RU2574017C1

RU2574017C1 - Medication for treating burns and wounds based on cytokines and growth factors, secreted by mesenchymal human cells, method for thereof obtaining and method for treating burns and wounds

Info

Publication number: RU2574017C1
Application number: RU2014139540/15A
Authority: RU
Inventors: Всеволод Арсеньевич Ткачук; Жанна Алексеевна Акопян; Анастасия Юрьевна Ефименко; Татьяна Николаевна Кочегура; Ксения Андреевна Рубина; Екатерина Владимировна Семина; Дмитрий Викторович Стамбольский; Вероника Юрьевна Сысоева; Елена Владимировна Тарасова
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2016-01-27

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: medication is obtained by method, including cultivation of mesenchymal stromal cells of human adipose tissue (MSC AT) of 2-5 passage in growth medium until concentration of total protein in medium 3-4 mg/ml is achieved. Selection and purification of culture medium and its concentration until initial volume of purified culture medium is reduced 9-11 times are carried out with obtaining sterile concentrate, with its further lyophilisation. Medication contains products of human MSC secretion, including key growth factors: FGF basic in concentration from 2 to 4 pg/ml, HGF in concentration from 40 to 80 pg/ml, VEGF in concentration from 200 to 800 pg/ml, angiopoietin-1 in concentration from 0.5 to 10.0 pg/ml, determined by method of enzyme immunoassay with reduction of lyophilisate in 100 ml of sterile physiological solution. Growth medium contains solution of AdvanceSTEM Cell Culture Media, solution of antibiotics Penicillin-Streptomycin and additives AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement with the following component ratio, vol %: AdvanceSTEM Cell Culture Media - 85-95, solution of antibiotics Penicillin-Streptomycin - 0.95-1.05, additives to growth medium AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9.5-10.5. Group of inventions also relate to method of treating burns and wounds.EFFECT: application of claimed group of inventions makes it possible to stimulate healing of burns and wounds due to regenerative action of balanced complex of cytokines and growth factors, secreted by mesenchymal human cells into culture medium.10 cl, 11 dwg, 1 tbl, 10 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использовано для лечения ожогов различного генеза и тяжести, острых и хронических ран различного генеза и тяжести, а также других заболеваний человека, связанных с нарушениями ангиогенеза и нейрогенеза, таких как трофические язвы, в том числе у больных диабетом, при заболеваниях пародонта, ишемии нижних конечностей, алопециях, при повреждениях нервной системы.The invention relates to the field of medicine and pharmacology and can be used to treat burns of various origins and severity, acute and chronic wounds of various origins and severity, as well as other human diseases associated with impaired angiogenesis and neurogenesis, such as trophic ulcers, including patients with diabetes, with periodontal diseases, lower limb ischemia, alopecia, with damage to the nervous system.

Уровень техникиState of the art

Из уровня техники известен способ для лечения ожогов с помощью лекарственного средства на основе кондиционированной среды, полученной при культивировании МСК костного мозга человека (RU 2292212 C1). Кондиционированная среда содержит солевой состав и аминокислоты, пенициллин, амфотерицин, L-глутамин и ЭБС, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста МСК костного мозга человека. При этом кондиционированную среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии МСК, находящихся в Go периоде клеточного цикла. Показано, что полученная среда обладает лечебным эффектом при термических ожогах.The prior art method for treating burns with a medicament based on a conditioned medium obtained by culturing human bone marrow MSCs (RU 2292212 C1). The conditioned medium contains salt composition and amino acids, penicillin, amphotericin, L-glutamine and EBS, sufficient to maintain the viability and growth of human bone marrow MSCs. In this case, the conditioned medium is obtained at the stage of stationary growth of a stable MSC cell line culture located in the Go period of the cell cycle. It is shown that the resulting medium has a therapeutic effect in thermal burns.

Из уровня техники также известна композиция, предназначенная для регенерации кожи и слизистых оболочек, содержащая культуральную питательную среду, включающую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемая для культивирования in vitro эукариотических клеток и кондиционированная продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами эукариотических клеток, выделяемыми ими в питательную среду в процессе их культивирования (RU 2455354 C1). Данная композиция также содержит костномозговые МСК человека в количестве, по меньшей мере, 10⁵ клеток/мл, а в качестве кондиционированной среды содержит культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами МСК, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам. Стоит отметить, что культуральная питательная среда содержит ЭБС (эмбриональную бычью сыворотку).The prior art also known composition intended for the regeneration of the skin and mucous membranes, containing a cultural nutrient medium, including biologically active compounds based on low molecular weight peptides and cytokines, used for culturing in vitro eukaryotic cells and conditioned by the vital products and growth factors of eukaryotic cells secreted by them in a nutrient medium in the process of their cultivation (RU 2455354 C1). This composition also contains human bone marrow MSCs in an amount of at least 10 ⁵ cells / ml, and as a conditioned medium contains a culture medium conditioned with vital products and growth factors of MSC obtained at the stages of the logarithmic phase and stationary growth phase of a stable cell culture cells containing biologically active compounds based on low molecular weight peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and low molecular weight substances with a molecular weight of 2-3 kDa, s corresponding to active cytokines. It is worth noting that the culture medium contains EBS (fetal bovine serum).

Кроме того, из уровня техники известны способ и композиция для предотвращения или лечения кожных дефектов, включающий нанесение на кожный дефект композиции, содержащей МСК костного мозга или кондиционную среду, полученную от МСК, или их комбинацию (WO 2008155659 А2). К числу кожных дефектов, для лечения которых может быть использована композиция, относятся морщины, рубец, возрастное пятно, порез или язва. Следует отметить, что и в данном изобретении использована среда роста, содержащая ЭБС.In addition, a method and composition for preventing or treating skin defects is known from the prior art, comprising applying to a skin defect a composition containing bone marrow MSCs or a conditioned medium obtained from MSCs, or a combination thereof (WO 2008155659 A2). Skin defects that the composition can be used to treat include wrinkles, a scar, an age spot, a cut, or an ulcer. It should be noted that in this invention used growth medium containing EB.

В указанных выше изобретениях для получения кондиционированной среды использованы МСК костного мозга. Однако по данным различных авторов МСК жировой ткани обладают более выраженными паракринными эффектами в отношении стимуляции роста кровеносных сосудов и нервов по сравнению с МСК костного мозга, использованными в данных изобретениях. Кроме того, в данных изобретениях кондиционированная среда включает в себя потенциально опасные животные компоненты в виде ЭБС.In the above inventions, bone marrow MSCs were used to produce the conditioned medium. However, according to various authors, MSCs of adipose tissue have more pronounced paracrine effects in relation to stimulation of the growth of blood vessels and nerves compared with bone marrow MSCs used in these inventions. In addition, in these inventions, the conditioned medium includes potentially hazardous animal components in the form of EBF.

Из уровня техники также известен способ получения обработанной среды, согласно которому проводят культивирование стволовых клеток в среде без факторов роста, содержащей десферроксамин, при этом стволовые клетки предварительно культивируют в ростовой среде, что обеспечивает получение кондиционированной среды, которая включает факторы, секретируемые данными стволовыми клетками (WO 2011127090 A1). Затем полученную кондиционированную среду отбирают и фильтруют с целью получения обработанной кондиционированной среды. Полученная таким способом среда может использоваться в составе композиции, дополнительно содержащей полимер, для лечения кожных ожогов.A method for producing a treated medium is also known from the prior art, according to which stem cells are cultured in a medium without growth factors containing desferroxamine, while the stem cells are pre-cultured in a growth medium, which provides a conditioned medium that includes factors secreted by these stem cells ( WO 2011127090 A1). Then, the resulting conditioned medium is taken and filtered to obtain a treated conditioned medium. The medium obtained in this way can be used as part of a composition additionally containing a polymer for the treatment of skin burns.

Однако в данном изобретении для получения кондиционированной среды используется среда, не предназначенная специально для поддержания функционального состояния стволовых клеток.However, the present invention uses a medium not specifically designed to maintain the functional state of stem cells to produce a conditioned medium.

Из уровня техники также известна кондиционированная культуральная среда, полученная при культивировании МСК, их потомства или клеточной линии, полученной из них, в культуральной среде. При этом МСК получают путем культивирования клеточной колонии эмбриональных стволовых клеток или их потомства, в отсутствие сокультуры и в бессывороточной среде, содержащей FGF2 (fibroblast growth factor 2) (US 2010323027 A1). Указанная среда может быть использована в составе композиции для лечения сердечной недостаточности, заболеваний костного мозга, заболеваний кожи, ожогов и дегенеративных заболеваний, таких как диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рак.The prior art also knows the conditioned culture medium obtained by culturing MSCs, their progeny or cell line derived from them in the culture medium. In this case, MSCs are obtained by culturing a cell colony of embryonic stem cells or their offspring, in the absence of co-culture and in a serum-free medium containing FGF2 (fibroblast growth factor 2) (US 2010323027 A1). This medium can be used in the composition for the treatment of heart failure, bone marrow diseases, skin diseases, burns and degenerative diseases such as diabetes, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and cancer.

Однако для поддержания МСК в функциональном состоянии при культивировании в бессывороточной среде путем добавления только одного ростового фактора - FGF2 может быть недостаточно, что оказывает негативное влияние на состав продуктов, секретируемых МСК в среду культивирования, и снижает регенеративный потенциал кондиционированной среды.However, to maintain the MSC in a functional state when cultured in a serum-free medium by adding only one growth factor, FGF2 may not be enough, which negatively affects the composition of the products secreted by MSC in the culture medium and reduces the regenerative potential of the conditioned medium.

Из уровня техники также известен способ, включающий добавление регенеративных клеток в культуральную среду, при этом культуральная среда подобрана таким образом, чтобы обеспечивать рост и поддержание регенеративных клеток (в частности, МСК) и позволить секрецию благоприятствующих факторов из регенеративных клеток в культуральную среду так, чтобы образовывать кондиционированную среду. Затем из полученной кондиционированной среды выделяют экстракт, который не содержит целых клеток. Полученный экстракт и/или его компоненты используют для местного нанесения на участок кожи человека с целью стимулирования роста клеток кожи (WO 2010038232 A1). В заявке предлагается использование композиции, содержащей полученный экстракт, для лечения дерматологических нарушений и/или нарушений роста волос, но нет экспериментальных данных, подтверждающих возможность и эффективность лечения ожогов и ран предлагаемым средством.The prior art also known a method comprising adding regenerative cells to the culture medium, while the culture medium is selected so as to ensure the growth and maintenance of regenerative cells (in particular, MSCs) and to allow the secretion of favorable factors from regenerative cells into the culture medium so that form an air-conditioned environment. Then, an extract that does not contain whole cells is isolated from the resulting conditioned medium. The obtained extract and / or its components are used for topical application to an area of human skin in order to stimulate the growth of skin cells (WO 2010038232 A1). The application proposes the use of a composition containing the obtained extract for the treatment of dermatological disorders and / or hair growth disorders, but there are no experimental data confirming the feasibility and effectiveness of treating burns and wounds with the proposed agent.

Другим направлением в лечении заболеваний с помощью регенеративной терапии является использование частиц, секретируемых МСК. В частности, для лечения кожных заболеваний и ожогов могут быть использованы частицы, включающие везикулы или эксзосомы (WO 2009105044 A1). Описан способ получения частицы, включающий получение среды, кондиционированной МСК; концентрирование полученной среды, кондиционированной МСК; обработку сконцентрированной среды, кондиционированной МСК, путем гель-фильтрации; отбор фракции, которая демонстрирует динамическое рассеяние света, путем УФ-детектирования при 220 нм. При этом этап отбора фракции включает сбор фракций, которые элюируют со временем удерживания 11-13 минут. Полученная частица может быть использована в составе фармацевтической композиции, применяемой для лечения заболеваний с помощью подходов регенеративной медицины.Another area in the treatment of diseases using regenerative therapy is the use of particles secreted by MSCs. In particular, particles including vesicles or exosomes can be used to treat skin diseases and burns (WO 2009105044 A1). A method for producing a particle is described, including obtaining a medium conditioned by MSC; concentration of the resulting medium, conditioned by MSC; processing concentrated MSC-conditioned medium by gel filtration; selection of a fraction that exhibits dynamic light scattering by UV detection at 220 nm. The fraction selection step involves collecting fractions that elute with a retention time of 11-13 minutes. The resulting particle can be used as part of a pharmaceutical composition used to treat diseases using regenerative medicine approaches.

Однако, несмотря на то, что в последнее время получено значительное количество данных, указывающих на важную роль экзосом в реализации паракринных эффектов МСК, нет доказательств того, что именно фракция, описанная в изобретении, является ключевой для регенеративного действия этих клеток. Помимо этого, использование представленной в изобретении технологии значительно усложняет процесс производства конечного продукта.However, despite the fact that recently a significant amount of data has been obtained indicating the important role of exosomes in the realization of the paracrine effects of MSCs, there is no evidence that the fraction described in the invention is the key to the regenerative action of these cells. In addition, the use of the technology presented in the invention greatly complicates the production process of the final product.

