RU2572333C1 - Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью(варианты) - Google Patents
Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью(варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2572333C1 RU2572333C1 RU2014143589/15A RU2014143589A RU2572333C1 RU 2572333 C1 RU2572333 C1 RU 2572333C1 RU 2014143589/15 A RU2014143589/15 A RU 2014143589/15A RU 2014143589 A RU2014143589 A RU 2014143589A RU 2572333 C1 RU2572333 C1 RU 2572333C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- prosthesis
- solution
- polymer
- protein
- electrospinning
- Prior art date
Links
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 88
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 59
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 43
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 36
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 36
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 24
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 24
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 24
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 11
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 7
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 7
- -1 polybutylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 7
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 5
- 229920001707 polybutylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 5
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 55
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920004936 Lavsan® Polymers 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 229920000520 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) Polymers 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-IMJSIDKUSA-N 4511-42-6 Chemical compound C[C@@H]1OC(=O)[C@H](C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N pentaneperoxoic acid Chemical compound CCCCC(=O)OO UQGPCEVQKLOLLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009864 tensile test Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical compound O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины. Описан способ, который включает растворение исходного синтетического полимера и белка в гексафторизопропаноле, смешивание раствора полимера с раствором белка в соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), при этом согласно первому варианту на первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора полученной композиции, затем сформированный внутренний слой протеза пропитывают раствором белка в концентрации 1,0-5,0%, а на втором этапе на сформированный внутренний слой наносят оставшиеся 90-99% раствора композиции и формируют внешний слой протеза. По второму варианту способа на сформированный внутренний слой протеза, составляющий 0,1-90,0% от заданной толщины стенки протеза, наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и формируют промежуточный слой, составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза, на который затем наносят оставшийся объем раствора композиции и формируют внешний слой протеза, составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза, при этом для формирования внутреннего и внешнего слоя протеза могут быть использованы разные полимеры. Технический результат: получение протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью, улучшение прочностных и эластических характеристик, а также повышение био- и гемосовместимости протезов сосудов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.
Description
Группа изобретений относится к области медицины и тканевой инженерии, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использована при изготовлении протезов сосудов малого диаметра (до 6 мм), предназначенных для хирургической реконструкции периферических/коронарных кровеносных сосудов.
Большинство используемых тканных, плетеных или вязаных протезов сосудов из синтетических материалов, таких как лавсан или политетрафторэтилен, имеют ряд серьезных недостатков, основным из которых является образование слоя неоинтимы и инициация процессов, приводящих к уменьшению и закупориванию просвета протеза (A. Lafont, et al, Circulation Research, 1995, V. 76. P. 996-1002).
Одной из принципиальных причин недостаточной био- и гемосовместимости таких протезов является высокая хирургическая пористость протезов, составляющая от 10-20 до 2000 мл/мин, определяемая по ГОСТ Ρ 51556-2000. Такие протезы быстро пропитываются кровью, стенки протезов и их анастомозы с нативной артерией герметизируются за счет свертывания аутокрови, что приводит к повышенной интраоперационной кровопотере. Кроме того, формирование парапротезной гематомы в условиях постоянного присутствия в ране инородного материала повышает риск инфицирования имплантированного сосуда, а формирование тромбов в стенке протеза и микротромбов на внутренней поверхности способствует развитию воспаления, росту неоинтимы, блокирует миграцию клеток в стенку протеза, формирование соединительнотканной основы в стенке протеза и экстрапротезной соединительной капсулы.
Плетеные, вязаные и нетканые протезы имеют неровную, ворсистую поверхность, что дополнительно замедляет ток крови и инициирует утолщение стенки протеза с внутренней стороны из-за плохой адгезии и пролиферации на такой поверхности эндотелиальных клеток и их предшественников, которые не способны сформировать на такой поверхности однослойный эндотелий. Протезы из пористого политетрафторэтилена, напротив, имеют давление пропитывания 120-350 мм рт.ст. (ГОСТ Ρ 51556-2000), имеют изолированные полости и плохую биосовместимость в силу плохой диффузии белков и низкомолекулярных веществ крови, плохого прорастания клетками тканей и эндотелия и также, как и плетеные/вязаные/нетканые протезы, низкую эластичность и, таким образом, плохую механическую совместимость с сосудистой стенкой.
Для того чтобы улучшить биосовместимость материалов, повысить эффективность адгезии и пролиферации клеток была предпринята попытка изготовить материалы из волокон разного диаметра (от 0,117 до 1,647 микрон) методом электроспиннинга (M. Chen, et al. Tissue Engineering, 2007, V. 13. P. 579-587).
Принцип метода электроспиннинга заключается в образовании волокон в сильном электрическом поле, образованном между двумя электродами противоположной полярности. При этом раствор или расплав полимерного материала подается из электрода-фильеры с заданной скоростью. Раствор полимера при выходе из шприца растягивается в электрическом поле и превращается в полимерные нити (растворитель испаряется), которые собираются на вращающийся металлический коллектор (электрод-коллектор), являющийся вторым электродом, образуя пористый материал (H. Wu, et al. J Mater Sci: Mater Med, 2010, V. 21. P. 3207-3215).
