[go: up one dir, main page]

RU2572569C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ - Google Patents

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ Download PDF

Info

Publication number
RU2572569C1
RU2572569C1 RU2014147824/10A RU2014147824A RU2572569C1 RU 2572569 C1 RU2572569 C1 RU 2572569C1 RU 2014147824/10 A RU2014147824/10 A RU 2014147824/10A RU 2014147824 A RU2014147824 A RU 2014147824A RU 2572569 C1 RU2572569 C1 RU 2572569C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cher
mel
cell line
braf
mutation
Prior art date
Application number
RU2014147824/10A
Other languages
English (en)
Inventor
Наталья Владимировна Андронова
Екатерина Геннадьевна Зенит-Журавлева
Юлия Александровна Борисова
Елена Михайловна Трещалина
Лидия Федоровна Морозова
Анатолий Юрьевич Барышников
Анна Александровна Лушникова
Ирина Викторовна Цыганова
Ирина Николаевна Михайлова
Евгений Александрович Черемушкин
Лев Вадимович Демидов
Натан Танфелевич Райхлин
Ирина Алексеевна Букаева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" (ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" (ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина") filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" (ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина")
Priority to RU2014147824/10A priority Critical patent/RU2572569C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2572569C1 publication Critical patent/RU2572569C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается создания подкожных ксенографтов меланомы кожи человека для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств. Способ получения подкожных ксенографтов клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств включает адаптацию клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude путем многократного пассирования до девяти пассажей взвеси опухолевых клеток по 50-60 мг на мышь со стабильной кинетикой роста и тестирование на наличие мутации V600E BRAF. Получены подкожные ксенографты клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств. 3 ил., 4 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается создания подкожных ксенографтов меланомы кожи человека для доклинического изучения противоопухолевых средств.
Диссеминированная меланома кожи человека отличается чрезвычайно низкой чувствительностью к различным видам терапии [Демидов Л.В., Орлова К.В. Индивидуализация лекарственного лечения меланомы кожи // Практическая онкология, 2013, Т.14, №4, С. 239-246].
Известно, что мутация V600E в экзоне 15 гена BRAF приводит к гиперактивации серинтреониновой BRAF-киназы с последующей аномальной пролиферацией клеток и быстрой прогрессией меланомы [Graeme J. Walker, et al. Modeling melanoma in mice // Pigment Cell Melanoma Res., 2011, 24, P. 1158-1176; Davies H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature, 2002, 417, P. 949-954; Tsai J. et al. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 10, P. 3041-3046].
Избирательное блокирование BRAF-киназы определило создание противоопухолевых таргетных средств, среди которых наиболее эффективным в лечении диссеминированной меланомы является вемурафениб [Ribas A., et al. BRIM-2: an open label, multicenter phase II study of vemurafenib in previously treated patients with BRAFV600E mutation positive melanoma // J. Clin. Oncol., 2011, 29, P. 8509].
Задачей изобретения является получение подкожных ксенографтов клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств.
Поставленная задача решается тем, что для получения подкожных ксенографтов использована клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher, адаптированная к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude со стабильной кинетикой роста, тестированная на наличие мутации V600E BRAF и использованная для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств.
