RU2569154C1 - Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths - Google Patents
Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths Download PDFInfo
- Publication number
- RU2569154C1 RU2569154C1 RU2014140764/10A RU2014140764A RU2569154C1 RU 2569154 C1 RU2569154 C1 RU 2569154C1 RU 2014140764/10 A RU2014140764/10 A RU 2014140764/10A RU 2014140764 A RU2014140764 A RU 2014140764A RU 2569154 C1 RU2569154 C1 RU 2569154C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mirna
- thyroid
- level
- mirnas
- sample
- Prior art date
Links
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 230000012010 growth Effects 0.000 title abstract 5
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 title abstract 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 79
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 66
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 48
- 208000013076 thyroid tumor Diseases 0.000 claims description 47
- 208000030878 follicular thyroid adenoma Diseases 0.000 claims description 12
- 206010033701 Papillary thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000030045 thyroid gland papillary carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000013066 thyroid gland cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000030901 thyroid gland follicular carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 206010016935 Follicular thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 claims description 3
- 208000009018 Medullary thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016842 benign thyroid gland neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 2
- 201000009741 thyroid Hurthle cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 17
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 14
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 12
- 201000004260 follicular adenoma Diseases 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 8
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000010882 preoperative diagnosis Methods 0.000 description 7
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 6
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 5
- 206010060999 Benign neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 201000010009 fetal adenoma Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000021738 Plummer disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 101150048834 braF gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 2
- 208000029481 thyroid gland fetal adenoma Diseases 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000854350 Enicospilus group Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000009453 Thyroid Nodule Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 208000030317 anaplastic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 201000009080 atypical follicular adenoma Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002985 oncosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000021808 thyroid gland atypical follicular adenoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии, и предназначено для быстрого определения типа злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) человека (папиллярный рак, медуллярный рак, фолликулярный рак, фолликулярная аденома) или типа доброкачественных новообразований.The invention relates to the field of molecular biology and medicine, in particular to oncology, and is intended to quickly determine the type of malignant neoplasms of the human thyroid gland (thyroid gland) (papillary cancer, medullary cancer, follicular cancer, follicular adenoma) or the type of benign neoplasms.
Узловые патологии ЩЖ доминируют по распространенности среди патологий эндокринной системы и встречаются, по различным данным, у 5-10% населения. Из них примерно 5% являются злокачественными и требуют оперативного вмешательства. Во многих регионах мира отмечается отчетливая тенденция роста заболеваемости раком ЩЖ. Самым распространенным типом рака ЩЖ является папиллярный рак (80-85% всех случаев). Фолликулярный рак встречается в 5-15% случаев, медуллярный рак - в 5% случаев. Плоскоклеточный рак и анапластический рак достаточно редко встречаются - в 0.2-0.7% и 0.1-1% случаев всех карцином, соответственно.Nodular thyroid pathologies dominate in prevalence among endocrine system pathologies and are found, according to various sources, in 5-10% of the population. Of these, approximately 5% are malignant and require surgical intervention. In many regions of the world, there is a clear tendency towards an increase in the incidence of thyroid cancer. The most common type of thyroid cancer is papillary cancer (80-85% of all cases). Follicular cancer occurs in 5-15% of cases, medullary cancer in 5% of cases. Squamous cell carcinoma and anaplastic cancer are quite rare - in 0.2-0.7% and 0.1-1% of cases of all carcinomas, respectively.
Наличие мутации гена BRAF, как диагностического и прогностического маркера, у пациентов с папиллярным раком ЩЖ, встречающейся по различным данным в 29.4-92.1% случаев, свидетельствует о более злокачественном течении заболевания, однако отсутствие мутации не означает отсутствие папиллярного рака [1].The presence of a BRAF gene mutation, as a diagnostic and prognostic marker, in patients with thyroid papillary cancer, which is found according to various sources in 29.4-92.1% of cases, indicates a more malignant course of the disease, but the absence of a mutation does not mean the absence of papillary cancer [1].
Точность дооперационной диагностики типа новообразования ЩЖ принципиально важна, поскольку именно диагноз определяет как объем оперативного вмешательства и последующего лечения, так и прогноз заболевания.The accuracy of preoperative diagnosis of a thyroid neoplasm type is fundamentally important, since it is the diagnosis that determines both the volume of surgical intervention and subsequent treatment, and the prognosis of the disease.
Наибольшие сложности связаны с дооперационной диагностикой фолликулярного рака ЩЖ, который в большинстве случаев не может быть дифференцирован от фолликулярной аденомы. Особенно сложно различить цитологически атипичную фолликулярную аденому от фолликулярной опухоли. Участки атипии в аденоме могут иметь различную степень выраженности и гетерогенности и по клеточной структуре такую фолликулярную аденому от фолликулярного рака отличить очень трудно. Окончательный диагноз в таких случаях ставится только после операции: диагностируют фолликулярный рак, если при гистологическом исследовании будет установлено прорастание опухоли в капсулу и сосудистая инвазия [2].The greatest difficulties are associated with the preoperative diagnosis of follicular thyroid cancer, which in most cases cannot be differentiated from follicular adenoma. It is especially difficult to distinguish between a cytologically atypical follicular adenoma and a follicular tumor. The sites of atypia in the adenoma can have varying degrees of severity and heterogeneity and it is very difficult to distinguish such a follicular adenoma from follicular cancer in the cellular structure. The final diagnosis in such cases is made only after surgery: a follicular cancer is diagnosed if, during histological examination, tumor growth into a capsule and vascular invasion are established [2].
В настоящее время основным методом диагностики является дооперационное цитологическое исследование биоптата опухоли.Currently, the main diagnostic method is preoperative cytological examination of a tumor biopsy specimen.
Известен стандартный способ дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ, включающий забор материала опухоли пациента путем аспирационной биопсии или вырезания фрагментов ткани опухоли, удаленной во время операции, приготовление препаратов для морфологического анализа - стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартную окраску для гистологического исследования и цитологическое исследование аномальных клеток опухоли ЩЖ [3].A standard method for differential diagnosis of thyroid tumors is known, including sampling the patient’s tumor material by aspiration biopsy or cutting out tumor tissue fragments removed during surgery, preparing preparations for morphological analysis — standard histological sections 5-6 μm thick, their standard color for histological examination and cytological investigation of abnormal thyroid tumor cells [3].
Способ не точный, не количественный, достаточно субъективный и требует большого практического опыта врачей при визуальной оценке структур опухоли и раковых клеток.The method is not accurate, not quantitative, rather subjective and requires great practical experience of doctors in the visual assessment of tumor structures and cancer cells.
В связи с необходимостью совершенствования подходов к дооперационному типированию патологий ЩЖ актуальной задачей является разработка способов диагностики новообразований ЩЖ с использованием биомаркеров.In connection with the need to improve approaches to the preoperative typing of thyroid pathologies, an urgent task is to develop methods for the diagnosis of thyroid neoplasms using biomarkers.