Однако полученные с помощью электроспиннинга материалы обладают высокой проницаемостью для клеток крови. Например, исследование матриксов из поликапролактона, полученных с помощью электроспиннинга, показало, что размер пор варьирует от 56.442±26.28 до 69.228±29.647, что в терминах проницаемости составляет не менее 20 мл/см2/мин, т.е. через стенку такого протеза легко проходят клетки крови.
Известен способ получения протезов сосудов методом электроспиннинга из сополимера L-лактида с капролактоном (J. Lee, et al. Biomaterials, 2008, V. 29. P. 1872-1879), включающий изготовление протезов электроспиннингом из растворов с разной концентрацией синтетического полимера и желатина, с последующей обработкой полученных изделий водорастворимым карбодиимидом. Полученные протезы хорошо поддерживали адгезию и пролиферацию клеток, имели хорошие механические свойства.
Однако пористость протезов, полученных известным способом, составляет (по данным меркуриметрии) 50-70%, что с учетом толщины волокна 1÷1,5 микрон соответствует проницаемости не менее 20 мл/см2/мин, т.е. такие протезы легко проницаемы для клеток крови и не обеспечивают нулевую хирургическую порозность. Кроме того, сшивка белков в описанных авторами условиях малоэффективна; авторы не провели динамических испытаний механических свойств протезов.
Для уменьшения пористости тканых и нетканых протезов сосудов используется пропитывание биополимерами, такими как белки и полисахариды, или синтетическими полимерами. Наиболее часто для такой обработки используется желатин - дешевый и доступный гидролизат коллагенов, не индуцирующий иммунные реакции (M. Li, et al. Biomaterials, 2005, V. 26. P. 5999-6008).
Известен, например, способ обработки протезов сосудов, включающий обработку текстильной основы водным раствором глутарового альдегида в концентрации 0,5-0,75% в течение 2-3 мин с последующей инкубацией в растворе желатина с концентрацией 5,0-7,5 мас.% в 0,9% растворе хлорида натрия с антибиотиками и 20-30% глицерином при температуре 40-55°С в течение 2-5 мин с последующей пропиткой и высушиванием протеза в течение суток при комнатной температуре (патент RU 2470671 C1, опубл. 27.12.2012). Протез непроницаем при давлении до 300 мм рт.ст., однако на примере протезов кровеносных сосудов марки "Gelsoft" (Vascutek, Шотландия) известно, что желатиновая пропитка полностью растворяется в организме человека в течение двух недель, т.е. выполняет только временную гемостатическую функцию. Кроме того, белковый матрикс не связан ковалентно с основой протеза и поэтому не отличается стабильностью и не способствует нормальной эндотелизации протеза, а большое количество использованного для пропитки чужеродного белка может стимулировать развитие иммунных реакций.
Известен способ подготовки фторлон-лавсанового протеза сосуда, заключающийся в том, что синтетический фторлон-лавсановый протез стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 45 минут, инкубируют в течение 5 минут в 76% этиловом спирте, высушивают в течение 3 минут до полного испарения спирта, и инкубируют в стерильном водном растворе аутофибриногена с гепарином (соотношение 1 мг/20 ЕД) в течение 5 мин (патент RU 2216296 C1, опубл. 20.11.2003). После этого протез замораживают на тефлоновом стержне до температуры -40°С и лиофильно высушивают. Обработанный таким образом протез приобретает временную нулевую хирургическую порозность.
Известный способ отличается сложностью, требует специальных стерильных условий, фибриноген является специфическим белком воспаления и, следовательно, может стимулировать стенозирование, фибриноген не имеет ковалентных связей со стенкой протеза и в условиях постоянно меняющейся нагрузки может отслаиваться от основы, процесс отличается низкой технологичностью, стадии процесса плохо воспроизводимы и контролируемы.
Таким образом, все известные на сегодняшний день способы уменьшения пористости сосудистого протеза обеспечивают слабую фиксацию белка на синтетической основе, выполняют только временную герметизирующую функцию, не способствуют формированию новой биологически инертной внутренней выстилки синтетического протеза и миграции в стенку протеза клеток внешних тканей, повышающих биосовместимость протезов.
Наиболее ближайшим к заявляемой группе изобретений - прототипом, является способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого имплантата малого диаметра, включающий использование биодеградируемой полимерной композиции, полученной путем смешивания в хлороформе полигидроксибутирата (ПГБВ) с молекулярной массой 2307 кДа с включением оксивалериата от 8.5% до 37% и эпсилон-поликапролактона (ПКЛ) с молекулярной массой 80000 кДа, и выполненный методом двухстадийного электроспиннинга, где размер пор между хаотично расположенными нитями составляет 30-150 мкм, при этом соотношение полимеров в сухой смеси композиции ПГБВ : ПКЛ составляет 23.1-36.4:76.9-63.6, при этом на первом этапе электроспиннинга к раствору полимера добавляют коллаген IV типа в концентрации 100 мкг на 1 мл раствора и человеческий фибронектин в концентрации 10 мкг на 1 мл композиции, а второй этап электроспиннинга осуществляют с использованием полимерной композиции, дополненной фактором роста фибробластов в концентрации 0.01 мкг на 1 мл раствора (патент RU 2504406 С1, опубл. 20.01.2014).
Недостатками известного способа являются высокая пористость стенки протеза, недостаточная размерная стабильность, недостаточная прочность, а также недостаточная био- и гемосовместимость протезов сосудов.