Для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств была использована клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher, депонированная в Коллекции клеточных культур института цитологии РАН РККК (П) 704Д. Клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher имеет стабильные культуральные, морфологические и индивидуальные фенотипические характеристики и высокий митотический потенциал [патент РФ №2364624].
В клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher определена мутация V600E в экзоне 15 гена BRAF.
Технический результат изобретения.
Получены подкожные ксенографты клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств.
Способ осуществляли следующим образом.
Адаптацию клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude осуществляли многократным пассированием мышам различных прививочных доз клеток. В стабильных пассажах подкожных ксенографтов определяли мутацию V600E BRAF с последующим применением вемурафениба.
Контролем состоявшейся адаптации клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher к росту in vivo служили следующие трансплантационные характеристики: прививочная доза клеток для 100% получения подкожных ксенографтов, цитологически идентичных клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher после имплантации у мышей (первый пассаж); устойчивая многократная трансплантация до девятого пассажа взвесью опухолевой ткани; устойчивая кинетика роста меланомы кожи человека mel Cher у мышей на поздних пассажах; гистологическая верификация меланомы.
Критерием к применению подкожных ксенографтов меланомы кожи человека mel Cher для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств считали наличие мутации V600E BRAF и высокую чувствительность к вемурафенибу.
Трансплантационные характеристики клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher получали следующим образом.
Инокулятом для имплантации служила культивированная в CO2 клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher. Отмытые физиологическим раствором от культуральной среды клетки помещали в питательную среду 199 и имплантировали подкожно в дозах 0,1×107; 0,5×107; 1,0×107 клеток на мышь в 0,2 мл питательной среды 199. В исследовании использовали 12 иммунодефицитных мышей Balb/c nude по 4 мыши на каждую дозу клеток. Контроль прививаемости клеток осуществляли по наличию пальпируемых опухолей у мышей с регистрацией длительности латентного периода в течение 21 дня. По окончании исследования определили оптимальную прививочную дозу 1,0×107 клеток на мышь, обеспечивающую 100% прививаемость.
Получение подкожных ксенографтов клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF.
Подкожные ксенографты меланомы кожи человека mel Cher получали на 10 мышах Balb/c nude. Многократные пассажи выполняли взвесью опухолевой ткани по 50-60 мг на мышь в разведении 1:20 питательной средой 199. Наличие трансплантированных опухолей у мышей в одни и те же сроки при многократном пассировании свидетельствовали о достижении стабильных кинетических характеристик подкожных ксенографтов in vivo.
Кинетику роста подкожных ксенографтов определяли по среднему объему опухолей, начиная от появления всех пальпируемых опухолей с учетом латентной фазы роста. Период увеличения среднего объема опухоли (Vcp=a×b×c) в два и более раз определял длительность экспоненциальной фазы роста, а стабилизация роста опухоли на уровне менее двукратного увеличения - длительность стационарной фазы роста. О кратности роста опухоли судили по соотношению последующего среднего объема к предыдущему (Vt/Vt-1) при измерении опухоли каждые 3-4 дня в течение 2-4 недель.
Статистический анализ параметров роста четвертого пассажа выполняли с помощью стандартного метода Фишера. Отсутствие значимых различий кривых роста опухоли двух пассажей в полулогарифмической системе координат подтверждало устойчивость кинетических характеристик роста подкожных ксенографтов меланомы кожи человека mel Cher у мышей Balb/c nude.
Гистологическую верификацию подкожных ксенографтов меланомы кожи для сравнения клеточного состава с исходной клеточной линией меланомы кожи человека mel Cher выполняли в девятом пассаже с устойчивой кинетикой роста с помощью световой микроскопии срезов опухоли, окрашенных гематоксилином и эозином.