В качестве таких маркеров могут выступать микроРНК, представляющие собой короткие (18-24 нуклеотида) не кодирующие белок молекулы РНК, регулирующие экспрессию множества генов на посттранскрипционном уровне. МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма. Исследования последних лет показали, что микроРНК сами могут выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолевого роста, при развитии самых разнообразных опухолей, в том числе и новообразований ЩЖ, содержание многих микроРНК существенно изменяется.These markers can be microRNAs, which are short (18-24 nucleotides) non-protein-coding RNA molecules that regulate the expression of many genes at the post-transcriptional level. MicroRNAs are involved in almost all basic processes from the moment an organism emerges: embryonic development, proliferation, differentiation, aging, immune and stress responses, genomic imprinting, and key metabolic processes. Recent studies have shown that miRNAs themselves can act as oncogenes and tumor suppressors, with the development of a wide variety of tumors, including thyroid tumors, the content of many miRNAs changes significantly.
Известен способ диагностики новообразований ЩЖ путем измерения уровня экспрессии микроРНК на основе микрочипа (технология microarray) по классификации фолликулярной неоплазии ЩЖ [4]. Способ заключается в измерении экспрессии 4-х групп микроРНК для улучшения дооперационной диагностики узелковых образований ЩЖ. Первая комбинация, состоящая из 14 и 2 микроРНК, позволяет, согласно двухстороннему классификатору с вероятностью от 0 до 1, получить ответ на один из поставленных вопросов: а) фолликулярная неоплазия (аденома или карцинома) или норма; б) фолликулярная аденома или норма и в) фолликулярная карцинома или норма. Вторая комбинация, состоящая из 2-х и нескольких дополнительных из 4-ой группы в 59 микроРНК, позволяет различить сильно агрессивную фолликулярную карциному, склонную к образованию метастазов, и минимально агрессивную фолликулярную карциному ЩЖ.A known method for the diagnosis of thyroid neoplasms by measuring the level of microRNA expression based on a microchip (microarray technology) according to the classification of follicular thyroid neoplasia [4]. The method consists in measuring the expression of 4 miRNA groups to improve the preoperative diagnosis of thyroid nodules. The first combination, consisting of 14 and 2 miRNAs, allows, according to a two-sided classifier with a probability from 0 to 1, to get an answer to one of the questions posed: a) follicular neoplasia (adenoma or carcinoma) or norm; b) follicular adenoma or norm; and c) follicular carcinoma or norm. The second combination, consisting of 2 and several additional ones from the 4th group of 59 miRNAs, allows us to distinguish between highly aggressive follicular carcinoma, prone to metastases, and minimally aggressive follicular carcinoma of the thyroid gland.
Недостатками известного способа являются сложность, громоздкость, дороговизна, ограниченные функциональные возможности, поскольку классификатор служит для распознавания в основном злокачественного и доброкачественного подтипов фолликулярного рака ЩЖ. Кроме того, диапазон количественных измерений при использовании микрочипов значительно уже, этот метод дает практически на порядок менее точные результаты, чем метод ПЦР в реальном времени.The disadvantages of this method are the complexity, bulkiness, high cost, limited functionality, because the classifier is used to recognize mainly malignant and benign subtypes of follicular thyroid cancer. In addition, the range of quantitative measurements using microchips is much narrower, this method gives almost an order of magnitude less accurate results than the real-time PCR method.
Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ дифференциальной диагностики новообразований ЩЖ путем измерения уровня экспрессии микроРНК [5], заключающийся в следующем. Образцами для исследования служили замороженные или свежие образцы опухолевой ткани ЩЖ или клетки, фиксированные ткани или клетки железы, полученные при биопсии или при хирургической операции. Анализ микроРНК из образцов нормальной ткани ЩЖ и ткани опухолевого образования проводили с помощью микрочипов (технология microarray). Общее количество анализируемых микроРНК составляло 44, разделенных на 6 групп по 4, 18, 4, 6, 5 и 7 микроРНК в каждой, соответственно. За снижение или повышение экспрессии микроРНК считали 4-, 6-, 8-, 10-, 20- и 40-кратное изменение. Результат исследования образца ЩЖ пациента представляли в виде вероятностного значения от 0% до 100%, что пациент имеет злокачественное или доброкачественное новообразование ЩЖ. Образец считался злокачественным, если отмечали повышенную экспрессию одной или нескольких микроРНК из 1 группы (4 микроРНК) или снижение экспрессии одной или нескольких микроРНК из 2 группы (18 микроРНК); или образец также считался злокачественным, если отмечали повышенную экспрессию одной или нескольких микроРНК из 3 группы (4 микроРНК) или снижение экспрессии одной или нескольких микроРНК из 4 группы (6 микроРНК). Образец считался не злокачественным (фолликулярная аденома), если отмечали повышенную экспрессию одной или нескольких микроРНК из 5 группы (5 микроРНК) или снижение экспрессии одной или нескольких микроРНК из 6 группы (7 микроРНК).The closest to the claimed method, the prototype, is a method for differential diagnosis of thyroid neoplasms by measuring the level of microRNA expression [5], which is as follows. Samples for the study were frozen or fresh samples of thyroid tumor tissue or cells, fixed tissue or gland cells obtained by biopsy or surgery. MicroRNA analysis from samples of normal thyroid tissue and tumor tissue was performed using microarrays (microarray technology). The total number of miRNAs analyzed was 44, divided into 6 groups of 4, 18, 4, 6, 5, and 7 miRNAs, respectively. A 4-, 6-, 8-, 10-, 20- and 40-fold change was considered as a decrease or increase in miRNA expression. The result of the study of the patient’s thyroid sample was presented in the form of a probabilistic value from 0% to 100% that the patient has a malignant or benign thyroid tumor. A sample was considered malignant if increased expression of one or more miRNAs from group 1 (4 miRNAs) or decreased expression of one or more miRNAs from group 2 (18 miRNAs) was noted; or the sample was also considered malignant if increased expression of one or more miRNAs from group 3 (4 miRNAs) or a decrease in the expression of one or more miRNAs from 4 groups (6 miRNA) was noted. A sample was considered non-malignant (follicular adenoma) if increased expression of one or more miRNAs from group 5 (5 miRNAs) or decreased expression of one or more miRNAs from group 6 (7 miRNAs) was noted.
Недостатками известного способа являются длительность, трудоемкость и ограниченные функциональные возможности, поскольку он не обеспечивает типирования опухолевых патологий ЩЖ, а только позволяет отличить злокачественное новообразование от доброкачественного вероятностным способом.The disadvantages of this method are the duration, complexity and limited functionality, since it does not provide typing of tumor pathologies of the thyroid gland, but only allows to distinguish malignant neoplasms from benign probabilistic way.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение способа, расширение функциональных возможностей способа за счет определения типа злокачественного или доброкачественного новообразования, а также сокращение длительности диагностики новообразований ЩЖ.The problem to which the present invention is directed is to simplify the method, expand the functionality of the method by determining the type of malignant or benign neoplasm, as well as reducing the duration of the diagnosis of thyroid neoplasms.
