RU2573927C2 - Способ получения моноклональной линии растительных клеток - Google Patents
Способ получения моноклональной линии растительных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2573927C2 RU2573927C2 RU2013157526/10A RU2013157526A RU2573927C2 RU 2573927 C2 RU2573927 C2 RU 2573927C2 RU 2013157526/10 A RU2013157526/10 A RU 2013157526/10A RU 2013157526 A RU2013157526 A RU 2013157526A RU 2573927 C2 RU2573927 C2 RU 2573927C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protoplasts
- cells
- plant
- plant cells
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 153
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 97
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 4
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 71
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 14
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 3
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- -1 phosphinotricin Chemical compound 0.000 description 3
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 2
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 241000723655 Cowpea mosaic virus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000006867 Discosoma Species 0.000 description 1
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000009164 Petroselinum crispum Species 0.000 description 1
- 235000002770 Petroselinum crispum Nutrition 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710203193 Thaumatin-like protein Proteins 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N chlorsulfuron Chemical compound COC1=NC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)Cl)=N1 VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 235000020415 coconut juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108091006050 fluorescent recombinant proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 125000001474 phenylpropanoid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000000892 thaumatin Substances 0.000 description 1
- 235000010436 thaumatin Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии. Способ включает получение гетерологичной популяции растительных клеток и получение протопластов от указанной гетерологичной популяции растительных клеток. Затем осуществляют разделение единичных протопластов путем подвергания получения протопластов проточно-цитометрическому сортингу. После этого осуществляют регенерацию отделенного единичного протопласта до образования микроколонии посредством совместного культивирования в присутствии материала фидерных клеток. Полученные микроколонии выделяют из материала фидерных клеток и культивируют до образования моноклональной линии растительных клеток. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений. В частности, настоящее изобретение относится к получению нативной (дикий тип) или трансгенной моноклональной линии растительных клеток из гетерогенной популяции растительных клеток посредством проточно-цитометрического сортинга. Как будет очевидно специалисту, настоящее изобретение также включает применение моноклональной линии растительных клеток для регенерации целых плодоносящих растений.
В течение прошедших десятилетий огромные усилия были посвящены разработке и культивированию основанных на растениях систем для накопления и получения нативных или гетерологичных белков и вторичных метаболитов. Литература предоставляет обширное количество фактологического материала, который доказывает практическую ценность основанных на растениях систем для получения большого разнообразия желаемых веществ, которые или секретированы в культуральную среду, или выделены из продуцирующих клеток, тканей, органелл или даже целых растений или их частей. Подобно этому существует широкий спектр протоколов трансформации, которые обеспечивают разработку или стабильно, или транзиентно трансформированного растительного материала. Однако все еще существует потребность в надежной, стоимостно-эффективной и быстрой технологии для получения высоких выходов желаемого продукта из растительных клеток.
Неоднократно сообщалось, что трансформация популяции растительных клеток, такой как суспензионная растительная культура, часто приводит к образованию трансгенных культур, которые демонстрируют клетки с высокогетерогенными (смешанными) и несогласующимися уровнями экспрессии требуемого белка, относящимися к смеси эпигенетически различных клеток в составе первичной гетерогенной популяции клеток. В рамках рекомбинантных клеточных линий гетерогенность в экспрессии трансгена демонстрирует серьезную проблему с точки зрения скоростей продукции.
Главная проблема состоит в том, что высокопродуцирующие клоны зачастую являются редкими событиями в рамках метода трансформации, и разработка гомогенной высокопроизводительной клеточной линии занимает много времени. Поэтому постоянно существующей технической задачей является получение элитного трансгенного события и регенерация из недавно транформированной или уже трансгенной культуры растений.
Для проточного цитометрического сортинга, такого как, например, устройство FACS, единичные сферические клетки должны быть получены из обычно агрегированной популяции растительных клеток или культуры посредством ферментативного расщепления клеток, чтобы выделить протопласты. Для большинства видов растений, однако, регенерации единичных протопластов препятствует необходимость поддерживать популяцию в определенных плотностях.
Надежный и воспроизводимый способ для регенерации единичной трансгенной клетки/протопласта или для регенерации из нее целого плодоносящего растения (особенно после проточно-цитометрического сортинга) не был до настоящего времени описан.
Настоящее изобретение, таким образом, прежде всего относится к разработке основанной на растениях системы для получения высоких уровней желаемых нативных или рекомбинантных продуктов, в которой применяется нетрансформированная или трансгенная моноклональная линия растительных клеток, полученная от гетерогенной (смешанной) популяции растительных клеток, таких как суспензионная культура, и преодолевает проблемы предшествующего уровня техники, в частности, относительно быстрого разделения и последующей регенерации единичных (трансгенных) протопластов до образования микроколонии, которая может быть применена для получения моноклональной линии растительных клеток, которая предпочтительно способна к образованию и накоплению высоких количеств желаемого продукта. Специалисту ясно, что настоящее изобретение, кроме того, позволяет создавать целые плодоносящие растения, восстановленные из разработанной моноклональной линии растительных клеток.
Вопреки многим в настоящее время применяемым и разработанным системам, которые основаны на применении интактных растений или, по меньшей мере, интактной и дифференцированной растительной ткани, применение суспензионных клеток имеет преимущество в том, что гомогенный материал может быть воспроизведен в контролируемых, асептических и закрытых условиях.
В настоящее время существуют две основные стратегии получения рекомбинантных белков в растениях, а именно (i) получение стабильно трансгенных растений или суспензионных клеточных линий, или (ii) транзиентная экспрессия гетерологичного гена(ов) после инфицирования растительных экспрессионных хозяев (растений, тканей или клеток) бактериями (например, агробактерией), вирусами (например, вирусом табачной мозаики, картофельным вирусом X/Y, вирусом мозаики Cowpea и многими другими), или комбинация обоих (например, магнифекция), чтобы позволить хозяину экспрессировать гетерологичную генетическую информацию (ДНК или РНК). Альтернативно и, как известно в области техники, генетическая информация может также быть внедрена в экспрессионного растительного хозяина посредством разработанных механических способов, таких как, например, электропорация или лазерная перфорация.
Хотя настоящее изобретение предпочтительно относится к применению стабильно трансформированного материала растительных клеток, системы для транзиентной экспрессии, имеющие преимущество в скорости (время «от гена к продукту», срок внедрения, аварийное реагирование), также как в возможности достигать уровней накопления, которые сильно выше, чем те, которые могут, как правило, быть получены на стабильно трансформированных растениях или их частях, таких как клетки, могут быть также включены в способ согласно настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению разработан способ получения нативной (дикий тип, нетрансформированный) или трансгенной моноклональной линии растительных клеток из гетерогенной популяции растительных клеток. Способ включает, во-первых, получение вышеуказанной популяции растительных клеток, такой как, например, суспензионные клетки растения, образующие исходный материал растительных клеток, который подвергают дальнейшим шагам, охваченных способом согласно настоящему изобретению. Обычно этот растительный клеточный материал может легко быть получен из, например, гетерогенной суспензионной растительной культуры, которую предпочтительно выращивают в контролируемых и/или асептических условиях. Исходные клетки могут быть (стабильно/транзиентно) трансформированными трансгенными клетками или клетками дикого типа (нативные, нетрансформированные), которые в состоянии продуцировать и накапливать желаемый продукт.