Кроме того, недостатком указанных выше изобретений является отсутствие указаний на количественное содержание факторов, обеспечивающих эффективность изобретений.In addition, the disadvantage of the above inventions is the lack of indications of the quantitative content of factors ensuring the effectiveness of the inventions.

Из уровня техники известен также способ лечения ожогов и ран с использованием мази «Солкосерил», содержащей депротеинизированный диализат из крови здоровых молочных телят, стандартизированный химически и биологически и обладающий регенеративным действием. Однако этот препарат представляет собой комплекс пептидов неизвестного состава, полученных из тканей животных, потенциально способный вызывать иммунные реакции и содержать инфекционные агенты животного происхождения.The prior art also known a method of treating burns and wounds using ointment "Solcoseryl" containing deproteinized dialysate from the blood of healthy dairy calves, standardized chemically and biologically, and having a regenerative effect. However, this drug is a complex of peptides of unknown composition derived from animal tissues, potentially capable of inducing immune responses and containing infectious agents of animal origin.

Из уровня техники также известно, что в качестве материалов для закрытия дефектов кожи используют коммерческие продукты на основе живых кожных заменителей дермального, эпидермального или двойного типа:It is also known from the prior art that commercial products based on live skin substitutes for dermal, epidermal or double type are used as materials for closing skin defects:

1) Dermagraft (криоконсервированные аллогенные фибробласты человека из кожи крайней плоти новорожденных, выращенные на биосорбирующей сетчатой подложке из полиглактина);1) Dermagraft (cryopreserved allogeneic human fibroblasts from the skin of the foreskin of newborns grown on a biosorbent mesh substrate made of polyglactin);

2) OrCel (двухслойный матрикс из бычьего коллагена типа 1, на поверхности и в пористом слое которого культивируются аллогенные дермальные фибробласты, а на непористом слое - эпидермальные кератиноциты от того же донора);2) OrCel (a bilayer matrix of bovine collagen type 1, on the surface and in the porous layer of which allogeneic dermal fibroblasts are cultured, and on the non-porous layer - epidermal keratinocytes from the same donor);

3) Epicel (искусственно полученный эпидермальный аутотрансплантат, представляющий собой слой (от 2 до 8 слоев клеток) аутологичных кератиноцитов, культивированных ex vivo в присутствии мышиных фибробластов);3) Epicel (artificially produced epidermal autograft representing a layer (from 2 to 8 layers of cells) of autologous keratinocytes cultivated ex vivo in the presence of murine fibroblasts);

4) Invitrx CSS (Composite Skin Substitute) представляет собой 3-мерный кожный эквивалент, состоящий из дермальных аутологичных фибробластов, помещенных на коллаген/викриловую сетку, и верхнего слоя кератиноцитов.4) Invitrx CSS (Composite Skin Substitute) is a 3-dimensional skin equivalent, consisting of dermal autologous fibroblasts placed on a collagen / vicryl network, and an upper layer of keratinocytes.

Кроме того, среди таких решений стоит отметить перевязочное средство, которое может быть использовано для лечения нарушений кожного покрова различного генеза, в том числе ожогов (RU 103474 U1). Перевязочное средство включает биосовместимую прозрачную полимерную пленку толщиной 3-100 мкм со сквозными отверстиями диаметром 0,01-3,00 мкм, на одной из поверхностей которой выращен слой диплоидных клеток фибробластов легкого эмбриона человека, взятых от 6-20 пассажа и выращенных на пленке в бессывороточной среде в присутствии кондиционной среды от аналогичной культуры. Средство эффективно при лечении обширных трофических поражений кожи.In addition, among these solutions, it is worth noting a dressing that can be used to treat disorders of the skin of various origins, including burns (RU 103474 U1). The dressing includes a biocompatible transparent polymer film 3-100 microns thick with through holes with a diameter of 0.01-3.00 microns, on one surface of which a layer of diploid fibroblast cells of human lung embryo is grown, taken from passage 6-20 and grown on film in serum-free medium in the presence of a conditioned medium from a similar culture. The tool is effective in the treatment of extensive trophic skin lesions.

Помимо этого, известно двухслойное раневое покрытие с использованием клеточного материала человека, которое применяется для заживления ран разной площади и содержит гидратированную микробную целлюлозу с наслоенным на нее коллагеновьм гелем (RU 94151 U1). В слоях или на их границе присутствует, по крайней мере, один источник ростовых факторов, ускоряющий эпителизацию раны. В качестве источников ростовых факторов применяют клетки мезодермального и/или эктодермального типа и/или тромбоциты крови. Описаны комбинации клеточного материала, дающие высокий лечебный эффект заявляемого лекарственного раневого покрытия. Сочетание бактериальной целлюлозы и коллагенового геля в двухслойном покрытии для ран создает оптимальные условия для проявления свойств ростовых факторов.In addition, a two-layer wound dressing using human cellular material is known, which is used for healing wounds of different sizes and contains hydrated microbial cellulose with a collagen gel layered on it (RU 94151 U1). At least one source of growth factors is present in the layers or at their boundary, accelerating wound epithelization. Mesodermal and / or ectodermal type cells and / or blood platelets are used as sources of growth factors. Combinations of cellular material are described that give a high therapeutic effect of the claimed medicinal wound dressing. The combination of bacterial cellulose and collagen gel in a two-layer coating for wounds creates optimal conditions for the manifestation of the properties of growth factors.

Однако все указанные выше продукты содержат живые клетки человека, что увеличивает риски, связанные с биобезопасностью препаратов, усложняет процессы их производства, стандартизации и контроля качества, кроме того, с учетом отсутствия в РФ законов, регулирующих использование клеточных технологий, коммерциализация подобных продуктов в России затруднена.However, all of the above products contain living human cells, which increases the risks associated with the biosafety of drugs, complicates the processes of their production, standardization and quality control, in addition, given the absence of laws in the Russian Federation regulating the use of cell technologies, the commercialization of such products in Russia is difficult .

Наиболее близким к заявляемому решению является средство для лечения, в том числе ран и ожогов, содержащее кондиционированную клеточную культуральную среду, полученную при культивировании эукариотических клеток в трех измерениях (RU 2280459 C1). Клеточные культуры, культивированные в трех измерениях, могут включать различные типы клеток, в том числе МСК, нервные стволовые клетки, фибробласты, эмбриональные стволовые клетки и др. Указанное средство содержит кондиционированную культуральную среду, из которой отделены клеточные культуры, и включает такие внеклеточные продукты, как факторы роста, противовоспалительные медиаторы, ферменты, цитокины, гормоны, факторы свертывания крови, регуляторные факторы, ангиогенные факторы или антиангиогенные факторы.Closest to the claimed solution is a tool for treatment, including wounds and burns, containing conditioned cell culture medium obtained by culturing eukaryotic cells in three dimensions (RU 2280459 C1). Cell cultures cultured in three dimensions can include various types of cells, including MSCs, nerve stem cells, fibroblasts, embryonic stem cells, etc. This agent contains an air-conditioned culture medium from which cell cultures are separated, and includes such extracellular products, such as growth factors, anti-inflammatory mediators, enzymes, cytokines, hormones, blood coagulation factors, regulatory factors, angiogenic factors or anti-angiogenic factors.

Однако в описании данного изобретения не представлено количественное содержание в кондиционированной среде факторов, обеспечивающих эффективность средства для лечения ран и ожогов, не раскрыты способы ее очистки, не подтверждено сохранение фармакологических свойств среды после процедуры лиофилизации.However, the description of the present invention does not show the quantitative content in the conditioned medium of factors ensuring the effectiveness of the agent for treating wounds and burns, does not disclose methods for cleaning it, and does not confirm the conservation of the pharmacological properties of the medium after the lyophilization procedure.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является создание нового лекарственного средства для лечения ожогов и ран, обладающего комплексным воздействием на различные этапы раневого процесса.The objective of the invention is the creation of a new drug for the treatment of burns and wounds, with a complex effect on the various stages of the wound process.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение лекарственного средства, с высокой эффективностью стимулирующего заживление ожогов и ран за счет регенеративного действия сбалансированного комплекса цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека в культуральную среду, не содержащую животных компонентов. Эффективность средства обеспечивается за счет подобранного содержания ключевых факторов роста, необходимых для реализации регенеративного действия МСК, а именно фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и ангиопоэтина 1 типа (Angpt-1), концентрацию которых измеряют с помощью иммуноферментного анализа (ELISA).The technical result to which the claimed invention is directed is to obtain a medicine with high efficiency stimulating the healing of burns and wounds due to the regenerative effect of a balanced complex of cytokines and growth factors secreted by human mesenchymal cells in a culture medium that does not contain animal components. The effectiveness of the drug is ensured by the selected content of key growth factors necessary for the regenerative effect of MSCs, namely, vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), main fibroblast growth factor (bFGF) and type 1 angiopoietin (Angpt-1 ), the concentration of which is measured using an enzyme immunoassay (ELISA).

Поставленная задача решается тем, что способ получения средства для лечения ожогов и ран включает культивирование мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ) человека 2-5 пассажей в среде роста до момента достижения концентрации общего белка в среде 3-4 мг/мл, отбор и очистку среды культивирования, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, от остатков клеток, ее концентрирование до уменьшения исходного объема очищенной среды культивирования в 9-11 раз с получением стерильного концентрата, с последующей его лиофилизацией для получения средства, содержащего продукты секреции МСК человека, включающие ключевые факторы роста: FGF basic в концентрации от 2 до 4 пкг/мл, HGF в концентрации от 40 до 80 пкг/мл, VEGF в концентрации от 200 до 800 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации от 0,5 до 10,0 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа при восстановлении лиофилизата в 100 мл стерильного физиологического раствора, при этом среда роста содержит раствор Advance S ТЕМ Cell Culture Media (HyClone, USA), раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA), добавки AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), которые берут при следующем соотношении компонентов, об.%:The problem is solved in that the method of obtaining funds for the treatment of burns and wounds includes the cultivation of mesenchymal stromal cells of adipose tissue (MSCs) of a person for 2-5 passages in a growth medium until the total protein concentration in the medium is 3-4 mg / ml, selection and purification of the culture medium containing the secretion products of human gastrointestinal MSC from cell debris, its concentration to reduce the initial volume of the purified culture medium by 9-11 times to obtain a sterile concentrate, followed by lyophilization to irradiation of a product containing human MSC secretion products, including key growth factors: FGF basic at a concentration of 2 to 4 pkg / ml, HGF at a concentration of 40 to 80 pkg / ml, VEGF at a concentration of 200 to 800 pkg / ml, angiopoietin 1 in a concentration of 0.5 to 10.0 pg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when restoring the lyophilisate in 100 ml of sterile saline solution, while the growth medium contains Advance S TEM Cell Culture Media solution (HyClone, USA), Penicillin antibiotic solution -Streptomycin (HyClone, USA), AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), which are taken when traveling ratio of components, vol.%:

AdvanceSTEM Cell Culture Media - 85-95AdvanceSTEM Cell Culture Media - 85-95

Раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin - 0,95-1,05Penicillin-Streptomycin antibiotic solution - 0.95-1.05

Добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9,5-10,5.AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9.5-10.5.

Культивирование может быть осуществлено в культуральных флаконах или чашках Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке с плотностью 5-15·10³/см² в среде роста в объеме 0,1-0,2 мл/см² в условиях CO₂ инкубатора при 37±1°C, 5%-ном содержании CO₂ и относительной влажности ≥95% до достижения концентрации общего белка в среде 3-4 мг/мл или в биореакторе (BioFlo / CelliGen 115, New Brunswick, США), при этом клетки выращивают на микроносителях (например, FibraCel, 50 г микроносителей на 2-2,5 л среды) плотностью 10⁶-10⁷ клеток/см³ до достижения концентрации общего белка в среде 3-4 мг/мл. Очистка среды культивирования от отстатков клеток (клеточного дебриса) может быть реализована центрифугированием, например, при 5000±10 об/мин, температуре 6±2°C в течение 10 минут. Концентрирование очищенной среды культивирования осуществляют посредством ее ультрафильтрации с удалением низкомолекулярных соединений массой менее 5 кДа, при этом для получения стерильного концентрата дополнительно осуществляют микрофильтрацию полученного концентрата через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Концентрирование может быть осуществлено с использованием системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences, США) или аналогичной с использованием ультрафильтрационных кассет (Minimate TFF capsule, PALL) или аналогичных. Лиофилизация может быть осуществлен в 6-10 стадий при давлении 0,013-0,027 кПа, температуре от -45°C до 25°C, время лиофилизации не более 24 часов при максимальной загрузке лиофильной сушки.The cultivation can be carried out in culture bottles or Petri dishes (Corning or similar), while the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 · 10 ³ / cm ² in a growth medium in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95% until a total protein concentration in the medium of 3-4 mg / ml or in a bioreactor is achieved (BioFlo / CelliGen 115, New Brunswick , USA), while the cells are grown on microcarriers (for example, FibraCel, 50 g of microcarriers per 2-2.5 l of medium) with a density of 10 ⁶ -10 ⁷ cells / cm ³ until concentration fraction of total protein in the medium 3-4 mg / ml. Cleaning the culture medium from cell debris (cell debris) can be carried out by centrifugation, for example, at 5000 ± 10 rpm, temperature 6 ± 2 ° C for 10 minutes. The concentration of the purified culture medium is carried out by ultrafiltration with the removal of low molecular weight compounds weighing less than 5 kDa, while microfiltration of the obtained concentrate is additionally carried out through filters with a pore diameter of 0.22 μm to obtain a sterile concentrate. Concentration can be carried out using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences, USA) or similar using ultrafiltration cassettes (Minimate TFF capsule, PALL) or similar. Lyophilization can be carried out in 6-10 stages at a pressure of 0.013-0.027 kPa, temperature from -45 ° C to 25 ° C, lyophilization time of no more than 24 hours at maximum load of freeze drying.