Технический результат: упрощение, расширение функциональных возможностей способа за счет определения типа злокачественного новообразования (папиллярный, медуллярный, фолликуллярный рак) или доброкачественного (опухолеподобные патологии (ОПП), фолликулярная аденома) и сокращение длительности способа.EFFECT: simplification, expansion of the functional capabilities of the method by determining the type of malignant neoplasm (papillary, medullary, follicular cancer) or benign (tumor-like pathology (AKP), follicular adenoma) and reducing the duration of the method.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The problem is achieved by the proposed method, which consists in the following.
Забор образца опухолевой ткани ЩЖ человека и образца прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля осуществляют при операции или с помощью тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии (ТАПБ). Из полученных образцов выделяют суммарный пул РНК (в том числе содержащий и микроРНК) любым пригодным методом выделения нуклеиновых кислот, например [6].A sample of human thyroid tumor tissue and a sample of adjacent unchanged glandular tissue were taken as a control during surgery or using a fine-needle aspiration puncture biopsy (TAPB). From the obtained samples, the total RNA pool (including those containing microRNAs) is isolated by any suitable nucleic acid isolation method, for example [6].
Далее проводят измерение уровней экспрессии 13 микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b (диагностируемые микроРНК) в опухолевых образцах, в сравнении с нормальными тканями, методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа) [7], позволяющим селективно выявлять зрелые микроРНК с высокой чувствительностью и специфичностью. Метод ОТ-ПЦР включает в себя обратную транскрипцию зрелой микроРНК с помощью длинного праймера со шпилькой, с последующей детекцией полученной к ДНК с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U6, которая характеризуется стабильной экспрессией. Сочетание времени и температуры на каждом этапе протокола реакции подбирают специально для эффективной реакции с используемыми олигонуклеотидами.Next, they measure the expression levels of 13 miRNAs, namely miRNA-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200a, -200b ( diagnosed miRNAs) in tumor samples, in comparison with normal tissues, by real-time RT-PCR (qRT-PCR platform) [7], which allows selective detection of mature miRNAs with high sensitivity and specificity. RT-PCR involves reverse transcription of mature microRNA using a long hairpin primer, followed by real-time PCR detection of DNA. Small internal RNA U6, which is characterized by stable expression, is used as internal control. The combination of time and temperature at each stage of the reaction protocol is selected specifically for an effective reaction with the oligonucleotides used.
Заключение о наличии и типе новообразования ЩЖ составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе медианных (средних) значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ, представленного в классификаторе (таблица 1).The conclusion about the presence and type of thyroid neoplasm is made on the basis of a complex criterion calculated on the basis of median (average) values of microRNA expression levels in different types of thyroid neoplasms, presented in the classifier (table 1).
Комплексный критерий заключаются в том, что для каждого типа новообразования ЩЖ из 13 диагностируемых микроРНК экспериментально выбраны несколько микроРНК, представляющие специфический профиль экспрессии микроРНК, который характеризует именно конкретный тип опухоли ЩЖ. Комплексный критерий позволяет типировать новообразование ЩЖ на основании количественных критериев не отдельных уровней экспрессии определенных диагностических микроРНК, а их специфических профилей, т.е. группы в несколько микроРНК одновременно. Так, каждый тип новообразования ЩЖ характеризуется определенным специфическим профилем микроРНК, представляющим собой выборку из 13 исследованных микроРНК, т.е. 9, 10 или 12 микроРНК в различном сочетании.A comprehensive criterion is that for each type of thyroid tumor, out of 13 diagnosed miRNAs, several miRNAs representing a specific profile of miRNA expression, which characterizes a particular type of thyroid tumor, were experimentally selected. The complex criterion allows typing thyroid neoplasms based on quantitative criteria not of individual expression levels of certain diagnostic miRNAs, but of their specific profiles, i.e. groups of several miRNAs simultaneously. Thus, each type of thyroid tumor is characterized by a specific specific microRNA profile, which is a sample of 13 studied microRNAs, i.e. 9, 10 or 12 miRNAs in various combinations.
В соответствии с таблицей 1 можно составить заключение, что:In accordance with table 1, we can conclude that:
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375 уровень микроРНК-146b или микроРНК-31 повышен, либо уровень трех любых из перечисленных 9 повышен, и при этом уровень микроРНК-31 не понижен, то имеется (можно констатировать) наличие папиллярного рака ЩЖ;- if in the sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 9 miRNA-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375 the level of miRNA-146b or miRNA-31 is increased, either the level of three of any of the 9 listed above is increased, while the level of microRNA-31 is not lowered, then there is (we can state) the presence of papillary thyroid cancer;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10- ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -187, -199b, -31, -144, -146b, -375 уровень микроРНК-146b не повышен, уровень двух любых из микроРНК-21, -221, -222, -187, -375 повышен, при этом уровень трех любых из микроРНК-205, -31, -199b, -144 понижен, то можно констатировать наличие медуллярного рака ЩЖ;- if in the sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 10 miRNA-21, -221, -222, -205, -187, -199b, -31, -144, -146b, -375 the level of miRNA-146b is not increased, the level of any two of miRNAs-21, -221, -222, -187, -375 is increased, while the level of any three of miRNAs-205, -31, -199b, -144 is lowered, we can state the presence of medullary thyroid cancer;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -199b, -31, -144, -187, -146b, -375 уровень микроРНК-221 или микроРНК-222, или микроРНК-187 повышен, уровень микроРНК-199b понижен, уровни микроРНК-21, -146b, -205, -375 не повышены, при этом уровень хотя бы одной из микроРНК-205, -31,-144, -375 понижен, то можно констатировать наличие фолликулярного рака ЩЖ;- if in the sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 10 miRNA-21, -221, -222, -205, -199b, -31, -144, -187, -146b, -375 the level of miRNA-221 or miRNA- 222, or miRNA-187 is increased, the level of miRNA-199b is decreased, the levels of miRNA-21, -146b, -205, -375 are not increased, while the level of at least one of miRNA-205, -31, -144, -375 is lowered , then we can state the presence of follicular thyroid cancer;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 12-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -181b, -187, -144, -375 уровни микроРНК-21, -221, -222, -200b не повышены, из микроРНК-181b, -187, -375 повышен уровень не более чем одной, уровни двух любых из микроРНК-205, -200а, -200b, -31, -199b, -144, -375 понижены, то можно констатировать наличие фолликулярной аденомы ЩЖ;- if in a sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 12 microRNA-21, -221, -222, -205, -200a, -200b, -31, -199b, -181b, -187, -144, -375 levels miRNA-21, -221, -222, -200b are not elevated, of miRNA-181b, -187, -375 the level is not more than one, the levels of any two of miRNA-205, -200a, -200b, -31, - 199b, -144, -375 are lowered, then we can state the presence of follicular thyroid adenoma;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9 микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -144 уровни микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31 не повышены, а уровни микроРНК -199b, -144 понижены, то можно констатировать наличие ОПП ЩЖ.- if in a sample of thyroid tumor tissue from a specific profile 9 microRNA-21, -221, -222, -205, -200a, -200b, -31, -199b, -144 levels of microRNA-21, -221, -222, - 205, -200a, -200b, -31 are not increased, and the miRNA levels -199b, -144 are lowered, then we can state the presence of thyroid gland AKP.