Поскольку в способе согласно настоящему изобретению применяют проточно-цитометрический сортинг, такой, например, как технология FACS для разделения или выделения единичных, т.е. индивидуальных протопластов, они должны быть получены из популяции растительных клеток так, как приводится выше, с применением материалов и способов, известных в области техники. Согласно предпочтительному варианту осуществления эти протопласты трансформированы и способны к (i) продукции флуоресцентного маркерного белка или полипептида, (ii) продукции желаемого продукта и/или (iii) выживанию в присутствии селектирующего вещества. Предпочтительными сортирующими критериями для проточно-цитометрического сортинга являются зернистость клетки как маркер для, например, качественных характеристик, таких как апоптоз и размер клетки. Предпочтительные критерии сортинга для FACS могут быть выбраны из группы, включающей генетический фон (например, плоидность, анеуплоидия), трансгеника мутантов, продукты генного обмена и флуоресценция (например, автофлуоресценция (хлоропласты, метаболиты), флуоресцентные белки или фермент-опосредованная флуоресценция). Нужно понимать, что применение селектирующего вещества не является обязательным. Таким образом, протопласт необязательно должен быть трансформирован последовательностью нуклеиновой кислоты, придающей подходящую устойчивость.
После разделения или выделения единичных (трансформированных) протопластов посредством проточно-цитометрического сортинга, такого как, например, FACS, каждый единичный трансформированный протопласт регенерируют до образования микроколонии (микрокаллюса) посредством совместного культивирования в присутствии фидерного клеточного материала. Происхождение исходного растения не ограничено, но сводится к тем линиям, сортам и видам, протопласты которых имеют потенциал к регенерации до образования микроколонии или микрокаллюса. Настоящее изобретение, таким образом, применимо ко всем сортам и видам растений, для которых протокол регенерации разработан или будет разработан в будущем. Ввиду аспекта настоящего изобретения относительно дальнейшей регенерации моноклональной микроколонии или линии растительных клеток в целые плодоносящие растения, нужно понимать, что этот аспект может быть выполнен со всеми сортами и видами растений, для которых протокол регенерации разработан или будет разработан в будущем.
Впоследствии микроколонию отделяют или выделяют из фидерного клеточного материала и культивируют до образования моноклональной линии растительных клеток.
Согласно предпочтительному варианту осуществления следующая стадия, входящая в состав способа по настоящему изобретению, таким образом, относится к генерации моноклональной ткани моноклонального каллюса посредством (i) переноса микроколонии или микрокаллюса на твердую среду культивирования и (ii) культивирования микроколонии или микрокаллюса в присутствии, по меньшей мере, одного селектирующего вещества до образования трансгенной ткани каллюса, из которой может быть разработана трансгенная моноклональная линия растительных клеток посредством переноса ткани каллюса в жидкую среду культивирования. Как будет оценено специалистом, микроколония может также быть удалена или отделена от материала фидерных клеток механическими способами, такими как, например, отбор клонов. В этом случае никакое селектирующее вещество не является обязательным и клетки, составляющие микроколонию, не должны проявлять устойчивость к какому-либо селектирующему веществу.
Согласно предпочтительному варианту осуществления клетки составляющие гетерогенную популяцию растительных клеток, представляют собой нативные (например, дикий тип) или нетрансгенные клетки, которые, прежде чем быть подвергнуты проточно-цитометрическому сортингу, стабильно или транзиентно трансформируются, по меньшей мере, одним вектором экспрессии, включающим, по меньшей мере, одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с функциональным промотором, в котором, как выше указано, по меньшей мере, одна гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует желаемый продукт. Согласно дополнительному варианту осуществления, по меньшей мере, один вектор экспрессии включает, по меньшей мере, две гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, функционально связанные с (a) функциональным промотором(ами), в котором, как выше указано, по меньшей мере, две гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты кодируют флуоресцентный маркерный белок или полипептид и устойчивость против селектирующего вещества или желаемый продукт. При желании клетки могут дополнительно включать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует желаемый продукт, который будет накоплен в трансгенной моноклональной линии растительных клеток, как предусмотрено в настоящем изобретении.
Термин «гетерологичный», как применено в настоящем описании, указывает на то, что ген/последовательность рассматриваемых нуклеотидов внедряют в растительные клетки путем генной инженерии, т.е. путем человеческого вмешательства. Гетерологичная последовательность нуклеотидов может включать кодирующую последовательность для рекомбинантного белка, состоящего из рекомбинантной части, которая может быть образована, например, частично белком растения, который может быть присоединен к нерастительному белку, который можно назвать гибридным растительным-нерастительным белком в целях настоящего изобретения. Альтернативно, рекомбинантный белок может быть таким, который образован из рекомбинантных частей, которые имеют нерастительное происхождение. Гетерологичный ген может усиливать экспрессию белка, представляющего интерес, от эндогенного эквивалентного гена, т.е. того, который обычно выполняет ту же самую или подобную функцию, или вставленная последовательность может быть дополнительной к эндогенному гену или другой последовательности. Нуклеиновая кислота, гетерологичная по отношению к клетке, может быть невстречающейся естественным образом в культивируемом типе клетки, сорте или виде. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота может включать кодирующую последовательность от или происходящую от специфического типа организма, такого, как вид растений или млекопитающих, например, вид человека, овцы, быка, лошади или свиньи, помещенную в контекст культивируемой клетки, такой как клетка BY2, происходящая от табака. Дополнительная возможность заключается во внедрении последовательности нуклеиновой кислоты в культивируемую клетку-мишень, в которой она или гомолог присутствует естественным образом, но в которой последовательность нуклеиновой кислоты связана и/или является смежной с нуклеиновой кислотой, которая не встречается естественным образом в этой клетке или клетках такого типа или видах или сортах растения, такие как функционально связанные с одной или более регулирующими последовательностями, такими как последовательность промотора, для контроля экспрессии. Кроме того, синтетические (искусственные) последовательности нуклеиновой кислоты могут быть также применены.
Определение «вектор» включает, среди прочего, любую плазмиду, космиду, бактериофаг или вирусный вектор в двойной или одноцепочечной линейной или замкнутой форме, которая может или не может быть самопередающейся или мобилизируемой и которая может трансформировать прокариотического или эукариотического хозяина и существовать внехромосомным образом (например, автономная реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации). В частности, включены шаттл-векторы, под которыми подразумевается ДНК вектор, способный, естественным путем или посредством дизайна, к репликации в двух различных организмах хозяев, которые могут быть выбраны из актиномицетов и родственных видов, бактерий и эукариотических клеток (например, высших растений, мхов, млекопитающих, дрожжей или грибов).
«Вектор экспрессии» относится к вектору, в котором нуклеиновая кислота находится под контролем и функционально связана с подходящим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции в клетке-хозяине, такой как микробная или растительная клетка. Вектор может быть бифункциональным вектором экспрессии, который функционирует в многочисленных хозяевах. В случае геномной или субгеномной ДНК он может включать свой собственный промотор или другие регуляторные элементы, и в случае кДНК он может находиться под контролем подходящего промотора или других регуляторных элементов для экспрессии в клетке-хозяине.
«Промотор» представляет собой последовательность нуклеотидов, от которой может быть инициирована транскрипция ДНК, которая функционально присоединена по ходу транскрипции (т.е. в 3' направлении на кодирующей цепи двухцепочечной ДНК).
«Функционально связанный» означает присоединенный как часть той же самой молекулы нуклеиновой кислоты, помещенной и ориентированной соответственно требованиям, чтобы транскрипция была инициирована от промотора.