Поставленная задача решается также тем, что средство для лечения ожогов и ран включает среду роста в виде лиофилизата, полученного по способу, описанному выше, который содержит ключевые факторы роста - FGF basic в концентрации от 2 до 4 пкг/мл, HGF в концентрации от 40 до 80 пкг/мл, VEGF в концентрации от 200 до 800 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации от 0,5 до 10,0 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа при восстановлении 2,5±0,3 г лиофилизата в 100 мл стерильного физиологического раствора.The problem is also solved by the fact that the tool for treating burns and wounds includes a growth medium in the form of a lyophilisate obtained by the method described above, which contains the key growth factors - FGF basic in a concentration of from 2 to 4 pkg / ml, HGF in a concentration of from 40 up to 80 pcg / ml, VEGF in a concentration of 200 to 800 pcg / ml, angiopoietin-1 in a concentration of 0.5 to 10.0 pg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when recovering 2.5 ± 0.3 g of lyophilisate in 100 ml of sterile saline.

Поставленная задача решается также тем, что способ лечения ожогов и ран включает разведение средства, описанного выше, в стерильном физиологическом растворе или стерильной воде для инъекций, из расчета 2,5±0,3 г средства на 100 мл раствора или воды, пропитывание повязок или материалов для закрытия дефектов кожи с последующим нанесением пропитанных повязок и материалов на ожог или рану 1-2 раза в день в течение 3-7 дней или до начала эпителизации раны.The problem is also solved by the fact that the method of treating burns and wounds includes diluting the agent described above in sterile saline or sterile water for injection, at the rate of 2.5 ± 0.3 g of the agent per 100 ml of solution or water, soaking the dressings or materials for closing skin defects with the subsequent application of soaked dressings and materials on a burn or wound 1-2 times a day for 3-7 days or before the start of epithelialization of the wound.

В качестве повязок могут быть использованы повязки с сорбционными свойствами на основе целлюлозы и ее производных (марля, вата и алигнин медицинской марки А или аналогичные); раневые целлюлозные повязки (Cosmopor steril, Германия или аналогичные) с гидрофобной микросеткой со стороны раны, всасывающей подушечкой из чистой ваты и мягкой основой из нетканого материала, покрытого гипоаллергенным полиакрилатным клеем; повязки на основе лигнина (Полифепан, Россия или аналогичные); атравматичные повязки с поглотительным слоем из целлюлозы, не приклеивающимся внутренним слоем и внешним водоотталкивающим слоем, препятствующим просачиванию секрета (повязка Zeruvit, Германия или аналогичные); повязки на основе карбоксиметилцеллюлозы (Aquacel, Великобритания), вискозы (Мероге, Германия), окисленной целлюлозы (Oxydized cellulose (США), Феранцел (Беларусь)) или аналогичные. В качестве материалов для закрытия дефектов кожи могут быть использованы атравматичные, сорбирующие покрытия на основе природных и синтетических полимеров: на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (повязка Aquacel, Великобритания или аналогичные); на основе альгинатов (натриево-кальциевая соль альгиновой кислоты - полисахарида морских водорослей, Альгипор, (Россия), Sorbsan, Sorbalgon и Algosteril (США), Tegagel, Kaltostat и Fibracol (Великобритания), Comfeel Sea-Sorb (Дания) или аналогичные).As dressings can be used dressings with sorption properties based on cellulose and its derivatives (gauze, cotton wool and alignin medical grade A or similar); cellulose wound dressings (Cosmopor steril, Germany or the like) with a hydrophobic micro grid on the side of the wound, a clean cotton pad and a soft non-woven base covered with hypoallergenic polyacrylate adhesive; lignin-based dressings (Polyphepan, Russia or similar); non-invasive dressings with an absorbent layer of cellulose, a non-adhesive inner layer and an external water-repellent layer that prevents secretion from leaking out (dressing Zeruvit, Germany or similar); dressings based on carboxymethyl cellulose (Aquacel, UK), viscose (Meroge, Germany), oxidized cellulose (Oxydized cellulose (USA), Ferancel (Belarus)) or similar. Atraumatic, sorbent coatings based on natural and synthetic polymers can be used as materials for closing skin defects: based on the sodium salt of carboxymethyl cellulose (Aquacel dressing, UK or similar); based on alginates (sodium-calcium salt of alginic acid - a seaweed polysaccharide, Algipor, (Russia), Sorbsan, Sorbalgon and Algosteril (USA), Tegagel, Kaltostat and Fibracol (Great Britain), Comfeel Sea-Sorb (Denmark) or similar).

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что лекарственное средство для лечения ожогов и ран получают при культивировании мезенхимных стромальных клеток человека в бессывороточной среде, поддерживающей рост недифференцированных стволовых и прогениторных клеток мезенхимного происхождения, путем сбора кондиционированной среды, содержащей цитокины и факторы роста, секретируемые клетками в культуральную среду, очистки и концентрирования полученной среды с помощью ультрафильтрации и ее стабилизации путем лиофилизации. Полученный лиофилизат разводят в стерильном физиологическом растворе и используют для местного лечения ожогов и ран путем пропитывания средств для перевязки.Thus, the technical result is achieved due to the fact that the drug for the treatment of burns and wounds is obtained by culturing human mesenchymal stromal cells in a serum-free medium that supports the growth of undifferentiated stem and progenitor cells of mesenchymal origin by collecting an conditioned medium containing cytokines and growth factors, secreted by cells into the culture medium, purification and concentration of the obtained medium by ultrafiltration and its stabilization by lyophilia nation. The resulting lyophilisate is diluted in sterile saline and used for topical treatment of burns and wounds by soaking the dressings.

Эффективность разрабатываемого лекарственного средства предполагает наличие целого комплекса воздействий, направленных на стимулирование пролиферации фибробластов кожи, реэпителизации (стимуляции базальных кератиноцитов), регуляцию процессов воспаления, а затем грануляцию вновь формирующейся ткани, и наконец, формирование стабильной сети сосудов и подрастание нервов. При этом необходимость восстановления сосудистой сети и нервных окончаний в зоне регенерации после ожогов является актуальной задачей. На сегодняшний день основной упор делается на быстрое закрытие раны и предотвращение развития воспаления. Это приводит к формированию рубца, развитию фиброза, а в ряде случае формированию келоидных рубцов. Использование среды культивирования, кондиционированной мезенхимными клетками человека, позволит решить весь комплекс проблем, возникающих при регенерации ткани после ожогов и ран. Предполагается, что ускоренное заживление кожных повреждений, в том числе за счет стимуляции васкуляризации и реиннервации, может быть осуществлено с помощью бессывороточной среды, содержащей комбинацию цитокинов и факторов роста, секретированных МСК человека. Данное решение позволяет получить оптимальное сочетание факторов роста, секретированных клетками человека - т.е. прошедших необходимые модификации и способствующее ангиогенезу и нейрогенезу в среде, не содержащей белков животного происхождения и бактериальных фрагментов.The effectiveness of the developed drug implies the presence of a whole range of effects aimed at stimulating the proliferation of skin fibroblasts, re-epithelialization (stimulation of basal keratinocytes), regulating inflammation, and then granulating the newly formed tissue, and finally, the formation of a stable vascular network and nerve growth. At the same time, the need to restore the vascular network and nerve endings in the regeneration zone after burns is an urgent task. Today, the main emphasis is on the rapid closure of the wound and the prevention of inflammation. This leads to the formation of a scar, the development of fibrosis, and in some cases the formation of keloid scars. Using a culture medium conditioned by human mesenchymal cells will solve the whole complex of problems that arise during tissue regeneration after burns and wounds. It is believed that accelerated healing of skin lesions, including by stimulating vascularization and reinnervation, can be accomplished using a serum-free medium containing a combination of cytokines and growth factors secreted by human MSCs. This solution allows you to get the optimal combination of growth factors secreted by human cells - i.e. having undergone the necessary modifications and promoting angiogenesis and neurogenesis in an environment that does not contain animal proteins and bacterial fragments.

Для получения кондиционированной среды нами использованы мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) человека, отвечающие за репарацию и регенерацию тканей и органов как в норме, так и при повреждениях. Одним из наиболее богатых источников МСК у человека является жировая ткань. МСК могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных МСК жировой ткани (МСК ЖТ) приводит к получению относительно гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток.To obtain a conditioned environment, we used multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) of a person, which are responsible for the repair and regeneration of tissues and organs both in normal and in case of damage. One of the richest sources of MSCs in humans is adipose tissue. MSCs can be easily isolated as a result of enzymatic processing of adipose tissue samples obtained as a result of cosmetic liposuction or during surgical removal of body fat. The cultivation of isolated adipose MSCs (adipose tissue MSCs) results in a relatively homogeneous population of multipotent stromal fibroblast-like cells.

В заявляемом изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному из уровня техники способу (см. Пример 1), и в виде коммерческих препаратов МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения, например, такие как продукт АТСС (АТСС^® PCS-500-011), представляющий собой МСК человека, выделенные из липоаспирата, культивированные до 2 пассажа и подвергнутые криоконсервации, или аналогичные.In the claimed invention, MSCs obtained independently by any method known from the prior art (see Example 1), and in the form of commercial preparations of MSCs with a quality certificate and intended, including for clinical use, for example, such as a product, can be used ATCC (ATCC ^® PCS-500-011), which is a human MSC isolated from lipoaspirate, cultured up to 2 passages and subjected to cryopreservation, or similar.

Ранее на моделях ишемии конечности и инфаркта миокарда и подкожно имплантированного матригеля у животных нами было показано, что локальное и системное введение МСК ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в этих тканях и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии. Кроме того, нами было выявлено, что введение МСК ЖТ способствует прорастанию нервных окончаний в подкожно имплантированный матригель и улучшает восстановление периферических нервов после травматического повреждения. Согласно данным наших исследований и работ других научных коллективов, основным механизмом, лежащим в основе регенеративного эффекта МСК ЖТ, является продукция этими клетками широкого спектра биологически активных цитокинов и факторов роста, ускоряющих процессы заживления и восстановления тканей после повреждения.Previously, on models of limb ischemia and myocardial infarction and subcutaneously implanted matrigel in animals, we showed that local and systemic administration of VT MSCs increases the number of vessels in tissues with impaired blood supply, leads to an improvement in blood flow in these tissues and a decrease or disappearance of symptoms of ischemia. In addition, we found that the introduction of MSC in the VT promotes the germination of nerve endings in the subcutaneously implanted matrigel and improves the recovery of peripheral nerves after traumatic injury. According to the data of our studies and the work of other scientific teams, the main mechanism underlying the regenerative effect of MSC in adipose tissue is the production by these cells of a wide range of biologically active cytokines and growth factors that accelerate the healing and restoration of tissues after damage.

В большинстве протоколов выделения и культивирования МСК ЖТ используется среда с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) или фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Эти сыворотки содержат необходимый коктейль факторов роста, гормонов и витаминов, стимулирующих клеточную адгезию и пролиферацию в условиях культивирования in vitro. В то же время накапливается все больше сведений о том, что клетки, выращенные с использованием сывороток животных, потенциально небезопасны, в частности, существует риск заражения прионами или вирусами культуры клеток при культивировании с использованием сывороток животных, а также возможность иммунной реакции со стороны организма реципиента. Кроме того, было показано, что длительное культивирование в присутствии ФБС значительно изменяет свойства клеток различного происхождения. Так, мезенхимные клетки костного мозга, культивированные в присутствие ФБС, характеризуются нестабильностью транскриптома, включая изменение экспрессии генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоз и клеточную адгезию.Most protocols for isolation and cultivation of MSC in adipose tissue use a medium supplemented with fetal calf serum (ETS) or fetal bovine serum (FBS). These serums contain the necessary cocktail of growth factors, hormones and vitamins that stimulate cell adhesion and proliferation in vitro. At the same time, more and more information is accumulating that cells grown using animal sera are potentially unsafe, in particular, there is a risk of infection of the cell culture by prions or viruses during cultivation using animal sera, as well as the possibility of an immune reaction from the recipient’s body . In addition, it was shown that long-term cultivation in the presence of PBS significantly changes the properties of cells of various origins. Thus, bone marrow mesenchymal cells cultured in the presence of PBS are characterized by transcriptome instability, including changes in the expression of genes responsible for the regulation of the cell cycle, apoptosis, and cell adhesion.