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:The defining differences of the proposed method, in comparison with the prototype, are:
1) В образцах опухолевой ткани, в сравнении с условно нормальными образцами ткани ЩЖ, измеряют уровни экспрессии экспериментально подобранных 13-ти микроРНК (микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b), что позволяет упростить способ в сравнении с прототипом вследствие подбора минимально значимого количества диагностируемых микроРНК, ускорить проведение диагностики (5-6 часов или один рабочий день, вместо как минимум трех рабочих дней по прототипу), а также обеспечить возможность типирования новообразований ЩЖ, используя специфические изменения уровней экспрессии (профили) диагностируемых микроРНК;1) In samples of tumor tissue, in comparison with conventionally normal thyroid tissue samples, the expression levels of experimentally selected 13 miRNAs (miRNA-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b are measured , -375, -199b, -144, -200a, -200b), which allows to simplify the method in comparison with the prototype due to the selection of the minimum significant number of diagnosed microRNAs, to speed up the diagnosis (5-6 hours or one working day, instead of at least three working days according to the prototype), as well as to provide the possibility of typing thyroid neoplasms using specific visual changes in expression levels (profiles) of diagnosed miRNAs;
2) Измерение уровня экспрессии 13 микроРНК в образцах опухолевой ткани в сравнении с условно нормальными образцами ткани проводят методом ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR платформа), что позволяет расширить диапазон количественных характеристик экспрессии определенных генов по сравнению с методом microarray (прототип). Кроме этого, метод microarray имеет более низкую специфичность, чем qRT-PCR, поэтому неприемлем для получения абсолютных количественных характеристик и для быстрого анализа образцов в клинической практической онкологии;2) Measurement of the expression level of 13 miRNAs in tumor tissue samples in comparison with conventionally normal tissue samples is carried out by real-time RT-PCR method (qRT-PCR platform), which allows to expand the range of quantitative characteristics of the expression of certain genes compared to the microarray method (prototype) . In addition, the microarray method has a lower specificity than qRT-PCR, therefore, it is unacceptable for obtaining absolute quantitative characteristics and for quick analysis of samples in clinical oncology;
3) Заключение о наличие и типе новообразования ЩЖ составляют на основании комплексного критерия, рассчитанного на основе медианных значений уровней экспрессии микроРНК в разных типах новообразований ЩЖ, представленного в классификаторе (таблица 1), что позволяет расширить функциональные возможности способа за счет обеспечения возможности типирования злокачественных новообразований ЩЖ человека (папиллярный рак, фолликулярный рак, медуллярный рак) и доброкачественных новообразований (фолликулярная аденома, ОПП).3) The conclusion about the presence and type of thyroid neoplasm is made on the basis of a complex criterion calculated on the basis of median values of miRNA expression levels in different types of thyroid neoplasms presented in the classifier (table 1), which allows to expand the functionality of the method by allowing typing of malignant neoplasms Human thyroid gland (papillary cancer, follicular cancer, medullary cancer) and benign neoplasms (follicular adenoma, AKP).
Выбранные для анализа микроРНК являются онкогенными или онкосупрессорными или имеющими непосредственное отношение к процессу метастазирования (по эпителиально-мезенхимной трансформации, способности стимулировать образование метастазов), или отличающимися по степени участия в процессах апоптоза, ангиогенеза и инвазивности. Данные 13 микроРНК являются оптимальными и достаточными для определения типов новообразований ЩЖ.The miRNAs selected for analysis are oncogenic or oncosuppressive or directly related to the process of metastasis (by epithelial-mesenchymal transformation, ability to stimulate the formation of metastases), or differing in the degree of participation in the processes of apoptosis, angiogenesis and invasiveness. These 13 microRNAs are optimal and sufficient to determine the types of thyroid neoplasms.
Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений микроРНК, был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии 13 человеческих микроРНК: микроРНК-21, микроРНК-221, микроРНК-222, микроРНК-146b, микроРНК-205, микроРНК -31, микроРНК-187, микроРНК-181b, микроРНК-375, микроРНК-199b, микроРНК-144, микроРНК-200а, микроРНК-200b в 208 образцах операционного материала с различными гистопатологическими типами опухолей, различающихся по степени злокачественности. Согласно данным гистологического заключения образцы распределились следующим образом: 108 случаев - папиллярный рак, 16 случаев - фолликулярный рак, 4 - медуллярный рак, 41 - фолликулярная аденома и в 39 случаях - опухолеподобные патологии (ОПП, к которым относятся зоб и аутоиммунный тиреоидит).Previously, to determine and justify the diagnostic values of miRNAs, a comparative analysis of the expression levels of 13 human miRNAs was performed: miRNA-21, miRNA-221, miRNA-222, miRNA-146b, miRNA-205, miRNA-31, miRNA-187, miRNA- 181b, miRNA-375, miRNA-199b, miRNA-144, miRNA-200a, miRNA-200b in 208 samples of surgical material with various histopathological types of tumors that differ in the degree of malignancy. According to the histological findings, the samples were distributed as follows: 108 cases - papillary cancer, 16 cases - follicular cancer, 4 - medullary cancer, 41 - follicular adenoma and in 39 cases tumor-like pathologies (AKI, which include goiter and autoimmune thyroiditis).
Оценку изменения уровня экспрессии диагностируемых микроРНК в опытном образце по отношению к контрольному (т.е. опухолевой и нормальной ткани ЩЖ) вычисляли по стандартной формуле [8]:Assessment of changes in the level of expression of diagnosed miRNAs in the test sample relative to the control (ie, tumor and normal thyroid tissue) was calculated using the standard formula [8]:
где Е - эффективность реакции амплификации микроРНК (EmiR) или внутреннего контроля U6(EU6), Ct - пороговый цикл реакции. Все значения Ct определяют как для опухоли (оп), так и для нормы (норм).where E is the efficiency of the miRNA amplification reaction (E miR ) or internal control U6 (E U6 ), Ct is the threshold reaction cycle. All Ct values are determined both for the tumor (op) and for the norm (s).
При проведении сравнительного анализа уровней экспрессии 13 онкогенных и онкосупрессорных микроРНК в разных типах опухолей ЩЖ человека - доброкачественных (фолликулярная аденома, ОПП) и злокачественных (папиллярный рак, фолликулярный рак и медуллярный рак) новообразованиях, были определены характерные для каждого вида новообразования специфические профили экспрессии микроРНК и сведены в классификатор (таблица 1).When conducting a comparative analysis of the expression levels of 13 oncogenic and tumor suppressing miRNAs in different types of human thyroid tumors - benign (follicular adenoma, AKP) and malignant (papillary cancer, follicular cancer and medullary cancer) neoplasms, specific miRNA expression profiles specific to each neoplasm were determined and are summarized in the classifier (table 1).
