RU206764U1 (ru) * | 2021-05-04 | 2021-09-28 | Публичное акционерное общество "КАМАЗ" | Система поворота задним мостом транспортного средства |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004055174A1 (fr) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | Celogos | Composition de milieu de culture, procede de culture, et myoblastes ainsi obtenus, et leurs utilisations |
-
2014
- 2014-02-28 RU RU2014107682/15A patent/RU2576842C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004055174A1 (fr) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | Celogos | Composition de milieu de culture, procede de culture, et myoblastes ainsi obtenus, et leurs utilisations |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FOURNIER B.P. et al. Gingiva as a source of stem cells with therapeutic potential // Stem Cells Dev., 2013, Dec 15;22(24):3157-77. * |
| YIYU FANG et al. Nicotine Inhibits Myofibroblast Differentiation in Human Gingival Fibroblasts // J Cell Biochem., 2005, Aug 15; 95(6): 1108-1119. . * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729365C1 (ru) * | 2019-07-11 | 2020-08-06 | Эрнест Арамович Базикян | Тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области |
| RU206764U1 (ru) * | 2021-05-04 | 2021-09-28 | Публичное акционерное общество "КАМАЗ" | Система поворота задним мостом транспортного средства |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014107682A (ru) | 2015-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8334135B2 (en) | Stem cells from adipose tissue, and differentiated cells from said cells | |
| Asumda et al. | Nuclear cardiac troponin and tropomyosin are expressed early in cardiac differentiation of rat mesenchymal stem cells | |
| ES2325715B1 (es) | Poblacion de celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo cardiaco y su uso en regeneracion cardiaca. | |
| Shukla et al. | Bone marrow stem cells for urologic tissue engineering | |
| EP3908297B1 (en) | Fibroblast regenerative cells | |
| Kesireddy | Evaluation of adipose-derived stem cells for tissue-engineered muscle repair construct-mediated repair of a murine model of volumetric muscle loss injury | |
| AU2019250653B2 (en) | A method of inducing or improving wound healing properties of mesenchymal stem cells | |
| Spoliti et al. | In vitro release and expansion of mesenchymal stem cells by a hyaluronic acid scaffold used in combination with bone marrow | |
| RU2323252C1 (ru) | Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo | |
| EP3911339B1 (en) | Platelet rich-fibrin derived mesenchymal stem cells | |
| RU2576842C2 (ru) | Способ получения миобластов, использование биоптата десны, препарат миобластов для лечения патологий мышечной ткани и способ его получения | |
| US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| KR20090104833A (ko) | 연골 세포 조제 방법 | |
| CN110747162A (zh) | 小分子化合物4-氨基联苯在促干细胞增殖与成软骨分化中的应用 | |
| Zhang et al. | Differentiation induction of cardiac c-kit positive cells from rat heart into sinus node-like cells by 5-azacytidine | |
| US12460178B2 (en) | Method of inducing or improving wound healing properties of mesenchymal stem cells | |
| RU2821926C1 (ru) | Способ получения и ведения мезенхимальных стволовых клеток из костного материала млекопитающих | |
| Wang et al. | Selection of basal medium for culturing human umbilical cord mesenchymal stem cells in combination with human platelet lysate | |
| CN104120106A (zh) | 利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法 | |
| Ghoneim et al. | Isolation of bone Marrow and adipose-derived mesenchymal stromal cells | |
| Putra et al. | Co-culture of human cardiomyocyte and human amnion epithelial stem cells in amnion bilayer matrix for cardiomyogenesis | |
| YAGHMAEI et al. | Induction of alpha-crystallins expression in umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| EP3523417A1 (en) | Method of cultivation of human salivary gland cells | |
| Larson et al. | Xenogen-free media provide variable equine mesenchymal stromal cell expansion after a 7-day culture period | |
| CN118460460A (zh) | 一种间充质干细胞用的无血清培养基及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20160602 |