Отличительной особенностью данного изобретения является использование специализированной среды, поддерживающей рост и функциональные свойства недифференцированных МСК человека и не содержащей животной сыворотки (AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) с добавлением раствора антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA) и добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA)), которые берут при следующем соотношении компонентов, об.%:A distinctive feature of this invention is the use of a specialized medium that supports the growth and functional properties of undifferentiated human MSCs and does not contain animal serum (AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) with the addition of Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone, USA) and AdvanceSTEM growth medium supplement Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA)), which are taken in the following ratio of components, vol.%:

AdvanceSTEM Cell Culture Media - 85-95AdvanceSTEM Cell Culture Media - 85-95

МСК выделяют из подкожной жировой ткани человека и культивируют в указанной среде роста до 2-5 пассажа. Затем к клеткам добавляют свежую среду роста и культивируют в условиях CO₂ инкубатора до достижения заданной концентрации общего белка в среде. Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК человека, собирают в стерильные емкости для центрифугирования, очищают путем центрифугирования от клеточного дебриса и полученный супернатант подвергают концентрированию с помощью процедуры ультрафильтрации, удаляя все низкомолекулярные соединения массой менее 5 кДа с уменьшением исходного объема в 9-11 раз. На этапе ультрафильтрации при использовании соответствующего оборудования и соблюдении асептических условий можно получить стерильный продукт. Если невозможно обеспечить стерильность продукта при процедуре ультрафильтрации, то добавляют этап микрофильтрации. Для этого концентрированную среду фильтруют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, достаточным для очистки от потенциально содержащихся в продукте микроорганизмов, а затем подвергают процедуре лиофилизации для получения итогового продукта (лиофилизат концентрированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека), содержащего в том числе ключевые факторы роста, по которым проводится стандартизация конечного продукта. Так, при восстановлении 2,5±0,3 г лиофилизата в 100 мл стерильного физиологического раствора методом иммуноферментного анализа в растворе должны определяться FGF basic в концентрации от 2 до 4 пкг/мл, HGF в концентрации от 40 до 80 пкг/мл, VEGF в концентрации от 200 до 800 пкг/мл, ангиопозтин-1 в концентрации от 0,5 до 10,0 пкг/мл.MSCs are isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured in the indicated growth medium until passage 2-5. Then fresh growth medium is added to the cells and cultured in a CO ₂ incubator until a predetermined concentration of total protein in the medium is reached. A conditioned medium containing all the secretion products of human MSCs is collected in sterile centrifugation containers, centrifuged to remove debris from the cells, and the resulting supernatant is concentrated by ultrafiltration, removing all low molecular weight compounds weighing less than 5 kDa with a decrease in the initial volume of 9-11 times . At the ultrafiltration stage, using appropriate equipment and observing aseptic conditions, a sterile product can be obtained. If it is not possible to ensure sterility of the product during the ultrafiltration procedure, then the microfiltration step is added. To do this, the concentrated medium is filtered through disposable sterile filters with a pore diameter of 0.22 μm, sufficient to purify microorganisms potentially contained in the product, and then subjected to a lyophilization procedure to obtain the final product (lyophilisate of a concentrated medium containing human MSC secretion products) containing including key growth factors that standardize the final product. So, when recovering 2.5 ± 0.3 g of lyophilisate in 100 ml of sterile physiological saline by enzyme-linked immunosorbent assay in solution, FGF basic should be determined in a concentration of 2 to 4 pkg / ml, HGF in a concentration of 40 to 80 pkg / ml, VEGF in a concentration of from 200 to 800 pkg / ml, angiopoztin-1 in a concentration of from 0.5 to 10.0 pkg / ml.

Технической особенностью данного изобретения является также возможность использования в качестве культуральной емкости для выращивания эукариотических клеток биореактора (BioFlo/CelliGen 115, New Brunswick, США или аналогичного), при этом клетки выращивают на специальных микроносителях (например, FibraCel, 50 г микроносителей на 2-2,5 л среды) с высокой плотностью, что позволяет в более сжатые сроки получить кондиционированную среду с заданными характеристиками.A technical feature of this invention is the possibility of using a bioreactor (BioFlo / CelliGen 115, New Brunswick, USA or the like) as a culture container for growing eukaryotic cells, while the cells are grown on special microcarriers (for example, FibraCel, 50 g of microcarriers for 2-2 , 5 l of medium) with a high density, which makes it possible to obtain an air-conditioned environment with specified characteristics in a shorter time.

Другой технической особенностью данного изобретения является возможность концентрировать кондиционированную среду с использованием системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences, США) или аналогичной, используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL) или аналогичные, что позволяет значительно ускорить процесс концентрирования и способствует лучшему сохранению биологически активных веществ в кондиционированной среде.Another technical feature of this invention is the ability to concentrate the conditioned medium using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences, USA) or similar, using ultrafiltration cartridges (Minimate TFF capsule, PALL) or similar, which can significantly accelerate the concentration process and contribute to a better preservation of biologically active substances in an air-conditioned environment.

В результате осуществления данного изобретения получают лекарственное средство на основе цитокинов и факторов роста секретируемых МСК человека, используемое для лечения ожогов и ран, преимущественно, на ранних этапах раневого процесса, которым пропитывают повязки и материалы для закрытия дефектов кожи.As a result of the implementation of this invention, a medicament is prepared based on cytokines and growth factors of secreted human MSCs, used to treat burns and wounds, mainly in the early stages of the wound healing process, which are applied to dressings and materials to cover skin defects.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.

Фигура 1. Микрофотографии, демонстрирующие формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) in vitro в присутствии кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, в которой блокировано действие VEGF. В среду культивирования добавляли нейтрализующие антитела к VEGF в различной концентрации (10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, соответственно). Антитела к VEGF дозозависимо подавляют формирование капилляроподобных структур.Figure 1. Microphotographs showing the formation of capillary-like structures by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vitro in the presence of an air-conditioned medium containing the secretion products of human MSC in which the action of VEGF is blocked. Anti-VEGF neutralizing antibodies were added to the culture medium at various concentrations (10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM, respectively). VEGF antibodies dose-dependently inhibit the formation of capillary-like structures.

Фигура 2. Микрофотографии культур фибробластов человека при культивировании в контрольной среде (А) и при культивировании в концентрированной кондиционированной среде, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека (Б).Figure 2. Micrographs of cultures of human fibroblasts when cultured in control medium (A) and when cultured in concentrated conditioned medium containing the secretion products of MSCs of human VT (B).

Фигура 3. Диаграмма, отражающая изменения пролиферативного индекса фибробластов человека при культивировании в концентрированной кондиционированной среде, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека (темный столбик), и контрольной среде (светлый столбик), не содержащей сыворотки, через 24 часа после нанесения раны.Figure 3. A diagram reflecting changes in the proliferative index of human fibroblasts when cultured in concentrated air-conditioned medium containing the secretion products of MJ in human VT (dark bar) and control medium (light bar) containing no serum, 24 hours after wound application.

Фигура 4. Диаграмма, отражающая рост скорости миграции фибробластов человека при культивировании в концентрированной кондиционированной среде, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека (темный столбик), и контрольной среде, не содержащей сыворотки, через 24 часа после нанесения раны. * - p<0.05.Figure 4. A diagram reflecting the increase in the rate of migration of human fibroblasts when cultured in a concentrated conditioned medium containing the secretion products of human MJ VT (dark bar) and a control medium not containing serum, 24 hours after applying the wound. * - p <0.05.

Фигура 5. Макрофотографии ожоговой раны без обработки и после воздействия средой, кондиционированной концентрированной средой МСК и мазью сразу после моделирования ожога (а, 6, в, г), через 3 (д, е, ж, з) и 10 (и, к, л, м) суток после моделирования ожога.Figure 5. Macrographs of the burn wound without treatment and after exposure to medium, conditioned with concentrated MSC medium and ointment immediately after modeling the burn (a, 6, c, d), after 3 (e, f, g, h) and 10 (and, to , l, m) days after modeling the burn.

Фигура 6. Микрофотографии срезов кожи крыс через 20 суток в группе кондиционированная концентрированная среда МСК (гематоксилин-эозин). Масштабный отрезок соответствует 100 мкм (в-г) и 50 мкм (а-б). Восстановление структуры эпидермиса и дермы и волосяных фолликулов. Единичные мелкие сосуды в дерме.Figure 6. Microphotographs of sections of the skin of rats after 20 days in the group of conditioned concentrated MSC medium (hematoxylin-eosin). The scale segment corresponds to 100 μm (b-d) and 50 μm (a-b). Restoring the structure of the epidermis and dermis and hair follicles. Single small vessels in the dermis.

Фигура 7. Микрофотографии срезов кожи крыс через 20 суток в группе мазь (гематоксилин-эозин). Масштабный отрезок соответствует 100 мкм (в, г) и 50 мкм (а, б). Крупные сосуды в дерме. Элементы воспаления, отложения коллагена (б, г). Нет восстановления эпителиального слоя и структуры дермы.Figure 7. Micrographs of sections of the skin of rats after 20 days in the ointment group (hematoxylin-eosin). The scale segment corresponds to 100 μm (c, d) and 50 μm (a, b). Large vessels in the dermis. Elements of inflammation, collagen deposition (b, d). There is no restoration of the epithelial layer and structure of the dermis.

Фигура 8. Микрофотографии срезов кожи крыс через 20 суток в группе Физ. раствор (гематоксилин-эозин). Масштабный отрезок соответствует 100 мкм (г-е) и 50 мкм (а-в). Крупные отечные сосуды в дерме, элементы воспаления во всей толще дермы. Нет восстановления эпидермального слоя даже на границе перехода ожог/интактная ткань. Отложения коллагена.Figure 8. Microphotographs of sections of the skin of rats after 20 days in the group Phys. solution (hematoxylin-eosin). The scale segment corresponds to 100 μm (gf) and 50 μm (a-c). Large edematous vessels in the dermis, elements of inflammation in the entire thickness of the dermis. There is no recovery of the epidermal layer even at the burn / intact tissue interface. Collagen deposits.

Фигура 9. Микроскопическая картина раны на 3 сутки при смачивании повязки исследуемым лекарственным средством: А - увеличение 100, окраска по Ван-Гизону; Б - увеличение 600, окраска гематоксилином и эозином.Figure 9. Microscopic picture of the wound on the 3rd day when the dressing is wetted with the studied medicinal product: A - increase of 100, Van Gieson stain; B - 600 magnification, hematoxylin and eosin staining.

Фигура 10. Микроскопическая картина раны на 14 сутки при смачивании повязки исследуемым лекарственным средством, увеличение 100, окраска гематоксилином и эозином.Figure 10. The microscopic picture of the wound on day 14 when the dressing is wetted with the investigational drug, an increase of 100, staining with hematoxylin and eosin.

Фигура 11. Вид раны на 28 сутки при лечении повязками с исследуемым лекарственным средством (А-Б) или при обкалывании раны исследуемым лекарственным средством (В-Г): А, В - макроскопическая картина, Б, Г - микроскопия, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 100.Figure 11. View of the wound on day 28 during treatment with dressings with the investigational medicinal product (A-B) or when chipping the wound with the investigational medicinal product (B-D): A, B - macroscopic picture, B, D - microscopy, staining with hematoxylin and eosin , an increase of 100.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Ниже представлено подробное описание изобретения на примерах конкретного выполнения, которые демонстрируют практическую осуществимость изобретения, но не ограничивают возможность осуществления изобретения с помощью иных средств и методов.Below is a detailed description of the invention by examples of specific performance, which demonstrate the practical feasibility of the invention, but do not limit the possibility of carrying out the invention using other means and methods.

Пример 1. Получение МСК жировой ткани человека.Example 1. Obtaining MSCs of human adipose tissue.

МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone), содержащим 5-кратную концентрацию антибиотика 500 ед./мл (HyClone).MSCs are isolated from subcutaneous fat deposits of healthy donors of both sexes. Cells are isolated from material obtained during minor surgery under local anesthesia or during routine surgical operations. Surgical material (15 g of adipose tissue taken from the umbilical region or other area of localization of subcutaneous fat) is placed in a disposable tube with HBSS buffer (HyClone) containing a 5-fold antibiotic concentration of 500 units / ml (HyClone).