Задачей группы изобретений является снижение пористости, улучшение механических характеристик и повышение био- и гемосовместимости протезов сосудов, изготовленных методом электроспиннинга.
Технический результат: получение протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью, улучшение механических характеристик, а также повышение био- и гемосовместимости протезов сосудов.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом (варианты), заключающимся в следующем:
Изготовление протезов сосудов осуществляют методом электроспиннинга со следующими параметрами: напряжение - 20 кВ, скорость подачи раствора полимеров - 1,5 мл/час, расстояние между иглой и коллектором - 20 см, скорость вращения коллектора - 300 об/мин.
Предварительно готовят раствор полимера и белка. Для этого синтетический полимер смешивают с гексафторизопропанолом (ГФИП) до конечной концентрации 7,0-15,0%, а выбранный белок - до конечной концентрации 10,0-50,0%. Затем к раствору полимера добавляют раствор белка в массовом соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), и получают раствор композиции, готовый для изготовления протезов сосудов при помощи электроспиннинга. В качестве синтетического полимера может быть использован полимер, выбранный из группы, но не ограничиваясь: поликапролактон (ПКЛ), полибутилентерефталат (ПБТФ), полилактид-ко-гликолид, нейлон и т.д. В качестве белка может быть использован гелеобразующий белок, выбранный из группы, но не ограничиваясь: желатин, эластин, фибронектин и т.д.
Первый вариант способа. На первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор выбранного диаметра наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора композиции. Затем полученный слой протеза пропитывают 1,0-5,0% водным раствором белка из расчета 1-25 мкл/см2. Далее на сформированный внутренний слой протеза наносят оставшийся объем раствора композиции (при помощи электроспиннинга) и формируют внешний слой протеза сосуда, составляющий 90-99% от заданной толщины стенки протеза сосуда.
По завершении электроспиннинга заготовку протеза сосудов снимают с электрода-коллектора и инкубируют в буферном растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбоната натрия (NaHCO3), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез обрабатывают раствором бифункционального поперечно-сшивающего реагента, преимущественно 0,5-4,0% раствором глутарового альдегида, в этом же буфере в течение 1-3 часов с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушиванием.
Второй вариант способа.
На первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор выбранного диаметра наносят 0,1-90,0% от требуемого объема раствора композиции, затем на сформированный внутренний слой протеза наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в массовом соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и получают промежуточный слой, составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда. Далее на сформированный промежуточный слой протеза наносят оставшийся объем раствора композиции (при помощи электроспиннинга) и формируют внешний слой протеза, составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза сосудов. При этом для формирования внутреннего и внешнего слоя протеза на первом и третьем этапах электроспиннинга могут быть использованы разные полимеры
Таким образом, второй вариант способа отличается от первого варианта тем, что вместо пропитки внутреннего слоя 1,0-5,0% раствором белка на него наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1:3)-(1:7), и получают промежуточный слой протеза (составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда), на который наносят оставшийся объем раствора композиции и формируют внешний слой протеза (составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза сосудов), при этом для формирования внутреннего и внешнего слоя протеза могут быть использованы разные полимеры.
Заявляемый способ позволяет получать протезы сосудов с любой требуемой проницаемостью, причем низкопористый (малопроницаемый) слой по данным динамических гидравлических испытаний сохраняется в течение не менее чем 500000 циклов нагрузки 100-200 мм рт.ст. Кроме того, протезы с таким слоем демонстрируют нулевую хирургическую порозность (не проницаемы для клеток крови), менее склонны к формированию неоинтимы и обеспечивают достоверно более высокую проходимость при длительном времени функционирования.
Существенными отличительными признаками первого варианта предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:
1. В качестве растворителя для синтетических полимеров и белка используют гексафторизопропанол (ГФИП), что позволяет приготавливать растворы синтетических полимеров с высоким содержанием белка и формировать волокна толщиной менее 1 микрона, создающие оптимальную поверхность для адгезии клеток.
2. На первом этапе электроспиннинга для получения внутреннего низкопористого слоя (стенки) протеза сосуда на электрод-коллектор наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора композиции, что позволяет сформировать тонкий малопроницаемый слой протеза, обеспечивающий эффективную миграцию в стенки протеза клеток из прилегающих тканей и быструю наработку внеклеточного матрикса в стенке протеза.
3. Полученный внутренний слой протеза сосуда пропитывают раствором белка в концентрации 1,0-5,0% из расчета 1-25 мкл/см2, а затем на сформированный внутренний слой протеза наносят оставшиеся 90-99% от требуемого объема раствора композиции и формируют внешний слой протеза сосудов, что позволяет обеспечить нулевую хирургическую порозность, уменьшить кровопотери во время операции, исключить тромбообразование, повысить гемо- и биосовместимость протеза, выражающуюся в формировании существенно более тонкого слоя неоинтимы в близкой и отдаленной перспективах.
4. Полученный протез сосудов обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом, преимущественно 0,5-4,0% раствором глутарового альдегида, с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина, что позволяет повысить прочность, эластичность и долговечность внутреннего слоя, а также размерную стабильность всего протеза за счет формирования прочных химических связей в синтетических волокнах.