Термин «индуцибельный» в применении к промотору хорошо понимается специалистами в области техники. По существу, экспрессия под контролем индуцибельного промотора «включается» или возрастает в ответ на приложенный стимул. Характер стимула варьирует между промоторами. Некоторые индуцибельные промоторы обусловливают малые или неопределяемые уровни экспрессии (или отсутствие экспрессии) в отсутствие подходящего стимула. Другие индуцибельные промоторы обусловливают заметную конститутивную экспрессию в отсутствие стимула. Независимо от уровня экспрессии в отсутствие стимула экспрессия под любым индуцибельным промотором повышается в присутствии правильного стимула.
Настоящее изобретение также охватывает применение разновидности любой из этих последовательностей. Вариантный белок имеет гомологию с или идентичен со всеми или частью последовательностей, рассмотренных выше.
Для экспрессии рекомбинантных белков суспензию рекомбинантных агробактерий или вирусов (векторы), содержащую генетическую информацию о белке, представляющем интерес, применяют к суспензии растительных клеток, указанных выше, способом, известным в области техники. Вектор заражает растительные клетки и передает генетическую информацию. Предпочтительно материал растительных клеток, который будет трансформирован, применять в высокой плотности с только небольшими количествами среды, присутствующей так, чтобы суспензия вектора могла быть применена только путем капания или разбрызгивания. Этот предпочтительный вариант осуществления трансформации имеет несколько практических преимуществ относительно манипуляции, автоматизации, масштабирования, выработки и удаления отходов. В альтернативе, известные способы, такие как бомбардировка частицами, электропорация и т.п., могут быть применены, как известно в области техники.
Подходящие промоторы включают промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (CaMV 35S). Промотор может быть выбран так, чтобы он включал один или более фрагментов последовательности или элементы, придающие связанный с развитием и/или тканеспецифичный регуляторный контроль экспрессии.
Как уже указано, по меньшей мере, один селектируемый генетический маркер, который может быть желаемым для продукции, может быть включен в конструкцию или быть представлен во второй конструкции, такой как те, которые придают селетируемые фенотипы, такие как устойчивость к антибиотикам или гербицидам (включающим, но не ограниченным ими, например, канамицин, гигромицин, фосфинотрицин, хлорсульфурон, метотрексат, гентамицин, спектиномицин, имидазолиноны и глифосат).
Альтернативно, клетки растительной суспензии, примененные для получения протопластов, также могут быть получены из уже трансгенной гетерогенной суспензионной растительной культуры, включающей трансгенные клетки.
(Трансгенную) моноклональную линию растительных клеток, полученную согласно настоящему изобретению, можно обрабатывать или культивировать в присутствии предшественников, стимуляторов, гормонов, стабилизаторов (например, совместимые растворенные вещества), ингибиторов, молекул интерферирующих РНК/малых интерферирующих РНК, сигнальных соединений, ферментов (например, пектиназ) и/или элиситоров в дополнение к или вместо векторной суспензии для получения рекомбинантных белков или метаболитов.
Согласно предпочтительному варианту осуществления желаемый продукт выбран из группы, состоящей из гетерологичных белков или полипептидов (например, препаратов крови, цитокинов, гормонов роста, терапевтических/диагностических/промышленных ферментов, вакцин, полноразмерных антител или различных производных антител), вторичных метаболитов (например, фенилпропаноидов, алкалоидов, терпеноидов, хинонов или стероидов) и маркеров для диагноза или анализа газообразных, твердых или жидких (химических) соединений и веществ.
Гены, представляющие интерес, включают такие кодируемые белки, которые самостоятельно являются естественными медикаментами, такими как фармацевтические препараты или ветеринарные продукты. Кроме того, гены, представляющие интерес, также включают любой другой рекомбинантный белок, такой как, например, технические ферменты, токсины или рекомбинантные белки, придающие новые агрономические входные и выходные признаки.
Гетерологичные нуклеиновые кислоты могут кодировать, среди прочего, гены бактериального, грибкового, растительного или нерастительного происхождения, такие как рекомбинантные белки, как указано выше в настоящем описании, или животного происхождения. Полученные полипептиды могут быть применены для получения полипептидов, которые могут быть очищены из них для применения где-либо еще. Белки, которые могут быть получены в способе по настоящему изобретению, включают гетеродимеры, такие как фолликулостимулирующий гормон гипофиза, иммуноглобулины, рекомбинантные антитела и одноцепочечные антитела. Кроме того, вышеуказанные гены могут быть изменены так, чтобы получить белки с измененными характеристиками, такими как модифицированная структура гликана. Однако настоящее изобретение также позволяет применять синтетические гены, такие как искусственные последовательности, которые как таковые не существуют в природе.
Такие белки включают, но не ограничены ими, белки ретинобластомы, p53, ангиостатин и лептин. Таким же образом способы по настоящему изобретению могут быть применены для получения регуляторных белков млекопитающих. Другие последовательности, представляющие интерес, включают белки, гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон, факторы роста, цитокины, сывороточный альбумин, гемоглобин, коллаген, тауматин, тауматин-подобные белки, эпидермальные факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов и т.д.
Как будет оценено специалистом, настоящее изобретение позволяет получать большое разнообразие белков и полипептидов, включающих (рекомбинантные) белки фармацевтической пригодности (такие как, например, вакцины, антитела, терапевтические ферменты, аллергены и гипоаллергены, противомикробные пептиды, структурные белки, такие как эластин и коллаген для применения в качестве биологически совместимых материалов покрытия, вирусоподобные частицы, белковые тела и т.д.), (рекомбинантные) белки пищевой ценности (пища и пищевые добавки), (рекомбинантные) белки для диагностических применений (такие как, например, ферменты, антитела и сконструированные антитела, другие ферментные или флуоресцентные рекомбинантные белки, антигены, которые будут применены как позитивный контроль, связывающие лиганды для белкового микроматричного анализа), (рекомбинантные) белки технической пригодности (такие как, например, связывающие лиганды для афинных сорбентов, ферменты большого значения, биокатализаторы) и рекомбинантные белки, улучшающие агрономические входящие или выходящие признаки.
В целом, гетерологичные нуклеиновые кислоты могут быть эксперссированы любым адекватным способом, применимым в области техники, или они могут быть транскрибированы или экспрессированы следующим образом:
(i) транзиентная экспрессия 'голой' ДНК, например, включающей промотор, функционально связанный с гетерологической последовательностью, представляющей интерес,
(ii) экспрессия с вектора экспрессии, такого как реплицируемый вектор. В целом, специалисты в области техники хорошо умеют создавать векторы и разрабатывать протоколы для транзиентной рекомбинантной экспрессии генов. Подходящие векторы могут быть выбраны или созданы, включая подходящие регуляторные последовательности, включая последовательности промотора, фрагменты терминатора, последовательности полиаденилирования, последовательности энхансера, маркерные гены и другие последовательности по необходимости. Для получения дальнейшей информации см., например, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2-е издание, Sambrook et al, l989, Cold Spring Harbor Laboratory Press или Current Protocols in Molecular Biology, 2-е издание, Ausubel et al. Edc., John Wiley & Sons, 1992,
(iii) экспрессия c неинтегрируемого вектора.
Будет понятно, что эти категории не являются взаимоисключающими, поскольку, например, вектор неинтегрируемый может также быть вектором экспрессии и т.д.