Изобретение иллюстрируется таблицами (1-4) и фигурами (1-3).
Табл. 1. Выбор оптимальной прививочной дозы клеток меланомы кожи человека mel Cher для получения подкожных ксенографтов у мышей Balb/c nude.
Табл. 2. Динамика роста опухоли после имплантации 1,0×107 клеток меланомы кожи человека mel Cher у мышей Balb/c nude (первый пассаж).
Табл. 3. Средний объем опухоли меланомы кожи человека mel Cher у мышей Balb/c nude (четвертый пассаж).
Табл. 4. Средний объем опухоли меланомы кожи человека mel Cher у мышей Balb/c nude (девятый пассаж).
Фиг. 1. Гистологическая картина подкожного ксенографта меланомы кожи человека mel Cher на 14 сутки роста опухоли (девятый пассаж).
Фиг. 2. Выявление мутации V600E BRAF в подкожных ксенографтах меланомы кожи человека mel Cher у мышей Balb/c nude (девятый пассаж).
Фиг. 3. Противоопухолевая активность вемурафениба у мышей с подкожными ксенографтами меланомы кожи человека mel Cher.
В табл. 1 показана зависимость роста опухоли после подкожной имплантации клеток меланомы кожи человека mel Cher от прививочной дозы клеток. Оптимальной была прививочная доза 1,0×107 клеток на мышь. При применении оптимальной прививочной дозы 1,0×107 клеток на мышь на 10 сутки (латентная фаза) у 100% мышей определяли пальпируемые опухоли.
В табл. 2 показано, что кинетика роста опухолей первого пассажа была относительно медленной (21 день), объем опухоли не достиг 1,0 см, а фаза экспоненциального роста практически отсутствовала. Кратность увеличения опухоли в течение этого периода была менее 2,0. Средний объем опухоли составил: на 10 сутки 42,2±10,5 мм3, на 15 сутки 112,0±35,1 мм3. Далее к 21 суткам объем опухоли достиг 133,0±27,8 мм3, превышая в 3,2 раза исходный объем.
В табл. 3 показано, что кинетика роста опухолей прогрессивно изменялась на четвертом пассаже. Латентная фаза сократилась до 8 дней, средний объем опухоли составил 68,0±25,0 мм3, почти в 1,6 раз превышающий объем опухоли первого пассажа. На 11 сутки средний объем опухоли составил 200±67,0 мм3 при кратности роста опухоли 2,9. На 14, 17 и 21 сутки, соответствующие стационарной фазе, кратность роста опухоли варьировала между 1,9; 2,1 и 1,8. Средний объем опухоли на 21сутки достиг 1526,3±496,0 мм3, в 10 раз превышая средний объем опухоли первого пассажа.
Устойчивая кинетика роста опухоли, достигнутая к четвертому пассажу, сохранялась до девятого пассажа с одинаковыми временными характеристиками: латентной фазой до 8 дней, экспоненциальной фазой до 14 дней и стационарной фазой до 21 дня после трансплантации (табл. 4).
При гистологическом исследовании подкожных ксенографтов меланомы кожи человека mel Cher девятого пассажа выявлено наличие крупных полиморфных клеток, идентичных цитологической характеристике культуры клеток меланомы кожи человека mel Cher (фиг. 1).
Мутацию V600E BRAF определяли в клетках опухоли меланомы кожи человека mel Cher девятого пассажа на пике экспоненциальной фазы роста.
На фиг. 2 представлена мутация V600E BRAF в подкожных ксенографтах меланомы кожи человека Mel Cher у мышей (а - дикий тип, b - мутация 1799Т>А, приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в позиции 600 (V600E), триплет GTG (GAG выделен серой полосой).
Для оценки чувствительности к ингибитору BRAF-киназы вемурафениб в разовой дозе 75 мг/кг вводили в желудок 10 мышам ежедневно с 4 по 19 сутки после трансплантации опухоли. Контрольная группа мышей не получала вемурафениб. Динамику роста опухоли в обеих группах оценивали во время и после применения вемурафениба каждые 4-5 дней в течение 20 дней.
На фиг. 3 показано непрерывное прогрессивное увеличение объема опухоли у мышей контрольной группы, в то время как вемурафениб полностью ингибировал рост опухоли в течение 7 дней с последующим ростом опухоли (серая кривая - контрольная группа, черная кривая - опытная группа).
Figure 00000001
Figure 00000002