В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM^тм (HyClone) /500 ед./мл антибиотика (HyClone), 200 ед./мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед/ml) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37°C в течение 30-45 минут при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM^тм support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) в сочетании с добавлением 10% раствора добавок AdvanceSTEM^тм Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед./мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).Under sterile conditions of the culture box, the biopsy is fragmented to a homogeneous mass using sterile instruments, and then subjected to enzymatic treatment in a solution containing AdvanceSTEM ^{™ tm} medium (HyClone) / 500 units / ml antibiotic (HyClone), 200 units / ml type I collagenase and dispases (40 units / ml) (Worthington Biochemical) (the ratio of the volume of enzymes and fat should be 1: 1: 1), at 37 ° C for 30-45 minutes with constant stirring. At the end of the incubation, an equal volume of serum medium is added to the sample and filtered through nylon membranes with a pore size of 100 μm (BD). The filtered suspension is centrifuged for 5 min at 200 g, after which the supernatant is completely removed. The cell pellet is subjected to treatment with erythrocyte lysis buffer (BD) until the solution becomes red, then centrifuged for 5 min at 200 g. The supernatant is completely removed, and the precipitated cells are resuspended in MSC growth medium. AdvanceSTEM ^™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) in combination with the addition of 10% AdvanceSTEM ^™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) and 100 units / ml antibiotic (HyClone) are used to cultivate mesenchymal cells. This medium was developed by the manufacturer (HyClone) for the cultivation of undifferentiated MSCs, in particular cells originating from adipose tissue without the addition of serum (http://www.thermo.com).

Выделенные мезенхимные клетки высевают в концентрации 200 тыс. в мл в чашках Петри и культивируют в среде роста в инкубаторе при 37°C и при 5%-ной концентрации CO₂. При достижении 80% монослоя МСК ЖТ (0 пассаж) замораживают в жидком азоте и хранят в мастер-банке для дальнейшего использования с целью наработки среды.Isolated mesenchymal cells are seeded at a concentration of 200 thousand in ml in Petri dishes and cultured in growth medium in an incubator at 37 ° C and at a 5% concentration of CO ₂ . Upon reaching 80% of the monolayer of MSC ZhT (0 passage), they are frozen in liquid nitrogen and stored in a master bank for further use in order to accumulate the medium.

Для наработки среды МСК ЖТ масштабируют. Перед снятием с поверхности культурального пластика клетки трехкратно промывают раствором Версена. Затем наносят в каждую чашку по 1 мл реагента для диссоциации клеток HyQTase (HyClone). При приобретении клетками округлой формы и откреплении их от подложки в каждую культуральную емкость вносят по 9 мл среды роста и интенсивно пипетируют клеточную суспензию. Затем клетки рассевают в соотношении 1:4.To produce the medium, MSCs of VT are scaled. Before removing from the surface of the culture plastic, the cells are washed three times with Versen's solution. Then, 1 ml of HyQTase (HyClone) cell dissociation reagent is applied to each dish. When the cells acquire a rounded shape and detach them from the substrate, 9 ml of growth medium is introduced into each culture container and the cell suspension is intensively pipetted. Then the cells are seeded in a ratio of 1: 4.

Пример 2. Получение кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.Example 2. Obtaining a conditioned medium containing the secretion products of MSCs in human adipose tissue.

Для получения кондиционированной среды МСК ЖТ наращивают до 2-5 пассажа. МСК ЖТ человека добавляют в количестве 5-15·10³/см² в культуральные емкости для выращивания эукариотических клеток и заполняют их свежей средой роста (AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) (90±5 мл), раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA) (1,00±0,05 мл) и добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA) (10,0±0,5 мл) на 100 мл) в количестве 0,1-0,2 мл/см², а затем культивируют в условиях CO₂ инкубатора при 37±1°C, 5%-ном содержании CO₂ и относительной влажности >95% до достижения концентрации общего белка в среде 3-4 мг/мл.To obtain a conditioned environment, MSCs of VT are increased to 2-5 passage. MSCs of human gastrointestinal tract are added in an amount of 5-15 · 10 ³ / cm ² in culture containers for growing eukaryotic cells and filled with fresh growth medium (AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) (90 ± 5 ml), Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone, USA) (1.00 ± 0.05 ml) and AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA) (10.0 ± 0.5 ml) per 100 ml) in the amount of 0.1- 0.2 ml / cm ² and then cultured in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity> 95% until a total protein concentration of 3-4 mg / ml is reached in the medium.

В качестве культуральных емкостей для выращивания эукариотических клеток используют культуральные флаконы или чашки Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке плотностью 5-15·10³/см².As culture containers for growing eukaryotic cells, culture bottles or Petri dishes (Corning or the like) are used, and the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 · 10 ³ / cm ² .

Для ускорения и повышения эффективности процесса кондиционирования среды используют биореактор (BioFlo/ CelliGen 115, New Brunswick, США), при этом клетки выращивают на специальных микроносителях (FibraCel, 50 г микроносителей на 2-2,5 л среды) плотностью 10⁶-10⁷ клеток/см³. Для этого клетки в количестве 10⁶-10⁷/см³ помещают в сосуды биореактора (к одной управляющей станции подключены 2 сосуда, объем каждого сосуда 3 л), в каждый сосуд наливают до 2000 мл среды роста (AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) (90±5 мл), раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA) (1,00±0,05 мл) и добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA) (10,0±0,5 мл) на 100 мл) и 50 г дисков FibraCel (New Bmnswick Scientific) и хорошо перемешивают. В течение 30 мин происходит прикрепление клеток к поверхности дисков FibraCel, после чего производится запуск работы биореактора, клетки культивируют при температуре 37±1°C, 5%-ном содержании CO₂ и постоянном перемешивании 200 об/мин с помощью магнитной мешалки.To accelerate and increase the efficiency of the conditioning process, a bioreactor (BioFlo / CelliGen 115, New Brunswick, USA) is used, while cells are grown on special microcarriers (FibraCel, 50 g of microcarriers per 2-2.5 l of medium) with a density of 10 ⁶ -10 ⁷ cells / cm ³ . For this, cells in an amount of 10 ⁶ -10 ⁷ / cm ³ are placed in the vessels of the bioreactor (2 vessels are connected to one control station, the volume of each vessel is 3 l), up to 2000 ml of growth medium (AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) (90 ± 5 ml), Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone, USA) (1.00 ± 0.05 ml) and AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA) (10.0 ± 0) , 5 ml) per 100 ml) and 50 g of FibraCel discs (New Bmnswick Scientific) and mix well. Cells attach to the surface of the FibraCel discs for 30 min, after which the bioreactor starts up, the cells are cultured at a temperature of 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and constant stirring at 200 rpm using a magnetic stirrer.

Культивирование клеток проводят до 6 дней. Ежедневно наблюдают за состоянием клеток, отбирают пробы культуральной среды (0,5 мл) и проводят анализ в ней общего белка. Если показатель концентрации общего белка в среде достигает интервала 3-4 мг/мл, начинают сбор кондиционированной среды: из 1 сосуда отбирают 1 л кондиционированной среды в стерильную емкость, после отбора в соответствующий сосуд биореактора вносят 1 литр свежей среды роста и продолжают процедуру культивирования. Сбор среды проводят ежедневно (по 1 л в день) до 1 месяца. По истечении этого срока клетки утилизируют, сосуды биореактора и диски промывают и подвергают автоклавированию.Cell cultivation is carried out up to 6 days. Daily monitor the condition of the cells, take samples of the culture medium (0.5 ml) and analyze the total protein in it. If the total protein concentration in the medium reaches the range of 3-4 mg / ml, the collection of conditioned medium begins: 1 liter of conditioned medium is taken from a 1 vessel into a sterile container, after selection, 1 liter of fresh growth medium is introduced into the corresponding vessel of the bioreactor and the cultivation procedure is continued. The collection of the medium is carried out daily (1 liter per day) up to 1 month. After this period, the cells are disposed of, the vessels of the bioreactor and discs are washed and autoclaved.

Пример 3. Очистка и концентрирование кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, методом ультрафильтрации.Example 3. The purification and concentration of the conditioned medium containing the secretion products of MSCs of human adipose tissue by ultrafiltration.

Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК ЖТ человека, собирают в стерильные емкости для центрифугирования, центрифугируют при (5000±10) об/мин, температуре (6±2) С, в течение 10 минут для очистки от клеточного дебриса. Полученный супернатант отбирают в новые стерильные емкости объемом 250-500 мл.An air-conditioned medium containing all the secretion products of human MF of MF VT is collected in sterile containers for centrifugation, centrifuged at (5000 ± 10) rpm, temperature (6 ± 2) C, for 10 minutes to remove cell debris. The resulting supernatant is taken into new sterile containers with a volume of 250-500 ml.

Концентрирование среды проводят с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences), используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL, 5 кДа) или аналогичные. Для этого питающий резервуар заполняют 500 мл кондиционированной среды, контролируя с помощью мерных цилиндров начальный объем раствора. Производительность насоса устанавливают на уровне 50 мл/мин, давление не более 2 атмосфер. С помощью мерного сосуда и таймера определяют начальную скорость фильтрации, собирая фильтрат в течение 10 минут, и рассчитывают время фильтрации 80% начального объема, исходя из начальной скорости, после чего устанавливают таймер на расчетное время. По мере концентрирования среды скорость фильтрации постепенно снижается, а производительность насоса и фильтрационное давление существенно не меняется. При уменьшении начального объема в 2 раза добавляют еще 500 мл кондиционированной среды в питающий резервуар. Затем процедуру повторяют еще необходимое количество раз для концентрирования всего объема кондиционированной среды, добавляя каждый раз по 500 мл кондиционированной среды. Осуществляя периодический контроль, добиваются уменьшения объема кондиционированной среды в 9-11 раз. После этого выключают насос, переносят возвращающий шланг в сосуд для сбора сконцентрированного раствора, включают насос и дожидаются осушения питающего резервуара. Для вытеснения остатков сконцентрированной среды в питающий резервуар добавляют фосфатно-солевой буфер/0,5% раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone), включают насос и под визуальным контролем собирают концентрированную среду до момента выхода из системы всего сконцентрированного раствора.Concentration of the medium is carried out using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences), using ultrafiltration cartridges (Minimate TFF capsule, PALL, 5 kDa) or similar. To do this, fill the supply tank with 500 ml of conditioned medium, controlling the initial volume of the solution using measuring cylinders. Pump performance is set at 50 ml / min, pressure not more than 2 atmospheres. Using a measuring vessel and a timer, the initial filtration rate is determined by collecting the filtrate for 10 minutes, and the filtration time of 80% of the initial volume is calculated based on the initial speed, after which a timer is set for the estimated time. As the medium is concentrated, the filtration rate gradually decreases, and the pump performance and filtration pressure do not change significantly. If the initial volume is reduced by 2 times, another 500 ml of conditioned medium is added to the feed tank. Then the procedure is repeated as many times as necessary to concentrate the entire volume of the conditioned medium, adding 500 ml of conditioned medium each time. By periodically monitoring, they achieve a reduction in the volume of the conditioned medium by 9–11 times. After that, turn off the pump, transfer the return hose to the vessel to collect the concentrated solution, turn on the pump and wait for the drainage of the supply tank. To displace the residual concentrated medium, phosphate-buffered saline / 0.5% Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone) is added to the supply tank, the pump is turned on and the concentrated medium is collected under visual control until the entire concentrated solution leaves the system.

Очищенную концентрированную среду подвергают микрофильтрации. Фильтрацию кондиционированной среды осуществляют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, обеспечивающие стерилизацию продукта. Среду подают на фильтры перистальтическим насосом. Фильтрат собирают в стерильную полипропиленовую емкость.The purified concentrated medium is subjected to microfiltration. Filtration of the conditioned medium is carried out through disposable sterile filters with a pore diameter of 0.22 μm, ensuring sterilization of the product. The medium is fed to the filters by a peristaltic pump. The filtrate is collected in a sterile polypropylene container.

Пример 4. Лиофилизация концентрированной кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.Example 4. Lyophilization of concentrated conditioned medium containing the secretion products of MSCs in human adipose tissue.