Существенными отличительными признаками второго варианта способа по сравнению с первым вариантом являются:
1. Вместо пропитки внутреннего слоя 1,0-5,0% водным раствором белка на него наносят раствор композиции (на требуемом расстоянии от внутреннего просвета протеза), содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и получают промежуточный слой протеза, составляющий 1,0-10% от заданной толщины стенки протеза сосуда, что позволяет регулировать пористость и структуру протезов сосудов, что приводит к улучшению гемо- и биосовместимости таких протезов.
2. Для формировании внутреннего и внешнего слоя протеза на первом и третьем этапах электроспиннинга могут быть использованы разные полимеры, выбранные из группы, но не ограничиваясь: поликапролактон (ПКЛ), полибутилентерефталат (ПБТФ), полилактид-ко-гликолид, нейлон и т.д., что позволяет обеспечить нормальную эндотелизацию протеза, регулировать шероховатость, прочность и скорость биодеградации протезов сосудов.
Предлагаемый способ позволяет с минимальными затратами сформировать внутренний или промежуточный низкопористый (малопроницаемый) слой протеза сосудов и повысить прочность стенки протеза сосудов в 1,3÷1,5 раза по сравнению с прототипом за счет высокого содержания белка в смеси полимера.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1
Первый вариант способа. 500 мг поликапролактона (ПКЛ) растворили в 9 мл гексафтоизопропанола (ГФИП) при перемешивании и комнатной температуре и получили 7% раствор. Затем к 9 мл приготовленного 7% раствора ПКЛ добавили 1 мл 5% раствора желатина в гексафтоизопропаноле (массовое соотношение ПКЛ : желатин равно 9:1, концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%) и тщательно перемешали полученный раствор. Стерильный шприц заполнили 0,75 мл готовой композицией, состоящей из ПКЛ и желатина в ГФИП, и запустили первый этап процесса изготовления протеза (2 мин, 10% от необходимого объема раствора композиции) при следующем режиме: напряжение - 20 кВ, скорость подачи полимерной композиции - 1,5 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора - 300 об/мин. Сформировали внутренний слой протеза с диаметром 1,7 мм и толщиной 20 мкм длиной 85 мм. На сформированный внутренний слой протеза нанесли 150 мкл 2% водного раствора желатина, нагретого до температуры 37°С, и разровняли раствор вдоль заготовки протеза, одновременно вращая электрод-коллектор для равномерного распределения раствора по длине заготовки протеза. После пропитывания продолжили процесс электроспиннинга в том же режиме, для чего на сформированный внутренний слой протеза нанесли оставшийся объем раствора композиции (0,675 мл) и сформировали внешний слой протеза, составляющий 90% от заданной толщины стенки протеза сосудов.
По завершении электроспиннинга заготовку протеза сосудов сняли с электрода-коллектора, инкубировали в растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбоната натрия (NaHCO3), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез перенесли в свежеприготовленный раствор 4,0% глутарового альдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончании инкубации в реакционную смесь внесли 1/10 объема 0,1 M раствора, содержащего глицин, оттитрованный соляной кислотой (глицин/HCl) до рН=9.0, инкубировали в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп, затем внесли 1/10 объема раствора боргидрида натрия (NaBH4) в концентрации 4 мг/мл и инкубировали 20 минут. После инкубации заготовку протеза сосудов отмыли 5-ю сменами апирогенной дистиллированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистиллированной водой с 2% глицерином и высушили на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).
В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубку из ПКЛ с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм, который может быть сегментирован на необходимую длину для конкретного применения при хирургических операциях. Исследование полученного протеза сосудов методом сканирующей электронной микроскопии (фиг. 1) показало, что в протезе сформирован внутренний уплотненный слой толщиной 15±3 микрона.
Пример 2
Первый вариант способа. 500 мг ПКЛ растворили в 9 мл ГФИП при комнатной температуре и перемешивании. Затем к 9 мл полученного 7% раствора ПКЛ добавили 1 мл 12,5% раствора желатина в ГФИП при перемешивании (массовое соотношение ПКЛ : желатин равно 7:3, концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%). Стерильный шприц заполнили 0,75 мл раствора композиции, состоящей из ПКЛ и желатина в ГФИП, и запустили первый этап электроспиннинга (2% от объема раствора композиции) при следующем режиме: напряжение - 20 кВ, скорость подачи полимерной композиции - 1,5 мл/час, скорость вращения электрода-коллектора - 300 об/мин. Сформировали внутренний слой протеза с диаметром 1,7 мм и длиной 80 мм.
На сформированный внутренний слой протеза нанесли 50 мкл 5% водного раствора желатина и разровняли раствор вдоль заготовки протеза, одновременно вращая коллектор для равномерного распределения раствора по длине заготовки протеза. На втором этапе электроспиннинга, в том же режиме, на сформированный внутренний слой протеза нанесли оставшийся объем раствора композиции (0,735 мл) и сформировали внешний слой протеза сосуда, составляющий 98% от заданной толщины стенки протеза сосуда.
По завершении электроспиннинга заготовку протеза сняли с электрода-коллектора инкубировали в растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбонат натрия (NaHCO3), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез сосудов перенесли в свежеприготовленный раствор 0,5% глутарового альдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончании инкубации в реакционную смесь внесли 1/10 объема 0,1 M раствора, содержащего глицин, оттитрованный соляной кислотой до (глицин/HCl), рН=9.0, смесь инкубировали в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп, затем внесли 1/10 объема раствора боргидрида натрия (NaBH4) в концентрации 4 мг/мл и инкубировали еще 20 минут. После инкубации протез отмыли 5-ю сменами апирогенной дистиллированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистиллированной водой с 2% глицерином и высушили на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).