Claims (1)

  1. Способ получения подкожных ксенографтов клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств, включающий адаптацию клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher к росту путем многократного пассирования до девяти пассажей взвеси опухолевых клеток по 50-60 мг на мышь со стабильной кинетикой роста и тестирование на наличие мутации V600E BRAF.
RU2014147824/10A 2014-11-27 2014-11-27 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ RU2572569C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014147824/10A RU2572569C1 (ru) 2014-11-27 2014-11-27 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014147824/10A RU2572569C1 (ru) 2014-11-27 2014-11-27 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2572569C1 true RU2572569C1 (ru) 2016-01-20

Family

ID=55086975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014147824/10A RU2572569C1 (ru) 2014-11-27 2014-11-27 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2572569C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651939C2 (ru) * 2016-04-12 2018-04-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) Подкожный ксенографт клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией NRAS для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств
US11040027B2 (en) 2017-01-17 2021-06-22 Heparegenix Gmbh Protein kinase inhibitors for promoting liver regeneration or reducing or preventing hepatocyte death

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2455993C1 (ru) * 2011-07-06 2012-07-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" Способ индукции апоптотической гибели клеток меланомы кожи
WO2014043700A1 (en) * 2012-09-17 2014-03-20 The General Hospital Corporation Melanocortin receptor mutant mouse and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2455993C1 (ru) * 2011-07-06 2012-07-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" Способ индукции апоптотической гибели клеток меланомы кожи
WO2014043700A1 (en) * 2012-09-17 2014-03-20 The General Hospital Corporation Melanocortin receptor mutant mouse and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Григорьева И.Н., "Васкулогенная мимикрия при меланоме кожи", диссертация, Москва, 2011. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651939C2 (ru) * 2016-04-12 2018-04-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) Подкожный ксенографт клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией NRAS для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств
US11040027B2 (en) 2017-01-17 2021-06-22 Heparegenix Gmbh Protein kinase inhibitors for promoting liver regeneration or reducing or preventing hepatocyte death

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106214699B (zh) 不同亚型中国乳腺癌患者来源异种移植瘤模型的构建方法及应用
CN108753831A (zh) 利用nk/t淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型
MY201555A (en) Combinations of an anti-her2 antibody-drug conjugate and chemotherapeutic agents, and methods of use
Osminkina et al. Silicon nanoparticles as amplifiers of the ultrasonic effect in sonodynamic therapy
Siu et al. Establishment and characterization of a primary human chordoma xenograft model
CN104800243B (zh) 一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用
RU2572569C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ КСЕНОГРАФТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel Cher С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ТАРГЕТНЫХ СРЕДСТВ
Winkler et al. Anodal transcranial direct current stimulation enhances survival and integration of dopaminergic cell transplants in a rat Parkinson model
CN108835051A (zh) 利用淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷裸鼠模型
CN115305257B (zh) 一种肝细胞-胆管细胞混合型肝癌小鼠模型及其构建方法
Chen et al. Biomimetic Nanoplatforms for Combined DDR2 Inhibition and Photothermal Therapy in Dense Breast Cancer Treatment
RU2388064C1 (ru) Способ воспроизведения злокачественного процесса в эксперименте
Jin et al. Combination of GNRs-PEI/cGAMP-laden macrophages-based photothermal induced in situ tumor vaccines and immune checkpoint blockade for synergistic anti-tumor immunotherapy
Bogaerts et al. Microsurgical access for cell injection into the mammalian cochlea
Nikitina et al. Study of genetic stability of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells
CN101831405A (zh) 肺靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法
Goldman et al. Long-term outcome after allogeneic hematopoietic cell transplantation (HCT) for CML
Emelyanov et al. Model acupuncture point: bone marrow-derived stromal stem cells are moved by a weak electromagnetic field
US12263182B2 (en) Method of introducing an mRNA molecule into a cell
CN101831404A (zh) 淋巴结靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法
CN103898043A (zh) 细胞饲养层及其在培养人原代肿瘤细胞中的应用
Meerovich et al. Study of action of cyclophosphamide and extract of mycelium of Pleurotus ostreatus in vivo on mice, bearing melanoma B16-F0-GFP
Kropp et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits
RU2651939C2 (ru) Подкожный ксенографт клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией NRAS для доклинического изучения противоопухолевых таргетных средств
Morioka et al. Subcutaneously inoculated cells and implanted pancreatic cancer tissue show different patterns of metastases in Syrian golden hamsters

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20171128