Предлагаемый способ отличается высокой диагностической специфичностью, чувствительностью, а также высокой предсказательной ценностью положительного и отрицательного результатов для всех типов опухолей (практически все выше 90%).The proposed method is characterized by high diagnostic specificity, sensitivity, as well as high predictive value of positive and negative results for all types of tumors (almost all above 90%).
Предлагаемый способ позволяет просто, быстро и точно идентифицировать и различать типы злокачественных новообразований ЩЖ человека (папиллярный рак, фолликулярный рак, медуллярный рак) и доброкачественные новообразования - фолликулярную аденому, ОПП.The proposed method allows you to simply, quickly and accurately identify and distinguish between types of malignant neoplasms of the human thyroid gland (papillary cancer, follicular cancer, medullary cancer) and benign neoplasms - follicular adenoma, AKP.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific performance of the method.
Пример 1Example 1
У пациента №170 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля и продиагностированы заявляемым способом.Patient No. 170 during the operation, samples of tissue from a thyroid tumor and adjacent unchanged gland tissue were taken for control and diagnosed by the claimed method.
Выделение РНК. Выделение суммарного пула РНК, содержащего также и микроРНК, из образцов ткани проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. К 50 мг ткани добавляли 500 мкл лизирующего гуанидинового буфера, содержащего 4 М гуанидин изотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,3% саркозил, 3% дитиотреитол. Ткань в растворе интенсивно перемешивали и оставляли в термошейкере при 65°С на 15 мин. Раствор центрифугировали 2 мин на 10000 об/мин, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли к нему равный объем изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, супернатант сливали, а осадок промывали с помощью 500 мкл 70% этанола, затем 300 мкл ацетона. РНК растворяли в 200 мкл деионизованной воды.RNA isolation. The total pool of RNA, which also contains microRNA, was isolated from tissue samples using the RealBest extraction 100 kit (Vector-Best CJSC, Novosibirsk) in accordance with the manufacturer's instructions. To 50 mg of tissue was added 500 μl of lysing guanidine buffer containing 4 M guanidine isothiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0.3% sarcosyl, 3% dithiothreitol. The tissue in the solution was intensively mixed and left in a thermal shaker at 65 ° C for 15 minutes. The solution was centrifuged for 2 minutes at 10,000 rpm, the supernatant was transferred to new tubes and an equal volume of isopropanol was added to it, stirred and left at room temperature for 5 minutes. It was centrifuged for 10 min at 13000 rpm, the supernatant was drained, and the precipitate was washed with 500 μl of 70% ethanol, then 300 μl of acetone. RNA was dissolved in 200 μl of deionized water.
Реакция обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции для получения копии кДНК проводили в объеме 50 мкл. Использовали готовые реакционные смеси «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Реакция обратной транскрипции содержала: 3 мкл выделенной РНК, 16.2 мкл 40% раствора трегалозы, 3 мкл 10х буфера для обратной транскрипции, 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), 100 e.a.M-MLV обратной транскриптазы, 1.5 мкл 10 мкМ раствора соответствующего праймера для обратной транскрипции. Использованные праймеры приведены в таблице 2.Reverse transcription reaction. The reverse transcription reaction to obtain a copy of cDNA was carried out in a volume of 50 μl. Ready reaction mixtures RealBest Master Mix OT were used (Vector-Best CJSC, Novosibirsk). The reverse transcription reaction contained: 3 μl of isolated RNA, 16.2 μl of a 40% trehalose solution, 3 μl of 10x reverse transcription buffer, 3 μl of a 4 mM deoxynucleoside triphosphate solution, 3 μl of a 10% bovine serum albumin solution (BSA), 100 eaM-MLV reverse transcriptase , 1.5 μl of a 10 μM solution of the corresponding primer for reverse transcription. The primers used are shown in table 2.
Реакцию проводили в течение 30 мин при 42°С, после чего реакционную смесь инкубировали 2 мин при 95°С для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.The reaction was carried out for 30 min at 42 ° C, after which the reaction mixture was incubated for 2 min at 95 ° C to inactivate reverse transcriptase. The resulting reaction mixture containing cDNA in a volume of 3 μl was immediately used as a template for PCR.
ПЦР в реальном времени. Измерение уровней экспрессии 13-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200а, -200b проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве контроля использовали малую РНК U6. Использовали праймеры и зонды, приведенные в таблице 2. Реакцию проводили в объеме 30 мкл: 3 мкл полученной кДНК, 14 мкл H2O, 3 мкл 10х буфера для ПЦР (ЗАО «Вектор-Бест»), 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора BSA, 1 е.а. Taq-полимеразы (ЗАО «Вектор-Бест») в комплексе с моноклональными антителами к ее активному центру (Clontech, США), 3 мкл раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ).Real-time PCR. The expression levels of 13 miRNA-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200a, -200b were measured by real-time PCR time on a CFX96 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, USA). Small RNA U6 was used as a control. Used primers and probes are shown in table 2. The reaction was carried out in a volume of 30 μl: 3 μl of the obtained cDNA, 14 μl of H 2 O, 3 μl of 10x PCR buffer (ZAO Vector-Best), 3 μl of a 4 mm solution of deoxynucleoside triphosphates, 3 μl of a 10% BSA solution, 1 ea Taq polymerase (CJSC Vector-Best) in combination with monoclonal antibodies to its active center (Clontech, USA), 3 μl of a solution of forward and reverse primers (5 μM) and a probe (2.5 μM).
Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 94°С - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 20 сек.PCR reaction protocol: preliminary heating at 94 ° C for 2 min, 50 main cycles: denaturation at 94 ° C for 10 sec, annealing and elongation: 60 ° C for 20 sec.
Изменение уровня экспрессии каждой микроРНК в опытном образце (fold change) по отношению к контрольному (во сколько раз) с учетом эффективности амплификации вычисляли по стандартной формуле [8].The change in the level of expression of each miRNA in the experimental sample (fold change) relative to the control (by how many times) taking into account the amplification efficiency was calculated by the standard formula [8].
Для каждого пациента измерения проводили в 3 образцах нормальной ткани и 3 образцах опухолевой ткани ЩЖ, для расчетов использовали средние значения. Учитывая случайную ошибку методики анализа, достоверным считали регистрируемое отличие содержания микроРНК в опытном образце (опухолевая ткань ЩЖ) в 5 и более раз (в большую или меньшую сторону) по отношению к контролю (нормальная ткань ЩЖ).For each patient, measurements were carried out in 3 samples of normal tissue and 3 samples of thyroid tumor tissue; average values were used for calculations. Given the random error of the analysis procedure, the recorded difference in the microRNA content in the experimental sample (thyroid tumor tissue) was 5 or more times (up or down) relative to the control (normal thyroid tissue) was considered reliable.