В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из ПКЛ с толщиной стенки 150 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 80 мм.
Пример 3
Процедуру изготовления протеза сосудов осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве полимера использовали 15% раствор полибутилентерефталата (ПБТФ), а в качестве белка использовали 10% раствор водорастворимого эластина. Для электроспиннинга приготавливали композицию, содержащую смесь ПБТФ и эластина, взятых в массовом соотношении, равном 8:2 (концентрация ПБТФ в растворе в пересчете на сухой вес составила 10%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из ПБТФ с толщиной стенки 150 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 80 мм.
Пример 4
Процедуру изготовления протеза сосудов осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве полимера использовали 15% раствор полилактид-ко-гликолида, а в качестве белка использовали 20% раствор фибронектина. Для электроспиннинга готовили композицию, содержащую смесь полилактид-ко-гликолида и фибронектина, взятых в массовом соотношении, равном 7:3 (концентрация полилактид-ко-гликолида в растворе в пересчете на сухой вес составила 10%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из полилактид-ко-гликолида с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.
Пример 5
Процедуру изготовления протеза сосудов осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве полимера использовали 15% раствор нейлона, а в качестве белка использовали 12,5% раствор желатина. Для электроспиннинга готовили композицию, содержащую смесь нейлона и желатина, взятых в массовом соотношении, равном 9:1 (концентрация нейлона в пересчете на сухой вес составила 7%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубочку из нейлона с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.
Пример 6
Второй вариант способа. 500 мг ПКЛ растворили в 9 мл ГФИП при перемешивании и комнатной температуре и получили 7% раствор. Затем к 9 мл приготовленного 7% раствора ПКЛ добавили 1 мл 5% раствора желатина в ГФИП (массовое соотношение ПКЛ : желатин равно 9:1, концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%) и тщательно перемешали полученный раствор. Стерильный шприц заполнили 0,75 мл готовой композиции, состоящей из ПКЛ и желатина в ГФИП, запустили первый этап процесса изготовления протеза (2 мин, 10% необходимого объема раствора композиции (0,075 мл), и сформировали внутренний слой протеза с диаметром 1,7 мм и длиной 85 мм.
Далее на сформированный внутренний слой протеза нанесли электроспиннингом 0,075 мл раствора композиции, содержащей ПКЛ : желатин в массовом соотношении, равном 1:1 (концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%), и получили промежуточный слой протеза, составляющий 10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда. Затем продолжили процесс электроспиннинга: на сформированный промежуточный слой протеза нанесли оставшийся объем раствора композиции (0,6 мл) и сформировали внешний слой протеза сосуда, составляющий 80% от заданной толщины стенки протеза сосуда.
По завершении электроспиннинга заготовку протеза сосудов сняли с электрода-коллектора, инкубировали в растворе, содержащем 0,05 M гидрокарбоната натрия (NaHCO3), рН 9.0 в течение 5 минут, затем протез сосуда перенесли в свежеприготовленный раствор 4,0% глутарового альдегида в этом же буфере и инкубировали в течение 2 часов. По окончании инкубации в реакционную смесь внесли 1/10 объема 0,1 M раствора, содержащего глицин в соляной кислоте (глицин/HCl) рН=9.0, инкубировали смесь в течение 10-15 минут для блокировки оставшихся альдегидных групп, затем внесли 1/10 объема раствора боргидрида натрия (NaBH4) в концентрации 4 мг/мл и инкубировали еще 20 минут. После инкубации заготовку протеза сосудов отмыли 5-ю сменами апирогенной дистиллированной воды (по 5 минут, 5-10 мл на один протез/одну смену), 1 раз апирогенной дистиллированной водой с 2% глицерином и высушили на воздухе в стерильном месте (ламинарном боксе).
В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубку из ПКЛ с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.
Пример 7
Второй вариант способа осуществили аналогично примеру 6, за исключением того, что для изготовления внутреннего слоя протеза сосудов использовали композицию, состоящую из смеси полилактид-ко-гликолида и желатин, взятых в массовом соотношении, равном 9:1 (концентрация полилактид-ко-гликолида в растворе в пересчете на сухой вес составила 10%); для изготовления промежуточного слоя протеза использовали композицию, состоящую из смеси ПКЛ и желатина, взятых в массовом соотношении, равном 3:7 (концентрация ПКЛ в пересчете на сухой вес составила 5%); а для изготовления внешнего слоя протеза сосудов использовали композицию, состоящую из смеси ПКЛ и желатина, взятых в массовом соотношении, равном 9:1 (концентрация ПКЛ в растворе в пересчете на сухой вес составила 5%). В результате получили протез сосудов, представляющий собой трубку с толщиной стенки 180 мкм (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 85 мм.
Были исследованы физико-механические свойства протезов сосудов, полученных по примерам 1-7.
Для измерения «пористости» в процессе изменяющейся гидравлической нагрузки протезы вымачивали в дистиллированной воде в течение 20 минут и измеряли пористость в соответствии с ГОСТ Р 51556-2000. Пористость протезов сосудов без малопроницаемого слоя составляла не менее 10-30 мл, пористость протезов с малопроницаемым слоем из белка составляла 0,2÷0,5 мл.