Как будет оценено специалистом, по меньшей мере, две гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей флуоресцентный белковый маркер, или полипептид, или фермент, продуцирующий флуоресцентную молекулу и гетерологичный белок, представляющий интерес (желаемый продукт), могут быть представлены или (i) в полицистронной конфигурации, составленной единичной кассетой экспрессии на том же самом векторе, (ii) в тандемной конфигурации, по меньшей мере, с двумя различными кассетами экспрессии в том же самом векторе или (iii) по меньшей мере, в двух различных кассетах экспрессии на различных векторах, в которых тандемная конфигурация предпочтительна.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение, таким образом, также обеспечивает способ получения, по меньшей мере, одного желаемого продукта, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из гетерологичных белков или полипептидов, вторичных метаболитов и маркерных генов. Способ включает применение (трансгенной) моноклональной линии растительных клеток, как разработано согласно настоящему изобретению для получения и накопления, по меньшей мере, одного желаемого продукта, который впоследствии получают или выделяют из продуцирующих клеток или из среды культивирования.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения раскрыто применение предпочтительно стабильно трансформированной моноклональной линии растительных клеток, дополнительно способной к производству мРНК, кодирующей желаемый продукт, такой как гетерологичный требуемый белок, произведенный транскрипцией с внедренной конструкции нуклеиновой кислоты, включая требуемую нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором.
«Внедренная нуклеиновая кислота» будет, таким образом, включать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, как последовательность ДНК, представленную в форме конструкции, которая способна давать начало выработке и накоплению желаемого продукта.
Таким образом, в предпочтительном аспекте настоящего изобретения раскрыт способ достижения стабильной экспрессии гетерологичной нуклеотидной последовательности в моноклональной линии растительных клеток, способ, который включает стадию стабильного внедрения в клетку-мишень, по меньшей мере, первой последовательности нуклеиновой кислоты, включающей гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую желаемый продукт.
В одном варианте осуществления представлен способ получения, по меньшей мере, внеклеточного гетерологичного белка, способ, который включает стадии:
(i) стабильное внедрение в клетку-мишень, составляющую стартовую популяцию растительных клеток, первой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок или желаемый продукт;
(ii) получение протопластов из суспензионных клеток, полученных из указанной суспензионной растительной культуры, в которой протопласты дополнительно трансформированы и способны к (i) продукции флуоресцентного маркерного белка или полипептида и (ii) выживанию в присутствии селектирующего вещества;
(iii) разделение единичных трансформированных протопластов путем подвергания получения протопластов действию FACS;
(iv) регенерация выделенного единичного трансформированного протопласта до образования микроколонии или микрокаллюса посредством совместного культивирования в присутствии фидерного клеточного материала;
(v) производство моноклональной ткани каллюса посредством (i) переноса микроколонии или микрокаллюса на твердую среду культивирования и (ii) культивирования микроколонии или микрокаллюса в присутствии, по меньшей мере, одного селектирующего средства до образования трансгенной ткани каллюса;
(vi) разработка трансгенной моноклональной линии растительных клеток путем переноса ткани каллюса в жидкую среду культивирования и
(vii) инициация или позволение экспрессии с нуклеиновой кислоты гетерологичного белка или желаемого продукта посредством создания адекватных условий культивирования и
(viii) сбор накопленного гетерологичного белка или желаемого продукта от производящих клеток.
Выделение может быть осуществлено при помощи полностью рутинных способов и может подразумевать или не подразумевать частичную или полную очистку.
Естественно, специалист в области техники одобрит, что более чем один ген может быть применен в этой или каждой конструкции. Многочисленные векторы (каждый, включая одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих гетерологичный белок выбора) могут быть внедрены в клетки-мишени, как приведено в настоящем описании или в другом месте. Это может быть полезно для получения, например, множественных субъединиц, например, фермента.
Флуоресцентный маркерный белок или полипептид может представлять собой любой белок, детектируемый посредством флуоресценции, такой как глюкоронидаза, флуоресцентные белки, такие как GFP или DsRed, люцифераза и т.д. Предпочтительно, чтобы репортер был неразрушающим маркером, таким как DsRed или GFP.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение описывает способ идентификации и выделения более высокоэкспрессирующих локусов вставки посредством сортинга клеток, включающего стадии трансформации клеток (например, как описано в Примере 1B ниже), например, конструкцией, содержащей флуоресцентный белок 1, и идентификации и выделения единичных высокопроизводящих флуоресцентный белок 1 клеток посредством FACS, включая регенерацию в микроколонию и суспензионную культуру и генный обмен, например, с флуоресцентным белком 2, и идентификацию и выделение редких продуктов генного обмена.
Настоящее изобретение будет далее дополнительно описано при помощи следующих неограничивающих иллюстраций и примеров. В свете этих вариантов другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны специалистам в области техники.
Фигура 1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее структуру кассеты экспрессии, примененной для получения трансгенной линии MTED BY-2, как приведено в настоящем описании. В частности, чертеж иллюстрирует T-ДНК растительного вектора экспрессии pTRAkc::MTED, примененного для трансформации суспензионных клеток BY-2.
LB и RB: левая и правая граница T-ДНК; Pnos и pAnos: промотор и терминатор гена нопалиновой синтазы; nptII: кодирующая последовательность гена неомицин-фосфотрансферазы; SAR: последовательности связывания с ядерным матриксом; p35SS и pA35S: промотор с дуплицированным энхансером и терминатор гена вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S; CHS: 5'-нетранслируемая область хальконовой синтазы из Petroselinum crispum; SP: сигнальный пептид; HC и LC: кодирующая последовательность тяжелой и легкой цепи антитела M12; TL: 5'-нетранслируемая область вируса гравировки табака (TEV); TP: переходный пептид; DsRed: кодирующая последовательность красного флуоресцентного белка из вида Discosoma.
Примеры
Пример 1
Быстрое получение элитных моноклональных клеточных линий после события трансформации
A. Клеточная культура табака
Суспензионную культуру дикого вида из Nicotiana tabacum сорта Bright Yellow (BY-2) поддерживали в темноте в стерильных условиях в виде 50 мл аликвот в стеклянных Колбах ЭрленМейера на 100 мл при 26°C с постоянным орбитальным взбалтыванием 180 оборотов в минуту. Среда культивирования включала базальную среду MSMO (pH 5,8), дополненную сахарозой (3%, в/о) и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиацетиловой кислоты. Пересев делали с интервалами в 7 дней посредством переноса 5% (о/о) клеток в 50 мл свежей среды.
Для получения протопластов суспензионную клеточную культуру пересевали путем переноса 2% (о/о) в 50 мл свежей среды.
B. Ускоренное получение трансгенных событий для последующего сортинга
Суспензионные клетки дикого типа BY-2 выращивали, как описано в секции A. Одновременно трансгенную агробактерию Agrobacterium tumefaciens, содержащую конструкцию, включающую несколько кассет экспрессии в одном и том же векторе (см. фигуру 1) культивировали в питательной среде YEB, содержащей подходящий антибиотик (0,5% питательного бульона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,5% сахарозы, 2 мМ MgSO4, pH 7,4), на орбитальном шейкере при 160 оборотах в минуту и 27°C до OD600нм 1. Спустя три дня после культивирования 3 мл диких клетки типа BY-2, 200 нМ ацетосирингона и 150 мкл агробактерий (OD600нм=1) совместное культивировали в чашках Петри в темноте. После 3 дней совместного культивирования при комнатной температуре BY-2 клетки ресуспендировали в 10 мл питательной среды (для) BY-2, дополненной 200 мг/л цефотаксима. Клетки переносили в стерильную колбу на 50 мл и промывали дважды путем центрифугирования (850 г, 5 минут), чтобы удалить агробактерии. После ресуспендирования осадка клеточной культуры культивирование трансформированных клеток BY-2 происходит во встряхиваемых колбах на 100 мл с применением 20-50 мл питательной среды BY-2 с добавлением цефотаксима и подходящего селектрующего вещества (180 оборотов в минуту, 26°C). После регенерации нужной суспензии (объем осажденных клеток приблизительно 50-60%) клетки могут быть пересеяны для получения протопластов (см. секцию C). Этот способ требует 14-21 дней для получения трансгенной суспензионной культуры, которая может быть применена для последующего получения протопластов (C) и проточно-цитометрического сортинга (D).