Для сравнения полученных результатов дополнительно была проведена детекция мутации в гене BRAF (V600E) с помощью аллель-специфичной ПЦР с гидролизуемым зондом, использованные праймеры и зонды приведены в таблице 3. Протокол ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°С - 10 сек, отжиг и элонгация: 60°С - 15 сек.To compare the obtained results, an additional mutation was detected in the BRAF gene (V600E) using allele-specific PCR with a hydrolyzable probe, the primers and probes used are shown in Table 3. PCR protocol: preliminary heating at 95 ° C for 2 min, 50 main cycles : denaturation at 94 ° С - 10 sec, annealing and elongation: 60 ° С - 15 sec.
Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образцов пациента №170, представлены в таблице 4. Жирным шрифтом указаны значимые, более чем в 5 раз, изменения уровней экспрессии микроРНК, из составляющих специфический профиль экспрессии микроРНК данного пациента. Из таблицы 4 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-221, -222 и -375 тоже повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.The results obtained by measuring the miRNA expression levels of patient samples No. 170 are presented in Table 4. Bold type indicates significant, more than 5 times, changes in miRNA expression levels that comprise the specific miRNA expression profile of this patient. Table 4 shows that the expression level of miRNA-146b is increased, while the expression levels of miRNA-221, -222 and -375 are also increased, and the expression level of miRNA-31 is not reduced, therefore, in accordance with the classifier (table 1), we can conclude about the presence of papillary thyroid cancer in the patient.
Дооперационный диагноз по ТАПБ пациента №170 - папиллярный рак; гистологический на операционном материале - фолликулярный рак T1N0M0; диагноз по наличию мутации BRAF - папиллярный рак.Preoperative diagnosis according to TAPB of patient No. 170 - papillary cancer; histological on surgical material - follicular cancer T1N0M0; The diagnosis of the presence of a BRAF mutation is papillary cancer.
Таким образом, заявляемый способ дифференциальной диагностики новообразований ЩЖ человека является более точным и надежным, чем гистологический и цитологический, что позволяет избежать ошибок в диагностике опухолевых патологий ЩЖ.Thus, the claimed method for the differential diagnosis of neoplasms of the human thyroid gland is more accurate and reliable than histological and cytological, which avoids errors in the diagnosis of tumor pathologies of the thyroid gland.
Пример 2Example 2
У пациента №28 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ диагностики новообразования ЩЖ пациента осуществляли аналогично примеру 1. Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образцов пациента №28, представлены в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-21, -221, -222 повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.Patient # 28 during the operation took tissue samples of a thyroid tumor and adjacent unchanged gland tissue for control. A method for diagnosing thyroid neoplasm of a patient was carried out analogously to example 1. The results obtained by measuring the miRNA expression levels of patient samples No. 28 are presented in table 5. From table 5 it is seen that the miRNA-146b expression level is increased, while miRNA-21 expression levels are 221, -222 are increased, and the expression level of miRNA-31 is not lowered, therefore, in accordance with the classifier (table 1), we can conclude that the patient has papillary thyroid cancer.
Дооперационный диагноз пациента №28 по ТАПБ - фолликулярная опухоль; гистологически на операционном материале - аденома эмбрионально-фетального типа; диагноз по наличию мутации BRAF - папиллярный рак.The preoperative diagnosis of patient No. 28 according to TAPB is a follicular tumor; histologically on the surgical material - embryonic-fetal adenoma; The diagnosis of the presence of a BRAF mutation is papillary cancer.
Диагноз патоморфолога после вторичной независимой экспертизы, проведенной для всех случаев с несовпадением цитологических, гистологических и молекулярно-генетических результатов обследования - фолликулярный вариант папиллярного рака. Фолликулярный вариант папиллярного рака - это второй по частоте подтип папиллярной карциномы ЩЖ, который встречается в 23-41% случаев [9]. Вывод: наличие мутации BRAF и результаты вторичной независимой экспертизы подтверждают результаты, полученные заявляемым способом, а именно о наличии у пациента №28 злокачественной опухолевой патологии - папиллярного рака.The diagnosis of a pathomorphologist after a second independent examination conducted for all cases with a mismatch of cytological, histological and molecular genetic results of the examination is a follicular variant of papillary cancer. The follicular variant of papillary cancer is the second most common subtype of papillary thyroid carcinoma, which occurs in 23-41% of cases [9]. Conclusion: the presence of a BRAF mutation and the results of a secondary independent examination confirm the results obtained by the claimed method, namely, the presence in patient No. 28 of malignant tumor pathology - papillary cancer.
Пример 3Example 3
У пациента №97 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ диагностики новообразования ЩЖ пациента осуществляли аналогично примеру 1.Patient No. 97 during the operation took tissue samples of the thyroid tumor and adjacent unchanged gland tissue for control. A method for diagnosing a thyroid tumor of a patient was carried out analogously to example 1.
Дооперационный диагноз пациента №97 по ТАПБ - микрофолликулярная аденома; гистологически на операционном материале - микрофолликулярная аденома. Результаты, полученные при измерении уровней экспрессии микроРНК образцов пациента №97, представлены в таблице 6. Из таблицы 6 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-221, -222, -187 и -375 повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.The preoperative diagnosis of patient No. 97 according to TAPB is microfollicular adenoma; histologically on the surgical material - microfollicular adenoma. The results obtained by measuring the miRNA expression levels of patient samples No. 97 are presented in table 6. Table 6 shows that the miRNA-146b expression level is increased, while miRNA-221, -222, -187 and -375 expression levels are increased, and the level of expression of miRNA-31 is not reduced, therefore, in accordance with the classifier (table 1), we can conclude that the patient has papillary thyroid cancer.
Диагноз по уровням экспрессии специфических для данного типа рака микроРНК и наличию мутации BRAF - папиллярный рак или фолликулярный вариант папиллярного рака. Диагноз после вторичной независимой экспертизы - фолликулярный вариант папиллярного рака.The diagnosis of expression levels specific for this type of cancer miRNAs and the presence of a BRAF mutation is papillary cancer or a follicular variant of papillary cancer. The diagnosis after a second independent examination is a follicular variant of papillary cancer.
Пример 4Example 4
У пациента №123 во время операции были взяты образцы ткани опухоли ЩЖ и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ диагностики новообразования ЩЖ пациента осуществляли аналогично примеру 1. Дооперационный диагноз пациента №123 по ТАПБ - диффузный токсический зоб; гистологически на операционном материале - токсический зоб; диагноз по наличию мутации BRAF - папиллярный рак; диагноз по измерению уровня экспрессии микроРНК заявляемым способом - папиллярный рак.Patient No. 123 during the operation took samples of thyroid tumor tissue and adjacent unchanged gland tissue for control. A method for diagnosing thyroid neoplasm of a patient was carried out analogously to example 1. Preoperative diagnosis of patient No. 123 according to TAPB - diffuse toxic goiter; histologically on the surgical material - toxic goiter; diagnosis of the presence of a BRAF mutation - papillary cancer; the diagnosis of measuring the level of miRNA expression by the claimed method is papillary cancer.
Диагноз, поставленный патоморфологом после вторичной независимой экспертизы, - ОПП.The diagnosis made by the pathomorphologist after a second independent examination is AKI.