Для тестирования стабильности малопроницаемого слоя в условиях изменяющейся гидравлической нагрузки протез сосуда устанавливали в гидравлический стенд, состоящий из резервуара для создания избыточного давления, системы установки и поддержания избыточного давления (120 мм рт.ст.), впускного и выпускного клапанов, контроллера, управляющего клапанами, и компьютерной программы, управляющей контроллером. Цикл нагрузки включал подачу давления (500 мс), удержание (100 мс), стравливание давления (200 мс) и временной разрыв (50 мс). Обнаружено, что 100000 циклов гидравлической нагрузки не приводят к изменению проницаемости протезов сосудов с малопроницаемым внутренним слоем, что демонстрирует высокую стабильность полученной структуры протеза сосудов.
Для исследования диффузии низко- и высокомолекулярных веществ через стенку протез сосуда длиной 2 см заполняли 0,265 мМ раствора флуоресцеина или 15 мкМ раствора флуоресцентно-меченого бычьего сывороточного альбумина в физрастворе, протез погружали физиологический раствор и измеряли скорость изменения концентрации флуоресцеина или флуоресцентно-меченого альбумина во внешней камере объемом 3 мл. Было показано, что коэффициент диффузии для флуоресцеина составляет 0,8×10-11 см2/с, а для альбумина - 0,22×10-14 см2/с. Таким образом, малопроницаемый слой, будучи непроницаем для клеток крови, легко проницаем для низкомолекулярных и для высокомолекулярных веществ и не затрудняет транспорт питательных веществ из крови в стенку протеза и окружающую ткань.
Для сравнения прочностных характеристик протезов сосудов, содержащих и не содержащих малопроницаемый внутренний слой, были проведены механические испытания образцов.
Механические свойства протезов сосудов, изучали, как описано в ГОСТ 51556-2000, с использованием универсальной разрывной машины для испытания материалов Zwick/Roell Z100 (Германия) при постоянной скорости приложения силы 10 мм/мин. Прочность протеза сосуда на прорыв ниткой измеряли, как описано в (Schaner P.J., et al, Journal of vascular surgery, 2004). Было показано, что формирование малопроницаемого внутреннего слоя не влияет на прочность протезов сосудов: прочность на разрыв составляет 2,2÷2,5 МПа, прочность на прорыв ниткой составляла в 160±20 грамм силы.
Биосовместимость исследовали в условия in vitro на протезах сосудов, полученных по примерам 1-7. Было установлено, что эндотелиальные клетки хорошо адгезируют и активно пролиферируют на поверхности материалов с малопроницаемым слоем. При инкубации первичных фибробластов с внешним слоем протезов сосудов не было обнаружено разницы в адгезии и пролиферации этих клеток на поверхности волокон.
В условиях in vivo были исследованы протезы сосудов, полученные по примерам 6 и 7.
В качестве контроля были использованы протезы сосудов, состоящие из ПКЛ (тип а). Тип б - протез сосудов, полученный по примеру 6; тип в - протез сосудов, полученный по примеру 7. Протезы сосудов (типы б и в) содержат малопроницаемый слой. Такие типы протезов сосудов были имплантированы в брюшную аорту крыс линии Wistar (по 15 животных на каждый тип протез сосудов).
За проходимостью протезов следили при помощи MP-томографии с использованием томографа «BioSpec 117/16USR» (Bruker, Germany) и двойного ультразвукового сканирования на установке (Vivid I, GE). При длительном наблюдении (от 2 до 19-20 недель) проходимость протезов сохранялась при отсутствии специальной послеоперационной антитромботической терапии (антикоагулянты и дезагреганты). Эти наблюдения подтверждают высокую тромборезистентность изготовленных сосудистых протезов.
Интраоперационно было показано, что протезы сосудов с малопроницаемым внутренним слоем (типы б и в) в процессе имплантации не пропитываются кровью. Микроскопическое исследование проводили при помощи обзорной микроскопии на бинокулярном микроскопе Stereo Discovery VI2 (ZEISS, Germany)
На фиг. 2 представлены фотографии световой микроскопии в отраженном свете (А, Б) и фотография флуоресцентной микроскопии (В) эксплантированных протезов сосудов, где: А - протез сосудов типа а, Б - протез сосудов типа б, В - флуоресцентная микроскопия протеза сосуда типа 6, где клетки окрашены SiberGreen I. На фиг. 2 видно, что клетки окружающих тканей быстро мигрируют в стенку протеза (Фиг. 2, В) и формируют соединительно-тканную капсулу.
При оценке степени формирования неоинтимы было обнаружено, что протезы сосудов с малопроницаемым слоем (типы б и в) образуют более тонкую неоинтиму, по сравнению с протезами сосудов типа а, как на 2-й, так и на 19-20 неделе после имплантации. Средняя толщина стенки протезов сосудов типа а на 20 неделе составила 374±99 микрометра против 261±56 микрометра для протезов сосудов типа в. Кроме того, в процессе функционирования протезы типа а увеличивались в диаметре в 1,2-1,3 раза, в то время как сосуды типов б и в сохраняли исходный диаметр.