Очищенную концентрированную фильтрованную среду подвергают процедуре лиофилизации для получения итогового продукта (лиофилизат концентрированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека). Для этого разливают очищенную концентрированную фильтрованную среду по (10,0±0,1) мл в стерильные стеклянные флаконы емкостью 100 мл. Флаконы укупоривают бутиловыми резиновыми пробками для лиофилизации. Затем флаконы помещают в лиофильную сушку. Охлаждают до -45°C с контролем по температуре полок, затем 1 час выдерживают при указанной температуре. После этого включают конденсор, охлаждают его до -45°C, включают вакуумный насос и доводят давление до 0,027 кПа. Проводят следующие шаги:The purified concentrated filtered medium is subjected to a lyophilization procedure to obtain the final product (lyophilisate of a concentrated medium containing human MSC secretion products). For this, the purified concentrated filtered medium (10.0 ± 0.1) ml is poured into sterile glass bottles with a capacity of 100 ml. Vials are sealed with butyl rubber stoppers for lyophilization. Then the bottles are placed in freeze drying. It is cooled to -45 ° C with temperature control of the shelves, then it is kept at the indicated temperature for 1 hour. After that, turn on the condenser, cool it to -45 ° C, turn on the vacuum pump and bring the pressure to 0.027 kPa. Perform the following steps:

1) ступенчатый нагрев до -40°C за 30 минут при давлении 0,013 кПа;1) stepwise heating to -40 ° C in 30 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

2) ступенчатый нагрев до -30°C за 60 минут при давлении 0,013 кПа;2) stepwise heating to -30 ° C in 60 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

3) ступенчатый нагрев до -10°C за 180 минут при давлении 0,013 кПа;3) stepwise heating to -10 ° C in 180 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

4) ступенчатый нагрев до -5°C за 180 минут при давлении 0,013 кПа;4) stepwise heating to -5 ° C in 180 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

5) плавный нагрев от -5°C до 0°C за 180 минут при давлении 0,013 кПа;5) smooth heating from -5 ° C to 0 ° C in 180 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

6) ступенчатый нагрев до 10°C за 60 минут;6) stepwise heating to 10 ° C in 60 minutes;

7) ступенчатый нагрев до 25°C за 60 минут;7) stepwise heating to 25 ° C in 60 minutes;

8) снижение температуры до 8°C (в течение 12 часов до отключения оператором);8) temperature reduction to 8 ° C (within 12 hours until the operator shuts down);

9) девакуумирование до 0,05 кПа;9) devacuation up to 0.05 kPa;

10) полная автоматическая укупорка резиновыми пробками;10) full automatic corking with rubber stoppers;

11) сброс вакуума;11) vacuum relief;

12) выгрузка флаконов.12) unloading of bottles.

Общая продолжительность процедуры лиофилизации не превышает 24 часов при полной загрузке лиофильной сушки. После выгрузки на флаконы надевают алюминиевые колпачки и завальцовывают их с помощью ручной машины для обжима колпачков.The total duration of the lyophilization procedure does not exceed 24 hours with a full load of freeze drying. After unloading, aluminum caps are put on the vials and rolled up using a manual machine for crimping the caps.

Пример 5. Выявление ключевых факторов, опосредующих регенеративные эффекты среды, кондиционированной МСК жировой ткани человека.Example 5. Identification of key factors mediating the regenerative effects of the medium, conditioned MSCs of human adipose tissue.

В многочисленных исследованиях было показано, что МСК-ЖТ секретируют в среду культивирования широкий спектр биологически активных веществ, факторов роста и цитокинов, играющих важную роль в процессах регенерации и репарации.In numerous studies, it was shown that MSC-VT secrete a wide range of biologically active substances, growth factors, and cytokines, which play an important role in the processes of regeneration and repair, in the culture medium.

Одним из важнейших проангиогенных факторов, играющих центральную роль в стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, является VEGF. Как было показано ранее, МСК ЖТ секретируют VEGF в среду культивирования. Для выявления вклада VEGF в стимулирующий эффект кондиционированной среды МСК-ЖТ на образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками действие VEGF блокировали. Для этого в среду культивирования эндотелиальных клеток, содержащую кондиционированную среду от МСК ЖТ, добавляли блокирующие антитела против VEGF (Abeam, ab9570) в концентрации 0,1 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля для нейтрализующих антител использовали неспецифические изотипические иммуноглобулины мыши.One of the most important pro-angiogenic factors that play a central role in stimulating the proliferation and migration of endothelial cells is VEGF. As shown earlier, VT MSCs secrete VEGF into the culture medium. To determine the contribution of VEGF to the stimulating effect of the conditioned MSC-VT medium on the formation of capillary-like structures by endothelial cells, the effect of VEGF was blocked. For this, blocking antibodies against VEGF (Abeam, ab9570) at a concentration of 0.1 μg / ml were added to the endothelial cell culture medium containing a conditioned medium from VT MSC. Non-specific isotypic mouse immunoglobulins were used as a negative control for neutralizing antibodies.

Добавление блокирующих антител против VEGF человека приводило к значительному подавлению эффекта среды культивирования на стимуляцию образования тубулярных структур - в среднем на 57% (40% и 65%) (Фиг. 1). Следует отметить, что этот эффект был тем больше выражен, чем выше были показатели содержания мРНК VEGF в клетках (r=0,64, p=0,09) и уровня продукции VEGF в среду культивирования (r=0,94, p=0,02). Таким образом, на модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками было подтверждено, что VEGF, основной фактор роста эндотелиальных клеток, является необходимым для реализации паракринных эффектов кондиционированной среды МСК ЖТ человека.The addition of blocking antibodies against human VEGF led to a significant suppression of the effect of the culture medium on stimulation of the formation of tubular structures - on average by 57% (40% and 65%) (Fig. 1). It should be noted that this effect was more pronounced, the higher the VEGF mRNA content in cells (r = 0.64, p = 0.09) and the level of VEGF production in the culture medium (r = 0.94, p = 0) , 02). Thus, in a model of the formation of capillary-like structures by endothelial cells, it was confirmed that VEGF, the main growth factor of endothelial cells, is necessary for the realization of the paracrine effects of the conditioned medium of human MSC in the VT.

Для выявления других ключевых факторов использовали последовательное исключение наиболее важных, согласно данным литературы, факторов, продуцируемых МСК ЖТ. Для этого в среду культивирования добавляли блокирующие антитела к плацентарному фактору роста (PLGF), HGF, FGFb, ангиопоэтину-1, ангиогенину, тромбоспондину-1, ингибитору активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) и анализировали способность такой среды стимулировать формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле.To identify other key factors, we used the sequential exclusion of the most important, according to the literature, factors produced by MSC of VT. For this, blocking antibodies to placental growth factor (PLGF), HGF, FGFb, angiopoietin-1, angiogenin, thrombospondin-1, a type 1 plasminogen activator inhibitor (PAI-1) were added to the cultivation medium, and the ability of such a medium to stimulate the formation of capillary like endothelial structures was analyzed cells on Matrigel.

Добавление блокирующих антител против HGF (Abeam, GeneTex), ангиопоэтина-1 (MyBioSource, LifeSpan Biosciences) и FGFb (antibodies-online Inc.) имело наиболее выраженный эффект и приводило к подавлению стимуляции образования тубулярных структур. Антитела к ангиогенину (LifeSpan Biosciences, santa cruz biotechnology, inc.) оказывали умеренный эффект по снижению стимулирующей ангиогенез активности среды культивирования МСК ЖТ, антитела к PLGF (GeneTex, RnDSystems), тромбоспондину-1 (Invitrogen), PAI-1 (antibodies-online Inc.) такого эффекта не оказывали (Таблица 1).The addition of blocking antibodies against HGF (Abeam, GeneTex), angiopoietin-1 (MyBioSource, LifeSpan Biosciences) and FGFb (antibodies-online Inc.) had the most pronounced effect and led to suppression of stimulation of the formation of tubular structures. Antibodies to angiogenin (LifeSpan Biosciences, santa cruz biotechnology, inc.) Had a moderate effect in reducing angiogenesis stimulating activity of the culture medium of MSC in the VT, antibodies to PLGF (GeneTex, RnDSystems), thrombospondin-1 (Invitrogen), PAI-1 (antibodies-online Inc.) did not have such an effect (Table 1).

Таблица 1 - Table 1 - Средняя длина микротрубочек, образованных HUVEC на Матригеле, в присутствии кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, при добавлении блокирующих антител против различных ростовых факторов.The average length of the microtubules formed by HUVEC on Matrigel, in the presence of a conditioned medium containing the secretion products of human MTC in the VT, with the addition of blocking antibodies against various growth factors.

С учетом полученных результатов стандартизацию кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, проводят по концентрации четырех ключевых факторов роста: VEGF, HGF, FGFb, Angpt-1.Taking into account the results obtained, the standardization of the conditioned medium containing the secretion products of human gastrointestinal MSCs is carried out by the concentration of four key growth factors: VEGF, HGF, FGFb, Angpt-1.

Пример 6. Метод оценки концентрации ключевых факторов, опосредующих регенеративные эффекты среды, кондиционированной МСК жировой ткани человека.Example 6. A method for assessing the concentration of key factors mediating the regenerative effects of an environment conditioned by MSCs of human adipose tissue.

Оценку содержания VEGF, HGF, FGF basic (FGFb), Angpt-1 в восстановленном в 100 мл стерильного физиологического раствора лиофилизате концентрированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека, проводят методом иммуноферментного анализа (ELISA). В растворе должны определяться FGFb в концентрации от 2 до 4 пкг/мл, HGF в концентрации от 40 до 80 пкг/мл, VEGF в концентрации от 200 до 800 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации от 0,5 до 10,0 пкг/мл.Evaluation of the content of VEGF, HGF, FGF basic (FGFb), Angpt-1 in reconstituted in 100 ml of sterile physiological solution lyophilisate concentrated medium containing the secretion products of human MSC is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In the solution, FGFb should be determined in a concentration of 2 to 4 pkg / ml, HGF in a concentration of 40 to 80 pkg / ml, VEGF in a concentration of 200 to 800 pkg / ml, angiopoietin-1 in a concentration of 0.5 to 10.0 PCG / ml.

Оценка содержания FGFb с использованием набора фирмы R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA KitEvaluation of FGFb content using the R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA Kit

Для определения концентрации FGFb методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat#DFB50) или аналогичный.To determine the concentration of FGFb by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat # DFB50) or a similar one is used.

Используя стандартизированный раствор FGFb, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл FGFb, каждая последующая содержала FGFb в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора FGFb троекратно наносят в лунки 96-луночный планшет и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°C. Планшет отмывают буфером Wash Buffer и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против FGFb человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized FGFb solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml FGFb, each subsequent one contains 2 times less FGFb. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of the FGFb solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human FGFb antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate is incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer is added to each well and the reaction is evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания HGF с использованием набора фирмы R&D Systems Human HGF Quantikine ELISA Kit.Evaluation of HGF content using the R&D Systems Human HGF Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации HGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human HGF Quantikine ELISA Kit, cat#DHG00) или аналогичный.To determine the concentration of HGF by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human HGF Quantikine ELISA Kit, cat # DHG00) or similar is used.

Используя стандартизированный раствор HGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл HGF, каждая последующая содержала HGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора HGF троекратно наносят в лунки 96-луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°C. Планшет отмывают буфером Wash Buffer и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против HGF человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized HGF solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml HGF, each subsequent one contains 2 times less HGF. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. Test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of a HGF solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human HGF antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate is incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer is added to each well and the reaction is evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания ангиопоэтина-1 с использованием набора фирмы R&D Systems Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit.Evaluation of angiopoietin-1 content using the R&D Systems Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации ангиопоэтина-1 методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit, cat#DANG10) или аналогичный.To determine the concentration of angiopoietin-1 by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit, cat # DANG10) or similar is used.

Используя стандартизированный раствор ангиопоэтина-1, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл ангиопоэтина-1, каждая последующая содержала ангиопоэтина-1 в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора ангиопоэтина-1 троекратно наносят в лунки 96-луночный планшет и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°C. Планшет отмывают буфером Wash Buffer и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против ангиопоэтина-1 человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized solution of angiopoietin-1, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml of angiopoietin-1, each subsequent one contains 2 times less angiopoietin-1. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. Test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of an angiopoietin-1 solution, are applied three times to wells in a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human angiopoietin-1 antibody is added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate is incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer is added to each well and the reaction is evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания VEGF с использованием набора фирмы R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA Kit.Evaluation of VEGF content using the R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации VEGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat#DVE00) или аналогичный.To determine the concentration of VEGF by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat # DVE00) or a similar one is used.

Используя стандартизированный раствор VEGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл VEGF, каждая последующая содержала VEGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора VEGF троекратно наносят в лунки 96-луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°C. Планшет отмывают буфером Wash Buffer и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против VEGF человека. Через 3 часа инкубации планшеты отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized VEGF solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml VEGF, each subsequent one contains 2 times less VEGF. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. Test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of a VEGF solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer and 100 μl of biotinylated mouse anti-human VEGF monoclonal antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plates are washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate is incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer is added to each well and the reaction is evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Пример 7. Специфическая активность лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых МСК жировой ткани человека, на моделях in vitro.Example 7. The specific activity of the drug based on cytokines and growth factors secreted by MSCs of human adipose tissue, in vitro models.

Для оценки способности разрабатываемого лекарственного средства эффективно стимулировать заживление кожных повреждений использовали два типа клеток входящих в состав кожи - эпидермиса и дермы - линейные эпителиальные клетки и первичные дермальные фибробласты человека 4-5 пассажа, полученные от здоровых доноров.To assess the ability of the developed drug to effectively stimulate the healing of skin lesions, two types of cells included in the skin — epidermis and dermis — linear epithelial cells and primary human dermal fibroblasts of passage 4-5 obtained from healthy donors were used.

Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для моделирования условий зарастания раны использовали модель клеточной раны (scratch assay), воспроизводящую условия зарастания раны после повреждения (Фиг. 2). Для этого клетки высаживали на чашки Петри в концентрации 200 тыс. кл./мл для эпителиальных клеток и 100 тыс. кл./мл для дермальных фибробластов и культивировали в стандартных условиях до достижения субконфлюентного монослоя. Затем клетки депривировали 2 и 12 часов соответственно.Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum. To model the conditions for wound overgrowth, a cell wound model (scratch assay) was used that reproduces the conditions for wound overgrowth after damage (Fig. 2). For this, cells were planted on Petri dishes at a concentration of 200 thousand cells / ml for epithelial cells and 100 thousand cells / ml for dermal fibroblasts and cultured under standard conditions until a subconfluent monolayer was reached. Then the cells were deprived 2 and 12 hours, respectively.

Стерильным наконечником 1000 мкл на монослое клеток наносили стандартную по ширине царапину длиной 2 см и заливали клетки концентрированной кондиционированной средой, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека. В качестве отрицательного контроля использовали среду DMEM без сыворотки. В качестве положительного контроля использовали среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки культивировали 24 часа, а затем оценивали пролиферацию и жизнеспособность клеток, подсчитывая митотические клетки в ране и рассчитывая пролиферативный индекс (Фиг. 3). Клетки промывали дважды раствором Версена и фиксировали, а затем подсчитывали по 10 полей зрения в каждой лунке. Пролиферативные характеристики фибробластов и кератиноцитов оценивали также в режиме реального времени, регистрируя показания через каждые 15 минут в течение первых 8 часов культивирования клеток в присутствии концентрированной кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, или контрольной среды с использованием аппарата xCELLigence (Roche). Использование этого метода позволяет наблюдать изменение клеточного индекса в режиме реального времени. Результаты были аналогичны полученным на модели клеточной раны.A sterile tip of 1000 μl was applied to the cell monolayer with a standard 2 cm wide scratch and the cells were poured with concentrated conditioned medium containing the secretion products of human MJ in the VT. Serum free DMEM was used as a negative control. As a positive control, DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum was used. Cells were cultured for 24 hours, and then proliferation and cell viability were evaluated by counting mitotic cells in the wound and calculating the proliferative index (Fig. 3). Cells were washed twice with Versen's solution and fixed, and then 10 fields of view in each well were counted. The proliferative characteristics of fibroblasts and keratinocytes were also evaluated in real time, recording readings every 15 minutes during the first 8 hours of cell cultivation in the presence of concentrated conditioned medium containing the secretion products of human MSC in the VT, or control medium using an xCELLigence apparatus (Roche). Using this method allows you to observe the change in the cell index in real time. The results were similar to those obtained on a cell wound model.

Миграцию фибробластов в рану оценивали, измеряя просвет раны через каждые 3 часа с момента нанесения раны. Динамику закрытия раны оценивали, проводя по 5 измерений в разных зонах раны (Фиг. 4).The migration of fibroblasts into the wound was evaluated by measuring the lumen of the wound every 3 hours from the time the wound was applied. The dynamics of the closure of the wound was evaluated by conducting 5 measurements in different zones of the wound (Fig. 4).

При исследовании действия концентрированной кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, на кератиноциты не было обнаружено достоверных различий, однако во всех проведенных исследованиях наблюдалась тенденция к увеличению пролиферации, жизнеспособности и миграции кератиноцитов.When studying the effect of a concentrated conditioned medium containing the secretion products of human MSC in the VT of the VT on keratinocytes, no significant differences were found, however, in all the studies conducted, there was a tendency to increase proliferation, viability and migration of keratinocytes.

Пример 8. Специфическая активность лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых МСК жировой ткани человека, на модели ожогового повреждения у крыс in vivo.Example 8. The specific activity of the drug based on cytokines and growth factors secreted by MSCs of human adipose tissue in an in vivo model of burn injury in rats.

Поскольку лекарственное средство предполагается использовать для лечения ожогов и ран, его потенциальную эффективность оценивали на экспериментальной модели ожогового повреждения кожи in vivo. Для моделирования ожога горячим паром использовали установку, состоящую из стеклянной термостойкой колбы объемом 100 мл, на горлышко которой плотно был насажен пластиковый цилиндр внутренним диаметром 2,5 см и высотой 12 см. Колбу на 2/3 заполняли водой и все время нагревали с помощью лабораторной газовой горелки, добиваясь стойкого постоянного кипения воды. Животных наркотизировали (хлоралгидрат 400 мг/кг внутрибрюшинно) и подносили к пластиковому цилиндру плотно, но не укладывали животное на цилиндр. Время выполнения ожога было подобрано в предварительных сериях эксперимента. Экспозицию паром выполняли в течение 2 сек. Крысу располагали над паром так, чтобы ожог формировался не в центре спины, в области позвоночника, а сбоку от него, ниже лопатки справа или слева от позвоночника. В этом случае на спине формируется аккуратное пятно круглой формы с диаметром 2,5 см.Since the drug is supposed to be used to treat burns and wounds, its potential effectiveness was evaluated in an experimental model of burn skin damage in vivo. To simulate a hot steam burn, we used a setup consisting of a 100 ml glass heat-resistant flask, on the neck of which a plastic cylinder was tightly inserted with an inner diameter of 2.5 cm and a height of 12 cm. The flask was filled in 2/3 with water and heated all the time using laboratory gas burner, achieving a stable constant boiling water. Animals were anesthetized (chloral hydrate 400 mg / kg intraperitoneally) and placed tightly to the plastic cylinder, but the animal was not placed on the cylinder. The burn time was selected in the preliminary series of the experiment. Steam exposure was performed for 2 seconds. The rat was placed above the steam so that the burn did not form in the center of the back, in the spine, but on the side of it, below the scapula to the right or left of the spine. In this case, a neat round spot with a diameter of 2.5 cm is formed on the back.

В исследование были включены 90 крыс линии Wistar. Были сформированы 5 групп животных по 18 крыс в группе (по 6 крыс для каждой точки выведения животных из эксперимента):The study included 90 Wistar rats. 5 groups of animals were formed, 18 rats in a group (6 rats for each point of removal of animals from the experiment):

1) группа с термическим ожогом без терапии (№1 - Ожог);1) a group with a thermal burn without therapy (No. 1 - Burn);

2) группа с термическим ожогом и нанесением препарата сравнения (мазь «Левомеколь», Нижфарм, Россия), 200 мкл/прием, 1 раз в 3 дня (№2 - Мазь);2) a group with a thermal burn and application of a comparison drug (Levomekol ointment, Nizhpharm, Russia), 200 μl / dose, 1 time in 3 days (No. 2 - Ointment);

3) группа с термическим ожогом и подкожным введением под область ожога 0,9 мл стерильного физиологического раствора, 1 раз в 3 дня (№3 - Физ. р-р);3) a group with a thermal burn and subcutaneous injection under the burn area of 0.9 ml of sterile physiological saline, once every 3 days (No. 3 - Phys. Solution);

4) группа с термическим ожогом и подкожным введением под область ожога 0,9 мл контрольной среды, не содержащей продуктов секреции МСК ЖТ человека, 1 раз в 3 дня (№4 - Среда);4) a group with a thermal burn and subcutaneous injection under the burn area of 0.9 ml of control medium containing no secretion products of MSC in human VT, 1 time in 3 days (No. 4 - Wednesday);

5) группа с термическим ожогом и подкожным введением под область ожога 0,9 мл лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых МСК ЖТ человека, 1 раз в 3 дня (№5 - Кондиционированная концентрированная среда МСК).5) a group with a thermal burn and subcutaneous injection under the burn area of 0.9 ml of a drug based on cytokines and growth factors secreted by human MSC in VT 3 times every 3 days (No. 5 - Conditioned concentrated MSC medium).

С учетом фаз заживления ожогов из эксперимента животных выводили на 3 (оценка воспалительной реакции), 9 (оценка развития регенеративных процессов) и 20 (оценка ремоделирования ткани и заживления) сутки.Taking into account the healing phases of burns from the experiment, the animals were taken on 3 (assessment of the inflammatory response), 9 (assessment of the development of regenerative processes) and 20 (assessment of tissue remodeling and healing) per day.

Согласно полученным данным, подкожное введение лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых МСК ЖТ человека, один раз в три дня приводит к более быстрому заживлению раны (Фиг. 5). Так, на 20 сутки после нанесения ожога наблюдается уменьшение площади раны при введении субстанции по сравнению с другими группами (ожог без лечения, лечение препаратом сравнения - мазью «Левомеколь», подкожное введение физиологического раствора или контрольной среды). Исследование гистологических препаратов кожи крыс после ожога методами световой и поляризационной микроскопии выявило, что через 20 суток в зоне ожога в группах животных, получавших терапию исследуемым лекарственным средством, происходит восстановление эпидермиса и дермы и отхождение струпа (Фиг. 6). В группах животных, у которых для лечения ожогов использовали контрольную среду или препарат сравнения (мазь «Левомеколь»), также есть участки восстановления дермы (Фиг. 7). Однако формирование слоя эпидермиса происходит фрагментарно и не у всех животных. Для групп негативного контроля (ожог без лечения и подкожное введение физиологического раствора) восстановление кожи наблюдается по периферии раны (Фиг. 8). В центре можно видеть отложения коллагена, расширенные капилляры/мелкие сосуды и очаги воспаления. Это свидетельствует о незавершенном процессе грануляции и воспаления в зоне регенерации. Таким образом, полученные результаты указывают на положительную динамику и комплексное восстановление тканей кожи после ожога через 20 суток только при использовании лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека.According to the data obtained, subcutaneous administration of a drug based on cytokines and growth factors secreted by human MSC in human VT once every three days leads to faster healing of the wound (Fig. 5). So, on the 20th day after applying the burn, there is a decrease in the area of the wound with the introduction of the substance compared with other groups (a burn without treatment, treatment with the reference drug - Levomekol ointment, subcutaneous injection of saline or control medium). The study of histological preparations of rat skin after a burn by light and polarization microscopy revealed that after 20 days in the burn zone in groups of animals treated with the studied medicinal product, the epidermis and dermis are restored and the scab is removed (Fig. 6). In groups of animals in which a control medium or a reference preparation (Levomekol ointment) was used to treat burns, there are also dermal restoration sites (Fig. 7). However, the formation of the epidermis layer occurs fragmentarily and not in all animals. For groups of negative control (burn without treatment and subcutaneous injection of saline), skin restoration is observed along the periphery of the wound (Fig. 8). Collagen deposits, dilated capillaries / small vessels, and foci of inflammation can be seen in the center. This indicates an incomplete process of granulation and inflammation in the regeneration zone. Thus, the results indicate a positive trend and a comprehensive restoration of skin tissue after a burn after 20 days only when using a drug based on cytokines and growth factors secreted by human mesenchymal cells.

Пример 9. Специфическая активность лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых МСК жировой ткани человека, на модели механической раны у мышей in vivo.Example 9. Specific activity of a drug based on cytokines and growth factors secreted by MSCs of human adipose tissue in an in vivo model of a mechanical wound in mice.

Вторая модель, использованная для изучения специфической активности лекарственного средства in vivo, представляет собой модель глубокой механической раны, края которой для предупреждения стягивания были подшиты к пластиковому кольцу. На данной модели, в отличие от модели ожогового поражения кожи паром, использовали режим введения исследуемого лекарственного средства только на самых ранних этапах раневого процесса (в течение первых 3 дней после моделирования раны) как в качестве средства для смачивания марлевых повязок, так и в виде подкожных инъекций. В качестве препарата сравнения использовали повязки, пропитанные мазью «Левомеколь». Исследование проводили на 60 белых беспородных мышах (по 12 мышей в каждой группе).The second model, used to study the specific activity of the drug in vivo, is a model of a deep mechanical wound, the edges of which were sewn to a plastic ring to prevent contraction. In this model, in contrast to the steam burn burn lesion model, the study drug was administered only at the very early stages of the wound healing process (during the first 3 days after modeling the wound) both as a means for wetting gauze dressings and as subcutaneous injection. As a comparison drug used dressings soaked with Levomekol ointment. The study was performed on 60 white outbred mice (12 mice in each group).