C. Получение протопластов и регенерация клеточной оболочки
Активно растущие клеточные культуры применяли спустя 3 дня после пересева для седиментации осадка клеток путем центрифугирования при 850 г в течение 5 минут в стерильных конических пластмассовых центрифужных колбах. Надосадочную жидкость удаляли и клетки ресуспендировали в 10 мл раствора расщепления PNT (3,6 г/л базисной смеси солей Kao Michayluk (Duchefa), 0,4 М сахарозы, 0,5 мг/л NAA, 1 мг/л BAP) включая 1% (в/о) целлюлозу и 0,3% (в/о) мацерозима. Клеточно-ферментную суспензию помещали в 6-сантиметровые чашки Петри, запечатанные изоляционной лентой. Расщепление проводили в течение ночи (16-18 ч) при 26°C в темноте с небольшим взбалтыванием. Протопласты фильтровали через 100-мкм нейлонову сеть и затем добивались всплывания на поверхность во время центрифугирования (104 г в течение 8 минут). Осадок и среднюю поверхность раздела удаляли и протопласты промывали дважды раствором PNT. Протопласты ресуспендировали в растворе W5 (154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 5 мМ глюкозы, pH 5,6) и осаждали посредством центрифугирования при 76 г в течение 2 мин. Протопласты культивировали в модифицированной питательной среде регенерации 8p2c (см. таблицу 1 ниже; оптимизирована из питательной среды 8p) после осторожной ресуспензии. Обычно результатом описанной процедуры являлись 7x105 протопластов в мл со средним процентом жизнеспособных протопластов 74%.
Протопласты регенерировали в течение 3 дней при 26°C в темноте, чтобы инициировать регенерацию клеточной оболочки. Полученные в результате протопласты снова просеивали через 100-мкм нейлоновую сеть и затем переносили в стерильную пробирку введения образца для FAC сортинга. Единичные протопласты сортировали в отдельные лунки 96-луночного титрационного микропланшета, содержащего нетрансгенные фидерные клетки или протопласты дикого типа (см. секцию D).
Протопласты дикого типа BY-2, которые применяли как фидерные протопласты, были приспособлены приблизительно к 2x103 клеток/мл питательной среды 8p2c с применением счетной камеры Fuchs-Rosenthal. Пятьдесят микролитров этих протопластов переносили в отдельные лунки 96-луночного титрационного микропланшета так, чтобы приблизительно 100 фидерных протопластов дикого типа были перенесены в каждую лунку.
Таблица 1: Композиция питательнлой среды 8p2c (pH 5,6)
- Базисная смесь солей Kao und Michayluk (Duchefa)
- Kao и раствор витаминов Michayluk (Sigma)
0,02 мг/л p-аминобензойной кислоты
2 мг/л L-аскорбиновой кислоты
0,01 мг/л биотина
1 мг/л пантотената D-кальция
1 мг/л холинового хлорида
0,4 мг/л фолиевой кислоты
100 мг/л мио-инозитола
1 мг/л никотинамида
1 мг/л пиридоксина HCl
0,2 мг/л рибофлавина
1 мг/л тиамина HCl
0,01 мг/л витамина А
0,02 мг/л витамина B12
0,01 мг/л витамина D
- Органические кислоты (pH 5,5 с NH4OH)
20 мг/л натриевой соли пировиноградной кислоты
40 мг/л яблочной кислоты
40 мг/л лимонной кислоты
40 мг/л фумаровой кислоты
- Сахарные и сахарные спирты
0,25 г/л сахарозы
250 мг/л маннозы
68,4 г/л глюкозы
250 мг/л рамнозы
250 мг/л фруктозы
250 мг/л целлобиозы
250 мг/л рибозы
250 мг/л сорбита
250 мг/л ксилозы
250 мг/л маннитола
- Гормоны
0,2 мг/л 2-4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
0,5 мг/л зеатина
1,0 мг/л NAA
- 2% (о/о) кокосовой воды
- 500 мг/л казаминовой кислоты
D. Проточный цитометрический анализ и сортинг
Прибор FACS Vantage (вариант DIVA, BD Bioscience) с 488 нМ/635 нМ аргоновым лазером применяли для сортинга трансгенных растительных протопластов. Проточную жидкость, фосфатно-буферный солевой раствор (pH 7,4 PBS), стерилизовали посредством автоклавирования и посредством фильтрования через 0,22 мкм фильтр. Перед сортингом пробирки для образцов очищали от остаточного этилового спирта посредством промывания проточной жидкостью. Параметры настройки системы/сортинга цитометра выверяли с применением коммерческих стандартных автофлуоресцентных частиц калибровки. Проточный сортер эксплуатировали при 488 нм с выходной мощностью лазера 175 мВт. Перед сортингом электронные сортировочные окна устанавливали на основании сигналов, полученных от прямого светорассеивателя, бокового светорассеивателя и флуоресценции образца культуры протопластов, чтобы определить популяцию с сильной флуоресценцией. Сигналы отображались в виде точечной диаграммы с применением программного обеспечения DIVA (BD Bioscience). Области для сортинга определяли путем создания границ, во-первых, вокруг популяции жизнеспособных протопластов и, во-вторых, на основе первых границ, вокруг популяции сильнофлуоресцирующих протопластов. Сортинг выполняли через 200 мкм - проточную канюлю с системным давлением канюли 4-6 фунт/кв.дюйм, частотой капель приблизительно 7 кГц и скоростью потока образца приблизительно 1000 событий/сек.
С применением описанных параметров сортинга достигали эффективности высева 20% (т.е. 20% лунок содержали интактные и жизнеспособные единичные отсортированные протопласты).
E. Регенерация единичных сортированных протопластов путем совместного культивирования с питающими/фидерными протопластами
Перед сортингом сильнофлуоресцирующих единичных протопластов каждую лунку 96-луночного микропланшета заполняли 50 мкл стерильной питательной среды регенерации 8p2c, содержащей приблизительно 100 протопластов дикого типа BY-2 сорта N. tabacum в качестве фидерных клеток. Единичные отсортированные трансгенные протопласты анализировали посредством инверсной флуоресцентной микроскопии в различные моменты времени, чтобы проверить отложение единичных клеток после процесса сортинга, а также контролировать пролиферацию и образование микроколонии трансгенных протопластов (спустя 14-20 дней после сортинга). Культивирование сортированных протопластов в 96-луночных планшетах проводили при 26°C-27°C в темноте, чашки закрывали стерильной крышкой и запечатывали изоляционной лентой.
Трансгенные микроколонии затем переносили на твердую питательную среду регенерации (0,8% (в/о) агар-агар), содержащую селективный маркерный антибиотик (например, канамицин). Таким образом, ткань микрокаллюса, включающая фидерные клетки в лунках, осторожно ресуспендировали посредством пипетирования и переносили с применением пипетки с широким концом кончика. Впоследствии лунки, а также перенесенные микрокаллюсы на твердой питательной среде регенерации анализировали посредством инверсной флуоресцентной микроскопии, чтобы проверить успешный перенос трансгенных и флуоресцентных микроколоний. При переносе трансгенные микрокаллюсы выращивали в течение 14-20 дней и переносили на свежую чашку, содержащую твердую среду регенерации, включающую селективный маркер. Ткань каллюса с размером приблизительно 2 см в диаметре применяли для получения суспензионных культур путем переноса клеточного материала в 5 мл питательной среды культивирования (описанной в секции A) в пластмассовые колбы для культивирования тканей на 50 мл. Эти колбы культивировали, как описано в секции А, пока клеточная суспензия не вырастала до объема осажденных клеток приблизительно 50-60% для переноса в стеклянные колбы ЭрленМейера на 100 мл. Культивирование трансгенной моноклональной суспензионные культуры осуществляли, как описано в секции A.