При проведении иммуногистохимического анализа (окраска Isolectin) выявлено, что процесс васкуляризации на 2-й неделе после имплантации в протезах сосудов типа в наиболее выражен, по сравнению с протезами сосудов типа а, в котором на 4-й неделе видны небольшие признаки неоваскуляризации. Анализ срезов показал, что количество клеток (в большей степени гладкомышечных клеток, в меньшей эндотелиальных) на внутренней и внешней (гладкомышечных клеток) поверхностях протезов сосудов типа а увеличивается в зависимости от времени, которое протез провел в организме. Активная выработка фибронектина и коллагена в исследуемых протезах свидетельствует о жизнедеятельности клеток. Предварительные данные экспериментов in vivo демонстрируют высокую био- и гемосовместимость протезов сосудов с непроницаемым внутренним слоем.
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать микроволокнистые протезы, которые имеют низкую пористость, улучшенные прочностные и эластические характеристики, а также отличаются высокой био- и гемосовместимостью для использования в медицинской практике. Процедура изготовления протезов отличается простотой, воспроизводимостью и технологичностью.
Claims (4)
1. Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью путем электроспиннинга, включающий растворение исходного синтетического полимера в растворителе, смешивание раствора полимера с раствором белка и проведение первого этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор полученной композиции и формированием внутреннего слоя протеза сосуда, затем проведение второго этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор оставшегося раствора композиции и формирование внешнего слоя протеза сосуда, отличающийся тем, что раствор полимера смешивают с раствором белка в соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), затем на первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор наносят 1,0-10,0% от требуемого объема раствора полученной композиции, далее сформированный внутренний слой протеза пропитывают 1,0-5,0% водным раствором белка из расчета 1-25 мкл/см2 и осуществляют второй этап электроспиннинга путем нанесения на сформированный внутренний слой оставшегося 90-99% раствора композиции и формируют внешний слой протеза, далее полученный протез сосудов обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушиванием, при этом в качестве полимера используют полимер, выбранный из группы: поликапролактон, полибутилентерефталат, полилактид-ко-гликолид, нейлон, в качестве белка используют гелеобразующий белок, выбранный из группы: желатин, эластин, фибронектин, а в качестве растворителя для полимера и белка используют гексафторизопропанол.
2. Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью путем электроспиннинга, включающий растворение исходного синтетического полимера в растворителе, смешивание раствора полимера с раствором белка и проведение первого этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор полученной композиции и формированием внутреннего слоя протеза сосуда, затем проведение второго этапа электроспиннинга и формирование малопроницаемого слоя в структуре протеза сосудов, проведение третьего этапа электроспиннинга путем нанесения на электрод-коллектор оставшегося раствора композиции и формирование внешнего слоя протеза сосуда, отличающийся тем, что раствор полимера смешивают с раствором белка в соотношении полимер : белок, равном (7-9):(1-3), затем на первом этапе электроспиннинга на электрод-коллектор наносят 0,1-90,0% от требуемого объема раствора полученной композиции, далее на сформированный внутренний слой протеза наносят раствор композиции, содержащей смесь полимера и белка в соотношении полимер : белок, равном (1-3):(1-7), и получают промежуточный слой, составляющий 1,0-10,0% от заданной толщины стенки протеза сосуда, на который затем наносят оставшийся объем раствора композиции и формируют внешний слой протеза, составляющий 9,0-98,9% от заданной толщины стенки протеза, далее полученный протез сосуда обрабатывают бифункциональным сшивающим реагентом с последующей дезактивацией реакционно-способных групп обработкой щелочным раствором глицина и высушиванием, при этом в качестве полимера используют полимер, выбранный из группы: поликапролактон, полибутилентерефталат, полилактид-ко-гликолид, нейлон, в качестве белка используют гелеобразующий белок, выбранный из группы: желатин, эластин, фибронектин, а в качестве растворителя для полимера и белка используют гексафторизопропанол.
3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что полученный протез сосудов обрабатывают 0,5-4,0% раствором глутарового альдегида в буферном растворе, содержащем 0,05 М NaHCO3, pH 9.0.
4. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что дезактивацию реакционно-способных групп осуществляют путем инкубации протеза сначала в ОДМ буферном растворе, содержащем глицин/HCl, pH=9.0, а затем в растворе боргидрида натрия (NaBH4) с концентрацией 4 мг/мл.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014143589/15A RU2572333C1 (ru) | 2014-10-28 | 2014-10-28 | Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью(варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014143589/15A RU2572333C1 (ru) | 2014-10-28 | 2014-10-28 | Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью(варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2572333C1 true RU2572333C1 (ru) | 2016-01-10 |
Family
ID=55072098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014143589/15A RU2572333C1 (ru) | 2014-10-28 | 2014-10-28 | Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью(варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2572333C1 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU173457U1 (ru) * | 2016-06-28 | 2017-08-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) | Биологический артериальный протез малого диаметра с наружным усилением |
| RU2630061C1 (ru) * | 2016-11-02 | 2017-09-05 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) | Способ изготовления трехслойного каркаса для протезирования желчного протока |
| RU176368U1 (ru) * | 2016-06-28 | 2018-01-17 | Закрытое акционерное общество "НеоКор" (ЗАО "НеоКор") | Биологический протез артерий с наружным усилением |
| RU2709621C1 (ru) * | 2019-05-06 | 2019-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК | Способ получения биорезорбируемого сосудистого протеза малого диаметра |
| RU2805590C1 (ru) * | 2023-04-20 | 2023-10-19 | Общество с ограниченной ответственностью "Тканевая инженерия и графты" (ТИиГрафты) | Способ изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра путем электроспиннинга и устройство для его осуществления |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2216296C1 (ru) * | 2002-04-10 | 2003-11-20 | Кузьмин Сергей Генрихович | Способ подготовки сосудистого фторлон-лавсанового протеза |
| RU2496526C1 (ru) * | 2012-04-06 | 2013-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ НИИ КПССЗ СО РАМН) | Тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра и способ его изготовления |
| RU2504406C1 (ru) * | 2012-11-21 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) | Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра |
-
2014
- 2014-10-28 RU RU2014143589/15A patent/RU2572333C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2216296C1 (ru) * | 2002-04-10 | 2003-11-20 | Кузьмин Сергей Генрихович | Способ подготовки сосудистого фторлон-лавсанового протеза |
| RU2496526C1 (ru) * | 2012-04-06 | 2013-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ НИИ КПССЗ СО РАМН) | Тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра и способ его изготовления |
| RU2504406C1 (ru) * | 2012-11-21 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) | Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU173457U1 (ru) * | 2016-06-28 | 2017-08-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) | Биологический артериальный протез малого диаметра с наружным усилением |
| RU176368U1 (ru) * | 2016-06-28 | 2018-01-17 | Закрытое акционерное общество "НеоКор" (ЗАО "НеоКор") | Биологический протез артерий с наружным усилением |
| RU2630061C1 (ru) * | 2016-11-02 | 2017-09-05 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) | Способ изготовления трехслойного каркаса для протезирования желчного протока |
| RU2709621C1 (ru) * | 2019-05-06 | 2019-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК | Способ получения биорезорбируемого сосудистого протеза малого диаметра |
| RU2805590C1 (ru) * | 2023-04-20 | 2023-10-19 | Общество с ограниченной ответственностью "Тканевая инженерия и графты" (ТИиГрафты) | Способ изготовления протезов кровеносных сосудов малого диаметра путем электроспиннинга и устройство для его осуществления |
| RU2845382C1 (ru) * | 2024-09-06 | 2025-08-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ получения сосудистого протеза малого диаметра со сниженной водопроницаемостью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | Fabrication of strong, bioactive vascular grafts with PCL/collagen and PCL/silica bilayers for small-diameter vascular applications | |
| US20210101946A1 (en) | High molecular weight silk fibroin and uses thereof | |
| Cipitria et al. | Design, fabrication and characterization of PCL electrospun scaffolds—a review | |
| Nadim et al. | Design and characterization of dexamethasone-loaded poly (glycerol sebacate)-poly caprolactone/gelatin scaffold by coaxial electro spinning for soft tissue engineering | |
| CN102277737A (zh) | 聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及应用 | |
| RU2496526C1 (ru) | Тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра и способ его изготовления | |
| JP6118905B2 (ja) | 心臓修復パッチの新しいスキャフォールド | |
| CN103736153A (zh) | 单层及双层聚己内酯基引导组织再生膜及其制备方法 | |
| Liu et al. | Dual-factor loaded functional silk fibroin scaffolds for peripheral nerve regeneration with the aid of neovascularization | |
| Amirian et al. | Designing of combined nano and microfiber network by immobilization of oxidized cellulose nanofiber on polycaprolactone fibrous scaffold | |
| van Uden et al. | A novel hybrid silk-fibroin/polyurethane three-layered vascular graft: towards in situ tissue-engineered vascular accesses for haemodialysis | |
| RU2572333C1 (ru) | Способ изготовления протезов сосудов малого диаметра с низкой пористостью(варианты) | |
| Cui et al. | Vascularization of LBL structured nanofibrous matrices with endothelial cells for tissue regeneration | |
| CN103876859A (zh) | 一种由微米纤维构成的具有大孔结构的人工血管及其制备方法与应用 | |
| Li et al. | Tough and VEGF-releasing scaffolds composed of artificial silk fibroin mats and a natural acellular matrix | |
| Ma et al. | Fiber configuration determines foreign body response of electrospun scaffolds: in vitro and in vivo assessments | |
| Park et al. | Tri-layered silk fibroin and poly-ɛ-caprolactone small diameter vascular grafts tested in vitro and in vivo | |
| JP7392952B2 (ja) | 多孔質体、中空材料、人工血管、及び、医療用材料 | |
| Sultana et al. | Physicochemical, in vitro and in vivo evaluation of VEGF loaded PCL‐mPEG and PDGF loaded PCL‐Chitosan dual layered vascular grafts | |
| Dorati et al. | Electrospun tubular vascular grafts to replace damaged peripheral arteries: A preliminary formulation study | |
| Xing et al. | Bilayer nicorandil-loaded small-diameter vascular grafts improve endothelial cell function via PI3K/AKT/eNOS pathway | |
| CN1919355A (zh) | 人造血管胶原蛋白预凝涂层 | |
| Ferrari et al. | Small diameter vascular grafts coated with gelatin | |
| GB2522749A (en) | Artificial tissue | |
| RU2845382C1 (ru) | Способ получения сосудистого протеза малого диаметра со сниженной водопроницаемостью |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201029 |