Результаты, полученные заявляемым способом путем измерения уровней экспрессии микроРНК в образцах опухолевой ткани пациента №123, представлены в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что уровень экспрессии микроРНК-146b повышен, при этом уровни экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -205, -187 повышены, а уровень экспрессии микроРНК-31 не понижен, поэтому в соответствии с классификатором (таблица 1) можно сделать заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ.The results obtained by the claimed method by measuring the levels of miRNA expression in samples of tumor tissue of patient No. 123 are presented in table 7. From table 7 it is seen that the expression level of miRNA-146b is increased, while the expression levels of miRNA-21, -221, -222, -205, -187 are increased, and the expression level of miRNA-31 is not lowered, therefore, in accordance with the classifier (table 1), we can conclude that the patient has papillary thyroid cancer.
Поскольку мутация BRAF - это бесспорное подтверждение наличия папиллярного рака, то диагностика заявляемым способом позволила разобраться в сложном и спорном случае, поставить верный диагноз и провести вовремя необходимое оперативное лечение. В противном случае пациент был бы обречен на позднее проведение оперативного лечения при раке и ухудшение прогноза.Since the BRAF mutation is an indisputable confirmation of the presence of papillary cancer, the diagnosis of the claimed method made it possible to understand the complex and controversial case, make the correct diagnosis and conduct the necessary surgical treatment on time. Otherwise, the patient would be doomed to late surgical treatment for cancer and a worsening prognosis.
Заявляемый способ позволит просто, быстро и точно диагностировать тип новообразования ЩЖ до операции, используя ткань опухоли, полученную с помощью ТАПБ или сразу после операции, чтобы подтвердить или скорректировать результаты, полученные при гистологическом и цитологическом исследовании, выбрать правильную тактику последующего лечения пациента.The inventive method will allow you to simply, quickly and accurately diagnose the type of thyroid neoplasm before surgery, using tumor tissue obtained using TAPB or immediately after surgery to confirm or adjust the results obtained by histological and cytological examination, choose the right tactics for subsequent treatment of the patient.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИINFORMATION SOURCES
1. Tang К.Т., Lee С.Н. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma: pathogenic role and clinical implications. J. Chin. Med. Assoc. - 2010. -V. 73.-№3.-P. 113-128.1. Tang K.T., Lee S.N. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma: pathogenic role and clinical implications. J. Chin. Med. Assoc. - 2010. -V. 73.-No3.-P. 113-128.
2. Шкурупий В.А., Полоз Т.Л. Цитоморфология фолликулярных опухолей щитовидной железы. Дифференциальная диагностика методом компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий. /Новосибирск: Наука, 2009. - 190 с.2. Skurupy V.A., Poloz T.L. Cytomorphology of follicular thyroid tumors. Differential diagnosis by computer image analysis and neural network technologies. / Novosibirsk: Nauka, 2009 .-- 190 p.
3. Богин Ю.Н. Комплексная экспресс-диагностика заболеваний щитовидной железы/ Ю.Н. Богин и др.// Методические рекомендации. - М., 1992. - 175 с.3. Bogin Yu.N. Integrated rapid diagnosis of thyroid diseases / Yu.N. Bogin et al. // Methodical recommendations. - M., 1992. - 175 p.
4. Nielsen F.С., Rossing М., Bennedbaek F.N. Microrna classification of thyroid follicular neoplasia. - Patent WO 2011154008A1, Pub. 25.12.2011.4. Nielsen F.C., Rossing M., Bennedbaek F.N. Microrna classification of thyroid follicular neoplasia. - Patent WO 2011154008A1, Pub. 12/25/2011.
5. Beaudenon-Huibregtse S., Choudhary A. MiRNA as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms. - Patent 20120157334, Pub. 2012.5. Beaudenon-Huibregtse S., Choudhary A. MiRNA as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms. - Patent 20120157334, Pub. 2012.
6. Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. - V. 2009 (2009). - Article ID 574398, 10 pages. - doi: 10.1155/2009/574398.6. Tan S.C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. - V. 2009 (2009). - Article ID 574398, 10 pages. - doi: 10.1155 / 2009/574398.
7. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J., Guegler K.J. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33. - №20. - e179, doi:10.1093/nar/gni178.7. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J., Guegler K.J. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33. - No. 20. - e179, doi: 10.1093 / nar / gni178.
8. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR //Nucleic Acids Res. - 2001. - V. 29. - №9. - e45.8. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucleic Acids Res. - 2001. - V. 29. - No. 9. - e45.
9. Passler C., Prager G., Scheuba C., Niederle B.E., Kaserer K., Zetting G., Niederle B.Follicular variant of papillary thyroid carcinoma: a long-term follow-up. Arch Surq. - 2003. - V. 138. - №12. - P. 1362-1366.9. Passler C., Prager G., Scheuba C., Niederle B.E., Kaserer K., Zetting G., Niederle B. Follicular variant of papillary thyroid carcinoma: a long-term follow-up. Arch Surq. - 2003. - V. 138. - No. 12. - P. 1362-1366.