Описанная стратегия для фидерных клеток позволяет регенерацию приблизительно 50% первоначально сортированных интактных и жизнеспособных единичных протопластов (т.е. приблизительно 10% единичных протопластов, сортированных в лунки 96-луночного микропланшета, развившихся в микрокаллюс).
F. Проверка успешной элиминации выживания фидерных клеток во время регенерации отсортированных единичных протопластов
Разработали способ, который позволяет надежную регенерацию выбранных с помощью FACS единичных протопластов в моноклональные суспензионные культуры. Поскольку единичные протопласты были регенерированы после сортинга, фидерные клетки должны поддерживать регенерацию и пролиферацию сортированных единичных протопластов. Поскольку фидерные протопласты временно совместно культивируют с сортированными флуоресцентными требуемыми протопластами, нужно обязательно элиминировать выживание фидерных протопластов во время регенерации моноклональных культур.
Исследовали потенциальную контаминацию единично сортированных трансгенных и флуоресцентных клеток BY-2 фидерными протопластами. Трансгенные клетки трансформировали конструкцией, содержащей кассету экспрессии GFP-KDEL и селективный маркер AHAS (придающий устойчивость к имазетапиру). Единичные BY-2 протопласты, трансформированные этой конструкцией и включающей GFP, сортировали в 96-луночные планшеты, содержащие протопласты трансгенной клеточной линии, содержащей кассету экспрессии DsRed и селективного маркера nptII (придающего устойчивость к канамицину). Во втором эксперименте единичные протопласты BY-2, трансформированные кассетой экспрессии DsRed и селективного маркера nptII, сортировали в 96-луночные планшеты, содержащие протопласты трансгенной клеточной линии, продуцирующей GFP. После регенерации получившиеся в результате GFP- и DsRed- флуоресцентные культуры анализировали в отношении их устойчивости к имазетапиру или канамицину и их флуоресценции (зеленый против красного). Ткань каллюса от обоих подходов высевали на чашки в селективную питательную среду, содержащую или 1,5 мкМ имазетапира или 100 мг/л канамицина. Рост клеток оценивали визуально после 14 дней инкубации. Все протестированные каллюсы (всего 20) росли исключительно на средних чашках, содержащих их специфическое селективное вещество. Короче говоря, трансформированный GFP/AHAS каллюсы росли на имазетапире, но не на чашках, содержащих канамицин, тогда как трансформированный DsRed/канамицином каллюсы росли только на канамициновых чашках. Это наблюдение ясно продемонстрировало, что регенерированные трансгенные клеточные линии не были контаминированы соответствующей линией фидерных клеток. Потенциальную контаминацию фидерными клетками дополнительно оценивали посредством проточного цитометрического анализа. Регенерированные GFP и DsRed суспензионные культуры анализировали в отношении их оптических свойств, выявляемых посредством флуоресцентных белков GFP или DsRed соответственно. Это наблюдение ясно продемонстрировало, что регенерированные трансгенные клеточные линии не были контаминированы соответствующей линией фидерных клеток. Все протестированные культуры BY-2 проявляли исключительно ожидаемый тип флуоресценции. Культуры, полученные после сортинга клеток, трансформированных GFP, демонстрировали только зеленую флуоресценцию, в то время как культуры, продуцирующие DsRed, детектировали исключительно в красном канале флуоресценции. В случае контаминации фидерными клетками, ожидался бы сигнал флуоресценции в обоих каналах. Результат цитометрического анализа подтвердил эффективное удаление фидерных клеток на селективных чашках, как продемонстрировано прежде тестом на устойчивость.
G. Анализ моноклональных трансгенных суспензионных культур
Моноклональные суспензионные культуры сначала анализировали в отношении их процента высокофлуоресцирующих клеток. Поэтому протопласты получали так, как описано в секции C. Для проточно-цитометрического определения части флуоресцирующих протопластов применяли прибор FACS Calibur (BD Bioscience). На основании протопластов дикого типа BY-2 устанавливали параметры настройки (например, усиление света и усилителей рассеяния флуоресценции) и образцы измеряли. После установления границ жизнеспособной популяции распределение этой популяции применяли в канале флуоресценции, чтобы установить порог, который исключал все второстепенные сигналы, вызванные посредством автофлуоресценции дикого типа. Согласно этому порогу вычисляли процент флуоресцентных протопластов в пределах улучшенных культур протопластов, происходящих из единичного протопласта. Проточный цитометрический анализ моноклональных суспензионных культур, продуцирующих рекомбинантный белок DsRed, выявил гомогенно распределенные клетки схожей или сильной интенсивностей флуоресценции (узкие флуоресцентные пики). Результатом подсчета части клеток с DsRed флуоресценцией явились проценты, варьирующие между 78-88% сильнофлуоресцирующих клеток.
Уровни накопления рекомбинантного белка могут быть определены различными способами (например, иммуносорбентного ферментного анализа (ELISA)). Поэтому, клетки центрифугировали (850 г, 5 минут), ресуспендировали в 3-объемном буфере экстракции (PBS pH 6, 5мМ 2-меркаптоэтанол, 5 мМ EDTA, 10 мМ аскорбиновой кислоты) и блокировали при помощи обработки ультразвуком. Экстракт отделяли от клеточных остатков путем следующей стадии центрифугирования (20 минут, 16000 г) и применяли для анализа. Иммунологический анализ накопления антитела M12 в 5 dpi (точек на дюйм) клеточных экстрактов от суспензионных культур, трансформированных pTRAkc:MTED выявил до 118±20 мкг/г свежей массы (в 1,5 раз выше, чем при применении обычного способа получения, т.е. получения каллюса и скрининга).
Пример 2
Получение моноклональных клеточных линий из гетерогенной трансгенной суспензионной культуры
A. Клеточная культура табака
Трансгенную суспензионную культуру Nicotiana tabacum сорта Bright Yellow (BY-2) MTED#18, продуцирующую полноразмерное антитело человека IgG1 M12, задержанное в эндоплазматическом ретикулюме, и флуоресцентный белок DsRed, нацеленно помещенный в пластиды, поддерживали в темноте в стерильных условиях в виде 50 мл аликвот в стеклянных колбах ЭрленМейера на 100 мл при 26°C с постоянным орбитальным взбалтыванием 180 оборотов в минуту. Клетки дикого типа BY-2 выращивали в тех же условиях в качестве контроля. Среда культивирования включала основную среду MSMO с pH 5,8, дополненную сахарозой (3%, в/о) и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Пересев делали с интервалом в 7 дней путем переноса 5% (о/о) клеток в 50 мл свежей среды.
Трансгенную суспензионную культуру получали путем агробактерио-опосредованной трансформаци клеток N. tabacum сорта BY-2 с последующей селекцией, основанной на антибиотике, и последующим разделением трансформированной ткани каллюса. Ткани каллюса скринировали согласно их продукции антитела посредством иммунологических анализов (Dotblot и ELISA), и самых лучших кандидатов применяли для получения суспензионной культуры (= клеточная линия MTED#18). Продукция специфического антитела M12 парентеральной культуры MTED#18 составляла 13 мг/г свежей клеточной массы (10 мг/л). Проточный цитометрический анализ показал, что трансгенная культура состоит из двух субпопуляций с только 24% жизнеспособной популяции, продуцирующей флуоресцентный маркерный белок DsRed.