Полученные результаты у животных опытных групп, которым применяли для лечения исследуемое лекарственное средство как в виде аппликаций в течение 3 дней, так и в виде инъекций, уже на этом сроке наблюдения показали различия в течении раневого процесса. Так, у животных в опытных группах в ране отсутствовал фибрин, экссудация и гиперемия окружающих тканей были слабо выражены, отмечалось набухание краев раны, что свидетельствовало о стихании воспаления, в то же время отмечалось появление фибробластов в инфильтрате, что указывало на начало фазы пролиферации (Фиг. 9). Смещение пика фазы воспаления в этих группах на более ранний срок наиболее вероятно связано с действием факторов роста и цитокинов, содержащихся в исследуемом лекарственном средстве. К концу фазы пролиферации на 14 сутки от начала эксперимента в контрольных группах наблюдали продолжающийся процесс эпителизации раневой поверхности, тогда как у животных опытных групп отмечали полное заживление раны и признаки процесса ремоделирования тканей, что указывало на более высокие темпы регенерации при использовании исследуемого препарата (Фиг. 10). К 28 суткам наблюдения восстановление дериватов кожи наблюдали только в опытных группах (Фиг. 11). При этом действие исследуемого лекарственного средства не зависело от способа введения. Сходные результаты были отмечены в группах как при применении средства в виде аппликаций на марлевых повязках в течение трех дней, так и в виде микроинъекций в дно и окружающие ткани сразу после нанесения раны.The results obtained in animals of the experimental groups, which used the studied medicinal product for treatment both in the form of applications for 3 days and in the form of injections, already at this observation period showed differences in the course of the wound process. Thus, in animals in the experimental groups, fibrin was absent in the wound, exudation and hyperemia of surrounding tissues were weak, swelling of the edges of the wound was observed, which indicated the subsidence of inflammation, at the same time, fibroblasts appeared in the infiltrate, which indicated the beginning of the proliferation phase (Fig. . 9). An earlier shift of the peak of the phase of inflammation in these groups is most likely due to the action of growth factors and cytokines contained in the studied drug. By the end of the proliferation phase, on the 14th day from the start of the experiment, in the control groups, the ongoing process of epithelization of the wound surface was observed, while the animals of the experimental groups noted complete wound healing and signs of tissue remodeling, which indicated a higher rate of regeneration when using the studied drug (Fig. 10). By 28 days of observation, recovery of skin derivatives was observed only in the experimental groups (Fig. 11). Moreover, the effect of the studied medicinal product did not depend on the route of administration. Similar results were noted in the groups, both when using the product in the form of applications on gauze dressings for three days, and in the form of microinjections into the bottom and surrounding tissues immediately after applying the wound.

Пример 10. Параметры контроля качества получаемого средства.Example 10. Parameters of quality control of the received funds.

Описание: средство представляет собой лиофилизат (аморфную массу) белого цвета с сероватым оттенком. После растворения в стерильной воде - прозрачный раствор темно-розового цвета.Description: the product is a lyophilisate (amorphous mass) of white color with a grayish tint. After dissolution in sterile water - a clear solution of dark pink color.

Подлинность: в восстановленном растворе должны определяться ключевые факторы роста в концентрации FGF basic от 2 до 4 пкг/мл; HGF от 40 до 80 пкг/мл; VEGF от 200 до 800 пкг/мл; ангиопоэтин-1 от 0,5 до 10,0 пкг/мл. Определяют методом ИФА.Authenticity: in the reconstituted solution, key growth factors should be determined in the concentration of FGF basic from 2 to 4 pkg / ml; HGF from 40 to 80 pg / ml; VEGF 200 to 800 pg / ml; angiopoietin-1 from 0.5 to 10.0 pg / ml. Determined by ELISA.

Растворимость: не более 2 минут.Solubility: no more than 2 minutes.

Прозрачность: восстановленный раствор должен быть прозрачным.Transparency: The reconstituted solution should be clear.

Цветность: восстановленный раствор должен быть темно-розовым или не превышать эталон R4.Color: the reconstituted solution should be dark pink or not exceed the R4 standard.

Механические включения: видимые механические включения должны отсутствовать в растворе. РД 42-501-98 «Инструкции по контролю на механические включения инъекционных лекарственных средств» при определении видимых механических включений.Mechanical inclusions: visible mechanical inclusions must not be present in the solution. RD 42-501-98 "Instructions for monitoring the mechanical inclusion of injectable drugs" in determining visible mechanical inclusions.

pH: от 6,5 до 7,5. Определяют потенциометрическим методом по ГФ XII, ч. 1, с. 89.pH: from 6.5 to 7.5. Determined by potentiometric method according to GF XII, part 1, p. 89.

Потеря в массе при высушивании: Не более 5%. Определяют весовым методом,Mass loss on drying: Not more than 5%. Determined by the gravimetric method,

ГФ XI.GF XI.

Стерильность: должно быть стерильным. Контроль проводят методом мембранной фильтрации (ГФ XII, ч. 1, с. 150).Sterility: must be sterile. The control is carried out by the method of membrane filtration (GF XII, part 1, p. 150).

Бактериальные эндотоксины: содержание бактериальных эндотоксинов должно быть не более 5 ЕЭ/мл. Определяют в хромогенном кинетическом ЛАЛ-тесте, ГФ XII.Bacterial endotoxins: the content of bacterial endotoxins should be no more than 5 EU / ml. Determined in the chromogenic kinetic LAL test, GF XII.

Нуклеиновые кислоты: содержание ДНК не более 35 мкг/мл. Определяют спектрофотометрически.Nucleic acids: DNA content not more than 35 μg / ml. Spectrophotometrically determined.

Количественное определение: Концентрация общего белка 3-4 мг/мл. Определяют спектрофотометрически.Quantification: The concentration of total protein is 3-4 mg / ml. Spectrophotometrically determined.

Специфическая активность: коэффициент активности должен составлять не менее 1,1. Определяют на модели стимуляции пролиферации фибробластов человека in vitro.Specific activity: the activity coefficient should be at least 1.1. Determined in a model of stimulation of proliferation of human fibroblasts in vitro.

Метод определения специфической активности: специфическую активность опытного образца средства определяют по способности стимулировать пролиферацию линейных фибробластов кожи человека. Для этого линейные фибробласты человека 6-7 пассажа снимают с чашек Петри с помощью реагента для диссоциации клеток HyQTase, ресуспендируют в среде DMEM с добавлением 10% ЭБС (HyClone) и раствора антибиотиков/антимикотиков (HyClone) и высаживают для проведения исследования в 24-луночный планшет (Costar) в концентрации 2×10⁵ клеток в мл в объеме 250 мкл на лунку. Клетки культивируют в течение суток, затем депривируют в течение 12 часов в среде DMEM без сыворотки. Для функционального теста в лунки с депривированными фибробластами добавляют по 250 мкл опытного образца средства. В качестве положительного контроля используют среду роста фибробластов (DMEM), содержащую 10%» ЭБС (HyClone), в качестве отрицательного контроля - DMEM без сыворотки в аналогичных объемах. Клетки культивируют 24 часа, после чего среду удаляют, клетки промывают теплым фосфатно-солевым буфером (ФСБ), фиксируют 4% раствором парафармальдегида (Рапгеас) в ФСБ в течение 5 минут, затем промывают дистиллированной водой три раза по 5 минут и окрашивают раствором гематоксилина (Merck). Подсчитывают число клеток с помощью счетчика клеток. Подсчитывают число окрашенных клеток на поле зрения в 10 полях зрения на каждую лунку. Индекс специфической активности опытного образца средства рассчитывают как отношение числа клеток в лунках, содержащих испытуемое средство, к числу клеток в лунках, содержащих среду роста фибробластов с добавлением 10% ЭБС.Method for determining specific activity: the specific activity of a prototype is determined by its ability to stimulate the proliferation of linear human skin fibroblasts. For this, linear human fibroblasts of passage 6-7 are removed from Petri dishes using a HyQTase cell dissociation reagent, resuspended in DMEM medium with 10% EBS (HyClone) and a solution of antibiotics / antimycotics (HyClone) and plated for 24-well testing tablet (Costar) at a concentration of 2 × 10 ⁵ cells per ml in a volume of 250 μl per well. Cells were cultured for 24 hours, then deprivated for 12 hours in serum-free DMEM. For a functional test, 250 μl of a test sample of the agent is added to wells with deprived fibroblasts. As a positive control, fibroblast growth medium (DMEM) containing 10% EBS (HyClone) is used, as a negative control, serum-free DMEM in similar volumes. The cells are cultured for 24 hours, after which the medium is removed, the cells are washed with warm phosphate-buffered saline (PBS), fixed with a 4% solution of parapharmaldehyde (Rapgeas) in PBS for 5 minutes, then washed with distilled water three times for 5 minutes and stained with hematoxylin solution ( Merck). Count the number of cells using a cell counter. Count the number of stained cells per field of view at 10 fields of view per well. The specific activity index of the prototype of the agent is calculated as the ratio of the number of cells in the wells containing the test agent to the number of cells in the wells containing fibroblast growth medium with the addition of 10% EBS.

Таким образом, применение лекарственного средства на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых МСК ЖТ человека, в лечении глубокой обширной раны у лабораторных животных как в виде аппликаций (смачивание марлевой повязки) в течение первых трех суток после нанесения раны, так и в виде инъекций в дно раны и окружающие ткани сразу после нанесения раны способствует более высоким темпам процессов регенерации за счет сокращения сроков воспалительной и пролиферативной фаз.Thus, the use of a drug based on cytokines and growth factors secreted by human MSC in the VT of the human body in the treatment of deep extensive wounds in laboratory animals both in the form of applications (wetting the gauze dressing) during the first three days after application of the wound, and in the form of injections in the bottom of the wound and surrounding tissue immediately after application of the wound contributes to a higher rate of regeneration processes by reducing the duration of the inflammatory and proliferative phases.

Claims

1. The method of obtaining funds for the treatment of burns and wounds, including the cultivation of mesenchymal stromal cells of adipose tissue (MSC in a human body) of passage 2-5 in growth medium until the total protein concentration in the medium reaches 3-4 mg / ml, selection and purification of the culture medium containing the products of secretion of MSC in human VT from cell debris, its concentration to reduce the initial volume of the purified culture medium by 9-11 times to obtain a sterile concentrate, followed by lyophilization to obtain a product containing food human MSC secretion lines, including key growth factors: FGF basic at a concentration of 2 to 4 pkg / ml, HGF at a concentration of 40 to 80 pkg / ml, VEGF at a concentration of 200 to 800 pkg / ml, angiopoietin-1 at a concentration of 0.5 to 10.0 pg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when restoring the lyophilisate in 100 ml of sterile saline,
the growth medium contains AdvanceSTEM Cell Culture Media solution (HyClone, USA), Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone, USA), AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), which are taken in the following ratio of components, vol.%:
AdvanceSTEM Cell Culture Media - 85-95
Penicillin-Streptomycin antibiotic solution - 0.95-1.05
AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9.5-10.5.

2. The method according to p. 1, characterized in that the cultivation is carried out in culture bottles or Petri dishes (Corning or the like), while the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 · 10 ³ / cm ² in a growth medium in volume 0.1-0.2 ml / cm ² in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95% until a total protein concentration of 3-4 mg / ml is reached in the medium.

3. The method according to p. 1, characterized in that the cultivation is carried out in a bioreactor (BioFlo / CelliGen 115, New Brunswick, USA), while the cells are grown on microcarriers (for example, FibraCel, 50 g of microcarriers per 2-2.5 l of medium ) with a density of 10 ⁶ -10 ⁷ cells / cm ³ to achieve a concentration of total protein in the medium of 3-4 mg / ml.

4. The method according to p. 1, characterized in that the purification of the culture medium is carried out by centrifugation.

5. The method according to p. 1, characterized in that the concentration of the purified culture medium is carried out by ultrafiltration with removal of low molecular weight compounds of less than 5 kDa, while in order to obtain a sterile concentrate, microfiltration of the obtained concentrate is additionally carried out through filters with a pore diameter of 0.22 μm.

6. The method according to p. 1, characterized in that the lyophilization is carried out in 6-10 stages at a pressure of 0.013-0.027 kPa, temperature from -45 ° C to 25 ° C, lyophilization time of not more than 24 hours at maximum load of freeze drying.

7. The method according to p. 4, characterized in that the centrifugation is carried out at 5000 ± 10 rpm, a temperature of 6 ± 2 ° C for 10 minutes to remove cell debris.

8. The method according to p. 1, characterized in that the concentration is carried out using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences, USA) or similar using ultrafiltration cassettes (Minimate TFF capsule, PALL) or similar.

9. The treatment for burns and wounds in the form of a lyophilisate obtained according to claim 1, including key growth factors - FGF basic in a concentration of from 2 to 4 pkg / ml, HGF in a concentration of from 40 to 80 pkg / ml, VEGF in a concentration of 200 to 800 PCG / ml, angiopoietin-1 in a concentration of 0.5 to 10.0 PCG / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when reconstructing 2.5 ± 0.3 g of lyophilisate in 100 ml of sterile saline.

10. A method of treating burns and wounds, including diluting the agent according to claim 9 in sterile saline or sterile water for injection, at the rate of 2.5 ± 0.3 g of the agent per 100 ml of solution or water, soaking dressings or materials to close the defects skin with the subsequent application of soaked dressings and materials on a burn or wound 1-2 times a day for 3-7 days or until the start of epithelialization of the wound.