Claims (2)
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375 уровень микроРНК- 146b или микроРНК-31 повышен, либо уровень трех любых из перечисленных микроРНК повышен, и при этом уровень микроРНК-31 не понижен, то делают заключение о наличии у пациента папиллярного рака ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -187, -199b, -31, -144, -146b, -375 уровень микроРНК-146b не повышен, уровень двух любых из микроРНК-21, -221, -222, -187, -375 повышен, при этом уровень трех любых из микроРНК-205, -31, -199b, -144 понижен, то делают заключение о наличии медуллярного рака ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 10-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -199b, -31, -144, -187, -146b, -375 уровень микроРНК-221 или микроРНК-222, или микроРНК-187 повышен, уровень микроРНК-199b понижен, уровни микроРНК-21, -146b, -205, -375 не повышены, при этом уровень хотя бы одной из микроРНК-205, -31, -144, -375 понижен, то делают заключение о наличии фолликулярного рака ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 12-ти микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -181b, -187, -144, -375 уровни микроРНК-21, -221, -222, -200b не повышены, из микроРНК-181b, -187, -375 повышен уровень не более чем одной, уровни двух любых из микроРНК-205, -200а, -200b, -31, -199b, -144, -375 понижены, то делают заключение о наличии фолликулярной аденомы ЩЖ;
- если в образце опухолевой ткани ЩЖ из специфического профиля 9 микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31, -199b, -144 уровни микроРНК-21, -221, -222, -205, -200а, -200b, -31 не повышены, а уровни микроРНК -199b, -144 понижены, то делают заключение о наличии доброкачественного новообразования ЩЖ.1. A method for differential diagnosis of human thyroid neoplasms, including taking a sample of thyroid tumor tissue (thyroid gland) and adjacent unchanged gland tissue as a control, isolating the total RNA pool from the samples, measuring the expression level of diagnosed miRNAs, followed by a comparative analysis of changes in the expression level of diagnosed miRNAs normal and with thyroid tumors and drawing up a conclusion about the presence and type of malignant neoplasm, characterized in that they express the level of expression of 13 miRNAs, namely miRNA-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375, -199b, -144, -200a, -200b using the RT- Real-time PCR, and the conclusion about the presence and type of thyroid neoplasm is based on a complex criterion calculated on the basis of average values of miRNA expression levels in different types of thyroid neoplasms characterized by a specific miRNA profile, in this case:
- if in the sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 9 miRNA-21, -221, -222, -205, -146b, -31, -187, -181b, -375 the level of miRNA-146b or miRNA-31 is increased, or the level of three of any of the miRNAs listed is elevated, and while the miRNA-31 level is not lowered, they conclude that the patient has papillary thyroid cancer;
- if in the sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 10 miRNA-21, -221, -222, -205, -187, -199b, -31, -144, -146b, -375 the level of miRNA-146b is not increased, the level of any two of miRNA-21, -221, -222, -187, -375 is increased, while the level of any three of miRNA-205, -31, -199b, -144 is lowered, then a conclusion is made about the presence of medullary thyroid cancer;
- if in the sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 10 miRNA-21, -221, -222, -205, -199b, -31, -144, -187, -146b, -375 the level of miRNA-221 or miRNA- 222, or miRNA-187 is increased, the level of miRNA-199b is decreased, the levels of miRNA-21, -146b, -205, -375 are not increased, while the level of at least one of miRNA-205, -31, -144, -375 is lowered , then conclude the presence of follicular thyroid cancer;
- if in a sample of thyroid tumor tissue from a specific profile of 12 microRNA-21, -221, -222, -205, -200a, -200b, -31, -199b, -181b, -187, -144, -375 levels miRNA-21, -221, -222, -200b are not elevated, of miRNA-181b, -187, -375 the level is not more than one, the levels of any two of miRNA-205, -200a, -200b, -31, - 199b, -144, -375 are lowered, then they conclude that there is a follicular thyroid adenoma;
- if in a sample of thyroid tumor tissue from a specific profile 9 microRNA-21, -221, -222, -205, -200a, -200b, -31, -199b, -144 levels of microRNA-21, -221, -222, - 205, -200a, -200b, -31 are not increased, and the miRNA levels -199b, -144 are lowered, then they conclude that there is a benign thyroid tumor.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014140764/10A RU2569154C1 (en) | 2014-10-08 | 2014-10-08 | Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014140764/10A RU2569154C1 (en) | 2014-10-08 | 2014-10-08 | Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2569154C1 true RU2569154C1 (en) | 2015-11-20 |
Family
ID=54598331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014140764/10A RU2569154C1 (en) | 2014-10-08 | 2014-10-08 | Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2569154C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705110C1 (en) * | 2019-04-10 | 2019-11-06 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Краевая клиническая больница N2" Министерства здравоохранения Краснодарского края | Method for differential diagnosis of thyroid neoplasms |
| RU2757347C1 (en) * | 2021-02-08 | 2021-10-13 | Сергей Евгеньевич Титов | Method for differential diagnosis of nodular formations of the human thyroid gland |
| RU2759128C1 (en) * | 2021-03-05 | 2021-11-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Method for preoperative differential diagnosis of anaplastic thyroid cancer |
| RU2819521C1 (en) * | 2023-11-22 | 2024-05-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Method for preoperative diagnosis of medullary thyroid cancer |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011154008A1 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Rigshospitalet | Microrna classification of thyroid follicular neoplasia |
| WO2012068400A2 (en) * | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Asuragen, Inc. | Mirnas as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms |
-
2014
- 2014-10-08 RU RU2014140764/10A patent/RU2569154C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011154008A1 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Rigshospitalet | Microrna classification of thyroid follicular neoplasia |
| WO2012068400A2 (en) * | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Asuragen, Inc. | Mirnas as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ШЕВЧЕНКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ, Современные клинические и молекулярно-генетические подходы к диагностике и лечению рака щитовидной железы, Автореферат дисс., Новосибирск, 2013, стр.27-28. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705110C1 (en) * | 2019-04-10 | 2019-11-06 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Краевая клиническая больница N2" Министерства здравоохранения Краснодарского края | Method for differential diagnosis of thyroid neoplasms |
| RU2757347C1 (en) * | 2021-02-08 | 2021-10-13 | Сергей Евгеньевич Титов | Method for differential diagnosis of nodular formations of the human thyroid gland |
| RU2759128C1 (en) * | 2021-03-05 | 2021-11-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Method for preoperative differential diagnosis of anaplastic thyroid cancer |
| RU2819521C1 (en) * | 2023-11-22 | 2024-05-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Method for preoperative diagnosis of medullary thyroid cancer |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10801072B2 (en) | Method of analysis allowing avoidance of surgery | |
| JP6155194B2 (en) | MiRNA as a biomarker for distinguishing benign and malignant thyroid neoplasms | |
| US9868992B2 (en) | Tissue and blood-based miRNA biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer | |
| CN101646783A (en) | Novel cancer marker | |
| CN110023513A (en) | Method for predicting prognosis of breast cancer patient | |
| WO2016186987A1 (en) | Biomarker micrornas and method for determining tumor burden | |
| AU2020445677B2 (en) | Tumor detection reagent and kit | |
| CN107858434B (en) | Application of lncRNA in liver cancer diagnosis and prognosis prediction | |
| CN106676191B (en) | A molecular marker for colon adenocarcinoma | |
| US20190316207A1 (en) | Mir-320e and colorectal cancer | |
| RU2569154C1 (en) | Differential diagnostic technique for individual's thyroid new growths | |
| CN107519193A (en) | Esophageal squamous cell carcinoma early molecule diagnosis marker and its application | |
| CN106319062A (en) | Minimally invasive kit for assistant diagnosis or efficacy prediction of efficacy prediction | |
| CN109355385A (en) | Application of LINC00266-1 RNA as a solid tumor marker | |
| US20150247202A1 (en) | Microrna based method for diagnosis of colorectal tumors and of metastasis | |
| KR20220052461A (en) | MicroRNA-1246 for diagnosing of ovarian cancer and use thereof | |
| CN103173450B (en) | Esophagus cancer postoperative early-stage recurrence and prognosis related miRNA marker and its application | |
| CN106636334A (en) | MicroRNA marker group and applications thereof in preparing kit for detecting lymph node metastasis of gastric carcinoma | |
| KR101381894B1 (en) | Serum miRNA as a marker for the diagnosis of lymph node metastasis of gastric cancer | |
| KR102096499B1 (en) | MicroRNA-3960 for diagnosing or predicting recurrence of colorectal cancer and use thereof | |
| CN111808966B (en) | Application of miRNA in diagnosis of breast cancer disease risk | |
| WO2016160882A1 (en) | Methods for diagnosing and treating colorectal cancer using mirna549a | |
| KR20220052462A (en) | MicroRNA-1290 for diagnosing of ovarian cancer and use thereof | |
| RU2837879C1 (en) | Method for prediction of recurrent miscarriage by microrna gene expression in endometrial biopsy material | |
| CN110699450A (en) | Application of miRNA biomarker in diagnosis and prognosis of liver disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171009 |