Для получения протопластов клеточную суспензионную культуру пересевали путем переноса 2% (о/о) в 50 мл свежей среды.
B. Получение протопластов и регенерация клеточной оболочки
См. пример 1, секция C.
Обычно результатом описанного способа являлось 5x105 протопластов в мл со средним процентным содержанием 62,2 жизнеспособных трансгенных протопластов.
C. Проточный цитометрический анализ и сортинг
Настройки приборных параметров и предварительные подготовки делали, как описано в примере 1, секция D.
Единичные сильно флуоресцирующие растительные протопласты (1-2% от всех отсортированных протопластов) сортировали в устройство приема клеток (т.е. планшеты микротитратора) в режиме единичных клеток. Один протопласт на лунку, в соответствии со вторыми критериями установления границ, отсортировывали в 96-луночные планшеты, наполненные 50 мкл стерильной среды регенерации 8p2c, содержащий приблизительно 100 протопластов дикого типа в качестве фидеров. 96-луночные планшеты закрывали стерильной крышкой и запечатывали изоляционной лентой. Фактическое число регенерируемых протопластов определяли путем инверсионной флуоресцентной микроскопии. Результатом проточно-цитометрическиого сортинга протопластов в режиме единичных клеток являлась эффективность высева приблизительно 20% лунок, содержащих один интактный и жизнеспособный протопласт на лунку.
D. Регенерация отсортированных протопластов в низких плотностях
Регенерацию единичных сортированных протопластов выполняли, как описано в примере 1 секции E.
Результатом проточно-цитометрического сортинга высокофлуоресцирующих протопластов в режиме единичных клеток являлись приблизительно 20% лунок, содержащих только один отсортированный протопласт. 50% этих единичных протопластов начали пролиферацию и могли быть применены для получения суспензионных культур.
E. Анализ моноклональных трансгенных суспензионных культур
Чтобы определить процент флуоресцирующих протопластов в улучшенных суспензионных культурах, происходящих из единственного протопласта, применяли проточный цитометрический анализ, как описано ранее (эксперимент 1, секция D). Уровни накопления антитела M12 определяли путем иммуносорбентного ферментного анализа (ELISA). Таким образом, суспензионные клетки центрифугировали (850 г, 5 минут), ресуспендировали в 3-объемном буфере экстракции (PBS pH 6, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ аскорбиновой кислоты) и блокировали обработкой ультразвуком. Экстракт отделяли от клеточных остатков с помощью стадии центрифугирования (20 минут, 16000 г) и применяли для анализа. Благодаря выбранным настройкам (захват Fc и детекция LC) детектировали только полностью сформированные антитела.
После одного раунда FACS моноклональные суспензионные культуры продемонстрировали значительно улучшенные уровни накопления обоих рекомбинантных белков: 3,7-кратный обогащенный процент клеток с DsRed флуоресцией (90%) и 11-кратное увеличение антитела M12 (145 мг/г свежей массы или 9,3-кратное увеличение уровня на мг/л (93 мг/л)), когда сравнивали с парентеральной суспензионной культурой.
F. Повторное проведение улучшения суспензионной культуры
Чтобы дополнительно увеличить и стабилизировать рекомбинантную производительность белка трансгенных моноклональных суспензионных культур, могут быть повторены стадии B-E. Для получения протопластов и регенерации применяли те же самые условия сортинга, как описано ранее.
Результатом второго раунда сортинга являлось дальнейшее увеличение накопления антитела: 182 мкг/г свежей массы или 113 мг/л, что является 14-кратным и 11,3-кратным увеличением по сравнению с парентеральной культурой.
Результатом третьего раунда сортинга 2-го поколения наилучшим образом продуцирующих моноклонов являлось 3-е поколение моноклональных культур, продуцирующих схожие уровни накопления, указывающие на то, что максимальный уровень был достигнут.
G. Устойчивость элитных продуцирующих моноклональных культур с точки зрения целевого производства белка
Устойчивость полученных с помощью FACS моноклональных клеточных линий исследовали для примера для 3 моноклональных линий. Моноклональные клеточные линии пересевали в 7-дневном цикле (относится к примеру 1, секция A), в то время как оба рекомбинантных требуемых белка измеряли в 2-месячных интервалах всегда на 5 день после пересева. В течение 12-месячного периода было продемонстрировано для 1-го поколения моноклональных культур, что эти культуры все еще продуцируют высокое и стабильное количество антитела M12 на грамм свежей массы. Наблюдали только небольшие вариации в уровнях антитела в 2-месячных интервалах между отбором образцов (вызванные вариациями культивирования клеток).
Анализ 2-го поколения моноклонов подтвердил устойчивость клеточной линии посредством демонстрации схожих или немного увеличенных уровней накопления и рекомбинантных белков и антитела M12 и DsRed по сравнению с 1-м поколением моноклональной культуры, из которой они были получены. В целом, проанализированные моноклональные культуры 2-го поколения кажутся более стабильными с точки зрения выработки требуемого белка (меньше вариаций в 2-месячных интервалах между отбором образцов) по сравнению с 1-м поколением моноклональных культур. Во время 12-месячного периода было обнаружено, что две из трех проанализированных моноклональных культур были высоко стабильными в отношении процентного содержания в них DsRed-флуоресцирующих клеток в общей численности популяции, так же, как накопления антитела M12.
Claims (5)
1. Способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии:
(a) получение гетерологичной популяции растительных клеток;
(b) получение протопластов из указанной гетерологичной популяции растительных клеток;
(c) предоставление устройства приема клеток, содержащего фидерный клеточный материал на жидкой среде;
(d) разделение единичных протопластов путем подвергания полученных протопластов проточно-цитометрическому сортингу;
(e) отбор единичного протопласта и помещение его в указанное устройство приема клеток, содержащее фидерный клеточный материал;
(f) регенерация выделенного единичного протопласта до образования микроколонии посредством совместного культивирования в присутствии указанного материала фидерных клеток;
(g) выделение микроколонии из материала фидерных клеток и культивирование микроколонии до образования моноклональной линии растительных клеток.
(a) получение гетерологичной популяции растительных клеток;
(b) получение протопластов из указанной гетерологичной популяции растительных клеток;
(c) предоставление устройства приема клеток, содержащего фидерный клеточный материал на жидкой среде;
(d) разделение единичных протопластов путем подвергания полученных протопластов проточно-цитометрическому сортингу;
(e) отбор единичного протопласта и помещение его в указанное устройство приема клеток, содержащее фидерный клеточный материал;
(f) регенерация выделенного единичного протопласта до образования микроколонии посредством совместного культивирования в присутствии указанного материала фидерных клеток;
(g) выделение микроколонии из материала фидерных клеток и культивирование микроколонии до образования моноклональной линии растительных клеток.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий регенерацию моноклональной линии растительных клеток, как представлено в стадии (g), в целые плодоносящие растения.
3. Способ по п. 1, в котором протопласты, как представлено в стадии (b), трансформированы и способны к (i) продукции флуоресцентного маркерного белка или полипептида, (ii) выработке желаемого продукта и/или (iii) выживанию в присутствии селектирующего вещества.
4. Способ по п. 3, в котором желаемый продукт выбран из группы, состоящей из гетерологичных белков или полипептидов, вторичных метаболитов и маркеров для диагностических или аналитических целей.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором разделение единичных протопластов на стадии (d) осуществлено путем подвергания протопластов FACS.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2011/002785 WO2012167803A1 (en) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Method for the generation of a monoclonal plant cell line |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013157526A RU2013157526A (ru) | 2015-07-20 |
| RU2573927C2 true RU2573927C2 (ru) | 2016-01-27 |
Family
ID=44529878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013157526/10A RU2573927C2 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения моноклональной линии растительных клеток |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10480001B2 (ru) |
| EP (1) | EP2717676B1 (ru) |
| JP (1) | JP5933700B2 (ru) |
| KR (1) | KR101933552B1 (ru) |
| CN (1) | CN103596423B (ru) |
| AR (1) | AR086674A1 (ru) |
| AU (1) | AU2011370336B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013031244B1 (ru) |
| CA (1) | CA2835253C (ru) |
| IL (1) | IL229168A0 (ru) |
| RU (1) | RU2573927C2 (ru) |
| TW (1) | TWI608795B (ru) |
| UA (1) | UA112546C2 (ru) |
| WO (1) | WO2012167803A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201309126B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2787519C2 (ru) * | 2017-08-17 | 2023-01-10 | Саката Сид Корпорейшн | Способ детекции нетипичного растения brassica oleracea |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140075593A1 (en) * | 2012-09-07 | 2014-03-13 | Dow Agrosciences Llc | Fluorescence activated cell sorting (facs) enrichment to generate plants |
| CN117882643A (zh) * | 2024-01-12 | 2024-04-16 | 北京师范大学珠海校区 | 一种提高完全脱分化植物愈伤组织继代效率的方法 |
| CN120082500A (zh) * | 2025-04-28 | 2025-06-03 | 北京艾普希隆生物科技有限公司 | 一种制备植物单细胞的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4300310A (en) * | 1980-07-28 | 1981-11-17 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Identification and sorting of plant heterokaryons |
| JPH03143390A (ja) * | 1989-10-27 | 1991-06-18 | Naasarii Technol:Kk | 植物細胞培養法 |
| CA2221411A1 (en) * | 1995-05-19 | 1996-11-21 | Phytera, Inc. | Manipulation of plant cell and tissue cultures |
| WO2001088168A2 (en) * | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Odyssey Pharmaceuticals, Inc. | Mapping molecular interactions in plants with protein fragments complementation assays |
| EP1401849A4 (en) * | 2001-05-30 | 2005-05-18 | Chromos Molecular Systems Inc | ARTIFICIAL PLANT CHROMOSOMES, THEIR USE AND METHOD FOR THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL PLANT CHROMOSOMES |
| US8247655B2 (en) * | 2006-09-13 | 2012-08-21 | Syngenta Participations Ag | Rucola plants with cytoplasmic male sterility (CMS) |
| CN101402938B (zh) * | 2008-11-17 | 2010-10-13 | 中国科学院植物研究所 | 一种制备原生质体的方法 |
-
2011
- 2011-06-07 WO PCT/EP2011/002785 patent/WO2012167803A1/en not_active Ceased
- 2011-06-07 KR KR1020137032519A patent/KR101933552B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-07 EP EP11729369.6A patent/EP2717676B1/en not_active Not-in-force
- 2011-06-07 AU AU2011370336A patent/AU2011370336B2/en not_active Ceased
- 2011-06-07 RU RU2013157526/10A patent/RU2573927C2/ru active IP Right Revival
- 2011-06-07 US US14/115,629 patent/US10480001B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-07 CA CA2835253A patent/CA2835253C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-07 BR BR112013031244-0A patent/BR112013031244B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-06-07 CN CN201180071503.2A patent/CN103596423B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-06-07 JP JP2014513915A patent/JP5933700B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-07-06 UA UAA201315360A patent/UA112546C2/uk unknown
-
2012
- 2012-06-05 AR ARP120101980A patent/AR086674A1/es unknown
- 2012-06-06 TW TW101120200A patent/TWI608795B/zh not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-10-31 IL IL229168A patent/IL229168A0/en active IP Right Grant
- 2013-12-04 ZA ZA2013/09126A patent/ZA201309126B/en unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ELFRIEDE SCHAFFLER et al, Single cell nurse culture of tobacco protoplasts: physiological analysis of conditioning factors, J. Plant Physiol. v 137, pp. 95-101, 1990. LUTZ EIGEL et al, Nurse culture of individual cells: regeneration of colonies from single protoplasts of Nicotiana tabacum, Brassica napus and Hordeum vulgare, J. Plant Physiol. v 134, pp. 577-581, 1989. D.W. GALDRAITH et al, Flow sorting and culture of protoplasts: conditions for high-frequency recovery, growth and morphogenesis from sorted protoplasts of suspension cultures of nicotiana, Plant Cell Reports 1984, 3:151-155. ELFRIEDE SCHAFFLER et al, Single cell nurse culture of tobacco protoplasts: physiological analysis of conditioning factors, J. Plant Physiol. v 137, pp. 95-101, 1990. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2787519C2 (ru) * | 2017-08-17 | 2023-01-10 | Саката Сид Корпорейшн | Способ детекции нетипичного растения brassica oleracea |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2717676B1 (en) | 2019-01-02 |
| JP5933700B2 (ja) | 2016-06-15 |
| RU2013157526A (ru) | 2015-07-20 |
| AR086674A1 (es) | 2014-01-15 |
| CA2835253C (en) | 2018-06-26 |
| TW201300014A (zh) | 2013-01-01 |
| IL229168A0 (en) | 2013-12-31 |
| US10480001B2 (en) | 2019-11-19 |
| WO2012167803A1 (en) | 2012-12-13 |
| BR112013031244B1 (pt) | 2019-10-29 |
| CN103596423A (zh) | 2014-02-19 |
| US20140053300A1 (en) | 2014-02-20 |
| ZA201309126B (en) | 2014-09-25 |
| UA112546C2 (uk) | 2016-09-26 |
| JP2014516553A (ja) | 2014-07-17 |
| EP2717676A1 (en) | 2014-04-16 |
| CA2835253A1 (en) | 2012-12-13 |
| KR20140048880A (ko) | 2014-04-24 |
| BR112013031244A2 (pt) | 2017-06-27 |
| AU2011370336B2 (en) | 2017-07-06 |
| CN103596423B (zh) | 2017-05-24 |
| AU2011370336A1 (en) | 2013-12-12 |
| KR101933552B1 (ko) | 2018-12-28 |
| TWI608795B (zh) | 2017-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2008203023B2 (en) | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes | |
| DE69929073T2 (de) | Verfahren und Zusammensetzungen für die Transformation von Pflanzen | |
| WO2008112044A1 (en) | Tranformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| US20240093222A1 (en) | Methods for transforming corn explants | |
| US7176352B1 (en) | Transgenic Lemnaceae | |
| RU2573927C2 (ru) | Способ получения моноклональной линии растительных клеток | |
| WO2009011725A1 (en) | Method for transforming soybean (glycine max) | |
| JP2015505465A (ja) | 植物細胞パックの発生及び培養のための方法 | |
| CA2064017A1 (en) | Particle-mediated transformation of woody plant species | |
| AU2003200734B2 (en) | Transgenic Lemnaceae | |
| CN118028345A (zh) | 磁力分拣单细胞/花粉粒的转基因方法及其应用 | |
| AU2011202647B2 (en) | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes | |
| AU2006202219B2 (en) | Genetically engineered duckweed | |
| JPH0576373A (ja) | 耐性遺伝子 | |
| Kirchhoff | Generation of highly productive polyclonal and monoclonal tobacco suspension lines from a heterogeneous transgenic BY-2 culture through flowcytometric sorting | |
| AU2002312268A1 (en) | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes | |
| HK1164885A (en) | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160608 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20180618 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190608 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200707 |